Summary
In dit protocol werden de translating ribosome affinity purification (TRAP) methode en de isolatie van nuclei tagged in specific cell types (INTACT) methode geoptimaliseerd voor de gepaarde ondervraging van het celspecifieke ovariumtranscriptoom en epigenoom met behulp van het NuTRAP muismodel gekruist naar een Cyp17a1-Cre muislijn.
Abstract
Het beoordelen van celtype-specifieke epigenomische en transcriptomische veranderingen zijn de sleutel tot het begrijpen van ovariële veroudering. Hiertoe werd de optimalisatie van de translating ribosome affinity purification (TRAP) methode en de isolatie van nuclei tagged in specific cell types (INTACT) methode uitgevoerd voor de daaropvolgende gepaarde ondervraging van het celspecifieke ovariumtranscriptoom en epigenoom met behulp van een nieuw transgeen NuTRAP muismodel. De expressie van het NuTRAP-allel staat onder controle van een gefloxte STOP-cassette en kan worden gericht op specifieke ovariumceltypen met behulp van promotorspecifieke Cre-lijnen. Aangezien recente studies eierstokstromale cellen hebben betrokken bij het aansturen van vroegtijdige verouderingsfenotypen, was het NuTRAP-expressiesysteem gericht op stromale cellen met behulp van een Cyp17a1-Cre-driver. De inductie van het NuTRAP-construct was specifiek voor ovariële stromale fibroblasten en voldoende DNA en RNA voor sequencingstudies werden verkregen uit een enkele eierstok. Het NuTRAP-model en de hier gepresenteerde methoden kunnen worden gebruikt om elk eierstokceltype met een beschikbare Cre-lijn te bestuderen.
Introduction
De eierstokken zijn belangrijke spelers in somatische veroudering1, met verschillende bijdragen van specifieke celpopulaties. De cellulaire heterogeniteit van de eierstok maakt het moeilijk om moleculaire resultaten van bulk, hele eierstoktesten te interpreteren. Het begrijpen van de rol van specifieke celpopulaties bij ovariële veroudering is de sleutel tot het identificeren van de moleculaire factoren die verantwoordelijk zijn voor vruchtbaarheid en gezondheidsafname bij oudere vrouwen. Traditioneel werd de multi-omics beoordeling van specifieke eierstokceltypen bereikt door technieken zoals lasermicrodissectie2, eencellige benaderingen3 of celsortering4. Microdissectie kan echter duur en moeilijk uit te voeren zijn, en celsortering kan cellulaire fenotypische profielen veranderen5.
Een nieuwe benadering om ovariumceltype-specifieke epigenomische en transcriptomische profielen te beoordelen, maakt gebruik van het nucleaire tagging en translating ribosoom affiniteitszuivering (NuTRAP) muismodel. Het NuTRAP-model maakt de isolatie van celtypespecifieke nucleïnezuren mogelijk zonder de noodzaak van celsortering met behulp van de affiniteitszuiveringsmethoden: het vertalen van ribosoomaffiniteitszuivering (TRAP) en isolatie van kernen gelabeld in specifieke celtypen (INTACT)6. De expressie van het NuTRAP-allel staat onder controle van een gefloxte STOP-cassette en kan worden gericht op specifieke ovariumceltypen met behulp van promotorspecifieke Cre-lijnen. Door de NuTRAP-muis te kruisen met een celtypespecifieke Cre-lijn, veroorzaakt het verwijderen van de STOP-cassette eGFP-tagging van het ribosomale complex en biotine / mCherry-tagging van de kern op een Cre-afhankelijke manier6. De TRAP- en INTACT-technieken kunnen vervolgens worden gebruikt om mRNA en nucleair DNA te isoleren van het celtype van belang en over te gaan tot transcriptomische en epigenomische analyses.
Het NuTRAP-model is gebruikt in verschillende weefsels, zoals vetweefsel6, hersenweefsel 7,8,9 en het netvlies 10, om celtypespecifieke epigenomische en transcriptomische veranderingen te onthullen die mogelijk niet worden gedetecteerd in homogenaat van het hele weefsel. De voordelen van de NuTRAP-aanpak ten opzichte van traditionele celsorteertechnieken omvatten het volgende: 1) de preventie van ex vivo activeringsartefacten8, 2) de minimale behoefte aan gespecialiseerde apparatuur (d.w.z. celsorteerders) en 3) de verhoogde doorvoer en lagere kosten van celtypespecifieke analyses. Bovendien maakt de mogelijkheid om celtypespecifiek DNA en RNA van een enkele muis te isoleren gepaarde analyses mogelijk die de statistische kracht vergroten. Aangezien recente studies eierstokstromale cellen hebben betrokken bij het aansturen van vroegtijdige verouderingsfenotypen11,12,13, hebben we het NuTRAP-expressiesysteem gericht op stromale en theca-cellen met behulp van een Cyp17a1-Cre-driver. Hier tonen we aan dat de inductie van het NuTRAP-construct specifiek is voor ovariële stromale en theca-cellen, en dat voldoende DNA en RNA voor sequencingstudies worden verkregen uit een enkele eierstok. Het NuTRAP-model en de hier gepresenteerde methoden kunnen worden gebruikt om elk type eierstokcel te bestuderen met elke beschikbare Cre-lijn.
