Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Fare yumurtalık epigenomu ve transkriptomunun hücreye özgü eşleştirilmiş sorgulaması

Published: February 24, 2023 doi: 10.3791/64765
Automatic Translation
*1,2,3, *1,3, 1, 2, 2, 4, 2,3, 1,3
1Aging and Metabolism Research Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 2Genes & Human Disease Research Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 3Oklahoma City Veterans Affairs Medical Center, 4Nutrition College, Federal University of Pelotas
* These authors contributed equally

Summary

Bu protokolde, çevirici ribozom afinite saflaştırma (TRAP) yöntemi ve spesifik hücre tiplerinde etiketlenmiş çekirdeklerin izolasyonu (INTACT) yöntemi, bir Cyp17a1-Cre fare hattına geçilen NuTRAP fare modeli kullanılarak hücreye özgü yumurtalık transkriptomunun ve epigenomun eşleştirilmiş sorgulaması için optimize edilmiştir.

Abstract

Hücre tipine özgü epigenomik ve transkriptomik değişikliklerin değerlendirilmesi, yumurtalık yaşlanmasını anlamanın anahtarıdır. Bu amaçla, çeviri ribozom afinite saflaştırma (TRAP) yönteminin optimizasyonu ve spesifik hücre tiplerinde etiketlenmiş çekirdeklerin izolasyonu (INTACT) yöntemi, yeni bir transgenik NuTRAP fare modeli kullanılarak hücreye özgü yumurtalık transkriptomu ve epigenomunun daha sonra eşleştirilmiş sorgulaması için gerçekleştirilmiştir. NuTRAP alelinin ekspresyonu, flokslu bir STOP kasetinin kontrolü altındadır ve promotöre özgü Cre hatları kullanılarak spesifik yumurtalık hücre tiplerine hedeflenebilir. Son çalışmalar, erken yaşlanma fenotiplerinin sürülmesinde yumurtalık stromal hücrelerini içerdiğinden, NuTRAP ekspresyon sistemi bir Cyp17a1-Cre sürücüsü kullanılarak stromal hücrelere hedeflenmiştir. NuTRAP yapısının indüksiyonu yumurtalık stromal fibroblastlarına özgüydü ve dizileme çalışmaları için yeterli DNA ve RNA tek bir yumurtalıktan elde edildi. Burada sunulan NuTRAP modeli ve yöntemleri, mevcut bir Cre çizgisine sahip herhangi bir yumurtalık hücre tipini incelemek için kullanılabilir.

Introduction

Yumurtalıklar, spesifik hücre popülasyonlarından farklı katkılarla somatik yaşlanma1'de önemli oyunculardır. Yumurtalığın hücresel heterojenliği, toplu, tüm yumurtalık tahlillerinden moleküler sonuçların yorumlanmasını zorlaştırır. Yumurtalık yaşlanmasında spesifik hücre popülasyonlarının rolünü anlamak, yaşlı kadınlarda doğurganlık ve sağlık düşüşünden sorumlu moleküler sürücüleri tanımlamanın anahtarıdır. Geleneksel olarak, spesifik over hücre tiplerinin multi-omik değerlendirmesi, lazer mikrodiseksiyon2, tek hücreli yaklaşımlar3 veya hücre sıralama4 gibi tekniklerle elde edilmiştir. Bununla birlikte, mikrodiseksiyonun gerçekleştirilmesi pahalı ve zor olabilir ve hücre sıralaması hücresel fenotipik profilleri değiştirebilir5.

Yumurtalık hücre tipine özgü epigenomik ve transkriptomik profilleri değerlendirmek için yeni bir yaklaşım, nükleer etiketleme ve çeviri ribozom afinite saflaştırma (NuTRAP) fare modelini kullanır. NuTRAP modeli, afinite saflaştırma yöntemlerini kullanarak hücre sıralamasına gerek kalmadan hücre tipine özgü nükleik asitlerin izolasyonuna izin verir: ribozom afinite saflaştırmasının (TRAP) çevrilmesi ve belirli hücre tiplerinde etiketlenmiş çekirdeklerin izolasyonu (INTACT)6. NuTRAP alelinin ekspresyonu, flokslu bir STOP kasetinin kontrolü altındadır ve promotöre özgü Cre hatları kullanılarak spesifik yumurtalık hücre tiplerine hedeflenebilir. NuTRAP fareyi hücre tipine özgü bir Cre çizgisiyle geçerek, STOP kasetinin çıkarılması, ribozomal kompleksin eGFP etiketlemesine ve çekirdeğin Cre'ye bağımlı bir şekilde biyotin / mCherry etiketlemesine neden olur6. TRAP ve INTACT teknikleri daha sonra mRNA ve nükleer DNA'yı ilgilenilen hücre tipinden izole etmek ve transkriptomik ve epigenomik analizlere devam etmek için kullanılabilir.

NuTRAP modeli, yağ dokusu6, beyin dokusu 7,8,9 ve retina 10 gibi farklı dokularda, tüm doku homojenatında tespit edilemeyen hücre tipine özgü epigenomik ve transkriptomik değişiklikleri ortaya çıkarmak için kullanılmıştır. NuTRAP yaklaşımının geleneksel hücre sıralama tekniklerine göre faydaları şunlardır: 1) ex vivo aktivasyonel artefaktların önlenmesi8, 2) özel ekipmana (yani hücre ayıklayıcılara) olan ihtiyacın en aza indirilmesi ve 3) hücre tipine özgü analizlerin artan verimi ve azalan maliyeti. Ek olarak, hücre tipine özgü DNA ve RNA'yı tek bir fareden izole etme yeteneği, istatistiksel gücü artıran eşleştirilmiş analizlere izin verir. Son çalışmalar, erken yaşlanma fenotipleri 11,12,13'ün sürülmesinde yumurtalık stromal hücrelerini içerdiğinden, NuTRAP ekspresyon sistemini bir Cyp17a1-Cre sürücüsü kullanarak stromal ve teka hücrelerine hedefledik. Burada, NuTRAP yapısının indüksiyonunun yumurtalık stromal ve teka hücrelerine özgü olduğunu ve dizileme çalışmaları için yeterli DNA ve RNA'nın tek bir yumurtalıktan elde edildiğini gösteriyoruz. Burada sunulan NuTRAP modeli ve yöntemleri, mevcut herhangi bir Cre çizgisine sahip herhangi bir yumurtalık hücre tipini incelemek için kullanılabilir.

