Summary
在该协议中,翻译核糖体亲和纯化(TRAP)方法和特定细胞类型(INTACT)方法中标记的细胞核的分离针对使用NuTRAP小鼠模型交叉到Cyp17a1-Cre小鼠系的细胞特异性卵巢转录组和表观基因组的配对询问进行了优化。
Abstract
评估细胞类型特异性表观基因组和转录组变化是了解卵巢衰老的关键。为此,使用新型转基因NuTRAP小鼠模型对翻译核糖体亲和纯化(TRAP)方法进行了优化,并分离了特定细胞类型中标记的细胞核(INTACT)方法,以便随后对细胞特异性卵巢转录组和表观基因组进行配对询问。NuTRAP等位基因的表达在絮状STOP盒的控制下,可以使用启动子特异性Cre系靶向特定的卵巢细胞类型。由于最近的研究表明卵巢基质细胞驱动过早衰老表型,NuTRAP表达系统使用Cyp17a1-Cre驱动程序靶向基质细胞。NuTRAP构建体的诱导对卵巢间质成纤维细胞具有特异性,并且从单个卵巢中获得足够的DNA和RNA进行测序研究。这里介绍的NuTRAP模型和方法可用于研究具有可用Cre系的任何卵巢细胞类型。
Introduction
卵巢是体细胞衰老的主要参与者1,具有来自特定细胞群的不同贡献。卵巢的细胞异质性使得难以解释来自大块全卵巢测定的分子结果。了解特定细胞群在卵巢衰老中的作用是确定导致老年妇女生育和健康下降的分子驱动因素的关键。传统上,特定卵巢细胞类型的多组学评估是通过激光显微切割2,单细胞方法3或细胞分选4等技术实现的。然而,显微切割可能昂贵且难以执行,细胞分选可以改变细胞表型谱5。
一种评估卵巢细胞类型特异性表观基因组和转录组谱的新方法使用核标记和翻译核糖体亲和纯化(NuTRAP)小鼠模型。NuTRAP模型允许使用亲和纯化方法分离细胞类型特异性核酸,而无需进行细胞分选:翻译核糖体亲和纯化(TRAP)和分离特定细胞类型中标记的细胞核(INTACT)6。NuTRAP等位基因的表达在絮状STOP盒的控制下,可以使用启动子特异性Cre系靶向特定的卵巢细胞类型。通过用细胞类型特异性Cre系交叉NuTRAP小鼠,去除STOP盒导致核糖体复合物的eGFP标记和细胞核的生物素/mCherry标记以Cre依赖性方式6。然后可以使用TRAP和INTACT技术从感兴趣的细胞类型中分离mRNA和核DNA,并进行转录组学和表观基因组学分析。
NuTRAP模型已用于不同的组织,例如脂肪组织6,脑组织7,8,9和视网膜10,以揭示细胞类型特异性表观基因组和转录组学变化,这些变化可能无法在全组织匀浆中检测到。与传统的细胞分选技术相比,NuTRAP方法的优势包括:1)防止离体活化伪影8,2)对专用设备(即细胞分选仪)的需求最小化,以及3)细胞类型特异性分析的通量增加和成本降低。此外,从单个小鼠中分离细胞类型特异性DNA和RNA的能力允许配对分析,从而提高统计能力。由于最近的研究表明卵巢基质细胞与驱动过早衰老表型11,12,13有关,我们使用Cyp17a1-Cre驱动程序将NuTRAP表达系统靶向基质细胞和膜细胞。在这里,我们证明了NuTRAP构建体的诱导对卵巢基质和膜细胞具有特异性,并且从单个卵巢中获得足够的DNA和RNA进行测序研究。这里介绍的NuTRAP模型和方法可用于研究具有任何可用Cre系的任何卵巢细胞类型。
为了生成细胞类型特异性卵巢NuTRAP小鼠系,核标记和翻译核糖体亲和纯化(NuTRAP)等位基因具有控制BirA,生物素连接酶识别肽(BLRP)标记的mCherry/mRANGAP1和eGFP/L10a表达的絮状STOP密码子。当与细胞类型特异性Cre系交叉时,NuTRAP盒的表达以Cre依赖性方式用生物素/mCherry和核糖体蛋白L10a与eGFP标记核蛋白mRANGAP1。这允许从特定细胞类型中分离细胞核和mRNA,而无需细胞分选。NuTRAP flox/flox 可以与与卵巢细胞类型相关的细胞类型特异性Cre配对以评估这一点。
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Protocol
所有动物程序均由俄克拉荷马州医学研究基金会(OMRF)的机构动物护理和使用委员会批准。亲本小鼠从杰克逊实验室(缅因州巴尔港)购买,并在 HEPA 屏障环境中的 SPF 条件下在 OMRF 的 14 小时/10 小时光照/黑暗循环(上午 6:00 开灯)下繁殖和饲养。
