בפרוטוקול זה, שיטת טיהור זיקה ריבוזום מתרגם (TRAP) ובידוד גרעינים המתויגים בסוגי תאים ספציפיים (INTACT) הותאמו לחקירה זוגית של שעתוק השחלות הספציפי לתא ואפיגנום באמצעות מודל עכבר NuTRAP שחצו לקו עכבר Cyp17a1-Cre.
הערכת שינויים אפיגנומיים ושעתוק ספציפיים לסוג התא הם המפתח להבנת הזדקנות השחלות. לשם כך, האופטימיזציה של שיטת טיהור זיקה ריבוזום מתרגם (TRAP) ובידוד גרעינים המתויגים בסוגי תאים ספציפיים (INTACT) בוצעה לצורך חקירה זוגית עוקבת של תעתיק השחלות והאפיגנום הספציפיים לתא באמצעות מודל עכבר NuTRAP מהונדס חדשני. הביטוי של אלל NuTRAP נמצא תחת שליטה של קלטת STOP floxed וניתן לכוון אותו לסוגי תאי שחלה ספציפיים באמצעות קווי Cre ספציפיים למקדם. מכיוון שמחקרים אחרונים קשרו תאי סטרומה בשחלות בהנעת פנוטיפים של הזדקנות מוקדמת, מערכת הביטוי NuTRAP התמקדה בתאי סטרומה באמצעות דרייבר Cyp17a1-Cre. השראת מבנה NuTRAP הייתה ספציפית לפיברובלסטים סטרומה בשחלות, והתקבלו מספיק DNA ו-RNA למחקרי ריצוף משחלה יחידה. ניתן להשתמש במודל NuTRAP ובשיטות המוצגות כאן כדי לחקור כל סוג תא שחלה עם קו Cre זמין.
השחלות הן שחקניות מרכזיות בהזדקנות סומטית1, עם תרומות שונות מאוכלוסיות תאים ספציפיות. ההטרוגניות התאית של השחלה מקשה על פירוש התוצאות המולקולריות מבדיקות שחלה שלמות בתפזורת. הבנת התפקיד של אוכלוסיות תאים ספציפיות בהזדקנות השחלות היא המפתח לזיהוי הגורמים המולקולריים האחראים לפוריות ולירידה בבריאות אצל נשים מזדקנות. באופן מסורתי, ההערכה הרב-אומית של סוגי תאי שחלה ספציפיים הושגה על ידי טכניקות כגון מיקרודיסקציה לייזר2, גישות חד-תאיות3 או מיון תאים4. עם זאת, מיקרודיסקציה יכולה להיות יקרה וקשה לביצוע, ומיון תאים יכול לשנות פרופילים פנוטיפיים תאיים5.
גישה חדשנית להערכת פרופילים אפיגנומיים ושעתוק ספציפיים לסוג תאי השחלות משתמשת במודל העכבר NuTRAP (ראשי תיבות של Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purification). מודל NuTRAP מאפשר בידוד של חומצות גרעין ספציפיות לסוג התא ללא צורך במיון תאים באמצעות שיטות טיהור הזיקה: תרגום טיהור זיקה ריבוזומים (TRAP) ובידוד גרעינים המסומנים בסוגי תאים ספציפיים (INTACT)6. הביטוי של אלל NuTRAP נמצא תחת שליטה של קלטת STOP floxed וניתן לכוון אותו לסוגי תאי שחלה ספציפיים באמצעות קווי Cre ספציפיים למקדם. על ידי חציית עכבר NuTRAP עם קו Cre ספציפי לסוג התא, הסרת קלטת STOP גורמת לתיוג eGFP של הקומפלקס הריבוזומלי ותיוג ביוטין/mCherry של הגרעין באופן תלוי Cre6. לאחר מכן ניתן להשתמש בטכניקות TRAP ו- INTACT כדי לבודד mRNA ו- DNA גרעיני מסוג התא המעניין ולהמשיך לניתוחים שעתוק ואפיגנומיים.
מודל NuTRAP שימש ברקמות שונות, כגון רקמת שומן6, רקמת מוח 7,8,9 ורשתית10, כדי לחשוף שינויים אפיגנומיים ושעתוק ספציפיים לסוג התא שעשויים שלא להיות מזוהים בהומוגנט של רקמה שלמה. היתרונות של גישת NuTRAP על פני טכניקות מסורתיות של מיון תאים כוללים: 1) מניעת ממצאים אקטיבציוניים של ex vivo 8, 2) הצורך הממוזער בציוד מיוחד (כלומר, ממייני תאים), ו -3) התפוקה המוגברת והעלות המופחתת של ניתוחים ספציפיים לסוג התא. בנוסף, היכולת לבודד דנ”א ורנ”א ספציפיים לסוג התא מעכבר בודד מאפשרת ניתוחים זוגיים המגבירים את הכוח הסטטיסטי. מכיוון שמחקרים אחרונים קשרו תאי סטרומה בשחלות בהנעת פנוטיפים של הזדקנות מוקדמת 11,12,13, כיוונו את מערכת הביטוי NuTRAP לתאי סטרומה ותקה באמצעות דרייבר Cyp17a1-Cre. כאן, אנו מראים כי השראת מבנה NuTRAP היא ספציפית לתאי סטרומה ותקה בשחלות, ומספיק DNA ו- RNA למחקרי ריצוף מתקבלים משחלה אחת. ניתן להשתמש במודל NuTRAP ובשיטות המוצגות כאן כדי לחקור כל סוג תא שחלה עם כל קו Cre זמין.
