Summary
בפרוטוקול זה, שיטת טיהור זיקה ריבוזום מתרגם (TRAP) ובידוד גרעינים המתויגים בסוגי תאים ספציפיים (INTACT) הותאמו לחקירה זוגית של שעתוק השחלות הספציפי לתא ואפיגנום באמצעות מודל עכבר NuTRAP שחצו לקו עכבר Cyp17a1-Cre.
Abstract
הערכת שינויים אפיגנומיים ושעתוק ספציפיים לסוג התא הם המפתח להבנת הזדקנות השחלות. לשם כך, האופטימיזציה של שיטת טיהור זיקה ריבוזום מתרגם (TRAP) ובידוד גרעינים המתויגים בסוגי תאים ספציפיים (INTACT) בוצעה לצורך חקירה זוגית עוקבת של תעתיק השחלות והאפיגנום הספציפיים לתא באמצעות מודל עכבר NuTRAP מהונדס חדשני. הביטוי של אלל NuTRAP נמצא תחת שליטה של קלטת STOP floxed וניתן לכוון אותו לסוגי תאי שחלה ספציפיים באמצעות קווי Cre ספציפיים למקדם. מכיוון שמחקרים אחרונים קשרו תאי סטרומה בשחלות בהנעת פנוטיפים של הזדקנות מוקדמת, מערכת הביטוי NuTRAP התמקדה בתאי סטרומה באמצעות דרייבר Cyp17a1-Cre. השראת מבנה NuTRAP הייתה ספציפית לפיברובלסטים סטרומה בשחלות, והתקבלו מספיק DNA ו-RNA למחקרי ריצוף משחלה יחידה. ניתן להשתמש במודל NuTRAP ובשיטות המוצגות כאן כדי לחקור כל סוג תא שחלה עם קו Cre זמין.
Introduction
השחלות הן שחקניות מרכזיות בהזדקנות סומטית1, עם תרומות שונות מאוכלוסיות תאים ספציפיות. ההטרוגניות התאית של השחלה מקשה על פירוש התוצאות המולקולריות מבדיקות שחלה שלמות בתפזורת. הבנת התפקיד של אוכלוסיות תאים ספציפיות בהזדקנות השחלות היא המפתח לזיהוי הגורמים המולקולריים האחראים לפוריות ולירידה בבריאות אצל נשים מזדקנות. באופן מסורתי, ההערכה הרב-אומית של סוגי תאי שחלה ספציפיים הושגה על ידי טכניקות כגון מיקרודיסקציה לייזר2, גישות חד-תאיות3 או מיון תאים4. עם זאת, מיקרודיסקציה יכולה להיות יקרה וקשה לביצוע, ומיון תאים יכול לשנות פרופילים פנוטיפיים תאיים5.
גישה חדשנית להערכת פרופילים אפיגנומיים ושעתוק ספציפיים לסוג תאי השחלות משתמשת במודל העכבר NuTRAP (ראשי תיבות של Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purification). מודל NuTRAP מאפשר בידוד של חומצות גרעין ספציפיות לסוג התא ללא צורך במיון תאים באמצעות שיטות טיהור הזיקה: תרגום טיהור זיקה ריבוזומים (TRAP) ובידוד גרעינים המסומנים בסוגי תאים ספציפיים (INTACT)6. הביטוי של אלל NuTRAP נמצא תחת שליטה של קלטת STOP floxed וניתן לכוון אותו לסוגי תאי שחלה ספציפיים באמצעות קווי Cre ספציפיים למקדם. על ידי חציית עכבר NuTRAP עם קו Cre ספציפי לסוג התא, הסרת קלטת STOP גורמת לתיוג eGFP של הקומפלקס הריבוזומלי ותיוג ביוטין/mCherry של הגרעין באופן תלוי Cre6. לאחר מכן ניתן להשתמש בטכניקות TRAP ו- INTACT כדי לבודד mRNA ו- DNA גרעיני מסוג התא המעניין ולהמשיך לניתוחים שעתוק ואפיגנומיים.
מודל NuTRAP שימש ברקמות שונות, כגון רקמת שומן6, רקמת מוח 7,8,9 ורשתית10, כדי לחשוף שינויים אפיגנומיים ושעתוק ספציפיים לסוג התא שעשויים שלא להיות מזוהים בהומוגנט של רקמה שלמה. היתרונות של גישת NuTRAP על פני טכניקות מסורתיות של מיון תאים כוללים: 1) מניעת ממצאים אקטיבציוניים של ex vivo 8, 2) הצורך הממוזער בציוד מיוחד (כלומר, ממייני תאים), ו -3) התפוקה המוגברת והעלות המופחתת של ניתוחים ספציפיים לסוג התא. בנוסף, היכולת לבודד דנ"א ורנ"א ספציפיים לסוג התא מעכבר בודד מאפשרת ניתוחים זוגיים המגבירים את הכוח הסטטיסטי. מכיוון שמחקרים אחרונים קשרו תאי סטרומה בשחלות בהנעת פנוטיפים של הזדקנות מוקדמת 11,12,13, כיוונו את מערכת הביטוי NuTRAP לתאי סטרומה ותקה באמצעות דרייבר Cyp17a1-Cre. כאן, אנו מראים כי השראת מבנה NuTRAP היא ספציפית לתאי סטרומה ותקה בשחלות, ומספיק DNA ו- RNA למחקרי ריצוף מתקבלים משחלה אחת. ניתן להשתמש במודל NuTRAP ובשיטות המוצגות כאן כדי לחקור כל סוג תא שחלה עם כל קו Cre זמין.