Voor het genereren van een celtype-specifieke ovariële NuTRAP-muislijn heeft het nucleaire tagging en translating ribosome affinity purification (NuTRAP) allel een floxed STOP-codon dat de expressie van BirA, biotine ligase recognition peptide (BLRP)-gelabeld mCherry / mRANGAP1 en eGFP / L10a regelt. Wanneer gekruist met een celtype-specifieke Cre-lijn, labelt de expressie van de NuTRAP-cassette het nucleaire eiwit mRANGAP1 met biotine / mCherry en ribosomaal eiwit L10a met eGFP op een Cre-afhankelijke manier. Dit maakt het mogelijk om kernen en mRNA van specifieke celtypen te isoleren zonder dat celsortering nodig is. De NuTRAP flox/flox kan worden gecombineerd met een celtype-specifieke Cre die relevant is voor eierstokceltypen om dit te beoordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierprocedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Oklahoma Medical Research Foundation (OMRF). Oudermuizen werden gekocht bij het Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) en gefokt en gehuisvest onder SPF-omstandigheden in een HEPA-barrièreomgeving op een 14 h / 10 h licht / donker-cyclus (lichten aan om 6:00 uur) bij de OMRF.
OPMERKING: In deze demonstratie gebruiken we een Cyp17iCre+/−(Strain # 028547, The Jackson Laboratory) mannetje gekoppeld aan een NuTRAP vrouwtje (Strain # 029899, The Jackson Laboratory). Het gewenste Cyp17-NuTRAP nageslacht (Cyp17iCre+/−; NuTRAPflox/WT) zal het NuTRAP-allel onder controle van de Cyp17a1-promotor tot expressie brengen in stromale eierstokcellen. Voor deze manuscriptvoorbereiding gebruikten we 4 maanden oude vrouwelijke Cyp17-NuTRAP-muizen (n = 4). DNA werd geëxtraheerd uit muizenoorponsmonsters voor genotypering om de overerving van de Cyp17iCre- en NuTRAP-transgenen te bevestigen en voor de PCR-detectie van 1) generieke Cre, 2) Cyp17iCre en 3) NuTRAP floxed met behulp van de primers vermeld in de materiaaltabel, zoals eerder beschreven 7,8.
1. Ovariële dissectie bij de muis
- Voer muizeneuthanasie uit volgens de richtlijnen voor dierverzorging en goedkeuring van de instelling, gevolgd door het verzamelen van eierstokken.
- Ontleed de eierstokken om vetweefsel of delen van de eileiders te verwijderen die aan het eierstokweefsel kunnen worden bevestigd voordat de eierstokken in buizen met buffer worden geplaatst. Ga onmiddellijk verder met TRAP- of INTACT-technieken.
OPMERKING: Dit protocol is niet geoptimaliseerd voor gebruik met bevroren weefsel. Het gebruik van één eierstok van dezelfde muis voor elke techniek wordt aanbevolen voor toekomstige statistische analyse.
2. Isolatie van kernen van specifieke eierstokceltypen
- Buffervoorbereiding
- Nucleaire zuiveringsbuffer (NPB): Om 100 ml NPB te bereiden, combineert u 2 ml 1 M HEPES (eindconcentratie: 20 mM HEPES), 0,8 ml 5 M NaCl (40 mM NaCl), 4,5 ml 2 M KCl (90 mM KCl), 0,4 ml 0,5 M EDTA (2 mM EDTA), 0,1 ml 0,5 M EGTA (0,5 mM EGTA), en 92,2 ml nucleasevrij water. Supplement met 1x proteaseremmer op de dag van kernisolatie.
OPMERKING: NPB kan vooraf zonder de proteaseremmer worden bereid en duurt maximaal 3 weken bij 4 °C. - Nuclei lysis buffer (compleet): Vul nuclei lysis buffer aan met 1x proteaseremmer op de dag van kernisolatie.
- Nucleaire zuiveringsbuffer (NPB): Om 100 ml NPB te bereiden, combineert u 2 ml 1 M HEPES (eindconcentratie: 20 mM HEPES), 0,8 ml 5 M NaCl (40 mM NaCl), 4,5 ml 2 M KCl (90 mM KCl), 0,4 ml 0,5 M EDTA (2 mM EDTA), 0,1 ml 0,5 M EGTA (0,5 mM EGTA), en 92,2 ml nucleasevrij water. Supplement met 1x proteaseremmer op de dag van kernisolatie.
- Creatie van de kernsuspensie
OPMERKING: De monsters moeten te allen tijde op ijs worden bewaard, tenzij anders aangegeven.- Verzamel één eierstok van een Cyp17-NuTRAP-muis (of een andere relevante Cre-NuTRAP) in 500 μL nuclei lysisbuffer (compleet). Hak de eierstok in acht delen in de buffer met een zelfopenende microschaar.
- Gebruik pipetpunten met brede boring om de gehakte eierstok en 500 μL lysisbuffer over te brengen in een glazen Dounce-homogenisator op ijs. Homogeniseer de eierstok 10x-20x met de losse stamper A. Voeg 400 μL lysisbuffer toe aan de Dounce homogenisator, wasstamper A.
- Homogeniseer de eierstok met de strakke stamper B 10x-20x. Voeg 1.000 μL lysisbuffer toe, wasstamper B. Breng het homogenaat (1,9 ml) over in een buis met ronde bodem van 2 ml.
- Centrifugeer bij 200 x g gedurende 1,5 min bij 4 °C om niet-gedissocieerd weefsel en bloedvaten te verwijderen14. Het supernatant bevat de kernen; Gooi de pellet van ongedissocieerd weefsel weg.