注意:在本演示中,我们使用Cyp17iCre+/−(菌株#028547,杰克逊实验室)雄性与NuTRAP雌性(菌株#029899,杰克逊实验室)配对。所需的Cyp17-NuTRAP后代(Cyp17iCre+/−;NuTRAPflox/WT)将在卵巢基质细胞中 Cyp17a1启动子的控制下表达NuTRAP等位基因。对于此手稿制备,我们使用4个月大的雌性Cyp17-NuTRAP小鼠(n = 4)。从小鼠耳穿孔样品中提取DNA进行基因分型,以确认Cyp17iCre和NuTRAP转基因的遗传,并使用 材料表中列出的引物进行PCR检测1)通用Cre,2)Cyp17iCre和3)NuTRAP絮凝,如前所述7,8。
1.小鼠卵巢夹层
- 根据动物护理指南和机构的批准进行小鼠安乐死,然后收集卵巢。
- 解剖卵巢以去除可能附着在卵巢组织上的任何脂肪组织或输卵管的一部分,然后再将卵巢放入带有缓冲液的管中。立即进行陷阱或完整技术。
注意:此协议尚未针对冷冻组织进行优化。建议对每种技术使用来自同一鼠标的一个卵巢,以便将来进行统计分析。
2. 从特定卵巢细胞类型中分离细胞核
- 缓冲液制备
- 核纯化缓冲液 (NPB):要制备 100 mL NPB,混合 2 mL 1 M HEPES(终浓度:20 mM HEPES)、0.8 mL 5 M 氯化钠 (40 mM NaCl)、4.5 mL 2 M 氯化钾 (90 mM KCl)、0.4 mL 0.5 M EDTA (2 mM EDTA)、0.1 mL 0.5 M EGTA (0.5 mM EGTA), 和 92.2 mL 无核酸酶水。在细胞核分离当天补充1x蛋白酶抑制剂。
注意:NPB可以在没有蛋白酶抑制剂的情况下提前制备,并在4°C下持续长达3周。 - 细胞核裂解缓冲液(完整):在细胞核分离当天用1x蛋白酶抑制剂补充细胞核裂解缓冲液。
- 核纯化缓冲液 (NPB):要制备 100 mL NPB,混合 2 mL 1 M HEPES(终浓度:20 mM HEPES)、0.8 mL 5 M 氯化钠 (40 mM NaCl)、4.5 mL 2 M 氯化钾 (90 mM KCl)、0.4 mL 0.5 M EDTA (2 mM EDTA)、0.1 mL 0.5 M EGTA (0.5 mM EGTA), 和 92.2 mL 无核酸酶水。在细胞核分离当天补充1x蛋白酶抑制剂。
- 产生细胞核悬浮液
注意:除非另有说明,否则样品应始终保持在冰上。- 从 Cyp17-NuTRAP 小鼠(或其他相关的 Cre-NuTRAP)中收集一个卵巢,放入 500 μL 细胞核裂解缓冲液(完整)中。使用自开式微型剪刀在缓冲液内将卵巢切成八个部分。
- 使用宽口径移液器吸头将切碎的卵巢和 500 μL 裂解缓冲液转移到冰上的玻璃 Dounce 均质器中。用松散的杵A均质化卵巢10x-20x.向Dounce均质器中加入400μL裂解缓冲液,洗涤研杵A。
- 用紧密的杵B 10x-20x均质化卵巢。加入 1,000 μL 裂解缓冲液,洗涤杵 B.将匀浆 (1.9 mL) 转移到 2 mL 圆底管中。
- 在4°C下以200× g 离心1.5分钟以除去未解离的组织和血管14。上清液含有细胞核;丢弃未解离组织的沉淀。
- 用 100 μL 裂解缓冲液预润湿 30 μm 细胞过滤器后,通过细胞过滤器将上清液过滤到 15 mL 锥形管中。然后,将含细胞核的混合物转移到 2 mL 圆底管中。
- 将样品在4°C下以500× g 离心5分钟,弃去上清液。颗粒含有细胞核。
- 通过中高速短暂涡旋,将核沉淀重悬于 250 μL 冰冷裂解缓冲液中。通过加入 1.5 mL 裂解缓冲液使体积达到 1.75 mL。轻轻混合,将核悬浮液放在冰上5分钟。
- 通过在4°C下以500× g 离心5分钟来沉淀细胞核。 小心地丢弃上清液而不干扰核颗粒。将沉淀重悬于 200 μL 冰冷储存缓冲液中,并短暂涡旋以完全重悬核沉淀。
- 保留 10% 的重悬沉淀 (20 μL) 作为下游分析的输入细胞核样品。
- 取重悬的细胞核沉淀,并用冰冷的NPB将体积补足至2.0mL。继续使用基于INTACT亲和力的纯化方法分离标记的细胞核。
- 分离特定细胞类型中标记的细胞核(完整)
- 以中速涡旋小瓶中的链霉亲和素珠30秒,以确保它们完全重新悬浮。将每个样品的重悬磁珠 30 μL 加入 2 mL 圆底管中(在单管中最多可洗涤 10 个样品的磁珠),加入 1 mL NPB,并通过移液重悬良好。