ליצירת קו עכברי NuTRAP ספציפי לסוג התא, אלל התיוג והתרגום הגרעיני של טיהור זיקה ריבוזום (NuTRAP) כולל קודון STOP floxed השולט בביטוי של BirA, פפטיד זיהוי ליגאז ביוטין (BLRP) המתויג mCherry/mRANGAP1 ו-eGFP/L10a. כאשר חוצים אותו עם קו Cre ספציפי לסוג התא, הביטוי של קלטת NuTRAP מתייג את החלבון הגרעיני mRANGAP1 עם ביוטין/mCherry ואת החלבון הריבוזומלי L10a עם eGFP באופן תלוי Cre. זה מאפשר בידוד של גרעינים ו-mRNA מסוגי תאים ספציפיים ללא צורך במיון תאים. ניתן להתאים אתNuTRAP flox/flox עם Cre ספציפי לסוג התא הרלוונטי לסוגי תאי השחלות כדי להעריך זאת.
עכבר NuTRAP מודל6 הוא גישת תיוג מהונדס רבת עוצמה לחקירה זוגית של התמליל והאפיגנום מסוגי תאים ספציפיים שניתן להתאים לכל סוג תא עם מנהל התקן Cre זמין. כאן, אנו מדגימים את הספציפיות של מודל העכבר Cyp17-NuTRAP בהתמקדות בתאי תקה וסטרומה בשחלות. ניתן להשתמש במודל Cyp17-NuTRAP כדי להבהיר עוד יותר את ?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות (NIH) (R01AG070035, R01AG069742, T32AG052363), קרן BrightFocus (M2020207) וקרן הבריאות הפרסביטריאנית. עבודה זו נתמכה בחלקה גם על ידי פרס MERIT I01BX003906 ופרס תוכנית הערכת ציוד משותף (ShEEP) ISIBX004797 מארה”ב (ארה”ב) המחלקה לענייני חיילים משוחררים, שירות מחקר ופיתוח מעבדה ביו-רפואית. המחברים רוצים גם להודות למרכז הגנומיקה הקלינית (OMRF) ולמתקן הליבה של הדימות (OMRF) על הסיוע והשימוש במכשירים.
0.1 M Spermidine | Sigma-Aldrich | 05292-1ML-F | |
1 M MgCl2 | Thermo Scientific | AM9530G | |
10% NP-40 | Thermo Scientific | 85124 | |
100 mg/mL Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C4859-1ML | |
2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
30 µm cell strainer | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
anti-GFP antibody | Abcam | Ab290 | For TRAP and IHC (Rabbit polyclonal to GFP) |
Buffer RLT | Qiagen | 79216 | RNA Lysis Buffer in protocol |
cOmplete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablet | Roche | 11836170001 | For TRAP Homogenization Buffer |
Cyp17iCre mouse model | The Jackson Laboratory | 28547 | B6;SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J |
DynaMag-2 magnet | Invitrogen | 12321D | |
Genotyping Primers | IDT | Custom | Generic Cre – Jackson Laboratory protocol 22392, Primers: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339 |
Cyp17iCre – Jackson Laboratory protocol 30847, Primers: 21218, 31704, 31705, 35663 | |||
NuTRAP – Jackson Laboratory protocol 21509, Primers: 21306, 24493, 32625, 32626 | |||
Halt Protease Inhibitor cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861278 | For NPB Buffer |
M-280 Streptavidin Dynabeads | Invitrogen | 11205D | 2.8 µm bead diameter |
MixMate | Eppendorf | 5353000529 | |
Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma-Aldrich | Nuc101 | Contains Nuclei Lysis Buffer and Nuclei Storage Buffer |
1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9760G | |
2M KCl | Thermo Scientific | AM9640G | |
0.5 M EDTA | Thermo Scientific | AM9260G | |
0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
NuTRAP mouse model | The Jackson Laboratory | 29899 | B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J |
Pierce DTT No-Weigh Format | Thermo Scientific | A39255 | |
Protein G Dynabeads | ThermoFisher | 10004D | For TRAP |
RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
Sodium Heparin | Fisher Scientific | BP2425 | |
Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
VWR Tube Rotator | Fisher Scientific | NC9854190 |