Hücre tipine özgü yumurtalık NuTRAP fare hattının oluşturulması için, nükleer etiketleme ve çevirme ribozom afinite saflaştırma (NuTRAP) aleli, BirA, biyotin ligaz tanıma peptidi (BLRP) etiketli mCherry / mRANGAP1 ve eGFP / L10a'nın ekspresyonunu kontrol eden flokslu bir STOP kodonuna sahiptir. Hücre tipine özgü bir Cre çizgisi ile çaprazlandığında, NuTRAP kasetinin ifadesi, nükleer protein mRANGAP1'i biotin / mCherry ile ve ribozomal protein L10a'yı eGFP ile Cre'ye bağımlı bir şekilde etiketler. Bu, hücre sıralamaya gerek kalmadan çekirdeklerin ve mRNA'nın spesifik hücre tiplerinden izole edilmesine izin verir. NuTRAP floks/ floks , bunu değerlendirmek için yumurtalık hücre tipleriyle ilgili hücre tipine özgü bir Cre ile eşleştirilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan prosedürleri, Oklahoma Tıbbi Araştırma Vakfı'ndaki (OMRF) Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Ebeveyn fareler Jackson Laboratuvarı'ndan (Bar Harbor, ME) satın alındı ve OMRF'de 14 saat / 10 saatlik bir ışık / karanlık döngüsünde (ışıklar sabah 6: 00'da yanıyor) bir HEPA bariyer ortamında SPF koşulları altında yetiştirildi ve barındırıldı.

NOT: Bu gösterimde, NuTRAP dişi (Suş # 029899, Jackson Laboratuvarı) ile eşleştirilmiş bir Cyp17iCre+/−(Suş # 028547, Jackson Laboratuvarı) erkek kullanıyoruz. İstenilen Cyp17-NuTRAP soyu (Cyp17iCre+/−; NuTRAPflox / WT), yumurtalık stromal hücrelerinde Cyp17a1 promotörünün kontrolü altındaki NuTRAP alelini eksprese edecektir. Bu makale hazırlığı için 4 aylık dişi Cyp17-NuTRAP fareleri (n = 4) kullandık. DNA, Cyp17iCre ve NuTRAP transgenlerinin kalıtımını doğrulamak için genotipleme için fare kulağı delme örneklerinden çıkarıldı ve daha öncetarif edildiği gibi 7,8 Malzeme Tablosunda listelenen primerler kullanılarak 1) jenerik Cre, 2) Cyp17iCre ve 3) NuTRAP'ın PCR tespiti için flokslandı.

1. Fare yumurtalık diseksiyonu

  1. Hayvan bakım kurallarına ve kurumun onayına göre fare ötenazisi yapın, ardından yumurtalık toplanması.
  2. Yumurtalıkları tamponlu tüplere yerleştirmeden önce yumurtalık dokusuna bağlanabilecek herhangi bir yağ dokusunu veya yumurta kanallarının parçalarını çıkarmak için yumurtalıkları diseke edin. Hemen TRAP veya INTACT tekniklerine geçin.
    NOT: Bu protokol dondurulmuş doku ile kullanım için optimize edilmemiştir. Her teknik için aynı fareden bir yumurtalık kullanılması gelecekteki istatistiksel analizler için önerilir.