ליצירת קו עכברי NuTRAP ספציפי לסוג התא, אלל התיוג והתרגום הגרעיני של טיהור זיקה ריבוזום (NuTRAP) כולל קודון STOP floxed השולט בביטוי של BirA, פפטיד זיהוי ליגאז ביוטין (BLRP) המתויג mCherry/mRANGAP1 ו-eGFP/L10a. כאשר חוצים אותו עם קו Cre ספציפי לסוג התא, הביטוי של קלטת NuTRAP מתייג את החלבון הגרעיני mRANGAP1 עם ביוטין/mCherry ואת החלבון הריבוזומלי L10a עם eGFP באופן תלוי Cre. זה מאפשר בידוד של גרעינים ו-mRNA מסוגי תאים ספציפיים ללא צורך במיון תאים. ניתן להתאים אתNuTRAP flox/flox עם Cre ספציפי לסוג התא הרלוונטי לסוגי תאי השחלות כדי להעריך זאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים בקרן המחקר הרפואי של אוקלהומה (OMRF). עכברי הורים נרכשו ממעבדת ג'קסון (בר הרבור, ME) וגודלו ושוכנו בתנאי SPF בסביבת מחסום HEPA במחזור אור/חושך של 14 שעות/10 שעות (אורות דולקים בשעה 6:00 בבוקר) ב- OMRF.
הערה: בהדגמה זו, אנו משתמשים בזכר Cyp17iCre+/−(Strain # 028547, The Jackson Laboratory) בשילוב עם נקבת NuTRAP (זן # 029899, מעבדת ג'קסון). צאצאי Cyp17-NuTRAP הרצויים (Cyp17iCre+/−; NuTRAPflox/WT) יבטא את אלל NuTRAP תחת שליטתו של מקדם Cyp17a1 בתאי סטרומה בשחלות. להכנת כתב היד השתמשנו בעכברות Cyp17-NuTRAP בנות 4 חודשים (n = 4). DNA הופק מדגימות ניקוב אוזניים של עכבר עבור גנוטיפ כדי לאשר את התורשה של טרנסגנים Cyp17iCre ו- NuTRAP ועבור זיהוי PCR של 1) Cre גנרי, 2) Cyp17iCre, ו -3) NuTRAP floxed באמצעות הפריימרים המפורטים בטבלת החומרים, כפי שתואר קודם לכן 7,8.
1. דיסקציה שחלתית עכבר
- לבצע המתת חסד עכבר בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי חיים ואישור המוסד, ולאחר מכן איסוף השחלות.
- לנתח את השחלות כדי להסיר כל רקמת שומן או חלקים של הביציות שעשויים להיות מחוברים לרקמת השחלה לפני הצבת השחלות בצינורות עם חיץ. המשך מיד לטכניקות TRAP או INTACT.
הערה: פרוטוקול זה לא מוטב לשימוש עם רקמות קפואות. מומלץ להשתמש בשחלה אחת מאותו עכבר עבור כל טכניקה לצורך ניתוח סטטיסטי עתידי.
2. בידוד גרעינים מסוגי תאי שחלה ספציפיים
- הכנת חיץ
- חיץ טיהור גרעיני (NPB): כדי להכין 100 מ"ל של NPB, לשלב 2 מ"ל של 1 M HEPES (ריכוז סופי: 20 mM HEPES), 0.8 מ"ל של 5 M NaCl (40 mM NaCl), 4.5 מ"ל של 2 M KCl (90 mM KCl), 0.4 מ"ל של 0.5 M EDTA (2 mM EDTA), 0.1 מ"ל של 0.5 M EGTA (0.5 mM EGTA), ו-92.2 מ"ל מים נטולי נוקלאז. יש ליטול תוסף עם מעכב פרוטאז 1x ביום בידוד הגרעינים.
הערה: NPB יכול להיות מוכן ללא מעכב פרוטאז מראש ונמשך עד 3 שבועות ב 4 ° C. - Nuclei lysis buffer (שלם): תוספת מאגר גרעיני ליזה עם מעכב פרוטאז 1x ביום בידוד גרעינים.
- חיץ טיהור גרעיני (NPB): כדי להכין 100 מ"ל של NPB, לשלב 2 מ"ל של 1 M HEPES (ריכוז סופי: 20 mM HEPES), 0.8 מ"ל של 5 M NaCl (40 mM NaCl), 4.5 מ"ל של 2 M KCl (90 mM KCl), 0.4 מ"ל של 0.5 M EDTA (2 mM EDTA), 0.1 מ"ל של 0.5 M EGTA (0.5 mM EGTA), ו-92.2 מ"ל מים נטולי נוקלאז. יש ליטול תוסף עם מעכב פרוטאז 1x ביום בידוד הגרעינים.
- יצירת תרחיף הגרעינים
הערה: הדגימות צריכות להישמר על קרח בכל עת, אלא אם צוין אחרת.- יש לאסוף שחלה אחת מעכבר Cyp17-NuTRAP (או מ-Cre-NuTRAP רלוונטי אחר) ב-500 מיקרוליטר של מאגר גרעיני ליזה (שלם). חותכים את השחלה לשמונה חלקים בתוך החיץ באמצעות מספריים זעירים הנפתחים מעצמם.
- השתמש קצות פיפטה רחב משעמם להעביר את השחלה טחון 500 μL של חיץ ליזיס לתוך להקפיץ homogenizer על קרח. הומוגניזציה השחלה 10x-20x עם pestle רופף A. להוסיף 400 μL של חיץ ליזיס הומוגנייזר Dounce, כביסה pestle A.
- הומוגניזציה השחלה עם pestle הדוק B 10x-20x. מוסיפים 1,000 מיקרוליטר של חיץ ליזיס, שטיפת מזיקים B. מעבירים את ההומוגנאט (1.9 מ"ל) לצינור בעל תחתית עגולה בנפח 2 מ"ל.
- צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 1.5 דקות ב 4 ° C כדי להסיר רקמות לא מנותקות וכלי דם14. הסופרנאטנט מכיל את הגרעינים; להשליך את הגלולה של רקמה לא מנותקת.