- 将管子放在磁性架上1分钟以分离珠子。弃去上清液,并从磁铁上取出管。将洗涤过的磁珠重悬于 1 mL NPB 中。
- 重复洗涤步骤,总共洗涤三次。最后一次洗涤后,将磁珠重悬于初始体积的NPB(每个样品30μL)。
- 将 30 μL 洗涤过的珠子加入步骤 2.2.10 中的 2 mL 核悬浮液中。通过移液并轻轻倒置试管来重悬磁珠-核混合物。
- 将管子放在冷藏室或冰箱中的旋转混合器上低速30分钟。在相同条件下孵育不含珠子的输入样品。
- 将带有核悬浮液和磁珠的管放在磁铁上,并将与链霉亲和素珠(正级分)结合的生物素化细胞核与细胞核的负级分分开。让珠子在磁铁上分离3分钟。
- 取出上清液,将阴性部分传递到新鲜的 2.0 mL 管中,并保存在冰上。对于每个正馏分管,从磁铁上取下管,然后将内容物重悬于 1 mL NPB 中。
- 将管放在磁铁上1分钟,弃去上清液。从磁铁上取下试管,并将洗涤过的珠核混合物重悬于 1 mL NPB 中。
- 重复步骤2.3.8,总共洗涤三次。完成三次洗涤后,将正馏分珠核混合物重悬于 30 μL NPB 中。
- 对于每个负馏分管,将步骤2.3.7中的核悬浮液在4°C下以500× g 离心7分钟。 小心吸出并丢弃上清液。将负级分细胞核沉淀重悬于 30 μL NPB 中。
- 将来自输入(步骤2.2.9),负级分(步骤2.3.10)和正级分(步骤2.3.9)的细胞核储存在-80°C冰箱中,直到准备好进行核DNA或RNA分离。
注意:对于需要完整细胞核作为输入的方案,不应冷冻细胞核(即转座酶可接近染色质的测定,染色质免疫沉淀)。
3. 从特定卵巢细胞类型中分离mRNA
- 准备缓冲区
- TRAP 缓冲液基质:将 78.8 mL 无 RNase 水、5 mL 1 M Tris-HCl(终浓度:50 mM Tris [pH 7.5])、5 mL 2 M KCl (100 mM KCl)、1.2 mL 1 M MgCl 2(12 mM MgCl2)和 10 mL 10% NP-40(1% NP-40)混合制备 100 mL TRAP 缓冲液基质。在4°C下储存长达1个月。
- 高盐缓冲基质:将 68.8 mL 无 RNase 水、5 mL 1 M Tris-HCl(终浓度:50 mM Tris [pH 7.5])、15 mL 2 M KCl (300 mM KCl)、1.2 mL 1M MgCl 2(12 mM MgCl2)和 10 mL 10% NP-40(1% NP-40)混合制备 100 mL 高盐缓冲液。在4°C下储存长达1个月。
- TRAP匀浆缓冲液(完全):在组织采集当天为每个样品准备1.5 mL。通过将 10 mL TRAP 缓冲液碱(来自步骤 3.1.1)与 10 μL 100 mg/mL 环己酰亚胺(终浓度:100 μg/mL 环己胺)、10 mg 肝素钠(1 mg/mL 肝素钠)、20 μL 0.5 M DTT(1 mM DTT)、50 μL 40 U/μL RNase 抑制剂(200 U/mL RNase 抑制剂)混合制备 10 mL TRAP 匀浆液, 200 μL 0.1 M 亚精胺(2 mM 亚精胺)和一片不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂片剂 (1x)。
- 低盐洗涤缓冲液(完全):在组织采集当天每个样品制备 1.5 mL。要制备 10 mL 低盐洗涤缓冲液,请将 10 mL TRAP 缓冲液基质(来自步骤 3.1.1)与 10 μL 100 mg/mL 环己酰亚胺(100 μg/mL 环己胺)和 20 μL 0.5 M DTT(1 mM DTT)混合。
- 高盐洗涤缓冲液(完全):在 TRAP 分离的第二天,每个样品取 1.5 mL。要制备 10 mL 高盐洗涤缓冲液,请将 10 mL 高盐缓冲液碱(来自步骤 3.1.2)与 10 μL 100 mg/mL 环己酰亚胺和 20 μL 0.5 M DTT 混合。
- 执行翻译核糖体亲和纯化(TRAP)
- 从 Cyp17-NuTRAP 小鼠(或其他相关的 Cre-NuTRAP)收集其他卵巢,并将其放入含有 100 μL 冰冷 TRAP 匀浆缓冲液的 1.5 mL 无 RNase 管中(来自步骤 3.1.3)。使用自开式微型剪刀在缓冲液内将卵巢切成八个部分。
- 使用宽口径吸头将卵巢和 100 μL 均质缓冲液转移到玻璃 Dounce 均质器中。用松散的杵A匀浆10x-20x.加入400μLTRAP匀浆液,洗涤研杵A。
