Summary
In questo protocollo, il metodo di purificazione dell'affinità dei ribosomi traslanti (TRAP) e l'isolamento dei nuclei marcati in specifici tipi cellulari (INTACT) sono stati ottimizzati per l'interrogazione accoppiata del trascrittoma ovarico e dell'epigenoma specifici della cellula utilizzando il modello murino NuTRAP incrociato su una linea murina Cyp17a1-Cre.
Abstract
La valutazione dei cambiamenti epigenomici e trascrittomici specifici del tipo di cellula è fondamentale per comprendere l'invecchiamento ovarico. A tal fine, è stata eseguita l'ottimizzazione del metodo di purificazione dell'affinità ribosomiale traslante (TRAP) e l'isolamento dei nuclei marcati in specifici tipi cellulari (INTACT) per il successivo interrogatorio accoppiato del trascrittoma ovarico e dell'epigenoma cellula-specifici utilizzando un nuovo modello murino NuTRAP transgenico. L'espressione dell'allele NuTRAP è sotto il controllo di una cassetta STOP floxata e può essere mirata a specifici tipi di cellule ovariche utilizzando linee Cre specifiche del promotore. Poiché studi recenti hanno implicato le cellule stromali ovariche nel guidare i fenotipi di invecchiamento precoce, il sistema di espressione NuTRAP è stato mirato alle cellule stromali utilizzando un driver Cyp17a1-Cre. L'induzione del costrutto NuTRAP era specifica per i fibroblasti stromali ovarici e da una singola ovaia sono stati ottenuti DNA e RNA sufficienti per studi di sequenziamento. Il modello NuTRAP e i metodi qui presentati possono essere utilizzati per studiare qualsiasi tipo di cellula ovarica con una linea Cre disponibile.
Introduction
Le ovaie sono i principali attori nell'invecchiamento somatico1, con contributi distinti da specifiche popolazioni cellulari. L'eterogeneità cellulare dell'ovaio rende difficile interpretare i risultati molecolari da saggi di massa dell'ovaio intero. Comprendere il ruolo di specifiche popolazioni cellulari nell'invecchiamento ovarico è la chiave per identificare i driver molecolari responsabili della fertilità e del declino della salute nelle donne anziane. Tradizionalmente, la valutazione multi-omica di specifici tipi di cellule ovariche è stata ottenuta con tecniche come la microdissezione laser2, gli approcci a singola cellula3 o la selezione cellulare4. Tuttavia, la microdissezione può essere costosa e difficile da eseguire e la selezione cellulare può alterare i profili fenotipici cellulari5.
Un nuovo approccio per valutare i profili epigenomici e trascrittomici specifici del tipo di cellula ovarica utilizza il modello murino NuTRAP (nuclear tagging and translating ribosoma affinity purification). Il modello NuTRAP consente l'isolamento di acidi nucleici specifici del tipo di cellula senza la necessità di selezionare le cellule utilizzando i metodi di purificazione dell'affinità: purificazione dell'affinità ribosomiale traslante (TRAP) e isolamento di nuclei marcati in specifici tipi cellulari (INTACT)6. L'espressione dell'allele NuTRAP è sotto il controllo di una cassetta STOP floxata e può essere mirata a specifici tipi di cellule ovariche utilizzando linee Cre specifiche del promotore. Incrociando il topo NuTRAP con una linea Cre specifica del tipo di cellula, la rimozione della cassetta STOP provoca l'etichettatura eGFP del complesso ribosomiale e la marcatura biotina/mCherry del nucleo in modo Cre-dipendente6. Le tecniche TRAP e INTACT possono quindi essere utilizzate per isolare mRNA e DNA nucleare dal tipo di cellula di interesse e procedere ad analisi trascrittomiche ed epigenomiche.
Il modello NuTRAP è stato utilizzato in diversi tessuti, come il tessuto adiposo6, il tessuto cerebrale 7,8,9 e la retina10, per rivelare cambiamenti epigenomici e trascrittomici specifici del tipo di cellula che potrebbero non essere rilevati nell'omogenato dell'intero tessuto. I vantaggi dell'approccio NuTRAP rispetto alle tradizionali tecniche di selezione cellulare includono quanto segue: 1) la prevenzione di artefatti di attivazione ex vivo 8, 2) la necessità ridotta al minimo di attrezzature specializzate (ad esempio, selezionatori di cellule) e 3) l'aumento della produttività e la riduzione dei costi delle analisi specifiche del tipo di cellula. Inoltre, la capacità di isolare DNA e RNA specifici del tipo di cellula da un singolo topo consente analisi accoppiate che aumentano il potere statistico. Poiché studi recenti hanno implicato le cellule stromali ovariche nel guidare i fenotipi di invecchiamento precoce 11,12,13, abbiamo mirato il sistema di espressione NuTRAP alle cellule stromali e teca utilizzando un driver Cyp17a1-Cre. Qui, dimostriamo che l'induzione del costrutto NuTRAP è specifica per le cellule stromali e teche ovariche, e DNA e RNA sufficienti per gli studi di sequenziamento sono ottenuti da una singola ovaia. Il modello NuTRAP e i metodi qui presentati possono essere utilizzati per studiare qualsiasi tipo di cellula ovarica con qualsiasi linea Cre disponibile.