- לאחר הרטבה מוקדמת של מסננת תאים של 30 מיקרומטר עם 100 מיקרוליטר של חיץ ליזיס, ומסננים את הסופרנאטנט דרך מסננת התא לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל. לאחר מכן, העבירו את התערובת המכילה גרעינים לצינור בעל תחתית עגולה של 2 מ"ל.
- צנטריפוגה את הדגימה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, ו להשליך את supernatant. הגלולה מכילה גרעינים.
- יש להשהות מחדש את הגלולה הגרעינית ב-250 מיקרוליטר של חיץ ליזה קר כקרח על ידי מערבול קצר במהירות בינונית עד גבוהה. הבא את עוצמת הקול עד 1.75 מ"ל על-ידי הוספת 1.5 מ"ל של מאגר ליזיס. מערבבים בעדינות, ומניחים את המתלה הגרעיני על קרח למשך 5 דקות.
- גלולה את הגרעינים על ידי צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. יש להשליך בזהירות את הסופרנאטנט מבלי להפריע לגלולה הגרעינית. השהה מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של מאגר אחסון קר כקרח, ומערבל לזמן קצר כדי להשהות מחדש לחלוטין את הגלולה הגרעינית.
- שמור 10% מהגלולה המרחפת מחדש (20 μL) כדגימת גרעיני קלט לניתוחים במורד הזרם.
- קח את גלולת הגרעינים המרחפים מחדש, והשלם את הנפח ל -2.0 מ"ל עם NPB קר כקרח. המשך לבודד את הגרעינים המסומנים באמצעות שיטת הטיהור מבוססת זיקה INTACT.
- בידוד גרעינים המתויגים בסוגי תאים ספציפיים (INTACT)
- מערבבים את חרוזי הסטרפטאבידין בבקבוקון במשך 30 שניות במהירות בינונית כדי להבטיח שהם מושהים מחדש במלואם. הוסף 30 μL של חרוזים מרחפים עבור כל דגימה לתוך צינור 2 מ"ל תחתית עגולה (חרוזים עבור עד 10 דגימות ניתן לשטוף בצינור אחד), להוסיף 1 מ"ל של NPB, ולהשהות היטב על ידי pipetting.
- הניחו את הצינור על המדף המגנטי למשך דקה אחת כדי להפריד בין החרוזים. השליכו את הסופרנטנט, והוציאו את הצינור מהמגנט. להשעות מחדש את החרוזים המגנטיים שטופים ב 1 מ"ל של NPB.
- חזרו על שלב השטיפה במשך שלוש כביסות בסך הכל. לאחר השטיפה הסופית, השהה מחדש את החרוזים בנפח הראשוני של NPB (30 μL לדגימה).
- הוסף 30 μL של חרוזים שטופים להשעיה גרעינית 2 מ"ל משלב 2.2.10. מרחפים היטב את תערובת גרעיני החרוזים על ידי פיפטינג והיפוך עדין של הצינור.
- מניחים את הצינורות על מיקסר מסתובב בחדר קר או מקרר למשך 30 דקות במהירות נמוכה. לדגור על דגימות הקלט ללא חרוזים באותם תנאים.
- מניחים את הצינורות עם התרחיף הגרעיני והחרוזים על המגנט, ומפרידים את גרעיני הביוטינילציה הקשורים לחרוזי סטרפטווידין (חלק חיובי) מהחלק השלילי של הגרעינים. הניחו לחרוזים להיפרד על המגנט למשך 3 דקות.
- מוציאים את הסופרנטנט, מעבירים את החלק השלילי לצינור טרי של 2.0 מ"ל, ושומרים על קרח. עבור כל צינור שבר חיובי, הסר את הצינור מהמגנט, והשהה מחדש את התוכן ב -1 מ"ל של NPB.
- מניחים את הצינור על המגנט למשך דקה אחת, ומשליכים את הסופרנטנט. הסר את הצינור מהמגנט, והשהה מחדש את תערובת גרעיני החרוזים שנשטפו ב -1 מ"ל של NPB.
- חזור על שלב 2.3.8 עבור שלוש כביסות בסך הכל. לאחר השלמת שלוש שטיפות, להשעות מחדש את תערובת גרעיני חרוזי החלק החיובי ב 30 μL של NPB.
- עבור כל צינור שבר שלילי, צנטריפוגה את המתלה הגרעיני משלב 2.3.7 ב 500 x גרם במשך 7 דקות ב 4 ° C. בזהירות לשאוף ולהשליך את supernatant. השהה מחדש את גלולת גרעיני השבר השלילי ב- 30 μL של NPB.
- אחסנו את הגרעינים מהקלט (שלב 2.2.9), מהשבר השלילי (שלב 2.3.10) ומהשבר החיובי (שלב 2.3.9) במקפיא של -80°C עד שיהיו מוכנים לבידוד DNA גרעיני או RNA.
הערה: אין להקפיא את הגרעינים עבור פרוטוקולים הדורשים גרעינים שלמים כקלט (כלומר, בדיקה עבור כרומטין, כרומטין נגיש למשקעים).
3. בידוד mRNA מסוגי תאי שחלה ספציפיים
- הכנת המאגרים
- בסיס חיץ מלכודת: הכינו 100 מ"ל של בסיס חיץ TRAP על ידי שילוב של 78.8 מ"ל מים נטולי RNase, 5 מ"ל של 1 M Tris-HCl (ריכוז סופי: 50 mM Tris [pH 7.5]), 5 מ"ל של 2 M KCl (100 mM KCl), 1.2 מ"ל של 1 M MgCl 2 (12 mM MgCl2), ו-10 מ"ל של 10% NP-40 (1% NP-40). יש לאחסן ב-4°C למשך עד חודש אחד.
- בסיס חיץ מלח גבוה: הכינו 100 מ"ל של בסיס חיץ מלח גבוה על ידי שילוב של 68.8 מ"ל מים נטולי RNase, 5 מ"ל של 1 M Tris-HCl (ריכוז סופי: 50 mM Tris [pH 7.5]), 15 מ"ל של 2 M KCl (300 mM KCl), 1.2 מ"ל של 1M MgCl 2 (12 mM MgCl2), ו-10 מ"ל של 10% NP-40 (1% NP-40). יש לאחסן ב-4°C למשך עד חודש אחד.