- 将匀浆转移到 2 mL 圆底管中。用另外 1 mL TRAP 均质缓冲液洗涤 Dounce 均质器,并将洗涤体积转移到 2 mL 圆底管中。
- 将匀浆在4°C下以12,000× g 离心10分钟。 将清除的上清液转移到新鲜的 2 mL 圆底管中。丢弃颗粒。
- 将 100 μL 清除的匀浆转移到新鲜的 2 mL 圆底管中,并作为冰上的输入保存。
- 将剩余的清除匀浆(来自步骤3.2.4)与抗GFP抗体(5μg/ mL)在4°C下孵育1小时,同时首尾相连。在相同条件下孵育输入样品。
- 在孵育的最后15分钟内,使用以下步骤(3.2.8-3.2.11)在低盐洗涤缓冲液中洗涤蛋白质G磁珠。
- 涡旋蛋白G磁珠小瓶30秒以完全重悬。将每个样品的 50 μL 蛋白 G 磁珠(一个试管中最多可洗涤 10 个样品)转移到 2 mL 圆底管中。
- 向磁珠中加入 500 μL 低盐洗涤缓冲液,轻轻移液混合。将试管放入磁性支架中1分钟,以将珠子收集到管的侧面。取出并弃去上清液。
- 从磁性支架上取下试管,并向试管中加入 1 mL 低盐洗涤缓冲液。轻轻移液混合。将试管放入磁性支架中1分钟,以将珠子收集到管的侧面。取出并弃去上清液。
- 重复步骤3.2.10,总共洗涤三次。最后一次洗涤后,从磁性架上取下试管,并将磁珠重悬于初始体积的低盐洗涤缓冲液(每个样品 50 μL)中。
- 将重悬的洗涤珠(50μL)转移到抗原样品/抗体混合物中,并在4°C下孵育过夜,同时在端到端混合器中旋转。将输入样品在4°C下端对端旋转孵育过夜以保持等效条件。
- 孵育过夜后,从旋转器中取出试管,并使用磁性支架将带有目标核糖体/ RNA(正级分)的磁珠与上清液(负级分)分离2.5-3分钟。吸出阴性部分,将其放入新鲜的 2 mL 圆底管中,并在处理正部分时将其放在冰上。
- 向含有阳性级分的管中加入 500 μL 高盐洗涤缓冲液(来自步骤 3.1.5),轻轻移液混合。将管放在冰上保持1分钟的磁性支架上以分离珠子。弃去上清液,并从磁铁上取出管。
- 重复步骤3.2.14,总共洗涤三次。最后一次洗涤后,将磁珠重悬于补充有 3.5 μL 2-巯基乙醇 (BME) 的 350 μL RNA 裂解缓冲液中。在室温下孵育试管,同时在数字摇床中以900rpm混合10分钟。
- 将珠子从现在含有目标核糖体/ RNA的溶液中分离出来,在室温下用磁性支架1分钟。将洗脱的阳性级分(上清液)收集在新鲜的 1.5 mL 管中,并加入 350 μL 100% 乙醇。反转混合。进行RNA分离。
- 可选:要从输入样品(步骤3.2.5)和阴性级分(步骤3.2.13)中分离RNA,请将100 μL的进样和阴性馏分转移到新鲜的1.5 mL管中。向每个样品中加入 350 μL RNA 裂解缓冲液,并补充 3.5 μL BME。反转混合。向每个试管中加入 250 μL 100% 乙醇,并倒置混合。进行RNA分离。
- 核糖核酸分离
- 将 700 μL 正级分以及(可选)输入和/或负级分转移到 RNA 离心柱中。按照制造商的说明从离心柱中分离RNA。
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Representative Results
TRAP和INTACT协议的原理图如图1所示。在这里,Cyp17-NuTRAP小鼠模型对卵巢基质/膜细胞的特异性通过免疫荧光成像和来自TRAP分离RNA的RNA-Seq得到证明。首先,对卵巢中的eGFP信号进行免疫荧光成像,并将eGFP信号定位到膜细胞和基质细胞。简而言之,用二甲苯和乙醇梯度对5μm切片进行脱蜡。为了获得更好的eGFP信号传导,使用山羊抗GFP一抗和Alexa 488驴抗山羊二抗对eGFP蛋白进行染色,并用DAPI15对细胞核进行染色。在荧光显微镜上以20倍放大倍率拍摄图像(图2A)。接下来,对4个月大的Cyp17-NuTRAP小鼠的卵巢进行TRAP,以特异性地从膜组/基质细胞中分离核糖体结合的RNA。使用TRAP分离的RNA(阳性部分)和全组织RNA(输入)构建链状RNA测序文库,以便在下一代测序仪上进行测序。如前所述,进行了RNA-Seq修剪,比对和归一化(DESeq2),如前所述7,8。主成分分析(PCA)显示第一组分中的输入和正部分有很强的分离,表明不同的转录组谱(图2B)。如火山图所示,输入分数和阳性分数之间有2,009个差异表达基因(配对t检验,Benjamini-Hochberg多重检验校正FDR<0.05,倍数变化>2;图 2C)。在差异表达的基因中,可以观察到基质和膜细胞标志物(Col3a1,Star,Fbn1,C1s)的富集以及卵母细胞(Gdf9,Oosp1,Ooep),颗粒(Amhr2,Serpine2,Eml5),免疫细胞(C1qa,C1qb,Fcerg1)和平滑肌细胞(Mfap5)基因16的消耗(图2D)。