Per la generazione di una linea murina NuTRAP ovarica specifica per tipo cellulare, l'allele NuTRAP (nuclear tagging and translating ribosome affinity purification) ha un codone STOP floxed che controlla l'espressione di BirA, peptide di riconoscimento della biotina ligasi (BLRP)-taggato mCherry/mRANGAP1 e eGFP/L10a. Quando incrociata con una linea Cre specifica per tipo cellulare, l'espressione della cassetta NuTRAP etichetta la proteina nucleare mRANGAP1 con biotina/mCherry e la proteina ribosomiale L10a con eGFP in modo Cre-dipendente. Ciò consente l'isolamento di nuclei e mRNA da specifici tipi di cellule senza la necessità di selezionare le cellule. Ilflox/flox NuTRAP può essere abbinato a un Cre specifico per il tipo di cellula rilevante per i tipi di cellule ovariche per valutare questo.
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Protocol
Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee presso l'Oklahoma Medical Research Foundation (OMRF). I topi genitori sono stati acquistati dal Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) e allevati e alloggiati in condizioni SPF in un ambiente barriera HEPA su un ciclo luce/buio di 14 ore / 10 ore (luci accese alle 6:00) presso l'OMRF.
NOTA: In questa dimostrazione, usiamo un maschio Cyp17iCre+/−(Ceppo # 028547, The Jackson Laboratory) abbinato a una femmina NuTRAP (Ceppo # 029899, The Jackson Laboratory). La progenie desiderata di Cyp17-NuTRAP (Cyp17iCre+/−; NuTRAPflox/WT) esprimerà l'allele NuTRAP sotto il controllo del promotore Cyp17a1 nelle cellule stromali ovariche. Per questa preparazione del manoscritto, abbiamo usato topi Cyp17-NuTRAP femmina di 4 mesi (n = 4). Il DNA è stato estratto da campioni di pugni auricolari di topo per la genotipizzazione per confermare l'ereditarietà dei transgeni Cyp17iCre e NuTRAP e per il rilevamento PCR di 1) Cre generico, 2) Cyp17iCre, e 3) NuTRAP floxed utilizzando i primer elencati nella Tabella dei Materiali, come precedentemente descritto 7,8.
1. Dissezione ovarica del topo
- Eseguire l'eutanasia del topo secondo le linee guida sulla cura degli animali e l'approvazione dell'istituzione, seguita dalla raccolta delle ovaie.
- Sezionare le ovaie per rimuovere qualsiasi tessuto adiposo o parti degli ovidotti che potrebbero essere attaccati al tessuto ovarico prima di posizionare le ovaie in tubi con tampone. Procedere immediatamente alle tecniche TRAP o INTACT.
NOTA: questo protocollo non è stato ottimizzato per l'uso con tessuto congelato. L'uso di un'ovaia dello stesso mouse per ciascuna tecnica è raccomandato per future analisi statistiche.
2. Isolamento di nuclei da specifici tipi di cellule ovariche
- Preparazione del buffer
- Tampone di purificazione nucleare (NPB): per preparare 100 mL di NPB, combinare 2 mL di 1 M HEPES (concentrazione finale: 20 mM HEPES), 0,8 mL di 5 M NaCl (40 mM NaCl), 4,5 mL di 2 M KCl (90 mM KCl), 0,4 mL di 0,5 M EDTA (2 mM EDTA), 0,1 mL di 0,5 M EGTA (0,5 mM EGTA), e 92,2 ml di acqua priva di nucleasi. Supplemento con 1x inibitore della proteasi il giorno dell'isolamento dei nuclei.
NOTA: NPB può essere preparato senza l'inibitore della proteasi in anticipo e dura fino a 3 settimane a 4 °C. - Tampone di lisi dei nuclei (completo): Tampone di lisi dei nuclei con 1x inibitore della proteasi il giorno dell'isolamento dei nuclei.
- Tampone di purificazione nucleare (NPB): per preparare 100 mL di NPB, combinare 2 mL di 1 M HEPES (concentrazione finale: 20 mM HEPES), 0,8 mL di 5 M NaCl (40 mM NaCl), 4,5 mL di 2 M KCl (90 mM KCl), 0,4 mL di 0,5 M EDTA (2 mM EDTA), 0,1 mL di 0,5 M EGTA (0,5 mM EGTA), e 92,2 ml di acqua priva di nucleasi. Supplemento con 1x inibitore della proteasi il giorno dell'isolamento dei nuclei.
- Creazione della sospensione dei nuclei
NOTA: I campioni devono essere conservati sempre sul ghiaccio, salvo diversa indicazione.- Raccogliere un'ovaia da un topo Cyp17-NuTRAP (o altro Cre-NuTRAP pertinente) in 500 μL di tampone di lisi nucleica (completo). Tritare l'ovaia in otto parti all'interno del tampone usando micro forbici autoapribili.
- Utilizzare punte di pipette ad ampio foro per trasferire l'ovaio tritato e 500 μL di tampone di lisi in un omogeneizzatore Dounce di vetro su ghiaccio. Omogeneizzare l'ovaio 10x-20x con il pestello sciolto A. Aggiungere 400 μL di tampone di lisi all'omogeneizzatore Dounce, lavare il pestello A.
- Omogeneizzare l'ovaia con il pestello stretto B 10x-20x. Aggiungere 1.000 μL di tampone di lisi, lavare il pestello B. Trasferire l'omogenato (1,9 ml) in un tubo a fondo tondo da 2 ml.
- Centrifugare a 200 x g per 1,5 minuti a 4 °C per rimuovere il tessuto e i vasi sanguigni non dissociati14. Il surnatante contiene i nuclei; Scartare il pellet di tessuto non dissociato.