2. Çekirdeklerin spesifik yumurtalık hücre tiplerinden izolasyonu

  1. Tampon hazırlama
    1. Nükleer saflaştırma tamponu (NPB): 100 mL NPB hazırlamak için, 2 mL 1 M HEPES (nihai konsantrasyon: 20 mM HEPES), 0,8 mL 5 M NaCl (40 mM NaCl), 4,5 mL 2 M KCl (90 mM KCl), 0,4 mL 0,5 M EDTA (2 mM EDTA), 0,1 mL 0,5 M EGTA (0,5 mM EGTA), ve 92.2 mL nükleaz içermeyen su. Çekirdek izolasyonu gününde 1x proteaz inhibitörü ile takviye edin.
      NOT: NPB, proteaz inhibitörü olmadan önceden hazırlanabilir ve 4 ° C'de 3 haftaya kadar sürer.
    2. Çekirdek lizis tamponu (eksiksiz): Çekirdek izolasyonu gününde 1x proteaz inhibitörü ile takviye edilen çekirdek lizis tamponu.
  2. Çekirdek süspansiyonunun oluşturulması
    NOT: Aksi belirtilmedikçe numuneler her zaman buz üzerinde tutulmalıdır.
    1. Bir Cyp17-NuTRAP fareden (veya diğer ilgili Cre-NuTRAP) 500 μL çekirdek lizis tamponunda (eksiksiz) bir yumurtalık toplayın. Kendiliğinden açılan mikro makas kullanarak yumurtalıkları tampon içinde sekiz parçaya bölün.
    2. Kıyılmış yumurtalık ve 500 μL lizis tamponunu buz üzerinde bir cam Dounce homojenizatöre aktarmak için geniş delikli pipet uçları kullanın. Yumurtalık 10x-20x'i gevşek havaneli A ile homojenize edin.
    3. Yumurtalıkları sıkı havaneli B 10x-20x ile homojenize edin. 1.000 μL lizis tamponu ekleyin, havane B'yi yıkayın Homojenatı (1.9 mL) 2 mL'lik yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın.
    4. Ayrışmamış doku ve kan damarlarını çıkarmak için 4 ° C'de 1,5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüjyapın 14. Süpernatant çekirdekleri içerir; ayrışmamış dokunun topağını atın.
    5. 100 μL lizis tamponu ile 30 μm'lik bir hücre süzgecini önceden ıslattıktan sonra ve süpernatantı hücre süzgecinden 15 mL'lik bir konik tüpe filtreleyin. Daha sonra, çekirdek içeren karışımı 2 mL'lik yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın.
    6. Numuneyi 500 x g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatanı atın. Pelet çekirdek içerir.
    7. Nükleer peleti 250 μL buz gibi soğuk lizis tamponunda, orta ila yüksek hızda kısa bir süre vorteks yaparak yeniden askıya alın. 1,5 mL lizis tamponu ekleyerek hacmi 1,75 mL'ye getirin. Yavaşça karıştırın ve nükleer süspansiyonu 5 dakika boyunca buz üzerinde dinlendirin.
    8. Çekirdekleri 500 x g'de santrifüjleme ile 4 °C'de 5 dakika boyunca pelet yapın. Nükleer peletleri rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice atın. Peletin 200 μL buz gibi soğuk depolama tamponunda yeniden askıya alınması ve nükleer peletin tamamen yeniden askıya alınması için kısa bir süre vorteks yapın.
    9. Askıya alınmış peletin (20 μL) %10'unu aşağı akış analizleri için giriş çekirdeği numunesi olarak ayırın.
    10. Yeniden askıya alınmış çekirdek topağını alın ve buz gibi soğuk NPB ile hacmi 2.0 mL'ye yükseltin. INTACT afinite tabanlı saflaştırma yöntemini kullanarak etiketli çekirdekleri izole etmeye devam edin.
  3. Belirli hücre tiplerinde etiketlenmiş çekirdeklerin izolasyonu (INTACT)
    1. Tamamen askıya alınmalarını sağlamak için streptavidin boncuklarını şişede 30 s boyunca orta hızda vorteks. Her numune için 2 mL'lik yuvarlak tabanlı bir tüpe 30 μL yeniden askıya alınmış boncuk ekleyin (10 numuneye kadar boncuklar tek bir tüpte yıkanabilir), 1 mL NPB ekleyin ve pipetleme ile iyice askıya alın.
    2. Boncukları ayırmak için tüpü manyetik rafa 1 dakika boyunca yerleştirin. Supernatan'ı atın ve tüpü mıknatıstan çıkarın. Yıkanmış manyetik boncukları 1 mL NPB'de tekrar askıya alın.
    3. Toplam üç yıkama için yıkama adımını tekrarlayın. Son yıkamayı takiben, boncukları NPB'nin ilk hacminde (numune başına 30 μL) tekrar askıya alın.
    4. Adım 2.2.10'dan itibaren 2 mL nükleer süspansiyona yıkanmış boncukların 30 μL'sini ekleyin. Boncuk çekirdeği karışımını pipetleyerek ve tüpü nazikçe ters çevirerek iyice askıya alın.
    5. Tüpleri soğuk bir odada veya buzdolabında dönen bir karıştırıcıya düşük hızda 30 dakika boyunca yerleştirin. Giriş örneklerini boncuksuz olarak aynı koşullarda inkübe edin.
    6. Tüpleri mıknatısın üzerine nükleer süspansiyon ve boncuklarla yerleştirin ve streptavidin boncuklarına (pozitif fraksiyon) bağlı biyotinile çekirdekleri çekirdeğin negatif fraksiyonundan ayırın. Boncukların mıknatıs üzerinde 3 dakika boyunca ayrılmasına izin verin.
    7. Süpernatanı çıkarın, negatif fraksiyonu taze bir 2.0 mL tüpe geçirin ve buz üzerinde saklayın. Her pozitif fraksiyon tüpü için, tüpü mıknatıstan çıkarın ve içeriği 1 mL NPB'de yeniden askıya alın.
    8. Tüpü mıknatısın üzerine 1 dakika boyunca yerleştirin ve süpernatanı atın. Tüpü mıknatıstan çıkarın ve yıkanmış boncuk-çekirdek karışımını 1 mL NPB'de yeniden askıya alın.
    9. Toplam üç yıkama için adım 2.3.8'i tekrarlayın. Üç yıkamanın tamamlanmasından sonra, pozitif fraksiyon boncuk-çekirdek karışımını 30 μL NPB'de yeniden askıya alın.
    10. Her negatif fraksiyon tüpü için, nükleer süspansiyonu adım 2.3.7'den 500 x g'de 4 ° C'de 7 dakika boyunca santrifüj edin. Supernatan'ı dikkatlice aspire edin ve atın. Negatif fraksiyon çekirdeği peletini 30 μL NPB'de yeniden askıya alın.
    11. Çekirdekleri girdiden (adım 2.2.9), negatif fraksiyondan (adım 2.3.10) ve pozitif fraksiyondan (adım 2.3.9) nükleer DNA veya RNA izolasyonuna hazır olana kadar -80 ° C'lik bir dondurucuda saklayın.
      NOT: Çekirdekler, girdi olarak sağlam çekirdekler gerektiren protokoller için dondurulmamalıdır (yani, transpozaz erişilebilir kromatin, kromatin immünopresipitasyonu için tahlil).