图 1:使用 INTACT 和 TRAP 方法从 Cyp17-NuTRAP 模型中分离细胞类型特异性细胞核和 mRNA。 (A)Cyp17-NuTRAP系的产生是通过将NuTRAP flox/flox 母与Cyp17iCre+/+ 雄性杂交来实现的。(B)从Cyp17-NuTRAP小鼠的基质/膜细胞中分离细胞核和多聚体的TRAP和INTACT方法示意图。 请点击此处查看此图的大图。
图2:Cyp17-NuTRAP小鼠模型的验证。 (A)对Cyp17-Cre+/−NuTRAP flox/WT和Cyp17-Cre−/−NuTRAPflox/WT小鼠的石蜡卵巢进行免疫荧光。使用山羊抗GFP一抗和Alexa 488驴抗山羊二抗对eGFP蛋白进行染色,并用DAPI染色细胞核。在荧光显微镜上以20倍放大倍率拍摄图像。(乙-四)从Cyp17-Cre+/−NuTRAPflox/WT小鼠卵巢(n = 4)中分离输入和TRAP阳性部分RNA,用于制备链RNA-Seq文库,如前7,并以配对方式测序。与之前所做的一样,进行了RNA-Seq修剪,比对和归一化(DESeq2),如前7,8。(B)所有表达基因的主成分分析(PCA)显示,第一组分的TRAP输入和正分数分离(51.4%解释方差)。(C)输入和阳性分数之间差异表达基因的火山图(配对t检验,Benjamini-Hochberg多重检验校正FDR<0.05,倍数变化>2)。(D)TRAP阳性部分与输入的比较(log2[倍数变化([ositive fraction/Input)])显示基质/膜细胞标记基因的整体富集以及TRAP阳性部分中卵母细胞,颗粒,免疫和平滑肌细胞(SMC)标记基因的消耗(比率配对t检验,Benjamini-Hochberg多重检验校正FDR<0.10, n = 4)。条形表示 SEM ±平均 log2[倍数变化(正分数/输入)]。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
NuTRAP小鼠模型6是一种强大的转基因标记方法,用于配对询问来自特定细胞类型的转录组和表观基因组,这些细胞类型可以通过可用的Cre驱动程序适应任何细胞类型。在这里,我们证明了Cyp17-NuTRAP小鼠模型在靶向卵巢膜和基质细胞方面的特异性。Cyp17-NuTRAP模型可用于进一步阐明参与卵巢衰老,癌症和疾病的膜和基质细胞特异性表观遗传机制。
选择Cre驱动程序时,建议使用几种正交方法验证Cre介导的NuTRAP表达的细胞特异性。Cyp17a1-Cre 是构成性的表达。NuTRAP模型也可以与诱导的Cre系杂交,以避免基因在发育过程中在非靶细胞中的瞬时表达。由于大多数卵巢细胞对荷尔蒙波动高度敏感,因此也应考虑发情周期分期17。
与传统的细胞分选技术相比,NuTRAP方法具有许多优点。首先,细胞分选技术依赖于单细胞悬浮液的产生,这可能导致 诱导离体 活化伪像8。此外,细胞分选依赖于细胞表面标记物,这些标记物可能随着年龄或疾病状态而变化,因此提出了两个实验组之间比较的细胞群是否实际上是等效的。细胞表面标志物标记还依赖于鉴定用于免疫染色的可靠抗体18。
在过去的十年中,单细胞/细胞核转录组学19,20,21,22,23和表观基因组学24,25,26技术已经扩展,以探索细胞群的异质性。虽然这些方法使人们对细胞异质性有了更大的认识,但它们往往缺乏敏感性和基因组覆盖率,这可能会限制分析的深度。例如,单细胞转录组(scRNA)技术仅检测每个细胞~1,000-5,000个基因27,而本研究中使用的NuTRAP技术可检测14,980个基因。此外,一些scRNA技术依赖于3'或5'标记20,21,22,28,29,30,这不允许使用TRAP-seq方法分析可用的特定RNA亚型。