- Na het voorbevochtigen van een 30 μm celzeef met 100 μL lysisbuffer en filter het supernatant door de celzeef in een conische buis van 15 ml. Breng vervolgens het kernbevattende mengsel over in een buis met ronde bodem van 2 ml.
- Centrifugeer het monster gedurende 5 minuten bij 500 x g bij 4 °C en gooi het supernatant weg. De pellet bevat kernen.
- Resuspensie van de kernpellet in 250 μL ijskoude lysisbuffer door kortstondig te vortexen met matige tot hoge snelheid. Breng het volume op 1,75 ml door 1,5 ml lysisbuffer toe te voegen. Meng voorzichtig en laat de nucleaire suspensie 5 minuten op ijs rusten.
- Pellet de kernen door centrifugeren bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant voorzichtig weg zonder de kernkorrel te verstoren. Resuspendeer de pellet in 200 μL ijskoude opslagbuffer en vortex kort om de nucleaire pellet volledig te resuspenderen.
- Reserveer 10% van de geresuspendeerde pellet (20 μL) als inputkernmonster voor downstream-analyses.
- Neem de geresuspendeerde kernpellet en vul het volume aan tot 2,0 ml met ijskoude NPB. Ga verder met het isoleren van de gelabelde kernen met behulp van de intacte affiniteitsgebaseerde zuiveringsmethode.
- Isolatie van kernen gelabeld in specifieke celtypen (INTACT)
- Vortex de streptavidin kralen in de injectieflacon gedurende 30 s op gemiddelde snelheid om ervoor te zorgen dat ze volledig worden geresuspendeerd. Voeg 30 μL geresuspendeerde kralen voor elk monster toe aan een buis met ronde bodem van 2 ml (kralen voor maximaal 10 monsters kunnen in een enkele buis worden gewassen), voeg 1 ml NPB toe en resuspensie goed door pipetteren.
- Plaats de buis gedurende 1 minuut op het magnetische rek om de kralen te scheiden. Gooi het supernatant weg en verwijder de buis van de magneet. Resuspendeer de gewassen magnetische kralen in 1 ml NPB.
- Herhaal de wasstap voor in totaal drie wasbeurten. Na de laatste wasbeurt resuspensie van de kralen in het oorspronkelijke volume NPB (30 μL per monster).
- Voeg 30 μL van de gewassen kralen toe aan de 2 ml kernsuspensie uit stap 2.2.10. Resuspendeer het kraal-kernmengsel goed door de buis te pipetteren en voorzichtig om te keren.
- Plaats de buizen op een roterende mixer in een koude ruimte of koelkast gedurende 30 minuten op lage snelheid. Incubeer de invoermonsters zonder kralen in dezelfde omstandigheden.
- Plaats de buizen met de kernsuspensie en kralen op de magneet en scheid de gebiotinyleerde kernen gebonden aan streptavidinkorrels (positieve fractie) van de negatieve fractie van kernen. Laat de kralen 3 minuten scheiden op de magneet.
- Verwijder het supernatant, geef de negatieve fractie door aan een verse buis van 2,0 ml en reserveer op ijs. Verwijder voor elke positieve fractiebuis de buis van de magneet en resuspensie van de inhoud in 1 ml NPB.
- Plaats de buis gedurende 1 minuut op de magneet en gooi het supernatant weg. Verwijder de buis van de magneet en resuspensie van het gewassen kraal-kernmengsel in 1 ml NPB.
- Herhaal stap 2.3.8 voor in totaal drie wasbeurten. Na het voltooien van drie wasbeurten, resuspensie van de positieve fractie kraal-kernmengsel in 30 μL NPB.
- Centrifugeer voor elke negatieve fractiebuis de kernsuspensie van stap 2.3.7 bij 500 x g gedurende 7 minuten bij 4 °C. Zuig het supernatant voorzichtig op en gooi het weg. Resuspendeerde de negatieve fractiekernpellet in 30 μL NPB.
- Bewaar de kernen van de input (stap 2.2.9), de negatieve fractie (stap 2.3.10) en de positieve fractie (stap 2.3.9) in een vriezer van −80 °C totdat ze klaar zijn voor nucleaire DNA- of RNA-isolatie.
OPMERKING: De kernen mogen niet worden ingevroren voor protocollen die intacte kernen als input vereisen (d.w.z. assay voor transposase-toegankelijk chromatine, chromatine-immunoprecipitatie).
3. Isolatie van mRNA uit specifieke eierstokceltypen
- De buffers voorbereiden
- TRAP-bufferbasis: Bereid 100 ml TRAP-bufferbasis voor door 78,8 ml RNase-vrij water, 5 ml 1 M Tris-HCl (eindconcentratie: 50 mM Tris [pH 7,5]), 5 ml 2 M KCl (100 mM KCl), 1,2 ml 1 M MgCl 2 (12 mM MgCl2) en 10 ml 10% NP-40 (1% NP-40) te combineren. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 1 maand.
- Hoge zoutbufferbasis: Bereid 100 ml hoge zoutbufferbasis door 68,8 ml RNasevrij water, 5 ml 1 M Tris-HCl (eindconcentratie: 50 mM Tris [pH 7,5]), 15 ml 2 M KCl (300 mM KCl), 1,2 ml 1M MgCl 2 (12 mM MgCl2) en 10 ml 10% NP-40 (1% NP-40) en 10 ml 10% NP-40 (1% NP-40) te combineren. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 1 maand.