- Dopo aver pre-bagnato un filtro cellulare da 30 μm con 100 μL di tampone di lisi, filtrare il surnatante attraverso il filtro cellulare in un tubo conico da 15 ml. Quindi, trasferire la miscela contenente nuclei in un tubo a fondo tondo da 2 ml.
- Centrifugare il campione a 500 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante. Il pellet contiene nuclei.
- Risospendere il pellet nucleare in 250 μL di tampone di lisi ghiacciato mediante vortice brevemente a velocità da moderata ad alta. Portare il volume a 1,75 ml aggiungendo 1,5 ml di tampone di lisi. Mescolare delicatamente e riposare la sospensione nucleare sul ghiaccio per 5 minuti.
- Pellettare i nuclei mediante centrifugazione a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare con attenzione il surnatante senza disturbare il pellet nucleare. Risospendere il pellet in 200 μL di tampone ghiacciato e vortice brevemente per risospendere completamente il pellet nucleare.
- Riservare il 10% del pellet risospeso (20 μL) come campione di nuclei in ingresso per le analisi a valle.
- Prendi il pellet di nuclei risospeso e porta il volume a 2,0 ml con NPB ghiacciato. Procedere all'isolamento dei nuclei marcati utilizzando il metodo di purificazione basato sull'affinità INTACT.
- Isolamento di nuclei marcati in specifici tipi cellulari (INTATTI)
- Vortice le perle di streptavidina nel flaconcino per 30 s a velocità media per assicurarsi che siano completamente risospese. Aggiungere 30 μL di perline risospese per ciascun campione in una provetta a fondo tondo da 2 ml (le perle per un massimo di 10 campioni possono essere lavate in una singola provetta), aggiungere 1 mL di NPB e risospendere bene mediante pipettaggio.
- Posizionare il tubo sul rack magnetico per 1 minuto per separare le perline. Scartare il surnatante e rimuovere il tubo dal magnete. Risospendere le sfere magnetiche lavate in 1 mL di NPB.
- Ripetere la fase di lavaggio per un totale di tre lavaggi. Dopo il lavaggio finale, risospendere le sfere nel volume iniziale di NPB (30 μL per campione).
- Aggiungere 30 μL delle sfere lavate alla sospensione nucleare da 2 mL del punto 2.2.10. Risospendere bene la miscela di nuclei di perline pipettando e invertendo delicatamente il tubo.
- Posizionare i tubi su un miscelatore rotante in una cella frigorifera o in frigorifero per 30 minuti a bassa velocità. Incubare i campioni di input senza perline nelle stesse condizioni.
- Posizionare i tubi con la sospensione nucleare e le perle sul magnete e separare i nuclei biotinilati legati alle perle di streptavidina (frazione positiva) dalla frazione negativa dei nuclei. Lasciare che le perline si separino sul magnete per 3 minuti.
- Rimuovere il surnatante, passare la frazione negativa in un tubo fresco da 2,0 mL e conservare sul ghiaccio. Per ogni tubo di frazione positiva, rimuovere il tubo dal magnete e risospendere il contenuto in 1 mL di NPB.
- Posizionare il tubo sul magnete per 1 minuto e scartare il surnatante. Rimuovere il tubo dal magnete e risospendere la miscela di nuclei di perline lavata in 1 mL di NPB.
- Ripetere il punto 2.3.8 per un totale di tre lavaggi. Dopo il completamento di tre lavaggi, risospendere la miscela di nuclei di perline di frazione positiva in 30 μL di NPB.
- Per ogni tubo di frazione negativa, centrifugare la sospensione nucleare dal punto 2.3.7 a 500 x g per 7 minuti a 4 °C. Aspirare con cautela e scartare il surnatante. Risospendere il pellet di nuclei di frazione negativa in 30 μL di NPB.
- Conservare i nuclei dell'ingresso (fase 2.2.9), della frazione negativa (fase 2.3.10) e della frazione positiva (fase 2.3.9) in un congelatore a -80 °C fino al momento dell'isolamento del DNA nucleare o dell'RNA.
NOTA: I nuclei non devono essere congelati per protocolli che richiedono nuclei intatti come input (ad esempio, test per cromatina accessibile alla trasposasi, immunoprecipitazione della cromatina).
3. Isolamento di mRNA da specifici tipi di cellule ovariche
- Preparazione dei buffer
- Base tampone TRAP: preparare 100 mL di base tampone TRAP combinando 78,8 mL di acqua priva di RNasi, 5 mL di 1 M Tris-HCl (concentrazione finale: 50 mM Tris [pH 7,5]), 5 mL di 2 M KCl (100 mM KCl), 1,2 mL di 1 M MgCl 2 (12 mM MgCl2) e 10 mL di NP-40 al 10% (1% NP-40). Conservare a 4 °C per un massimo di 1 mese.
- Base tampone salina alta: preparare 100 ml di base tampone salina alta combinando 68,8 ml di acqua priva di RNasi, 5 ml di 1 M Tris-HCl (concentrazione finale: 50 mM Tris [pH 7,5]), 15 mL di 2 M KCl (300 mM KCl), 1,2 mL di 1M MgCl 2 (12 mM MgCl2) e 10 mL di NP-40 al 10% (1% NP-40). Conservare a 4 °C per un massimo di 1 mese.