虽然单细胞转录组学在分子生物学中已经变得司空见惯(在Aldridge和Teichmann31中回顾),但表观遗传学领域却落后了。大多数单细胞表观基因组技术依赖于细胞的FACS沉积或微流体技术,然后从单细胞制备文库。因此,单细胞表观基因组技术的通量通常低于通常用于单细胞RNA-Seq32的液滴包封方法。最近在10x基因组学系列单细胞溶液中增加了用于转座可访问染色质(ATAC-Seq)的单细胞(sc)或单核(sn)测定,这是第一种基于液滴的方法,允许以单细胞分辨率询问表观基因组终点(染色质可及性)。多重技术,例如用于组蛋白修饰的CoBATCH-Seq24,显着提高了通量,但没有达到基于液滴的方法的水平。单核甲基测序(snmC-Seq)已使用荧光激活的细胞核分选到单个孔中和BS-Seq文库制备25,26进行。然而,苛刻的硫酸氢盐转换导致全基因组覆盖稀疏,这需要在数据分析过程中进行大的基因组分箱(~100 kb),并导致得出可靠的科学结论所需的基因组背景丢失。NuTRAP小鼠模型允许对特定细胞类型的表观基因组和转录组进行灵敏分析。
关于 TRAP 程序,有一些注意事项可以确保成功隔离。首先,必须在均质化之前切割卵巢,以使外膜破裂并允许完全解离。卵巢是一种纤维组织,特别是在老年小鼠中,使其难以完全匀浆。然而,在该方案的优化过程中,TRAP方案期间的积极匀浆导致RNA分离物受到污染,毛细管电泳显示可见的DNA条带。为了解决这个问题,在TRAP均质缓冲液中加入了2mM亚精胺,以稳定核膜33。此外,我们仅用松散的杵A均质化TRAP样品,以防止核膜的破坏。在进行测序应用之前,重要的是在分离后在生物分析仪或TapeStation上检查RNA样品,以确保RNA完整性数>7。
对于完整程序,卵巢也应在均质化之前切割。此外,我们发现,匀浆后的短而低速旋转(200 x g 1.5分钟)可有效去除未解离的组织和血管,就像之前所做的那样7,14。如果核RNA是期望的终点,则应在完整缓冲液中加入RNase抑制剂。核RNA-Seq或RT-qPCR可用于测试完整分离的细胞特异性。链霉亲和素微球对生物素具有令人难以置信的高亲和力,因此很难按照 INTACT 方案将磁珠与生物素 + 细胞核分离,在规划下游应用时应考虑这一点。除了使用INTACT从NuTRAP模型中分离细胞类型特异性细胞核外,还可以根据eGFP表达对细胞核进行分类,用于下游应用。用于分离细胞核的 INTACT 程序可用于评估多个终点,包括核转录组学、表观基因组学和蛋白质组学。
上述技术是卵巢衰老评估的重要工具。卵巢衰老不仅从生殖角度来看,而且从健康跨度的角度来看都是一个问题。更年期是卵巢功能的停止,与生物钟的加速有关34,更年期提前与女性寿命缩短和疾病风险增加有关35,36。众所周知,卵母细胞衰老与卵巢健康下降直接相关。然而,其他细胞类型也被认为在卵巢健康寿命下降和卵巢衰老和炎症增加中发挥作用37。更好地了解哪些细胞参与了这一过程以及如何减缓它的速度是关键。尽管人类和小鼠卵巢动力学之间存在不可否认的差异,但小鼠模型仍然是研究卵巢生物学的重要工具。在这种情况下,Cre-NuTRAP模型可以成为有用的工具,以确定最有效的细胞类型靶标,以减缓卵巢衰老和更年期。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国立卫生研究院(NIH)(R01AG070035,R01AG069742,T32AG052363),BrightFocus基金会(M2020207)和长老会健康基金会的资助。这项工作也得到了美国 (U.S) 的 MERIT 奖 I01BX003906 和共享设备评估计划 (ShEEP) 奖 ISIBX004797 的部分支持。退伍军人事务部,生物医学实验室研究与发展处。作者还要感谢临床基因组学中心(OMRF)和成像核心设施(OMRF)的帮助和仪器使用。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.1 M Spermidine | Sigma-Aldrich | 05292-1ML-F | |
1 M MgCl2 | Thermo Scientific | AM9530G | |
10% NP-40 | Thermo Scientific | 85124 | |
100 mg/mL Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C4859-1ML | |
2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