- חיץ הומוגניזציה TRAP (מלא): הכינו 1.5 מ"ל לכל דגימה ביום איסוף הרקמות. הכן 10 מ"ל של מאגר הומוגניזציה של TRAP על ידי שילוב של 10 מ"ל של בסיס מאגר TRAP (משלב 3.1.1) עם 10 μL של 100 מ"ג/מ"ל ציקלוהקסימיד (ריכוז סופי: 100 מיקרוגרם/מ"ל ציקלוהקסימיד), 10 מ"ג נתרן הפרין (1 מ"ג/מ"ל נתרן הפרין), 20 מיקרוליטר של 0.5 M DTT (1 mM DTT), 50 μL של 40 U/μL מעכב RNase (200 U/mL RNase inhibitor), 200 μL של 0.1 M ספרמידין (2 mM זרע), וטבליה אחת ללא מעכבי פרוטאז ללא EDTA (1x).
- חיץ שטיפת מלח נמוך (שלם): יש לייצר 1.5 מ"ל לדגימה ביום איסוף הרקמות. כדי ליצור 10 מ"ל של חיץ שטיפת מלח נמוך, ערבבו 10 מ"ל של בסיס חיץ TRAP (משלב 3.1.1) עם 10 מיקרוליטר של 100 מ"ג/מ"ל ציקלוהקסימיד (100 מיקרוגרם/מ"ל ציקלוהקסימיד) ו-20 מיקרוליטר של 0.5 מ"מ DTT (1 מ"מ DTT).
- חיץ שטיפת מלח גבוה (מלא): יש לייצר 1.5 מ"ל לדגימה ביום השני לבידוד TRAP. כדי ליצור 10 מ"ל של חיץ שטיפת מלח גבוה, שלב 10 מ"ל של בסיס חיץ מלח גבוה (משלב 3.1.2) עם 10 μL של 100 מ"ג / מ"ל cycloheximide ו 20 μL של 0.5 M DTT.
- ביצוע טיהור זיקה ריבוזומי מתרגם (TRAP)
- אסוף את השחלה השנייה מעכבר Cyp17-NuTRAP (או מ- Cre-NuTRAP רלוונטי אחר) והנח אותה בצינור ללא RNase בנפח 1.5 מ"ל המכיל 100 μL של מאגר הומוגניזציה של TRAP קר כקרח (משלב 3.1.3). חותכים את השחלה לשמונה חלקים בתוך החיץ באמצעות מספריים זעירים הנפתחים מעצמם.
- השתמש בקצוות רחבים כדי להעביר את השחלה ואת 100 μL של חיץ הומוגניזציה לתוך זכוכית להקפיץ הומוגנייזר. הומוגניזציה 10x-20x עם המזיק הרופף A. הוסף 400 μL של חיץ הומוגניזציה TRAP, שטיפת מזיק A.
- מעבירים את ההומוגנט לצינור עגול בנפח 2 מ"ל. שטפו את ההומוגנייזר Dounce עם 1 מ"ל נוספים של מאגר הומוגניזציה TRAP, והעבירו את נפח השטיפה לצינור בעל תחתית עגולה של 2 מ"ל.
- צנטריפוגה הומוגנט ב 12,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. מעבירים את הסופרנאטנט המפונה לצינור טרי בנפח 2 מ"ל בעל תחתית עגולה. השליכו את הכדור.
- מעבירים 100 μL של ההומוגנט המפונה לצינור טרי בעל תחתית עגולה של 2 מ"ל, ושומרים כקלט על קרח.
- יש לדגור על שארית ההומוגנט המפונה (משלב 3.2.4) עם נוגדן אנטי-GFP (5 מיקרוגרם/מ"ל) למשך שעה אחת ב-4°C תוך סיבוב מקצה לקצה. לדגור על דגימת הקלט באותם תנאים.
- ב-15 הדקות האחרונות של הדגירה, שטפו את החרוזים המגנטיים של חלבון G במאגר שטיפת המלח הנמוך באמצעות השלבים הבאים (3.2.8-3.2.11).
- מערבלים את בקבוקון החרוזים המגנטיים של חלבון G למשך 30 שניות כדי להשהות מחדש לחלוטין. מעבירים 50 μL של חלבון G חרוזים מגנטיים עבור כל דגימה (עד 10 דגימות ניתן לשטוף בצינור אחד) לתוך 2 מ"ל תחתית עגולה.
- מוסיפים 500 μL של חיץ שטיפה דל מלח לחרוזים, ופיפטה בעדינות לערבוב. הניחו את הצינור במעמד מגנטי למשך דקה אחת כדי לאסוף את החרוזים כנגד דופן הצינור. הסר והשליך את הסופר-נטנט.
- הסר את הצינור מהמעמד המגנטי והוסף 1 מ"ל של חיץ שטיפת מלח נמוך לצינור. פיפטה בעדינות לערבב. הניחו את הצינור במעמד מגנטי למשך דקה אחת כדי לאסוף את החרוזים כנגד דופן הצינור. הסר והשליך את הסופר-נטנט.
- חזור על שלב 3.2.10 עבור שלוש כביסות בסך הכל. לאחר השטיפה הסופית, הסר את הצינור מהמדף המגנטי, והשהה מחדש את החרוזים בנפח ההתחלתי של חיץ שטיפת מלח נמוך (50 מיקרוליטר לדגימה).
- מעבירים את החרוזים השטופים המרחפים (50 μL) לתערובת דגימת האנטיגן/נוגדנים, ודגרים ב-4°C למשך הלילה תוך כדי סיבוב במיקסר מקצה לקצה. דגרו על דגימות הקלט המסתובבות מקצה לקצה ב-4°C למשך הלילה כדי לשמור על תנאים שווים.