- Tampone di omogeneizzazione TRAP (completo): preparare 1,5 ml per campione il giorno della raccolta del tessuto. Preparare 10 mL di tampone di omogeneizzazione TRAP combinando 10 mL di base tampone TRAP (dal punto 3.1.1) con 10 μL di 100 mg/mL di cicloeximide (concentrazione finale: 100 μg/mL cicloeximide), 10 mg di eparina sodica (1 mg/mL di eparina di sodio), 20 μL di 0,5 M DTT (1 mM DTT), 50 μL di 40 U/μL RNasi inibitore (200 U/mL RNasi inibitore), 200 μL di 0,1 M di spermidina (2 mM di spermidina) e una compressa di inibitori della proteasi privi di EDTA (1x).
- Tampone di lavaggio a basso contenuto di sale (completo): produrre 1,5 ml per campione il giorno della raccolta dei tessuti. Per ottenere 10 ml di tampone a basso lavaggio salino, combinare 10 mL di base tampone TRAP (dal punto 3.1.1) con 10 μL di 100 mg/mL di cicloeximide (100 μg/mL di cicloeximide) e 20 μL di 0,5 M DTT (1 mM DTT).
- Tampone ad alto lavaggio salino (completo): produrre 1,5 ml per campione il secondo giorno di isolamento TRAP. Per ottenere 10 mL di tampone ad alto lavaggio salino, combinare 10 mL di base tampone salino alto (dal punto 3.1.2) con 10 μL di 100 mg/mL di cicloeximide e 20 μL di 0,5 M DTT.
- Esecuzione della purificazione dell'affinità ribosomiale traslatoria (TRAP)
- Raccogliere l'altra ovaia da un topo Cyp17-NuTRAP (o altro Cre-NuTRAP pertinente) e metterlo in una provetta priva di RNasi da 1,5 mL contenente 100 μL di tampone di omogeneizzazione TRAP ghiacciato (dal punto 3.1.3). Tritare l'ovaia in otto parti all'interno del tampone usando micro forbici autoapribili.
- Utilizzare punte larghe per trasferire l'ovaio e 100 μL di tampone di omogeneizzazione in un omogeneizzatore Dounce di vetro. Omogeneizzare 10x-20x con il pestello sciolto A. Aggiungere 400 μL di tampone di omogeneizzazione TRAP, lavare il pestello A.
- Trasferire l'omogenato in un tubo a fondo tondo da 2 ml. Lavare l'omogeneizzatore Dounce con un ulteriore tampone di omogeneizzazione TRAP da 1 mL e trasferire il volume lavato nel tubo a fondo tondo da 2 ml.
- Centrifugare l'omogenato a 12.000 x g per 10 minuti a 4 °C. Trasferire il surnatante eliminato in un tubo a fondo tondo fresco da 2 ml. Scartare il pellet.
- Trasferire 100 μL dell'omogenato eliminato in un tubo a fondo tondo fresco da 2 mL e riservare come input su ghiaccio.
- Incubare il resto dell'omogenato eliminato (dal punto 3.2.4) con un anticorpo anti-GFP (5 μg/ml) per 1 ora a 4 °C mentre ruota l'estremità finale. Incubare il campione di input nelle stesse condizioni.
- Negli ultimi 15 minuti dell'incubazione, lavare le sfere magnetiche della proteina G nel tampone a basso contenuto di sale seguendo le seguenti fasi (3.2.8-3.2.11).
- Vortice la fiala di proteine G sfere magnetiche per 30 s per risospendere completamente. Trasferire 50 μL delle sfere magnetiche della proteina G per ciascun campione (fino a 10 campioni possono essere lavati in una provetta) in una provetta a fondo tondo da 2 ml.
- Aggiungere 500 μL di tampone a basso contenuto di sale alle perle e pipettare delicatamente per mescolare. Posizionare il tubo in un supporto magnetico per 1 minuto per raccogliere le perline contro il lato del tubo. Rimuovere e scartare il surnatante.
- Rimuovere il tubo dal supporto magnetico e aggiungere 1 mL di tampone a basso contenuto di sale al tubo. Pipettare delicatamente per mescolare. Posizionare il tubo in un supporto magnetico per 1 minuto per raccogliere le perline contro il lato del tubo. Rimuovere e scartare il surnatante.
- Ripetere il punto 3.2.10 per un totale di tre lavaggi. Dopo il lavaggio finale, rimuovere il tubo dal rack magnetico e risospendere le sfere nel volume iniziale di tampone a basso lavaggio salino (50 μL per campione).
- Trasferire le sfere lavate risospese (50 μL) nella miscela di antigene/anticorpo e incubare a 4 °C durante la notte ruotando in un miscelatore end-over-end. Incubare i campioni in ingresso ruotando end-over-end a 4 °C durante la notte per mantenere condizioni equivalenti.
- Dopo l'incubazione notturna, rimuovere i tubi dal rotatore e separare le sfere magnetiche con i ribosomi / RNA bersaglio (frazione positiva) dal surnatante (frazione negativa) utilizzando il supporto magnetico per 2,5-3 minuti. Aspirare la frazione negativa, metterla in un tubo fresco a fondo tondo da 2 ml e metterla da parte sul ghiaccio mentre si elabora la frazione positiva.
- Aggiungere 500 μL di tampone ad alto lavaggio salino (dal punto 3.1.5) al tubo con la frazione positiva e pipettare delicatamente per miscelare. Posizionare il tubo su un supporto magnetico mantenuto sul ghiaccio per 1 minuto per separare le perline. Scartare il surnatante e rimuovere il tubo dal magnete.