3. mRNA'nın spesifik yumurtalık hücre tiplerinden izolasyonu

  1. Arabelleklerin hazırlanması
    1. TRAP tampon tabanı: 78,8 mL RNaz içermeyen su, 5 mL 1 M Tris-HCl (nihai konsantrasyon: 50 mM Tris [pH 7,5]), 5 mL 2 M KCl (100 mM KCl), 1,2 mL 1 M MgCl 2 (12 mM MgCl2) ve 10 mL %10 NP-40 (%1 NP-40) birleştirerek 100 mL TRAP tampon tabanı hazırlayın. 4 °C'de 1 aya kadar saklayın.
    2. Yüksek tuz tampon bazı: 68,8 mL RNaz içermeyen su, 5 mL 1 M Tris-HCl (nihai konsantrasyon: 50 mM Tris [pH 7,5]), 15 mL 2 M KCl (300 mM KCl), 1,2 mL 1M MgCl 2 (12 mM MgCl2) ve 10 mL %10 NP-40 (%1 NP-40) birleştirerek 100 mL yüksek tuz tamponu baz hazırlayın. 4 °C'de 1 aya kadar saklayın.
    3. TRAP homojenizasyon tamponu (eksiksiz): Doku toplama gününde numune başına 1,5 mL hazırlayın. 10 μL 100 mg/mL sikloheksimid (nihai konsantrasyon: 100 μg/mL sikloheksimid), 10 mg sodyum heparin (1 mg/mL sodyum heparin), 20 μL 0,5 M DTT (1 mM DTT), 50 μL 40 U/μL RNaz inhibitörü (200 U/mL RNaz inhibitörü) ile birleştirerek 10 mL TRAP homojenizasyon tamponu hazırlayın, 200 μL 0.1 M spermidin (2 mM spermidin) ve bir EDTA içermeyen proteaz inhibitörü tablet (1x).
    4. Düşük tuzlu yıkama tamponu (eksiksiz): Doku toplama gününde numune başına 1,5 mL yapın. 10 mL düşük tuzlu yıkama tamponu yapmak için, 10 mL TRAP tampon bazını (adım 3.1.1'den itibaren) 10 μL 100 mg/mL sikloheksimid (100 μg/mL sikloheksimid) ve 20 μL 0,5 M DTT (1 mM DTT) ile birleştirin.
    5. Yüksek tuzlu yıkama tamponu (eksiksiz): TRAP izolasyonunun ikinci gününde numune başına 1,5 mL yapın. 10 mL yüksek tuzlu yıkama tamponu yapmak için, 10 mL yüksek tuz tamponu bazını (adım 3.1.2'den itibaren) 10 μL 100 mg / mL sikloheksimid ve 20 μL 0.5 M DTT ile birleştirin.
  2. Ribozom afinite saflaştırmasının (TRAP) çevirisinin gerçekleştirilmesi
    1. Diğer yumurtalıkları bir Cyp17-NuTRAP fareden (veya diğer ilgili Cre-NuTRAP) toplayın ve 100 μL buz gibi soğuk TRAP homojenizasyon tamponu içeren 1,5 mL RNaz içermeyen bir tüpe yerleştirin (adım 3.1.3'ten itibaren). Kendiliğinden açılan mikro makas kullanarak yumurtalıkları tampon içinde sekiz parçaya bölün.
    2. Yumurtalık ve 100 μL homojenizasyon tamponunu bir cam Dounce homojenizatöre aktarmak için geniş delikli uçlar kullanın. Gevşek havaneli A ile 10x-20x'i homojenize edin. 400 μL TRAP homojenizasyon tamponu ekleyin, havane A'yı yıkayın.
    3. Homojenatı 2 mL'lik yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın. Dounce homojenizatörünü ilave 1 mL TRAP homojenizasyon tamponu ile yıkayın ve yıkanan hacmi 2 mL yuvarlak tabanlı tüpe aktarın.
    4. Homojenatı 12.000 x g'de 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj edin. Temizlenmiş süpernatantı taze 2 mL yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın. Pelet atın.
    5. Temizlenmiş homojenatın 100 μL'sini yeni bir 2 mL yuvarlak tabanlı tüpe aktarın ve buz üzerinde girdi olarak ayırın.
    6. Temizlenmiş homojenatın geri kalanını (adım 3.2.4'ten itibaren) bir anti-GFP antikoru (5 μg / mL) ile 4 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edin ve uçtan uca döndürün. Giriş örneğini aynı koşullarda inkübe edin.
    7. İnkübasyonun son 15 dakikasında, aşağıdaki adımları (3.2.8-3.2.11) kullanarak protein G manyetik boncuklarını düşük tuzlu yıkama tamponunda yıkayın.
    8. Vorteks protein şişesi G manyetik boncukları 30 s boyunca tamamen askıya almak için. Her numune için 50 μL protein G manyetik boncuk (bir tüpte 10 numuneye kadar yıkanabilir) 2 mL'lik yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın.
    9. Boncuklara 500 μL düşük tuzlu yıkama tamponu ekleyin ve karıştırmak için yavaşça pipet yapın. Boncukları tüpün yan tarafına doğru toplamak için tüpü 1 dakika boyunca manyetik bir standa yerleştirin. Supernatan'ı çıkarın ve atın.
    10. Tüpü manyetik standdan çıkarın ve tüpe 1 mL düşük tuzlu yıkama tamponu ekleyin. Karıştırmak için yavaşça pipet yapın. Boncukları tüpün yan tarafına doğru toplamak için tüpü 1 dakika boyunca manyetik bir standa yerleştirin. Supernatan'ı çıkarın ve atın.
    11. Toplam üç yıkama için adım 3.2.10'u tekrarlayın. Son yıkamayı takiben, tüpü manyetik raftan çıkarın ve boncukları düşük tuzlu yıkama tamponunun ilk hacminde (numune başına 50 μL) yeniden askıya alın.
    12. Yeniden askıya alınmış yıkanmış boncukları (50 μL) antijen numunesine/antikor karışımına aktarın ve uçtan uca mikserde dönerken gece boyunca 4 °C'de inkübe edin. Eşdeğer koşulları korumak için giriş numunelerini gece boyunca 4 °C'de uçtan uca dönen inkübe edin.
    13. Gece inkübasyonundan sonra, tüpleri rotatörden çıkarın ve manyetik boncukları hedef ribozomlar / RNA (pozitif fraksiyon) ile süpernatanttan (negatif fraksiyon) 2.5-3 dakika boyunca ayırın. Negatif fraksiyonu aspire edin, taze bir 2 mL yuvarlak tabanlı tüpe yerleştirin ve pozitif fraksiyonu işlerken buz üzerinde bir kenara koyun.
    14. Pozitif fraksiyonlu tüpe 500 μL yüksek tuzlu yıkama tamponu (adım 3.1.5'ten itibaren) ekleyin ve karıştırmak için hafifçe pipet ekleyin. Boncukları ayırmak için tüpü 1 dakika boyunca buz üzerinde tutulan manyetik bir standın üzerine yerleştirin. Supernatan'ı atın ve tüpü mıknatıstan çıkarın.
    15. Toplam üç yıkama için adım 3.2.14'ü tekrarlayın. Son yıkamayı takiben, boncukları 3.5 μL 2-merkaptoetanol (BME) ile desteklenmiş 350 μL RNA lizis tamponunda yeniden askıya alın. Dijital bir çalkalayıcıda 900 rpm'de 10 dakika karıştırırken tüpleri oda sıcaklığında inkübe edin.
    16. Boncukları, şimdi hedef ribozomları / RNA'yı içeren çözeltiden, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca manyetik bir stand ile ayırın. Salınan pozitif fraksiyonu (süpernatan) taze bir 1.5 mL tüpte toplayın ve 350 μL% 100 etanol ekleyin. Karıştırmak için ters çevirin. RNA izolasyonuna geçin.
    17. İsteğe bağlı: RNA'yı giriş örneğinden (adım 3.2.5) ve negatif fraksiyondan (adım 3.2.13) izole etmek için, girişin 100 μL'sini ve negatif fraksiyonları taze 1.5 mL tüplere aktarın. Her numuneye 3,5 μL BME ile desteklenmiş 350 μL RNA lizis tamponu ekleyin. Karıştırmak için ters çevirin. Her tüpe 250 μL% 100 etanol ekleyin ve karıştırmak için ters çevirin. RNA izolasyonuna geçin.
  3. RNA izolasyonu
    1. Pozitif fraksiyonun 700 μL'sini ve isteğe bağlı olarak giriş ve/veya negatif fraksiyonu bir RNA spin sütununa aktarın. RNA'yı spin sütunundan izole etmek için üreticinin talimatlarını izleyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