- לאחר הדגירה בלילה, הסר את הצינורות מהמסובב, והפרד את החרוזים המגנטיים עם ריבוזומי המטרה / RNA (חלק חיובי) מהסופרנאטנט (שבר שלילי) באמצעות המעמד המגנטי למשך 2.5-3 דקות. שאפו את החלק השלילי, הניחו אותו בצינור עגול טרי של 2 מ"ל, והניחו אותו בצד על קרח תוך כדי עיבוד החלק החיובי.
- הוסף 500 μL של חיץ שטיפת מלח גבוה (משלב 3.1.5) לצינור עם החלק החיובי, ופיפטה עדינה כדי לערבב. הניחו את הצינור על מעמד מגנטי שנשמר על קרח למשך דקה אחת כדי להפריד בין החרוזים. השליכו את הסופרנטנט, והוציאו את הצינור מהמגנט.
- חזור על שלב 3.2.14 עבור שלוש כביסות בסך הכל. לאחר השטיפה הסופית, יש להשהות מחדש את החרוזים ב-350 מיקרוליטר של חיץ RNA ליזה בתוספת 3.5 מיקרוליטר של 2-מרקפטואתנול (BME). דוגרים על הצינורות בטמפרטורת החדר תוך ערבוב במשך 10 דקות ב-900 סל"ד בשייקר דיגיטלי.
- הפרידו את החרוזים מהתמיסה שמכילה כעת את ריבוזום/רנ"א המטרה עם מעמד מגנטי למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. לאסוף את החלק החיובי המדולל (supernatant) בצינור טרי 1.5 מ"ל, ולהוסיף 350 μL של 100% אתנול. הפוך כדי לערבב. המשך לבידוד RNA.
- אופציונלי: כדי לבודד RNA מדגימת הקלט (שלב 3.2.5) ומחלק שלילי (שלב 3.2.13), העבר 100 μL של הקלט ושברים שליליים לצינורות טריים של 1.5 מ"ל. הוסף 350 μL של חיץ RNA lysis בתוספת 3.5 μL של BME לכל דגימה. הפוך כדי לערבב. מוסיפים 250 μL של 100% אתנול לכל צינור, והופכים כדי לערבב. המשך לבידוד RNA.
- בידוד RNA
- העבר 700 μL של החלק החיובי, ולחלופין, את הקלט ו / או החלק השלילי לעמודת ספין RNA. עקוב אחר הוראות היצרן כדי לבודד RNA מעמודת הסחיטה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סכמה של פרוטוקולי TRAP ו-INTACT מוצגת באיור 1. כאן הספציפיות של מודל העכבר Cyp17-NuTRAP לתאי סטרומה/תקה בשחלות מודגמת על ידי הדמיה אימונופלואורסצנטית ו-RNA-Seq מ-RNA מבודד TRAP. ראשית, בוצעה הדמיה אימונופלואורסצנטית של אות eGFP בשחלה ולוקליזציה של אות eGFP לתאי התקה והסטרומה. בקצרה, 5 מקטעים מיקרומטר היו deparaffinized עם xylene ו אתנול הדרגתי. לאיתות eGFP טוב יותר, חלבון ה-eGFP הוכתם באמצעות נוגדן ראשוני נגד GFP עז ונוגדן משני נגד חמור אלקסה 488, והגרעינים הוכתמו ב-DAPI15. התמונות צולמו במיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של פי 20 (איור 2A). לאחר מכן, TRAP בוצע על שחלות מעכברי Cyp17-NuTRAP בני 4 חודשים כדי לבודד RNA הקשור לריבוזום במיוחד מתאי theca/stromal. הרנ"א המבודד TRAP (מקטע חיובי) והרנ"א של הרקמה כולה (קלט) שימשו לבניית ספריות ריצוף RNA תקועות לריצוף על רצף מהדור הבא. בוצעו חיתוך, יישור ונורמליזציה של RNA-Seq (DESeq2), כפי שתואר קודם לכן 7,8. ניתוח הרכיבים העיקריים (PCA) הראה הפרדה חזקה בין הקלט לשבר החיובי ברכיב הראשון, מה שמרמז על פרופילים שעתוק נפרדים (איור 2B). היו 2,009 גנים המבוטאים באופן דיפרנציאלי בין הקלט לבין השברים החיוביים, כפי שניתן לראות בחלקת הר הגעש (מבחן t זוגי, תיקון בדיקות מרובות של בנימיני-הוכברג FDR < 0.05, שינוי קיפול >2; איור 2C). מבין הגנים המבוטאים באופן דיפרנציאלי, ניתן היה להבחין בהעשרת סמני תאי סטרומה ותקה (Col3a1, Star, Fbn1, C1s) ודלדול הביציות (Gdf9, Oosp1, Ooep), גרנולוזה (Amhr2, Serpine2, Eml5), תאי מערכת החיסון (C1qa, C1qb, Fcerg1) ותאי שריר חלק (Mfap5)גנים 16 (איור 2D).