- Ripetere il punto 3.2.14 per un totale di tre lavaggi. Dopo il lavaggio finale, risospendere le perle in 350 μL di tampone di lisi RNA integrato con 3,5 μL di 2-mercaptoetanolo (BME). Incubare i tubi a temperatura ambiente mescolando per 10 minuti a 900 giri / min in uno shaker digitale.
- Separare le perle dalla soluzione che ora contiene i ribosomi/RNA bersaglio con un supporto magnetico per 1 minuto a temperatura ambiente. Raccogliere la frazione positiva eluita (supernatante) in un tubo fresco da 1,5 ml e aggiungere 350 μL di etanolo al 100%. Inverti per mescolare. Procedere all'isolamento dell'RNA.
- Facoltativo: per isolare l'RNA dal campione di ingresso (fase 3.2.5) e dalla frazione negativa (fase 3.2.13), trasferire 100 μL delle frazioni in ingresso e negative in provette fresche da 1,5 ml. Aggiungere 350 μL di tampone di lisi dell'RNA integrato con 3,5 μL di BME a ciascun campione. Inverti per mescolare. Aggiungere 250 μL di etanolo al 100% a ciascun tubo e capovolgere per miscelare. Procedere all'isolamento dell'RNA.
- Isolamento dell'RNA
- Trasferire 700 μL della frazione positiva e, facoltativamente, della frazione di ingresso e/o negativa su una colonna di spin di RNA. Seguire le istruzioni del produttore per isolare l'RNA dalla colonna di spin.
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Representative Results
Uno schema dei protocolli TRAP e INTACT è mostrato nella Figura 1. Qui la specificità del modello murino Cyp17-NuTRAP per le cellule stromali/teca ovariche è dimostrata dall'imaging immunofluorescente e dall'RNA-Seq dall'RNA isolato con TRAP. In primo luogo, sono state eseguite l'imaging immunofluorescenza del segnale eGFP nell'ovaio e la localizzazione del segnale eGFP alle cellule tecache e stromali. In breve, sezioni di 5 μm sono state deparaffinizzate con un gradiente di xilene ed etanolo. Per una migliore segnalazione eGFP, la proteina eGFP è stata colorata utilizzando l'anticorpo primario anti-GFP di capra e l'anticorpo secondario anti-capra Alexa 488 d'asino, e i nuclei sono stati colorati con DAPI15. Le immagini sono state scattate con un microscopio a fluorescenza con ingrandimento 20x (Figura 2A). Successivamente, TRAP è stato eseguito su ovaie di topi Cyp17-NuTRAP di 4 mesi per isolare l'RNA legato al ribosoma specificamente dalle cellule teca / stromali. L'RNA isolato da TRAP (frazione positiva) e l'RNA dell'intero tessuto (input) sono stati utilizzati per costruire librerie di sequenziamento dell'RNA filato da sequenziare su un sequenziatore di nuova generazione. Sono stati eseguiti il taglio, l'allineamento e la normalizzazione dell'RNA-Seq (DESeq2), come descritto in precedenza 7,8. L'analisi della componente principale (PCA) ha mostrato una forte separazione della frazione di input e positiva nella prima componente, suggerendo profili trascrittomici distinti (Figura 2B). C'erano 2.009 geni differenzialmente espressi tra l'input e le frazioni positive, come si vede nel grafico del vulcano (test t accoppiato, correzione FDR di test multipli di Benjamini-Hochberg < 0,05, cambiamento di piega >2; Figura 2C). Tra i geni differenzialmente espressi, è stato possibile osservare l'arricchimento dei marcatori delle cellule stromali e teca (Col3a1, Star, Fbn1, C1s) e la deplezione dei geni ovocitario (Gdf9, Oosp1, Ooep), granulosa (Amhr2, Serpine2, Eml5), delle cellule immunitarie (C1qa, C1qb, Fcerg1) e delle cellule muscolari lisce (Mfap5)16 (Figura 2D).