- TRAP-homogenisatiebuffer (volledig): Bereid 1,5 ml per monster voor op de dag van weefselverzameling. Bereid 10 ml TRAP-homogenisatiebuffer door 10 ml TRAP-bufferbasis (uit stap 3.1.1) te combineren met 10 μl 100 mg/ml cycloheximide (eindconcentratie: 100 μg/ml cycloheximide), 10 mg natriumheparine (1 mg/ml natriumheparine), 20 μl 0,5 M DTT (1 mM DTT), 50 μl 40 U/μl RNaseremmer (200 U/ml RNaseremmer), 200 μL van 0,1 M spermidine (2 mM spermidine) en één EDTA-vrije proteaseremmertablet (1x).
- Lage zoutwasbuffer (compleet): Maak 1,5 ml per monster op de dag van weefselverzameling. Om 10 ml zoutarme wasbuffer te maken, combineert u 10 ml TRAP-bufferbasis (vanaf stap 3.1.1) met 10 μl 100 mg / ml cycloheximide (100 μg / ml cycloheximide) en 20 μl 0,5 M DTT (1 mM DTT).
- Hoge zoutwasbuffer (compleet): Maak 1,5 ml per monster op de tweede dag van TRAP-isolatie. Om 10 ml hoge zoutwasbuffer te maken, combineert u 10 ml hoge zoutbufferbasis (uit stap 3.1.2) met 10 μl 100 mg / ml cycloheximide en 20 μl van 0,5 m DTT.
- Uitvoeren van translating ribosoom affiniteitszuivering (TRAP)
- Verzamel de andere eierstok van een Cyp17-NuTRAP-muis (of een andere relevante Cre-NuTRAP) en plaats deze in een RNasevrije buis van 1,5 ml met 100 μL ijskoude TRAP-homogenisatiebuffer (vanaf stap 3.1.3). Hak de eierstok in acht delen in de buffer met een zelfopenende microschaar.
- Gebruik uiteinden met brede boring om de eierstok en 100 μL homogenisatiebuffer over te brengen in een glazen Dounce-homogenisator. Homogeniseer 10x-20x met de losse stamper A. Voeg 400 μL TRAP homogenisatiebuffer toe, wasstamper A.
- Breng het homogenaat over in een buis met ronde bodem van 2 ml. Was de Dounce-homogenisator met een extra 1 ml TRAP-homogenisatiebuffer en breng het gewassen volume over naar de 2 ml buis met ronde bodem.
- Centrifugeer het homogenaat bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Breng het geklaarde supernatant over in een verse buis met ronde bodem van 2 ml. Gooi de pellet weg.
- Breng 100 μL van het geklaarde homogenaat over in een verse buis met ronde bodem van 2 ml en reserveer als input op ijs.
- Incubeer de rest van het geklaarde homogenaat (vanaf stap 3.2.4) met een anti-GFP-antilichaam (5 μg/ml) gedurende 1 uur bij 4 °C terwijl het end-over-end draait. Incubeer het invoermonster onder dezelfde omstandigheden.
- Was in de laatste 15 minuten van de incubatie de eiwit G-magnetische kralen in de zoutarme wasbuffer met behulp van de volgende stappen (3.2.8-3.2.11).
- Vortex de injectieflacon met proteïne G magnetische kralen gedurende 30 s om volledig te resuspenderen. Breng 50 μL van de proteïne G magnetische kralen voor elk monster (maximaal 10 monsters kunnen in één buis worden gewassen) over in een 2 ml buis met ronde bodem.
- Voeg 500 μL zoutarme wasbuffer toe aan de kralen en pipetteer voorzichtig om te mengen. Plaats de buis gedurende 1 minuut in een magnetische standaard om de kralen tegen de zijkant van de buis te verzamelen. Verwijder het supernatant en gooi het weg.
- Verwijder de buis van de magnetische standaard en voeg 1 ml zoutarme wasbuffer toe aan de buis. Pipetteer zachtjes om te mengen. Plaats de buis gedurende 1 minuut in een magnetische standaard om de kralen tegen de zijkant van de buis te verzamelen. Verwijder het supernatant en gooi het weg.
- Herhaal stap 3.2.10 voor in totaal drie wasbeurten. Verwijder na de laatste wasbeurt de buis uit het magnetische rek en resuspensie van de kralen in het oorspronkelijke volume van de lage zoutwasbuffer (50 μL per monster).
- Breng de geresuspendeerde gewassen kralen (50 μl) over in het antigeenmonster/antilichaammengsel en incubeer 's nachts bij 4 °C terwijl u roteert in een end-over-end mixer. Incubeer de inputmonsters en draai end-over-end bij 4 °C gedurende de nacht om gelijkwaardige omstandigheden te behouden.
- Verwijder na de nachtelijke incubatie de buizen van de rotator en scheid de magnetische kralen met de doelribosomen / RNA (positieve fractie) van het supernatant (negatieve fractie) met behulp van de magnetische standaard gedurende 2,5-3 minuten. Zuig de negatieve fractie op, plaats deze in een verse buis met ronde bodem van 2 ml en leg deze opzij op ijs terwijl u de positieve fractie verwerkt.
- Voeg 500 μL hoge zoutwasbuffer (vanaf stap 3.1.5) toe aan de tube met de positieve fractie en pipetteer voorzichtig om te mengen. Plaats de buis op een magnetische standaard die gedurende 1 minuut op ijs wordt gehouden om de kralen te scheiden. Gooi het supernatant weg en verwijder de buis van de magneet.