איור 1: בידוד של גרעינים ו-mRNA ספציפיים לסוג התא ממודל Cyp17-NuTRAP באמצעות השיטות INTACT ו-TRAP. (A) יצירת קו Cyp17-NuTRAP מושגת על ידי חציית נקבתNuTRAP flox/flox עם זכר Cyp17iCre+/+ . (B) סכמה של מתודולוגיות TRAP ו-INTACT לבידוד גרעינים ופוליזומים מתאי סטרומה/תקה של עכבר Cyp17-NuTRAP. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: אימות מודל העכבר Cyp17-NuTRAP. (A) אימונופלואורסנציה בוצעה בשחלות הפרפין של עכברי Cyp17-Cre+/−NuTRAP flox/WT ו-Cyp17-Cre−/−NuTRAPflox/WT. חלבון eGFP הוכתם באמצעות נוגדן ראשוני נגד GFP עז ונוגדן משני נגד חמור אלקסה 488, והגרעינים הוכתמו ב- DAPI. התמונות צולמו במיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של פי 20. (ב-ד) RNA השבר החיובי קלט ו- TRAP בודד משחלות עכבר Cyp17-Cre+/−NuTRAPflox/WT (n = 4), המשמש להכנת ספריות RNA-Seq תקועות,כפי שנעשה בעבר 7, ורוצף באופן זוגי. בוצע חיתוך, יישור ונורמליזציה של RNA-Seq (DESeq2), כפי שנעשה בעבר 7,8. (B) ניתוח הרכיבים העיקריים (PCA) של כל הגנים המבוטאים הראה הפרדה בין קלט ה-TRAP לבין שברים חיוביים ברכיב הראשון (51.4% הסבירו שונות). (C) תרשים הר געש של גנים המבוטאים באופן דיפרנציאלי בין הקלט לבין שברים חיוביים (מבחן t זוגי, תיקון בדיקות מרובות בנג'מיני-הוכברג FDR < 0.05, שינוי קיפול >2). (D) ההשוואה של המקטע החיובי TRAP לקלט (log2[fold change ([ositive fraction/Input)]) הראתה העשרה כוללת של הגנים של סמן תאי סטרומה/תקה ודלדול הגנים של סמן הביציות, הגרנולוסה, מערכת החיסון ותאי השריר החלק (SMC) בחלק החיובי TRAP (יחס זוגי t-test, Benjamini-Hochberg multiple testing correction FDR < 0.10, n = 4). העמודות מייצגות את הממוצע log2[שינוי קיפול (שבר/קלט חיובי)] ± SEM. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עכבר NuTRAP מודל6 הוא גישת תיוג מהונדס רבת עוצמה לחקירה זוגית של התמליל והאפיגנום מסוגי תאים ספציפיים שניתן להתאים לכל סוג תא עם מנהל התקן Cre זמין. כאן, אנו מדגימים את הספציפיות של מודל העכבר Cyp17-NuTRAP בהתמקדות בתאי תקה וסטרומה בשחלות. ניתן להשתמש במודל Cyp17-NuTRAP כדי להבהיר עוד יותר את המנגנונים האפיגנטיים הספציפיים לתאי תקה וסטרומה המעורבים בהזדקנות השחלות, סרטן ומחלות.
בעת בחירת מנהל התקן Cre, מומלץ לאמת את ספציפיות התא של ביטוי NuTRAP בתיווך Cre באמצעות מספר גישות אורתוגונליות. Cyp17a1-Cre בא לידי ביטוי באופן מכונן. ניתן גם לחצות את מודל NuTRAP עם קווי Cre מושרים כדי למנוע ביטוי חולף של גנים בתאים שאינם מטרה במהלך ההתפתחות. מכיוון שרוב תאי השחלות רגישים מאוד לתנודות הורמונליות, יש להתייחס גם למחזור הייחום17.
לגישת NuTRAP יתרונות רבים בהשוואה לטכניקות מסורתיות של מיון תאים. ראשית, טכניקות מיון תאים מסתמכות על יצירת מתלים חד-תאיים, שיכולים לגרום להשראת הפעלת אקס ויו 8. בנוסף, מיון התאים מסתמך על סמני פני השטח של התא, אשר עשויים להשתנות עם הגיל או מצבי מחלה, ובכך להעלות את השאלה אם אוכלוסיות התאים המושווים בין שתי קבוצות ניסוי הן אכן שקולות. סימון פני השטח של התא מסתמך גם על זיהוי נוגדנים אמינים עבור immunostaining18.
במהלך העשור האחרון, חלה התרחבות בטכניקות שעתוק חד-תא/גרעיני 19,20,21,22,23 ואפיגנומי24,25,26 כדי לחקור את ההטרוגניות של אוכלוסיות תאים. בעוד גישות אלה הובילו להערכה גדולה יותר של הטרוגניות תאית, הם סובלים לעתים קרובות מחוסר רגישות וכיסוי גנומי, אשר יכול להגביל את עומק הניתוחים. לדוגמה, טכניקות שעתוק חד-תאי (scRNA) מזהות רק ~1,000-5,000 גנים לכל תא27, בעוד שטכניקת NuTRAP ששימשה במחקר זה זיהתה 14,980 גנים. בנוסף, מספר טכניקות scRNA מסתמכות על תיוג 3' או 5' 20,21,22,28,29,30, אשר אינו מאפשר ניתוח של איזופורמים ספציפיים של RNA הזמינים באמצעות מתודולוגיית TRAP-seq.
בעוד שתעתיק חד-תאי הפך לדבר שבשגרה בביולוגיה מולקולרית (נסקר אצל אולדרידג' וטייכמן31), התחום האפיגנטי השתרך מאחור. רוב הטכניקות האפיגנומיות של תא בודד מסתמכות על שקיעת FACS של תאים או טכניקות מיקרופלואידיות ולאחר מכן הכנת ספרייה מתאים בודדים. לפיכך, התפוקה עבור טכניקות אפיגנומיות של תא בודד היא בדרך כלל נמוכה יותר מאשר עבור שיטות אנקפסולציה טיפתית המשמשות בדרך כלל עבור RNA-Seq32 של תא יחיד. התוספת האחרונה של בדיקת תא בודד (sc) או גרעינים בודדים (sn) עבור כרומטין נגיש לטרנספוזיה (ATAC-Seq) למשפחת 10x גנומיקה של תמיסות תא בודד מייצגת את השיטה הראשונה מבוססת טיפות המאפשרת חקירה של נקודת קצה אפיגנומית (נגישות כרומטין) ברזולוציה של תא יחיד. טכניקות ריבוב, כגון CoBATCH-Seq24 לשינויים בהיסטון, הגדילו את התפוקה באופן דרמטי, אך לא לרמה של גישות מבוססות טיפות. ריצוף מתיל גרעינים בודדים (snmC-Seq) בוצע באמצעות מיון גרעינים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות לבארות בודדות והכנת ספריית BS-Seq25,26. עם זאת, ההמרה הדו-גופרתית הקשה מובילה לכיסוי גנומי דליל, מה שמחייב קשירה גנומית גדולה במהלך ניתוח נתונים (~100 קילובייט) וגורם להקשר הגנומי הדרוש למסקנות מדעיות מוצקות ללכת לאיבוד. מודל העכבר NuTRAP מאפשר ניתוח רגיש של אפיגנום ושעתוק של סוגי תאים ספציפיים.