30 µm cell strainer | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
anti-GFP antibody | Abcam | Ab290 | For TRAP and IHC (Rabbit polyclonal to GFP) |
Buffer RLT | Qiagen | 79216 | RNA Lysis Buffer in protocol |
cOmplete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablet | Roche | 11836170001 | For TRAP Homogenization Buffer |
Cyp17iCre mouse model | The Jackson Laboratory | 28547 | B6;SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J |
DynaMag-2 magnet | Invitrogen | 12321D | |
Genotyping Primers | IDT | Custom | Generic Cre - Jackson Laboratory protocol 22392, Primers: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339 |
Cyp17iCre - Jackson Laboratory protocol 30847, Primers: 21218, 31704, 31705, 35663 | |||
NuTRAP - Jackson Laboratory protocol 21509, Primers: 21306, 24493, 32625, 32626 | |||
Halt Protease Inhibitor cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861278 | For NPB Buffer |
M-280 Streptavidin Dynabeads | Invitrogen | 11205D | 2.8 µm bead diameter |
MixMate | Eppendorf | 5353000529 | |
Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma-Aldrich | Nuc101 | Contains Nuclei Lysis Buffer and Nuclei Storage Buffer |
1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9760G | |
2M KCl | Thermo Scientific | AM9640G | |
0.5 M EDTA | Thermo Scientific | AM9260G | |
0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
NuTRAP mouse model | The Jackson Laboratory | 29899 | B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J |
Pierce DTT No-Weigh Format | Thermo Scientific | A39255 | |
Protein G Dynabeads | ThermoFisher | 10004D | For TRAP |
RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
Sodium Heparin | Fisher Scientific | BP2425 | |
Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
VWR Tube Rotator | Fisher Scientific | NC9854190 |
References
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