- Herhaal stap 3.2.14 voor in totaal drie wasbeurten. Na de laatste wasbeurt, resuspensie van de kralen in 350 μL RNA lysis buffer aangevuld met 3,5 μL 2-mercaptoethanol (BME). Incubeer de buizen bij kamertemperatuur terwijl u gedurende 10 minuten bij 900 tpm mengt in een digitale shaker.
- Scheid de kralen van de oplossing die nu de doelribosomen / RNA bevat met een magnetische standaard gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur. Verzamel de geëlueerde positieve fractie (supernatant) in een verse buis van 1,5 ml en voeg 350 μL 100% ethanol toe. Omkeren om te mengen. Ga verder met de RNA-isolatie.
- Optioneel: Om RNA uit het invoermonster (stap 3.2.5) en de negatieve fractie (stap 3.2.13) te isoleren, brengt u 100 μL van de input en negatieve fracties over naar verse buizen van 1,5 ml. Voeg 350 μL RNA-lysisbuffer aangevuld met 3,5 μL BME toe aan elk monster. Omkeren om te mengen. Voeg 250 μL 100% ethanol toe aan elke buis en keer om om te mengen. Ga verder met de RNA-isolatie.
- RNA-isolatie
- Breng 700 μL van de positieve fractie en, optioneel, de input en/of negatieve fractie over naar een RNA-spinkolom. Volg de instructies van de fabrikant om RNA uit de spinkolom te isoleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een schema van de TRAP- en INTACT-protocollen is weergegeven in figuur 1. Hier wordt de specificiteit van het Cyp17-NuTRAP muismodel voor ovariële stromale / theca-cellen aangetoond door immunofluorescente beeldvorming en RNA-Seq van TRAP-geïsoleerd RNA. Eerst werden immunofluorescentiebeeldvorming van het eGFP-signaal in de eierstok en lokalisatie van het eGFP-signaal naar de theca- en stromale cellen uitgevoerd. In het kort werden 5 μm secties gedeparaffineerd met een xyleen- en ethanolgradiënt. Voor een betere eGFP-signalering werd het eGFP-eiwit gekleurd met behulp van geit anti-GFP primair antilichaam en Alexa 488 ezel anti-geit secundair antilichaam, en de kernen werden gekleurd met DAPI15. De beelden zijn gemaakt met een fluorescentiemicroscoop bij een vergroting van 20x (figuur 2A). Vervolgens werd TRAP uitgevoerd op eierstokken van 4 maanden oude Cyp17-NuTRAP-muizen om ribosoomgebonden RNA specifiek uit de theca / stromale cellen te isoleren. Het TRAP-geïsoleerde RNA (positieve fractie) en het hele weefsel RNA (input) werden gebruikt om gestrande RNA-sequencingbibliotheken te construeren om te sequencen op een sequencer van de volgende generatie. RNA-Seq trimming, alignment, and normalization (DESeq2) werden uitgevoerd, zoals eerder beschreven 7,8. De principal component analysis (PCA) toonde een sterke scheiding van de input en positieve fractie in de eerste component, wat wijst op verschillende transcriptomische profielen (figuur 2B). Er waren 2.009 differentieel tot expressie gebrachte genen tussen de input en positieve fracties, zoals te zien in de vulkaanplot (gepaarde t-test, Benjamini-Hochberg meervoudige testcorrectie FDR < 0,05, vouwverandering >2; Figuur 2C). Van de differentieel tot expressie gebrachte genen kon de verrijking van stromale en theca-celmarkers (Col3a1, Star, Fbn1, C1s) en de uitputting van eicellen (Gdf9, Oosp1, Ooep), granulosa (Amhr2, Serpine2, Eml5), immuuncel (C1qa, C1qb, Fcerg1) en gladde spiercel (Mfap5) genen16 worden waargenomen (figuur 2D).
Figuur 1: Isolatie van celtypespecifieke kernen en mRNA uit het Cyp17-NuTRAP-model met behulp van de INTACT- en TRAP-methoden. (A) De generatie van de Cyp17-NuTRAP lijn wordt bereikt door een NuTRAP flox/flox vrouwtje te kruisen met een Cyp17iCre+/+ mannetje. (B) Schema van de TRAP- en INTACT-methoden om kernen en polysomen te isoleren uit de stromale/theca-cellen van de Cyp17-NuTRAP-muis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Validatie van het Cyp17-NuTRAP muismodel. (A) Immunofluorescentie werd uitgevoerd op de geparaffineerde eierstokken van Cyp17-Cre+/−NuTRAP flox/WT en Cyp17-Cre−/−NuTRAPflox/WT muizen. eGFP-eiwit werd gekleurd met behulp van geit anti-GFP primair antilichaam en Alexa 488 ezel anti-geit secundair antilichaam, en de kernen waren gekleurd met DAPI. De beelden werden gemaakt met een fluorescentiemicroscoop bij een vergroting van 20x. (B-D) Het input- en TRAP-positieve fractie-RNA werd geïsoleerd uit Cyp17-Cre+/−NuTRAPflox/WT muis-eierstokken (n = 4), gebruikt om gestrande RNA-Seq-bibliotheken voor te bereiden, zoals eerder gedaan7, en gesequenced op een gepaarde manier. RNA-Seq trimming, alignment, and normalization (DESeq2) werden uitgevoerd, zoals eerder gedaan 7,8. (B) De principal component analysis (PCA) van alle tot expressie gebrachte genen toonde een scheiding van de TRAP-input en positieve fracties in de eerste component (51,4% verklaarde variantie). (C) Vulkaanplot van differentieel tot expressie gebrachte genen tussen de input en positieve fracties (gepaarde t-test, Benjamini-Hochberg meervoudige testcorrectie FDR < 0,05, vouwverandering >2). (D) De vergelijking van de TRAP-positieve fractie met de input (log2[vouwverandering ([ositieve fractie/input)]) toonde een algehele verrijking van de stromale/theca-celmarkergenen en de uitputting van de markergenen van de eicellen, granulosa, immuun en gladde spiercellen (SMC) in de TRAP-positieve fractie (ratio gepaarde t-test, Benjamini-Hochberg meervoudige testcorrectie FDR < 0,10, n = 4). De balken vertegenwoordigen de gemiddelde log2[vouwverandering (positieve fractie/invoer)] ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het NuTRAP-muismodel6 is een krachtige transgene etiketteringsbenadering voor de gepaarde ondervraging van het transcriptoom en het epigenoom van specifieke celtypen die kunnen worden aangepast aan elk celtype met een beschikbare Cre-driver. Hier demonstreren we de specificiteit van het Cyp17-NuTRAP-muismodel bij het richten op ovariële theca- en stromale cellen. Het Cyp17-NuTRAP-model kan worden gebruikt om de theca- en stromale celspecifieke epigenetische mechanismen die betrokken zijn bij eierstokveroudering, kanker en ziekte verder op te helderen.