Figura 1: Isolamento di nuclei specifici del tipo cellulare e mRNA dal modello Cyp17-NuTRAP utilizzando i metodi INTACT e TRAP. (A) La generazione della linea Cyp17-NuTRAP si ottiene incrociando unNuTRAP flox/flox femmina con un maschio Cyp17iCre+/+ . (B) Schema delle metodologie TRAP e INTACT per isolare nuclei e polisomi dalle cellule stromali/teca del topo Cyp17-NuTRAP. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Validazione del modello murino Cyp17-NuTRAP. (A) L'immunofluorescenza è stata effettuata sulle ovaie paraffinizzate di topi Cyp17-Cre+/−NuTRAP flox/WT e Cyp17-Cre−/−NuTRAP flox/WT. La proteina eGFP è stata colorata utilizzando l'anticorpo primario anti-GFP di capra e l'anticorpo secondario anti-capra dell'asino Alexa 488 e i nuclei sono stati colorati con DAPI. Le immagini sono state scattate con un microscopio a fluorescenza con un ingrandimento di 20x. (B-D) L'RNA della frazione positiva di input e TRAP è stato isolato dalle ovaie di topoflox/WT Cyp17-Cre+/−NuTRAP (n = 4), utilizzato per preparare librerie di RNA-Seq incagliate, come precedentemente fatto7, e sequenziato in modo paired-end. Sono stati eseguiti il taglio, l'allineamento e la normalizzazione dell'RNA-Seq (DESeq2), come precedentemente fatto 7,8. (B) L'analisi delle componenti principali (PCA) di tutti i geni espressi ha mostrato una separazione dell'input TRAP e delle frazioni positive nella prima componente (varianza spiegata al 51,4%). (C) Grafico vulcanico di geni differenzialmente espressi tra le frazioni input e positive (test t accoppiato, correzione del test multiplo di Benjamini-Hochberg FDR < 0,05, variazione di piega >2). (D) Il confronto tra la frazione positiva TRAP e l'input [log2[fold change ([ositive fraction/Input)]) ha mostrato un arricchimento complessivo dei geni marcatori delle cellule stromali/theca e la deplezione dei geni marcatori ovocita, granulosa, immune e delle cellule muscolari lisce (SMC) nella frazione positiva TRAP (ratio paired t-test, Benjamini-Hochberg multiple testing correction FDR < 0,10, n = 4). Le barre rappresentano la media log2[variazione di piega (frazione positiva/input)] ± SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Il modello murino NuTRAP6 è un potente approccio di marcatura transgenica per l'interrogazione accoppiata del trascrittoma e dell'epigenoma da specifici tipi di cellule che possono essere adattati a qualsiasi tipo di cellula con un driver Cre disponibile. Qui, dimostriamo la specificità del modello murino Cyp17-NuTRAP nel colpire la teca ovarica e le cellule stromali. Il modello Cyp17-NuTRAP può essere utilizzato per chiarire ulteriormente i meccanismi epigenetici specifici della teca e delle cellule stromali coinvolti nell'invecchiamento ovarico, nel cancro e nella malattia.
Quando si seleziona un driver Cre, si consiglia di convalidare la specificità cellulare dell'espressione NuTRAP mediata da Cre utilizzando diversi approcci ortogonali. Il Cyp17a1-Cre è espresso costitutivamente. Il modello NuTRAP può anche essere incrociato con linee Cre inducibili per evitare l'espressione transitoria di geni in cellule non bersaglio durante lo sviluppo. Poiché la maggior parte delle cellule ovariche sono altamente sensibili alle fluttuazioni ormonali, anche la stadiazione del ciclo estrale dovrebbe essere considerata17.
L'approccio NuTRAP ha molti vantaggi rispetto alle tradizionali tecniche di selezione cellulare. In primo luogo, le tecniche di selezione cellulare si basano sulla creazione di sospensioni a singola cellula, che possono causare l'induzione di artefatti di attivazione ex vivo 8. Inoltre, la selezione cellulare si basa su marcatori di superficie cellulare, che possono cambiare con l'età o gli stati di malattia, mettendo così in discussione se le popolazioni di cellule confrontate tra due gruppi sperimentali siano effettivamente equivalenti. L'etichettatura dei marcatori di superficie cellulare si basa anche sull'identificazione di anticorpi affidabili per l'immunocolorazione18.
Negli ultimi dieci anni, c'è stata un'espansione delle tecniche trascrittomiche 19,20,21,22,23 ed epigenomiche24,25,26 a singola cellula/nuclei per esplorare l'eterogeneità delle popolazioni cellulari. Mentre questi approcci hanno portato a un maggiore apprezzamento dell'eterogeneità cellulare, spesso soffrono di una mancanza di sensibilità e copertura genomica, che può limitare la profondità delle analisi. Ad esempio, le tecniche di trascrittomica a singola cellula (scRNA) rilevano solo ~ 1.000-5.000 geni per cellula27, mentre la tecnica NuTRAP utilizzata in questo studio ha rilevato 14.980 geni. Inoltre, diverse tecniche di scRNA si basano sul marcaggio 3' o 5' 20,21,22,28,29,30, che non consente l'analisi di specifiche isoforme di RNA disponibili utilizzando la metodologia TRAP-seq.
Mentre la trascrittomica a singola cellula è diventata un luogo comune nella biologia molecolare (rivista in Aldridge e Teichmann31), il campo epigenetico è rimasto indietro. La maggior parte delle tecniche epigenomiche a singola cellula si basano sulla deposizione FACS di cellule o tecniche microfluidiche seguite dalla preparazione della libreria da singole cellule. Pertanto, il rendimento per le tecniche epigenomiche a singola cellula è generalmente inferiore rispetto ai metodi di incapsulamento delle goccioline comunemente usati per l'RNA-Seq32 a singola cellula. La recente aggiunta di un saggio a singola cellula (sc) o a nuclei singoli (sn) per la cromatina accessibile trasponibile (ATAC-Seq) alla famiglia genomica 10x di soluzioni unicellulari rappresenta il primo metodo basato su goccioline che consente l'interrogazione di un endpoint epigenomico (accessibilità della cromatina) a risoluzione singola cellulare. Le tecniche di multiplexing, come CoBATCH-Seq24 per le modifiche degli istoni, hanno aumentato drasticamente il throughput ma non al livello degli approcci basati su goccioline. Il sequenziamento metilico di singoli nuclei (snmC-Seq) è stato eseguito utilizzando la selezione di nuclei attivati dalla fluorescenza in singoli pozzetti e la preparazione della libreria BS-Seq25,26. Tuttavia, la dura conversione del bisolfato porta a una scarsa copertura dell'intero genoma, che richiede un ampio binning genomico durante l'analisi dei dati (~ 100 kb) e fa perdere il contesto genomico necessario per trarre solide conclusioni scientifiche. Il modello murino NuTRAP consente l'analisi sensibile dell'epigenoma e del trascrittoma di specifici tipi di cellule.