TRAP ve INTACT protokollerinin bir şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. Burada, Cyp17-NuTRAP fare modelinin yumurtalık stromal / teka hücrelerine özgüllüğü, immünofloresan görüntüleme ve TRAP ile izole RNA'dan RNA-Seq ile gösterilmiştir. İlk olarak yumurtalıkta eGFP sinyalinin immünofloresan görüntülemesi ve eGFP sinyalinin teka ve stromal hücrelere lokalizasyonu yapıldı. Kısaca, 5 μm kesitler bir ksilen ve etanol gradyanı ile deparafinize edildi. Daha iyi eGFP sinyallemesi için, eGFP proteini keçi anti-GFP primer antikoru ve Alexa 488 eşek anti-keçi sekonder antikoru kullanılarak boyandı ve çekirdekler DAPI15 ile boyandı. Görüntüler floresan mikroskobunda 20x büyütmede çekildi (Şekil 2A). Daha sonra, ribozoma bağlı RNA'yı özellikle teka / stromal hücrelerden izole etmek için 4 aylık Cyp17-NuTRAP farelerinden yumurtalıklar üzerinde TRAP uygulandı. TRAP ile izole RNA (pozitif fraksiyon) ve tüm doku RNA'sı (girdi), yeni nesil bir dizileyici üzerinde dizilemek üzere sarmallı RNA dizileme kütüphaneleri oluşturmak için kullanıldı. RNA-Seq kırpma, hizalama ve normalleştirme (DESeq2), daha önce tarif edildiği gibi 7,8 gerçekleştirildi. Ana bileşen analizi (PCA), ilk bileşendeki girdi ve pozitif fraksiyonun güçlü bir şekilde ayrıldığını gösterdi ve farklı transkriptomik profiller düşündürdü (Şekil 2B). Volkan grafiğinde görüldüğü gibi, girdi ve pozitif fraksiyonlar arasında 2.009 farklı olarak ifade edilen gen vardı (eşleştirilmiş t-testi, Benjamini-Hochberg çoklu test düzeltmesi FDR < 0.05, katlama değişimi >2; Şekil 2C). Diferansiyel olarak eksprese edilen genlerden stromal ve teka hücre belirteçlerinin (Col3a1, Star, Fbn1, C1s) zenginleşmesi ve oosit (Gdf9, Oosp1, Ooep), granüloza (Amhr2, Serpine2, Eml5), immün hücre (C1qa, C1qb, Fcerg1) ve düz kas hücresi (Mfap5) genlerinin16'sının tükenmesi gözlenmiştir (Şekil 2D).

Figure 1
Şekil 1: Hücre tipine özgü çekirdeklerin ve mRNA'nın Cyp17-NuTRAP modelinden INTACT ve TRAP yöntemleri kullanılarak izolasyonu. (A) Cyp17-NuTRAP hattının oluşturulması, bir NuTRAP floks/ floks dişinin bir Cyp17iCre + / + erkeği ile geçilmesiyle elde edilir. (B) Cyp17-NuTRAP farenin stromal/theca hücrelerinden çekirdekleri ve polizomları izole etmek için TRAP ve INTACT metodolojilerinin şeması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Cyp17-NuTRAP fare modelinin doğrulanması. (A) İmmünofloresan, Cyp17-Cre+/−NuTRAP floks/WT ve Cyp17-Cre−/−NuTRAPfloks/WT farelerinin parafinize yumurtalıklarında uygulandı. eGFP proteini keçi anti-GFP primer antikoru ve Alexa 488 eşek anti-keçi sekonder antikoru kullanılarak boyandı ve çekirdekler DAPI ile boyandı. Görüntüler floresan mikroskobunda 20x büyütme ile çekildi. (B-D) Giriş ve TRAP pozitif fraksiyon RNA'sı, daha önce7'de yapıldığı gibi sarmallı RNA-Seq kütüphanelerini hazırlamak için kullanılan Cyp17-Cre + / −NuTRAPflox / WT fare yumurtalıklarından (n = 4) izole edildi ve çift uçlu bir şekilde sıralandı. RNA-Seq kırpma, hizalama ve normalleştirme (DESeq2), daha önce 7,8'de yapıldığı gibi gerçekleştirildi. (B) İfade edilen tüm genlerin ana bileşen analizi (PCA), ilk bileşendeki TRAP girdisinin ve pozitif fraksiyonların ayrıldığını göstermiştir (% 51.4 açıklanmış varyans). (C) Giriş ve pozitif fraksiyonlar arasındaki diferansiyel olarak eksprese edilen genlerin volkan grafiği (eşleştirilmiş t-testi, Benjamini-Hochberg çoklu test düzeltmesi FDR < 0.05, katlama değişimi >2). (D) TRAP pozitif fraksiyonunun girdi ile karşılaştırılması (log2 [kıvrım değişimi ([ositif fraksiyon / Giriş)]), stromal / teka hücre belirteci genlerinin genel olarak zenginleşmesini ve TRAP pozitif fraksiyonundaki oosit, granüloza, immün ve düz kas hücresi (SMC) belirteç genlerinin tükenmesini göstermiştir (oran eşleştirilmiş t-testi, Benjamini-Hochberg çoklu test düzeltmesi FDR < 0.10, n = 4). Çubuklar, SEM ± ortalama log2[katlama değişimi (pozitif fraksiyon/giriş)] değerini temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