Bij het selecteren van een Cre-driver wordt aanbevolen om de celspecificiteit van de Cre-gemedieerde NuTRAP-expressie te valideren met behulp van verschillende orthogonale benaderingen. De Cyp17a1-Cre is constitutief uitgedrukt. Het NuTRAP-model kan ook worden gekruist met induceerbare Cre-lijnen om de voorbijgaande expressie van genen in niet-doelcellen tijdens de ontwikkeling te voorkomen. Aangezien de meeste eierstokcellen zeer gevoelig zijn voor hormonale schommelingen, moet oestruscyclusstadiëring ook worden overwogen17.
De NuTRAP-aanpak heeft veel voordelen in vergelijking met traditionele celsorteertechnieken. Ten eerste zijn celsorteertechnieken afhankelijk van het creëren van eencellige suspensies, die de inductie van ex vivo activeringsartefacten kunnen veroorzaken8. Bovendien is celsortering afhankelijk van celoppervlakmarkers, die kunnen veranderen met de leeftijd of ziektetoestanden, waardoor de vraag rijst of de populaties cellen die worden vergeleken tussen twee experimentele groepen daadwerkelijk gelijkwaardig zijn. Celoppervlakmarkeretikettering is ook afhankelijk van de identificatie van betrouwbare antilichamen voor immunostaining18.
In het afgelopen decennium is er een uitbreiding geweest in single-cell / nuclei transcriptomic 19,20,21,22,23 en epigenomic24,25,26 technieken om de heterogeniteit van celpopulaties te onderzoeken. Hoewel deze benaderingen hebben geleid tot een grotere waardering van cellulaire heterogeniteit, lijden ze vaak aan een gebrek aan gevoeligheid en genomische dekking, wat de diepte van analyses kan beperken. Single-cell transcriptomic (scRNA) -technieken detecteren bijvoorbeeld slechts ~ 1.000-5.000 genen per cel27, terwijl de NuTRAP-techniek die in deze studie wordt gebruikt 14.980 genen detecteerde. Bovendien zijn verschillende scRNA-technieken afhankelijk van 3' of 5' tagging 20,21,22,28,29,30, wat de analyse van specifieke RNA-isovormen die beschikbaar zijn met behulp van de TRAP-seq-methodologie niet mogelijk maakt.
Terwijl eencellige transcriptomics gemeengoed is geworden in de moleculaire biologie (besproken in Aldridge en Teichmann31), is het epigenetische veld achtergebleven. De meeste eencellige epigenomische technieken zijn gebaseerd op de FACS-afzetting van cellen of microfluïdische technieken gevolgd door bibliotheekvoorbereiding van afzonderlijke cellen. Als zodanig is de doorvoer voor eencellige epigenomische technieken over het algemeen lager dan voor de druppelinkapselingsmethoden die gewoonlijk worden gebruikt voor eencellig RNA-Seq32. De recente toevoeging van een single-cell (sc) of single-nuclei (sn) assay voor transponable-accessible chromatine (ATAC-Seq) aan de 10x genomics familie van single-cell oplossingen vertegenwoordigt de eerste druppel-gebaseerde methode die de ondervraging van een epigenomisch eindpunt (chromatine toegankelijkheid) bij single-cell resolutie mogelijk maakt. Multiplexingtechnieken, zoals CoBATCH-Seq24 voor histonmodificaties, hebben de doorvoer drastisch verhoogd, maar niet tot het niveau van druppelgebaseerde benaderingen. Single nuclei methyl-sequencing (snmC-Seq) is uitgevoerd met behulp van fluorescentie-geactiveerde kernen sortering in individuele putten en BS-Seq bibliotheekvoorbereiding25,26. De harde bisulfaatconversie leidt echter tot een schaarse genoombrede dekking, wat grote genomische binning tijdens data-analyse (~ 100 kb) vereist en ervoor zorgt dat de genomische context die nodig is om robuuste wetenschappelijke conclusies te trekken, verloren gaat. Het NuTRAP-muismodel maakt de gevoelige analyse van het epigenoom en transcriptoom van specifieke celtypen mogelijk.