Per quanto riguarda la procedura TRAP, ci sono alcune considerazioni per garantire un isolamento di successo. In primo luogo, l'ovaio deve essere tagliato prima dell'omogeneizzazione per rompere la membrana esterna e consentire la completa dissociazione. L'ovaio è un tessuto fibroso, specialmente nei topi più anziani, rendendo difficile la completa omogeneizzazione. Tuttavia, durante l'ottimizzazione di questo protocollo, l'omogeneizzazione aggressiva durante il protocollo TRAP ha provocato la contaminazione degli isolati di RNA, con bande di DNA visibili visualizzate dall'elettroforesi capillare. Per risolvere questo problema, 2 mM di spermidina sono stati inclusi nel tampone di omogeneizzazione TRAP per stabilizzare la membrana nucleare33. Inoltre, abbiamo omogeneizzato i campioni TRAP solo con il pestello sciolto A per prevenire la rottura della membrana nucleare. È importante controllare i campioni di RNA su un Bioanalyzer o TapeStation dopo l'isolamento per garantire un numero di integrità dell'RNA >7 prima di procedere alle applicazioni di sequenziamento.
Per la procedura INTACT, anche l'ovaio deve essere tagliato prima dell'omogeneizzazione. Inoltre, abbiamo scoperto che una rotazione breve e a bassa velocità (200 x g per 1,5 minuti) dopo l'omogeneizzazione è efficace per rimuovere tessuti e vasi sanguigni non dissociati, come è stato fatto in precedenza 7,14. Se l'RNA nucleare è un endpoint desiderato, un inibitore della RNasi deve essere incluso nei tamponi INTACT. RNA-Seq nucleare o RT-qPCR possono essere utilizzati per testare la specificità cellulare degli isolamenti INTACT. Le perle di streptavidina hanno un'affinità incredibilmente elevata per la biotina, rendendo difficile separare le perle dai nuclei di biotina + seguendo il protocollo INTACT, e questo dovrebbe essere considerato quando si pianificano applicazioni a valle. Oltre a isolare nuclei specifici del tipo di cellula dai modelli NuTRAP utilizzando INTACT, i nuclei possono anche essere ordinati in base all'espressione di eGFP per applicazioni a valle. La procedura INTACT per isolare i nuclei può essere utilizzata per valutare diversi endpoint, tra cui la trascrittomica nucleare, l'epigenomica e la proteomica.
Le tecniche di cui sopra sono ottimi strumenti per le valutazioni dell'invecchiamento ovarico. L'invecchiamento ovarico è una preoccupazione non solo dal punto di vista riproduttivo, ma anche dal punto di vista della salute. La menopausa, che è la cessazione della funzione ovarica, è associata all'accelerazione degli orologi biologici34, e la menopausa precoce è associata a una durata della vita più breve e ad un aumentato rischio di malattie nelle donne35,36. L'invecchiamento degli ovociti è noto per essere direttamente correlato a un declino della forma fisica ovarica. Tuttavia, si ritiene che anche altri tipi di cellule svolgano un ruolo nel declino della durata della salute ovarica e un aumento della senescenza ovarica e dell'infiammazione37. Una migliore comprensione di quali cellule sono coinvolte in questo processo e come rallentarlo è fondamentale. Anche se ci sono differenze innegabili tra le dinamiche ovariche umane e murine, i modelli murini rimangono strumenti importanti per studiare la biologia ovarica. In questo contesto, i modelli Cre-NuTRAP possono essere strumenti utili per identificare i bersagli di tipo cellulare più efficaci per i tentativi di rallentare l'invecchiamento ovarico e la menopausa.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del National Institutes of Health (NIH) (R01AG070035, R01AG069742, T32AG052363), BrightFocus Foundation (M2020207) e Presbyterian Health Foundation. Questo lavoro è stato anche supportato in parte dal premio MERIT I01BX003906 e da un premio Shared Equipment Evaluation Program (ShEEP) ISIBX004797 dagli Stati Uniti (USA). Dipartimento degli affari dei veterani, servizio di ricerca e sviluppo del laboratorio biomedico. Gli autori desiderano inoltre ringraziare il Clinical Genomics Center (OMRF) e l'Imaging Core Facility (OMRF) per l'assistenza e l'utilizzo degli strumenti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Spermidine | Sigma-Aldrich | 05292-1ML-F | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Scientific | AM9530G | |
| 10% NP-40 | Thermo Scientific | 85124 | |
| 100 mg/mL Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C4859-1ML | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| 30 µm cell strainer | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
| anti-GFP antibody | Abcam | Ab290 | For TRAP and IHC (Rabbit polyclonal to GFP) |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | RNA Lysis Buffer in protocol |
| cOmplete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablet | Roche | 11836170001 | For TRAP Homogenization Buffer |
| Cyp17iCre mouse model | The Jackson Laboratory | 28547 | B6;SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J |
| DynaMag-2 magnet | Invitrogen | 12321D | |
| Genotyping Primers | IDT | Custom | Generic Cre - Jackson Laboratory protocol 22392, Primers: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339 |
| Cyp17iCre - Jackson Laboratory protocol 30847, Primers: 21218, 31704, 31705, 35663 | |||
| NuTRAP - Jackson Laboratory protocol 21509, Primers: 21306, 24493, 32625, 32626 | |||
| Halt Protease Inhibitor cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861278 | For NPB Buffer |
| M-280 Streptavidin Dynabeads | Invitrogen | 11205D | 2.8 µm bead diameter |
| MixMate | Eppendorf | 5353000529 | |
| Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma-Aldrich | Nuc101 | Contains Nuclei Lysis Buffer and Nuclei Storage Buffer |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9760G | |
| 2M KCl | Thermo Scientific | AM9640G | |
| 0.5 M EDTA | Thermo Scientific | AM9260G | |
| 0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
| NuTRAP mouse model | The Jackson Laboratory | 29899 | B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J |
| Pierce DTT No-Weigh Format | Thermo Scientific | A39255 | |
| Protein G Dynabeads | ThermoFisher | 10004D | For TRAP |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| Sodium Heparin | Fisher Scientific | BP2425 | |
| Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| VWR Tube Rotator | Fisher Scientific | NC9854190 |
References
- Broekmans, F. J., Soules, M. R., Fauser, B. C. Ovarian aging: Mechanisms and clinical consequences. Endocrine Reviews. 30 (5), 465-493 (2009).
- Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: Theory, technical considerations, and future applications. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).
- Morris, M. E., et al. A single-cell atlas of the cycling murine ovary. eLife. 11, 77239 (2022).
- Kendrick, H., et al. Transcriptome analysis of mammary epithelial subpopulations identifies novel determinants of lineage commitment and cell fate. BMC Genomics. 9, 591 (2008).
- Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. Does FACS perturb gene expression. Cytometry A. 87 (2), 166-175 (2015).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).
- Ocanas, S. R., et al. Minimizing the ex vivo confounds of cell-isolation techniques on transcriptomic and translatomic profiles of purified microglia. eNeuro. 9 (2), (2022).
- Raus, A. M., Nelson, N. E., Fuller, T. D., Ivy, A. S. 34;SIT" with Emx1-NuTRAP mice: Simultaneous INTACT and TRAP for paired transcriptomic and epigenetic sequencing. Current Protocols. 2 (10), 570 (2022).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Translatomic response of retinal Muller glia to acute and chronic stress. Neurobiology Disease. 175, 105931 (2022).
- Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), 13259 (2020).
- Briley, S. M., et al. Reproductive age-associated fibrosis in the stroma of the mammalian ovary. Reproduction. 152 (3), 245-260 (2016).
- Umehara, T., et al. Female reproductive life span is extended by targeted removal of fibrotic collagen from the mouse ovary. Science Advances. 8 (24), (2022).
- Lopez-Sanchez, N., Frade, J. M. Cell cycle analysis in the vertebrate brain using immunolabeled fresh cell nuclei. Bio-Protocol. 3 (22), 973 (2013).
- Saccon, T. D., et al. Primordial follicle reserve, DNA damage and macrophage infiltration in the ovaries of the long-living Ames dwarf mice. Experimental Gerontology. 132, 110851 (2020).
- Kinnear, H. M., et al. The ovarian stroma as a new frontier. Reproduction. 160 (3), 25-39 (2020).
- Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6, 5 (2020).
- Tighe, R. M., et al. Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American Thoracic Society workshop report. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61 (2), 150-161 (2019).
- Zhang, X., et al. Comparative analysis of droplet-based ultra-high-throughput single-cell RNA-Seq systems. Molecular Cell. 73 (1), 130-142 (2019).
- Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049 (2017).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Prakadan, S. M., Shalek, A. K., Weitz, D. A. Scaling by shrinking: Empowering single-cell 'omics' with microfluidic devices. Nature Reviews Genetics. 18 (6), 345-361 (2017).
- Wang, Q., et al. CoBATCH for high-throughput single-cell epigenomic profiling. Molecular Cell. 76 (1), 206-216 (2019).
- Luo, C., et al. Robust single-cell DNA methylome profiling with snmC-seq2. Nature Communications. 9, 3824 (2018).
- Liu, H., et al. DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution. Nature. 598 (7879), 120-128 (2021).
- Yamawaki, T. M., et al. Systematic comparison of high-throughput single-cell RNA-seq methods for immune cell profiling. BMC Genomics. 22 (1), 66 (2021).
- Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77 (2016).
- Natarajan, K. N. Single-cell tagged reverse transcription (STRT-Seq). Methods in Molecular Biology. 1979, 133-153 (2019).
- Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
- Aldridge, S., Teichmann, S. A. Single cell transcriptomics comes of age. Nature Communications. 11, 4307 (2020).
- Clark, S. J., Lee, H. J., Smallwood, S. A., Kelsey, G., Reik, W. Single-cell epigenomics: Powerful new methods for understanding gene regulation and cell identity. Genome Biology. 17, 72 (2016).
- Christensson, E., Lewan, L. The use of spermidine for the isolation of nuclei from mouse liver. Studies of purity and yield during different physiological conditions. Zeitschrift für Naturforschung. Section C, Biosciences. 29 (5-6), 267-271 (1974).
- Levine, M. E., et al.
- Ossewaarde, M. E., et al. Age at menopause, cause-specific mortality and total life expectancy. Epidemiology. 16 (4), 556-562 (2005).
- Wellons, M., Ouyang, P., Schreiner, P. J., Herrington, D. M., Vaidya, D. Early menopause predicts future coronary heart disease and stroke: the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis. Menopause. 19 (10), 1081-1087 (2012).
- Camaioni, A., et al. The process of ovarian aging: It is not just about oocytes and granulosa cells. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 39 (4), 783-792 (2022).