לגבי הליך TRAP, ישנם כמה שיקולים כדי להבטיח בידוד מוצלח. ראשית, יש לחתוך את השחלה לפני ההומוגניזציה על מנת לקרוע את הקרום החיצוני ולאפשר דיסוציאציה מוחלטת. השחלה היא רקמה סיבית, במיוחד בעכברים מבוגרים, מה שמקשה על הומוגניזציה מלאה. עם זאת, במהלך האופטימיזציה של פרוטוקול זה, הומוגניזציה אגרסיבית במהלך פרוטוקול TRAP הביאה לזיהום של מבודדי RNA, עם פסי DNA גלויים המוצגים על ידי אלקטרופורזה נימית. כדי לפתור בעיה זו, 2 mM זרע נכלל במאגר הומוגניזציה TRAP על מנת לייצב את קרום הגרעין33. בנוסף, ביצענו הומוגניות רק בדגימות ה-TRAP עם המזיק הרופף A כדי למנוע שיבוש של קרום הגרעין. חשוב לבדוק את דגימות ה-RNA ב-Bioanalyzer או ב-TapeStation לאחר הבידוד כדי להבטיח תקינות RNA מספר >7 לפני שממשיכים ליישומי ריצוף.
עבור הליך INTACT, השחלה צריכה להיות חתוכה גם לפני הומוגניזציה. בנוסף, מצאנו כי סחרור קצר במהירות נמוכה (200 x גרם למשך 1.5 דקות) לאחר הומוגניזציה יעיל להסרת רקמות וכלי דם לא מנותקים, כפי שנעשה בעבר 7,14. אם RNA גרעיני הוא נקודת קצה רצויה, מעכב RNase צריך להיכלל במאגרים INTACT. ניתן להשתמש ב- RNA-Seq גרעיני או RT-qPCR כדי לבדוק את ספציפיות התא של הבידודים INTACT. לחרוזי סטרפטווידין יש זיקה גבוהה להפליא לביוטין, מה שמקשה על הפרדת החרוזים מגרעיני ביוטין+ בעקבות פרוטוקול INTACT, ויש לקחת זאת בחשבון בעת תכנון יישומים במורד הזרם. בנוסף לבידוד גרעינים ספציפיים לסוג התא ממודלים של NuTRAP באמצעות INTACT, ניתן גם למיין גרעינים בהתבסס על ביטוי eGFP עבור יישומים במורד הזרם. הליך INTACT לבידוד גרעינים יכול לשמש להערכת מספר נקודות קצה, כולל תעתיק גרעיני, אפיגנומיקה ופרוטאומיקה.
הטכניקות הנ"ל הן כלים נהדרים להערכות הזדקנות השחלות. הזדקנות השחלות היא דאגה לא רק מנקודת מבט של רבייה אלא גם מנקודת מבט של תוחלת בריאות. גיל המעבר, שהוא הפסקת תפקוד השחלות, קשור להאצת השעונים הביולוגיים34, וגיל המעבר המוקדם קשור לתוחלת חיים קצרה יותר ולסיכון מוגבר למחלות אצל נשים35,36. הזדקנות הביציות ידועה כקשורה ישירות לירידה בכושר השחלות. עם זאת, סוגים אחרים של תאים הם גם האמינו לשחק תפקיד בירידה של תוחלת בריאות השחלות ועלייה הזדקנות השחלות דלקת37. הבנה טובה יותר של אילו תאים מעורבים בתהליך זה וכיצד להאט אותו היא המפתח. אף על פי שישנם הבדלים בלתי ניתנים להכחשה בין הדינמיקה האנושית לדינמיקה השחלתית של השחלות, מודלים של עכברים נותרו כלים חשובים לחקר הביולוגיה השחלתית. בהקשר זה, המודלים של Cre-NuTRAP יכולים להיות כלים שימושיים לזיהוי המטרות היעילות ביותר לסוג התא עבור ניסיונות להאט את הזדקנות השחלות ואת גיל המעבר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות (NIH) (R01AG070035, R01AG069742, T32AG052363), קרן BrightFocus (M2020207) וקרן הבריאות הפרסביטריאנית. עבודה זו נתמכה בחלקה גם על ידי פרס MERIT I01BX003906 ופרס תוכנית הערכת ציוד משותף (ShEEP) ISIBX004797 מארה"ב (ארה"ב) המחלקה לענייני חיילים משוחררים, שירות מחקר ופיתוח מעבדה ביו-רפואית. המחברים רוצים גם להודות למרכז הגנומיקה הקלינית (OMRF) ולמתקן הליבה של הדימות (OMRF) על הסיוע והשימוש במכשירים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Spermidine | Sigma-Aldrich | 05292-1ML-F | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Scientific | AM9530G | |
| 10% NP-40 | Thermo Scientific | 85124 | |
| 100 mg/mL Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C4859-1ML | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| 30 µm cell strainer | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
| anti-GFP antibody | Abcam | Ab290 | For TRAP and IHC (Rabbit polyclonal to GFP) |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | RNA Lysis Buffer in protocol |
| cOmplete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablet | Roche | 11836170001 | For TRAP Homogenization Buffer |
| Cyp17iCre mouse model | The Jackson Laboratory | 28547 | B6;SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J |
| DynaMag-2 magnet | Invitrogen | 12321D | |
| Genotyping Primers | IDT | Custom | Generic Cre - Jackson Laboratory protocol 22392, Primers: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339 |
| Cyp17iCre - Jackson Laboratory protocol 30847, Primers: 21218, 31704, 31705, 35663 | |||
| NuTRAP - Jackson Laboratory protocol 21509, Primers: 21306, 24493, 32625, 32626 | |||
| Halt Protease Inhibitor cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861278 | For NPB Buffer |
| M-280 Streptavidin Dynabeads | Invitrogen | 11205D | 2.8 µm bead diameter |
| MixMate | Eppendorf | 5353000529 | |
| Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma-Aldrich | Nuc101 | Contains Nuclei Lysis Buffer and Nuclei Storage Buffer |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9760G | |
| 2M KCl | Thermo Scientific | AM9640G | |
| 0.5 M EDTA | Thermo Scientific | AM9260G | |
| 0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
| NuTRAP mouse model | The Jackson Laboratory | 29899 | B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J |
| Pierce DTT No-Weigh Format | Thermo Scientific | A39255 | |
| Protein G Dynabeads | ThermoFisher | 10004D | For TRAP |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| Sodium Heparin | Fisher Scientific | BP2425 | |
| Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| VWR Tube Rotator | Fisher Scientific | NC9854190 |
References
- Broekmans, F. J., Soules, M. R., Fauser, B. C. Ovarian aging: Mechanisms and clinical consequences. Endocrine Reviews. 30 (5), 465-493 (2009).
- Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: Theory, technical considerations, and future applications. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).
- Morris, M. E., et al. A single-cell atlas of the cycling murine ovary. eLife. 11, 77239 (2022).
- Kendrick, H., et al. Transcriptome analysis of mammary epithelial subpopulations identifies novel determinants of lineage commitment and cell fate. BMC Genomics. 9, 591 (2008).
- Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. Does FACS perturb gene expression. Cytometry A. 87 (2), 166-175 (2015).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).
- Ocanas, S. R., et al. Minimizing the ex vivo confounds of cell-isolation techniques on transcriptomic and translatomic profiles of purified microglia. eNeuro. 9 (2), (2022).
- Raus, A. M., Nelson, N. E., Fuller, T. D., Ivy, A. S. 34;SIT" with Emx1-NuTRAP mice: Simultaneous INTACT and TRAP for paired transcriptomic and epigenetic sequencing. Current Protocols. 2 (10), 570 (2022).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Translatomic response of retinal Muller glia to acute and chronic stress. Neurobiology Disease. 175, 105931 (2022).
- Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), 13259 (2020).
- Briley, S. M., et al. Reproductive age-associated fibrosis in the stroma of the mammalian ovary. Reproduction. 152 (3), 245-260 (2016).
- Umehara, T., et al. Female reproductive life span is extended by targeted removal of fibrotic collagen from the mouse ovary. Science Advances. 8 (24), (2022).
- Lopez-Sanchez, N., Frade, J. M. Cell cycle analysis in the vertebrate brain using immunolabeled fresh cell nuclei. Bio-Protocol. 3 (22), 973 (2013).
- Saccon, T. D., et al. Primordial follicle reserve, DNA damage and macrophage infiltration in the ovaries of the long-living Ames dwarf mice. Experimental Gerontology. 132, 110851 (2020).
- Kinnear, H. M., et al. The ovarian stroma as a new frontier. Reproduction. 160 (3), 25-39 (2020).
- Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6, 5 (2020).
- Tighe, R. M., et al. Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American Thoracic Society workshop report. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61 (2), 150-161 (2019).
- Zhang, X., et al. Comparative analysis of droplet-based ultra-high-throughput single-cell RNA-Seq systems. Molecular Cell. 73 (1), 130-142 (2019).
- Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049 (2017).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Prakadan, S. M., Shalek, A. K., Weitz, D. A. Scaling by shrinking: Empowering single-cell 'omics' with microfluidic devices. Nature Reviews Genetics. 18 (6), 345-361 (2017).
- Wang, Q., et al. CoBATCH for high-throughput single-cell epigenomic profiling. Molecular Cell. 76 (1), 206-216 (2019).
- Luo, C., et al. Robust single-cell DNA methylome profiling with snmC-seq2. Nature Communications. 9, 3824 (2018).
- Liu, H., et al. DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution. Nature. 598 (7879), 120-128 (2021).
- Yamawaki, T. M., et al. Systematic comparison of high-throughput single-cell RNA-seq methods for immune cell profiling. BMC Genomics. 22 (1), 66 (2021).
- Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77 (2016).
- Natarajan, K. N. Single-cell tagged reverse transcription (STRT-Seq). Methods in Molecular Biology. 1979, 133-153 (2019).
- Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
- Aldridge, S., Teichmann, S. A. Single cell transcriptomics comes of age. Nature Communications. 11, 4307 (2020).
- Clark, S. J., Lee, H. J., Smallwood, S. A., Kelsey, G., Reik, W. Single-cell epigenomics: Powerful new methods for understanding gene regulation and cell identity. Genome Biology. 17, 72 (2016).
- Christensson, E., Lewan, L. The use of spermidine for the isolation of nuclei from mouse liver. Studies of purity and yield during different physiological conditions. Zeitschrift für Naturforschung. Section C, Biosciences. 29 (5-6), 267-271 (1974).
- Levine, M. E., et al.
- Ossewaarde, M. E., et al. Age at menopause, cause-specific mortality and total life expectancy. Epidemiology. 16 (4), 556-562 (2005).
- Wellons, M., Ouyang, P., Schreiner, P. J., Herrington, D. M., Vaidya, D. Early menopause predicts future coronary heart disease and stroke: the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis. Menopause. 19 (10), 1081-1087 (2012).
- Camaioni, A., et al. The process of ovarian aging: It is not just about oocytes and granulosa cells. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 39 (4), 783-792 (2022).