Met betrekking tot de TRAP-procedure zijn er enkele overwegingen om een succesvolle isolatie te garanderen. Eerst moet de eierstok vóór homogenisatie worden gesneden om het externe membraan te scheuren en volledige dissociatie mogelijk te maken. De eierstok is een vezelig weefsel, vooral bij oudere muizen, waardoor het moeilijk is om volledig te homogeniseren. Tijdens de optimalisatie van dit protocol resulteerde agressieve homogenisatie tijdens het TRAP-protocol echter in besmetting van de RNA-isolaten, met zichtbare DNA-banden weergegeven door capillaire elektroforese. Om dit probleem op te lossen, werd 2 mM spermidine opgenomen in de TRAP-homogenisatiebuffer om het kernmembraan33 te stabiliseren. Bovendien hebben we de TRAP-monsters alleen gehomogeniseerd met de losse stamper A om verstoring van het kernmembraan te voorkomen. Het is belangrijk om de RNA-monsters op een Bioanalyzer of TapeStation na isolatie te controleren om een RNA-integriteitsnummer >7 te garanderen voordat u overgaat tot sequencingtoepassingen.
Voor de INTACT-procedure moet de eierstok ook worden gesneden voorafgaand aan homogenisatie. Bovendien hebben we ontdekt dat een korte, lage snelheid spin (200 x g gedurende 1,5 min) na homogenisatie effectief is voor het verwijderen van niet-gedissocieerd weefsel en bloedvaten, zoals eerder werd gedaan 7,14. Als nucleair RNA een gewenst eindpunt is, moet een RNaseremmer worden opgenomen in de INTACT-buffers. Nucleair RNA-Seq of RT-qPCR kan worden gebruikt om de celspecificiteit van de INTACT-isolaties te testen. Streptavidin-kralen hebben een ongelooflijk hoge affiniteit voor biotine, waardoor het moeilijk is om de kralen van biotine + -kernen te scheiden volgens het INTACT-protocol, en dit moet worden overwogen bij het plannen van downstream-toepassingen. Naast het isoleren van celtypespecifieke kernen uit NuTRAP-modellen met behulp van INTACT, kunnen kernen ook worden gesorteerd op basis van eGFP-expressie voor downstream-toepassingen. De INTACT-procedure voor het isoleren van kernen kan worden gebruikt om verschillende eindpunten te beoordelen, waaronder nucleaire transcriptomica, epigenomica en proteomica.
De bovengenoemde technieken zijn geweldige hulpmiddelen voor ovariumverouderingsbeoordelingen. Ovariële veroudering is een zorg, niet alleen vanuit een reproductief perspectief, maar ook vanuit een gezondheidsspanneperspectief. Menopauze, wat het stoppen van de ovariële functie is, wordt geassocieerd met de versnelling van biologische klokken34, en vroege menopauze is geassocieerd met een kortere levensduur en een verhoogd risico op ziekten bij vrouwen35,36. Van eicelveroudering is bekend dat het direct verband houdt met een afname van de ovariële fitheid. Er wordt echter ook aangenomen dat andere celtypen een rol spelen in de afname van de ovariële gezondheidsspanne en een toename van ovariële senescentie en ontsteking37. Een beter begrip van welke cellen betrokken zijn bij dit proces en hoe het te vertragen is de sleutel. Hoewel er onmiskenbare verschillen zijn tussen de menselijke en muriene ovariële dynamiek, blijven muismodellen belangrijke hulpmiddelen om de ovariële biologie te onderzoeken. In deze context kunnen de Cre-NuTRAP-modellen nuttige hulpmiddelen zijn om de meest effectieve celtypedoelen te identificeren voor pogingen om ovariële veroudering en menopauze te vertragen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (NIH) (R01AG070035, R01AG069742, T32AG052363), BrightFocus Foundation (M2020207) en Presbyterian Health Foundation. Dit werk werd ook gedeeltelijk ondersteund door de MERIT award I01BX003906 en een Shared Equipment Evaluation Program (ShEEP) award ISIBX004797 uit de Verenigde Staten (VS) Afdeling Veteranenzaken, Biomedische Laboratorium Onderzoeks- en Ontwikkelingsdienst. De auteurs willen ook het Clinical Genomics Center (OMRF) en Imaging Core Facility (OMRF) bedanken voor hun hulp en instrumentgebruik.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Spermidine | Sigma-Aldrich | 05292-1ML-F | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Scientific | AM9530G | |
| 10% NP-40 | Thermo Scientific | 85124 | |
| 100 mg/mL Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C4859-1ML | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| 30 µm cell strainer | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
| anti-GFP antibody | Abcam | Ab290 | For TRAP and IHC (Rabbit polyclonal to GFP) |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | RNA Lysis Buffer in protocol |
| cOmplete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablet | Roche | 11836170001 | For TRAP Homogenization Buffer |
| Cyp17iCre mouse model | The Jackson Laboratory | 28547 | B6;SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J |
| DynaMag-2 magnet | Invitrogen | 12321D | |
| Genotyping Primers | IDT | Custom | Generic Cre - Jackson Laboratory protocol 22392, Primers: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339 |
| Cyp17iCre - Jackson Laboratory protocol 30847, Primers: 21218, 31704, 31705, 35663 | |||
| NuTRAP - Jackson Laboratory protocol 21509, Primers: 21306, 24493, 32625, 32626 | |||
| Halt Protease Inhibitor cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861278 | For NPB Buffer |
| M-280 Streptavidin Dynabeads | Invitrogen | 11205D | 2.8 µm bead diameter |
| MixMate | Eppendorf | 5353000529 | |
| Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma-Aldrich | Nuc101 | Contains Nuclei Lysis Buffer and Nuclei Storage Buffer |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9760G | |
| 2M KCl | Thermo Scientific | AM9640G | |
| 0.5 M EDTA | Thermo Scientific | AM9260G | |
| 0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
| NuTRAP mouse model | The Jackson Laboratory | 29899 | B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J |
| Pierce DTT No-Weigh Format | Thermo Scientific | A39255 | |
| Protein G Dynabeads | ThermoFisher | 10004D | For TRAP |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| Sodium Heparin | Fisher Scientific | BP2425 | |
| Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| VWR Tube Rotator | Fisher Scientific | NC9854190 |
References
- Broekmans, F. J., Soules, M. R., Fauser, B. C. Ovarian aging: Mechanisms and clinical consequences. Endocrine Reviews. 30 (5), 465-493 (2009).
- Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: Theory, technical considerations, and future applications. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).
- Morris, M. E., et al. A single-cell atlas of the cycling murine ovary. eLife. 11, 77239 (2022).
- Kendrick, H., et al. Transcriptome analysis of mammary epithelial subpopulations identifies novel determinants of lineage commitment and cell fate. BMC Genomics. 9, 591 (2008).
- Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. Does FACS perturb gene expression. Cytometry A. 87 (2), 166-175 (2015).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).
- Ocanas, S. R., et al. Minimizing the ex vivo confounds of cell-isolation techniques on transcriptomic and translatomic profiles of purified microglia. eNeuro. 9 (2), (2022).
- Raus, A. M., Nelson, N. E., Fuller, T. D., Ivy, A. S. 34;SIT" with Emx1-NuTRAP mice: Simultaneous INTACT and TRAP for paired transcriptomic and epigenetic sequencing. Current Protocols. 2 (10), 570 (2022).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Translatomic response of retinal Muller glia to acute and chronic stress. Neurobiology Disease. 175, 105931 (2022).
- Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), 13259 (2020).
- Briley, S. M., et al. Reproductive age-associated fibrosis in the stroma of the mammalian ovary. Reproduction. 152 (3), 245-260 (2016).
- Umehara, T., et al. Female reproductive life span is extended by targeted removal of fibrotic collagen from the mouse ovary. Science Advances. 8 (24), (2022).
- Lopez-Sanchez, N., Frade, J. M. Cell cycle analysis in the vertebrate brain using immunolabeled fresh cell nuclei. Bio-Protocol. 3 (22), 973 (2013).
- Saccon, T. D., et al. Primordial follicle reserve, DNA damage and macrophage infiltration in the ovaries of the long-living Ames dwarf mice. Experimental Gerontology. 132, 110851 (2020).
- Kinnear, H. M., et al. The ovarian stroma as a new frontier. Reproduction. 160 (3), 25-39 (2020).
- Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6, 5 (2020).
- Tighe, R. M., et al. Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American Thoracic Society workshop report. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61 (2), 150-161 (2019).
- Zhang, X., et al. Comparative analysis of droplet-based ultra-high-throughput single-cell RNA-Seq systems. Molecular Cell. 73 (1), 130-142 (2019).
- Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049 (2017).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Prakadan, S. M., Shalek, A. K., Weitz, D. A. Scaling by shrinking: Empowering single-cell 'omics' with microfluidic devices. Nature Reviews Genetics. 18 (6), 345-361 (2017).
- Wang, Q., et al. CoBATCH for high-throughput single-cell epigenomic profiling. Molecular Cell. 76 (1), 206-216 (2019).
- Luo, C., et al. Robust single-cell DNA methylome profiling with snmC-seq2. Nature Communications. 9, 3824 (2018).
- Liu, H., et al. DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution. Nature. 598 (7879), 120-128 (2021).
- Yamawaki, T. M., et al. Systematic comparison of high-throughput single-cell RNA-seq methods for immune cell profiling. BMC Genomics. 22 (1), 66 (2021).
- Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77 (2016).
- Natarajan, K. N. Single-cell tagged reverse transcription (STRT-Seq). Methods in Molecular Biology. 1979, 133-153 (2019).
- Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
- Aldridge, S., Teichmann, S. A. Single cell transcriptomics comes of age. Nature Communications. 11, 4307 (2020).
- Clark, S. J., Lee, H. J., Smallwood, S. A., Kelsey, G., Reik, W. Single-cell epigenomics: Powerful new methods for understanding gene regulation and cell identity. Genome Biology. 17, 72 (2016).
- Christensson, E., Lewan, L. The use of spermidine for the isolation of nuclei from mouse liver. Studies of purity and yield during different physiological conditions. Zeitschrift für Naturforschung. Section C, Biosciences. 29 (5-6), 267-271 (1974).
- Levine, M. E., et al.
- Ossewaarde, M. E., et al. Age at menopause, cause-specific mortality and total life expectancy. Epidemiology. 16 (4), 556-562 (2005).
- Wellons, M., Ouyang, P., Schreiner, P. J., Herrington, D. M., Vaidya, D. Early menopause predicts future coronary heart disease and stroke: the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis. Menopause. 19 (10), 1081-1087 (2012).
- Camaioni, A., et al. The process of ovarian aging: It is not just about oocytes and granulosa cells. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 39 (4), 783-792 (2022).