NuTRAP fare modeli6, mevcut bir Cre sürücüsü ile herhangi bir hücre tipine uyarlanabilen belirli hücre tiplerinden transkriptom ve epigenomun eşleştirilmiş sorgulaması için güçlü bir transgenik etiketleme yaklaşımıdır. Burada, Cyp17-NuTRAP fare modelinin yumurtalık teka ve stromal hücreleri hedeflemedeki özgüllüğünü gösteriyoruz. Cyp17-NuTRAP modeli, yumurtalık yaşlanması, kanser ve hastalıkta rol oynayan teka ve stromal hücreye özgü epigenetik mekanizmaları daha fazla aydınlatmak için kullanılabilir.

Bir Cre sürücüsü seçerken, Cre aracılı NuTRAP ifadesinin hücre özgüllüğünü birkaç ortogonal yaklaşım kullanarak doğrulamanız önerilir. Cyp17a1-Cre yapısal olarak ifade edilir. NuTRAP modeli, geliştirme sırasında hedef olmayan hücrelerdeki genlerin geçici ekspresyonunu önlemek için indüklenebilir Cre çizgileri ile de geçilebilir. Çoğu yumurtalık hücresi hormonal dalgalanmalara karşı oldukça hassas olduğundan, östrus döngüsü evrelemesi de17 olarak düşünülmelidir.

NuTRAP yaklaşımı, geleneksel hücre sıralama teknikleriyle karşılaştırıldığında birçok avantaja sahiptir. İlk olarak, hücre sıralama teknikleri, ex vivo aktivasyon artefaktlarının indüksiyonuna neden olabilecek tek hücreli süspansiyonların oluşturulmasına dayanır8. Ek olarak, hücre sıralama, yaş veya hastalık durumlarına göre değişebilen hücre yüzey belirteçlerine dayanır, böylece iki deney grubu arasında karşılaştırılan hücre popülasyonlarının gerçekten eşdeğer olup olmadığı sorgulanır. Hücre yüzey belirteci etiketlemesi ayrıca immün boyama için güvenilir antikorların tanımlanmasına dayanır18.

Son on yılda, hücre popülasyonlarının heterojenliğini araştırmak için tek hücreli / çekirdekli transkriptomik 19,20,21,22,23 ve epigenomik24,25,26 tekniklerinde bir genişleme olmuştur. Bu yaklaşımlar hücresel heterojenliğin daha fazla takdir edilmesine yol açmış olsa da, genellikle analizlerin derinliğini sınırlayabilecek duyarlılık ve genomik kapsama eksikliğinden muzdariptirler. Örneğin, tek hücreli transkriptomik (scRNA) teknikler,hücre 27 başına sadece ~ 1.000-5.000 gen tespit ederken, bu çalışmada kullanılan NuTRAP tekniği 14.980 gen tespit etmiştir. Ek olarak, birkaç scRNA tekniği, TRAP-seq metodolojisi kullanılarak mevcut spesifik RNA izoformlarının analizine izin vermeyen 20,21,22,28,29,30 'veya 5' etiketlemesine dayanır.

Tek hücreli transkriptomikler moleküler biyolojide yaygın hale gelirken (Aldridge ve Teichmann31'de gözden geçirilmiştir), epigenetik alan geride kalmıştır. Tek hücreli epigenomik tekniklerin çoğu, hücrelerin FACS birikimine veya mikroakışkan tekniklere ve ardından tek hücrelerden kütüphane hazırlığına dayanır. Bu nedenle, tek hücreli epigenomik teknikler için verim genellikle tek hücreli RNA-Seq32 için yaygın olarak kullanılan damlacık kapsülleme yöntemlerinden daha düşüktür. 10x genomik tek hücreli çözelti ailesine transpoze edilebilir erişilebilir kromatin (ATAC-Seq) için tek hücreli (sc) veya tek çekirdekli (sn) bir testin yakın zamanda eklenmesi, tek hücreli çözünürlükte bir epigenomik son noktanın (kromatin erişilebilirliği) sorgulanmasına izin veren ilk damlacık bazlı yöntemi temsil etmektedir. Histon modifikasyonları için CoBATCH-Seq24 gibi çoklama teknikleri, verimi önemli ölçüde artırmış, ancak damlacık tabanlı yaklaşımlar seviyesine getirmemiştir. Tek çekirdekli metil dizilimi (snmC-Seq), floresan ile aktive edilmiş çekirdeklerin ayrı ayrı kuyucuklara ayrılması ve BS-Seq kütüphanesi hazırlığı25,26 kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, sert bisülfat dönüşümü, veri analizi sırasında (~ 100 kb) büyük genomik binleme gerektiren ve sağlam bilimsel sonuçlar çıkarmak için gerekli genomik bağlamın kaybolmasına neden olan seyrek genomik kapsama alanına yol açar. NuTRAP fare modeli, belirli hücre tiplerinin epigenomunun ve transkriptomunun hassas analizine izin verir.

TRAP prosedürü ile ilgili olarak, başarılı bir izolasyon sağlamak için bazı hususlar vardır. İlk olarak, dış zarı yırtmak ve tam ayrışmaya izin vermek için homojenizasyondan önce yumurtalık kesilmelidir. Yumurtalık, özellikle yaşlı farelerde fibröz bir dokudur ve tamamen homojenize edilmesini zorlaştırır. Bununla birlikte, bu protokolün optimizasyonu sırasında, TRAP protokolü sırasında agresif homojenizasyon, kılcal elektroforez tarafından görüntülenen görünür DNA bantları ile RNA izolatlarının kontaminasyonuna neden olmuştur. Bu sorunu çözmek için, nükleer membran33'ü stabilize etmek için TRAP homojenizasyon tamponuna 2 mM spermidin dahil edildi. Ek olarak, nükleer membranın bozulmasını önlemek için TRAP numunelerini sadece gevşek havaneli A ile homojenize ettik. Dizileme uygulamalarına geçmeden önce RNA bütünlük numarası >7'yi sağlamak için izolasyondan sonra RNA örneklerini bir Biyoanalizör veya TapeStation üzerinde kontrol etmek önemlidir.

INTACT prosedürü için, homojenizasyondan önce yumurtalık da kesilmelidir. Ek olarak, homojenizasyonu takiben kısa, düşük hızlı bir dönüşün (1,5 dakika boyunca 200 x g), daha önce 7,14 yapıldığı gibi, ayrışmamış doku ve kan damarlarının çıkarılmasında etkili olduğunu bulduk. Nükleer RNA istenen bir son nokta ise, INTACT tamponlarına bir RNaz inhibitörü dahil edilmelidir. Nükleer RNA-Seq veya RT-qPCR, INTACT izolasyonlarının hücre özgüllüğünü test etmek için kullanılabilir. Streptavidin boncukları, biyotin için inanılmaz derecede yüksek bir afiniteye sahiptir, bu da boncukları INTACT protokolünü takiben biyotin + çekirdeklerinden ayırmayı zorlaştırır ve bu, aşağı akış uygulamaları için planlama yaparken dikkate alınmalıdır. INTACT kullanarak NuTRAP modellerinden hücre tipine özgü çekirdekleri izole etmenin yanı sıra, çekirdekler aşağı akış uygulamaları için eGFP ekspresyonuna göre de sıralanabilir. Çekirdekleri izole etmek için INTACT prosedürü, nükleer transkriptomikler, epigenomikler ve proteomikler dahil olmak üzere çeşitli uç noktaları değerlendirmek için kullanılabilir.

Yukarıda belirtilen teknikler yumurtalık yaşlanması değerlendirmeleri için harika araçlardır. Yumurtalık yaşlanması sadece üreme açısından değil, aynı zamanda sağlık süresi açısından da bir endişe kaynağıdır. Yumurtalık fonksiyonunun durması olan menopoz, biyolojik saatlerin hızlanması ile ilişkilidir34 ve erken menopoz, kadınlarda daha kısa bir ömür ve artmış hastalık riski ile ilişkilidir35,36. Oosit yaşlanmasının yumurtalık zindeliğindeki düşüşle doğrudan ilişkili olduğu bilinmektedir. Bununla birlikte, diğer hücre tiplerinin de yumurtalık sağlığı süresinin azalmasında ve yumurtalık yaşlanmasında ve inflamasyonunda bir artışta rol oynadığına inanılmaktadır37. Hangi hücrelerin bu sürece dahil olduğunu ve nasıl yavaşlatılacağını daha iyi anlamak anahtardır. İnsan ve murin yumurtalık dinamikleri arasında inkar edilemez farklılıklar olsa da, fare modelleri yumurtalık biyolojisini araştırmak için önemli araçlar olmaya devam etmektedir. Bu bağlamda, Cre-NuTRAP modelleri, yumurtalık yaşlanmasını ve menopozu yavaşlatma girişimleri için en etkili hücre tipi hedeflerini belirlemek için yararlı araçlar olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) (R01AG070035, R01AG069742, T32AG052363), BrightFocus Vakfı (M2020207) ve Presbiteryen Sağlık Vakfı'ndan gelen hibelerle desteklenmiştir. Bu çalışma kısmen MERIT ödülü I01BX003906 ve Amerika Birleşik Devletleri'nden (ABD) Paylaşılan Ekipman Değerlendirme Programı (ShEEP) ödülü ISIBX004797 tarafından da desteklenmiştir. Gazi İşleri Daire Başkanlığı, Biyomedikal Laboratuvarı Araştırma ve Geliştirme Servisi. Yazarlar ayrıca yardım ve cihaz kullanımı için Klinik Genomik Merkezi (OMRF) ve Görüntüleme Çekirdeği Tesisi'ne (OMRF) teşekkür eder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 M Spermidine Sigma-Aldrich 05292-1ML-F
1 M MgCl2 Thermo Scientific AM9530G
10% NP-40 Thermo Scientific 85124
100 mg/mL Cycloheximide Sigma-Aldrich C4859-1ML
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
30 µm cell strainer  Miltenyi Biotec 130-098-458
All Prep DNA/RNA Mini Kit Qiagen 80204
anti-GFP antibody Abcam Ab290 For TRAP and IHC (Rabbit polyclonal to GFP)
Buffer RLT Qiagen 79216 RNA Lysis Buffer in protocol
cOmplete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablet Roche 11836170001 For TRAP Homogenization Buffer
Cyp17iCre mouse model The Jackson Laboratory 28547 B6;SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J
DynaMag-2 magnet Invitrogen 12321D
Genotyping Primers IDT Custom Generic Cre - Jackson Laboratory protocol 22392, Primers: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339
         Cyp17iCre - Jackson Laboratory protocol 30847, Primers: 21218, 31704, 31705, 35663
         NuTRAP - Jackson Laboratory protocol 21509, Primers: 21306, 24493, 32625, 32626
Halt Protease Inhibitor cocktail (100X) Thermo Scientific 1861278 For NPB Buffer
M-280 Streptavidin Dynabeads  Invitrogen 11205D 2.8 µm bead diameter
MixMate Eppendorf 5353000529
Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep Sigma-Aldrich Nuc101 Contains Nuclei Lysis Buffer and Nuclei Storage Buffer
1 M HEPES Gibco 15630-080
5 M NaCl Thermo Scientific AM9760G
2M KCl Thermo Scientific AM9640G
0.5 M EDTA Thermo Scientific AM9260G
0.5 M EGTA Fisher Scientific 50-255-956
NuTRAP mouse model The Jackson Laboratory 29899 B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J
Pierce DTT No-Weigh Format Thermo Scientific A39255
Protein G Dynabeads ThermoFisher 10004D For TRAP
RNaseOUT Invitrogen 10777019
Sodium Heparin Fisher Scientific BP2425
Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7.5 Invitrogen 15567-027
VWR Tube Rotator Fisher Scientific NC9854190

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Broekmans, F. J., Soules, M. R., Fauser, B. C. Ovarian aging: Mechanisms and clinical consequences. Endocrine Reviews. 30 (5), 465-493 (2009).
  2. Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: Theory, technical considerations, and future applications. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).
  3. Morris, M. E., et al. A single-cell atlas of the cycling murine ovary. eLife. 11, 77239 (2022).
  4. Kendrick, H., et al. Transcriptome analysis of mammary epithelial subpopulations identifies novel determinants of lineage commitment and cell fate. BMC Genomics. 9, 591 (2008).
  5. Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. Does FACS perturb gene expression. Cytometry A. 87 (2), 166-175 (2015).
  6. Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
  7. Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).
  8. Ocanas, S. R., et al. Minimizing the ex vivo confounds of cell-isolation techniques on transcriptomic and translatomic profiles of purified microglia. eNeuro. 9 (2), (2022).
  9. Raus, A. M., Nelson, N. E., Fuller, T. D., Ivy, A. S. 34;SIT" with Emx1-NuTRAP mice: Simultaneous INTACT and TRAP for paired transcriptomic and epigenetic sequencing. Current Protocols. 2 (10), 570 (2022).
  10. Chucair-Elliott, A. J., et al. Translatomic response of retinal Muller glia to acute and chronic stress. Neurobiology Disease. 175, 105931 (2022).
  11. Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), 13259 (2020).
  12. Briley, S. M., et al. Reproductive age-associated fibrosis in the stroma of the mammalian ovary. Reproduction. 152 (3), 245-260 (2016).
  13. Umehara, T., et al. Female reproductive life span is extended by targeted removal of fibrotic collagen from the mouse ovary. Science Advances. 8 (24), (2022).
  14. Lopez-Sanchez, N., Frade, J. M. Cell cycle analysis in the vertebrate brain using immunolabeled fresh cell nuclei. Bio-Protocol. 3 (22), 973 (2013).
  15. Saccon, T. D., et al. Primordial follicle reserve, DNA damage and macrophage infiltration in the ovaries of the long-living Ames dwarf mice. Experimental Gerontology. 132, 110851 (2020).
  16. Kinnear, H. M., et al. The ovarian stroma as a new frontier. Reproduction. 160 (3), 25-39 (2020).
  17. Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6, 5 (2020).
  18. Tighe, R. M., et al. Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American Thoracic Society workshop report. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61 (2), 150-161 (2019).
  19. Zhang, X., et al. Comparative analysis of droplet-based ultra-high-throughput single-cell RNA-Seq systems. Molecular Cell. 73 (1), 130-142 (2019).
  20. Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049 (2017).
  21. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  22. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  23. Prakadan, S. M., Shalek, A. K., Weitz, D. A. Scaling by shrinking: Empowering single-cell 'omics' with microfluidic devices. Nature Reviews Genetics. 18 (6), 345-361 (2017).
  24. Wang, Q., et al. CoBATCH for high-throughput single-cell epigenomic profiling. Molecular Cell. 76 (1), 206-216 (2019).
  25. Luo, C., et al. Robust single-cell DNA methylome profiling with snmC-seq2. Nature Communications. 9, 3824 (2018).
  26. Liu, H., et al. DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution. Nature. 598 (7879), 120-128 (2021).
  27. Yamawaki, T. M., et al. Systematic comparison of high-throughput single-cell RNA-seq methods for immune cell profiling. BMC Genomics. 22 (1), 66 (2021).
  28. Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77 (2016).
  29. Natarajan, K. N. Single-cell tagged reverse transcription (STRT-Seq). Methods in Molecular Biology. 1979, 133-153 (2019).
  30. Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
  31. Aldridge, S., Teichmann, S. A. Single cell transcriptomics comes of age. Nature Communications. 11, 4307 (2020).
  32. Clark, S. J., Lee, H. J., Smallwood, S. A., Kelsey, G., Reik, W. Single-cell epigenomics: Powerful new methods for understanding gene regulation and cell identity. Genome Biology. 17, 72 (2016).
  33. Christensson, E., Lewan, L. The use of spermidine for the isolation of nuclei from mouse liver. Studies of purity and yield during different physiological conditions. Zeitschrift für Naturforschung. Section C, Biosciences. 29 (5-6), 267-271 (1974).
  34. Levine, M. E., et al. Menopause accelerates biological aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (33), 9327-9332 (2016).
  35. Ossewaarde, M. E., et al. Age at menopause, cause-specific mortality and total life expectancy. Epidemiology. 16 (4), 556-562 (2005).
  36. Wellons, M., Ouyang, P., Schreiner, P. J., Herrington, D. M., Vaidya, D. Early menopause predicts future coronary heart disease and stroke: the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis. Menopause. 19 (10), 1081-1087 (2012).
  37. Camaioni, A., et al. The process of ovarian aging: It is not just about oocytes and granulosa cells. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 39 (4), 783-792 (2022).

Tags

JoVE'de Bu Ay Sayı 192
Fare yumurtalık epigenomu ve transkriptomunun hücreye özgü eşleştirilmiş sorgulaması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ocañas, S. R., Isola, J. V. V., … More

Ocañas, S. R., Isola, J. V. V., Saccon, T. D., Pham, K. D., Chucair-Elliott, A. J., Schneider, A., Freeman, W. M., Stout, M. B. Cell-Specific Paired Interrogation of the Mouse Ovarian Epigenome and Transcriptome. J. Vis. Exp. (192), e64765, doi:10.3791/64765 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter