Summary
I denne protokollen ble metoden for translatering av ribosomaffinitetsrensing (TRAP) og isolering av kjerner merket i spesifikke celletyper (INTAKT) optimalisert for parret undersøkelse av det cellespesifikke ovarietranskriptomet og epigenomet ved bruk av NuTRAP-musemodellen krysset til en Cyp17a1-Cre muselinje.
Abstract
Vurdering av celletypespesifikke epigenomiske og transkriptomiske endringer er nøkkelen til å forstå aldring av eggstokkene. For dette formål ble optimalisering av metoden for translatering av ribosomaffinitetsrensing (TRAP) og isolering av kjerner merket i spesifikke celletyper (INTAKT) utført for den påfølgende parede undersøkelsen av det cellespesifikke ovarietranskriptomet og epigenomet ved hjelp av en ny transgen NuTRAP-musemodell. Uttrykket av NuTRAP-allelet er under kontroll av en floxed STOP-kassett og kan målrettes mot spesifikke eggstokkcelletyper ved bruk av promotorspesifikke Cre-linjer. Siden nyere studier har implisert stromale ovarieceller i å drive for tidlig aldrende fenotyper, ble NuTRAP-ekspresjonssystemet målrettet mot stromale celler ved hjelp av en Cyp17a1-Cre-driver. Induksjonen av NuTRAP-konstruksjonen var spesifikk for ovariale stromale fibroblaster, og tilstrekkelig DNA og RNA for sekvenseringsstudier ble oppnådd fra en enkelt ovarie. NuTRAP-modellen og metodene som presenteres her, kan brukes til å studere alle eggstokkcelletyper med en tilgjengelig Cre-linje.
Introduction
Eggstokkene er store aktører i somatisk aldring1, med tydelige bidrag fra spesifikke cellepopulasjoner. Den cellulære heterogeniteten til eggstokken gjør det vanskelig å tolke molekylære resultater fra bulk, hele eggstokkanalyser. Å forstå rollen som spesifikke cellepopulasjoner i aldring av eggstokkene er nøkkelen til å identifisere molekylære drivere som er ansvarlige for fruktbarhet og helsenedgang hos eldre kvinner. Tradisjonelt ble multi-omics-vurderingen av spesifikke eggstokkcelletyper oppnådd ved teknikker som lasermikrodisseksjon2, enkeltcelletilnærminger3 eller cellesortering4. Mikrodisseksjon kan imidlertid være dyrt og vanskelig å utføre, og cellesortering kan endre cellulære fenotypiske profiler5.
En ny tilnærming for å vurdere ovariecelletypespesifikke epigenomiske og transkriptomiske profiler bruker nukleær merking og oversettelse av ribosomaffinitetsrensing (NuTRAP) musemodell. NuTRAP-modellen tillater isolering av celletypespesifikke nukleinsyrer uten behov for cellesortering ved å bruke affinitetsrensingsmetodene: oversette ribosomaffinitetsrensing (TRAP) og isolering av kjerner merket i spesifikke celletyper (INTAKT)6. Uttrykket av NuTRAP-allelet er under kontroll av en floxed STOP-kassett og kan målrettes mot spesifikke eggstokkcelletyper ved bruk av promotorspesifikke Cre-linjer. Ved å krysse NuTRAP-musen med en celletypespesifikk Cre-linje, forårsaker fjerningen av STOP-kassetten eGFP-merking av det ribosomale komplekset og biotin/mCherry-merking av kjernen på en Cre-avhengig måte6. TRAP- og INACT-teknikkene kan deretter brukes til å isolere mRNA og nukleært DNA fra celletypen av interesse og fortsette til transkriptomiske og epigenomiske analyser.
NuTRAP-modellen har blitt brukt i forskjellige vev, for eksempel fettvev6, hjernevev 7,8,9 og netthinnen 10, for å avsløre celletypespesifikke epigenomiske og transkriptomiske forandringer som kanskje ikke oppdages i helvevshomogenat. Fordelene med NuTRAP-tilnærmingen i forhold til tradisjonelle cellesorteringsteknikker inkluderer følgende: 1) forebygging av ex vivo aktiveringsartefakter8, 2) det minimaliserte behovet for spesialutstyr (dvs. cellesorterere), og 3) økt gjennomstrømning og reduserte kostnader for celletypespesifikke analyser. I tillegg tillater evnen til å isolere celletypespesifikt DNA og RNA fra en enkelt mus parvise analyser som øker den statistiske styrken. Siden nyere studier har implisert stromale celler fra eggstokkene i å drive for tidlig aldrende fenotyper 11,12,13, målrettet vi NuTRAP-ekspresjonssystemet til stromale og theca-celler ved hjelp av en Cyp17a1-Cre-driver. Her demonstrerer vi at induksjonen av NuTRAP-konstruksjonen er spesifikk for ovarie stromale og theca celler, og tilstrekkelig DNA og RNA for sekvenseringsstudier er oppnådd fra en enkelt eggstokk. NuTRAP-modellen og metodene som presenteres her, kan brukes til å studere alle eggstokkcelletyper med en hvilken som helst tilgjengelig Cre-linje.
For generering av en celletypespesifikk ovarie-NuTRAP-muselinje, har kjernefysisk merking og translating ribosomaffinitetsrensing (NuTRAP) allel et floxed STOP-kodon som styrer uttrykket av BirA, biotin ligase anerkjennelse peptid (BLRP)-merket mCherry / mRANGAP1 og eGFP / L10a. Når krysset med en celletypespesifikk Cre-linje, merker uttrykket av NuTRAP-kassetten det nukleære proteinet mRANGAP1 med biotin / mCherry og ribosomalt protein L10a med eGFP på en Cre-avhengig måte. Dette muliggjør isolering av kjerner og mRNA fra spesifikke celletyper uten behov for cellesortering. NuTRAPflox/flox kan pares med en celletypespesifikk Cre relevant for eggstokkcelletyper for å vurdere dette.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Oklahoma Medical Research Foundation (OMRF). Foreldremus ble kjøpt fra Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) og avlet og plassert under SPF-forhold i et HEPA-barrieremiljø på en 14 h / 10 h lys / mørk syklus (lys på kl. 06:00) på OMRF.
MERK: I denne demonstrasjonen bruker vi en Cyp17iCre+/−(Stamme # 028547, The Jackson Laboratory) hann sammen med en NuTRAP-hunn (Stamme # 029899, Jackson-laboratoriet). Det ønskede Cyp17-NuTRAP-avkommet (Cyp17iCre+/−; NuTRAPflox/WT) vil uttrykke NuTRAP-allelet under kontroll av Cyp17a1-promotoren i stromale celler fra eggstokkene. Til denne manuskriptforberedelsen brukte vi 4 måneder gamle hunnmus Cyp17-NuTRAP (n = 4). DNA ble ekstrahert fra museøreprøver for genotyping for å bekrefte arven til Cyp17iCre- og NuTRAP-transgenene og for PCR-påvisning av 1) generisk Cre, 2) Cyp17iCre og 3) NuTRAP floxed ved hjelp av primerne oppført i materialfortegnelsen, som tidligere beskrevet 7,8.
1. Mus ovariedisseksjon
- Utfør museeutanasi i henhold til retningslinjene for dyrepleie og godkjenning av institusjonen, etterfulgt av eggstokkinnsamling.
- Dissekere eggstokkene for å fjerne fettvev eller deler av oviduktene som kan være festet til eggstokkvevet før du plasserer eggstokkene i rør med buffer. Gå umiddelbart videre til TRAP- eller INTAKT-teknikker.
MERK: Denne protokollen er ikke optimalisert for bruk med frosset vev. Bruk av en eggstokk fra samme mus for hver teknikk anbefales for fremtidig statistisk analyse.
2. Isolering av kjerner fra spesifikke eggstokkcelletyper
- Buffer forberedelse
- Kjernefysisk rensingsbuffer (NPB): For å forberede 100 ml NPB, kombiner 2 ml 1 M HEPES (sluttkonsentrasjon: 20 mM HEPES), 0,8 ml 5 M NaCl (40 mM NaCl), 4,5 ml 2 M KCl (90 mM KCl), 0,4 ml 0,5 M EDTA (2 mM EDTA), 0,1 ml 0,5 M EGTA (0,5 mM EGTA), og 92,2 ml nukleasefritt vann. Suppler med 1x proteasehemmer på dagen for kjerneisolasjon.
MERK: NPB kan tilberedes uten proteasehemmeren på forhånd og varer i opptil 3 uker ved 4 °C. - Nuclei lysis buffer (komplett): Suppler nuclei lysis buffer med 1x proteasehemmer på dagen for kjerneisolering.
- Kjernefysisk rensingsbuffer (NPB): For å forberede 100 ml NPB, kombiner 2 ml 1 M HEPES (sluttkonsentrasjon: 20 mM HEPES), 0,8 ml 5 M NaCl (40 mM NaCl), 4,5 ml 2 M KCl (90 mM KCl), 0,4 ml 0,5 M EDTA (2 mM EDTA), 0,1 ml 0,5 M EGTA (0,5 mM EGTA), og 92,2 ml nukleasefritt vann. Suppler med 1x proteasehemmer på dagen for kjerneisolasjon.
- Opprettelse av kjernesuspensjonen
MERK: Prøvene skal holdes på is til enhver tid med mindre annet er angitt.- Samle en eggstokk fra en Cyp17-NuTRAP-mus (eller annen relevant Cre-NuTRAP) i 500 μL kjernelysisbuffer (komplett). Hakk eggstokken i åtte deler i bufferen ved hjelp av selvåpnende mikrosaks.
- Bruk brede pipettespisser for å overføre hakket eggstokk og 500 μL lysisbuffer til et glass Dounce homogenisator på is. Homogeniser eggstokken 10x-20x med løs pestle A. Tilsett 400 μL lysisbuffer til Dounce-homogenisatoren, vask pestle A.
- Homogeniser eggstokken med den tette stammen B 10x-20x. Tilsett 1,000 μL lysisbuffer, vask pestle B. Overfør homogenatet (1,9 ml) til et 2 ml rundbunnsrør.
- Sentrifuge ved 200 x g i 1,5 min ved 4 °C for å fjerne udissosiert vev og blodkar14. Supernatanten inneholder kjernene; Kast pelleten av udissosiert vev.
- Etter å ha forvætet en 30 μm cellesil med 100 μL lysisbuffer, og filtrer supernatanten gjennom cellesilen til et 15 ml konisk rør. Overfør deretter den kjerneholdige blandingen til et 2 ml rundbunnsrør.
- Sentrifuger prøven ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C, og kast supernatanten. Pelleten inneholder kjerner.
- Resuspender kjernepelleten i 250 μL iskald lysisbuffer ved å virvle kort ved moderat til høy hastighet. Få volumet opp til 1,75 ml ved å legge til 1,5 ml lysisbuffer. Bland forsiktig, og hvil atomopphenget på is i 5 min.
- Pellet kjernene ved sentrifugering ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Kast forsiktig supernatanten uten å forstyrre kjernefysisk pellet. Resuspender pelleten i 200 μL iskald lagringsbuffer, og virvel kort for å fullstendig resuspendere atompelleten.
- Reserver 10% av den resuspenderte pelleten (20 μL) som en inngangskjerneprøve for nedstrømsanalyser.
- Ta den resuspenderte kjernepelleten, og øk volumet til 2,0 ml med iskald NPB. Fortsett å isolere de merkede kjernene ved hjelp av INTAKT affinitetsbasert rensemetode.
- Isolering av kjerner merket i spesifikke celletyper (INTAKT)
- Virvel streptavidinperlene i hetteglasset i 30 sekunder ved middels hastighet for å sikre at de er fullstendig resuspendert. Tilsett 30 μL resuspenderte perler for hver prøve i et 2 ml rundbunnsrør (perler for opptil 10 prøver kan vaskes i et enkelt rør), tilsett 1 ml NPB og resuspender godt ved pipettering.
- Plasser røret på magnetstativet i 1 min for å skille perlene. Kast supernatanten, og fjern slangen fra magneten. Suspender de vasket magnetiske perlene i 1 ml NPB.
- Gjenta vasketrinnet i totalt tre vasker. Etter den endelige vasken, resuspender perlene i startvolumet av NPB (30 μL per prøve).
- Tilsett 30 μL av de vaskede kulene til 2 ml kjernefysisk suspensjon fra trinn 2.2.10. Resuspender perlekjerneblandingen godt ved å pipettere og forsiktig snu røret.
- Plasser rørene på en roterende mikser i et kaldt rom eller kjøleskap i 30 minutter ved lav hastighet. Inkuber inngangsprøvene uten perler under de samme forholdene.
- Plasser rørene med kjernefysisk suspensjon og perler på magneten, og skille de biotinylerte kjernene bundet til streptapavidinperler (positiv fraksjon) fra den negative fraksjonen av kjerner. La kulene skille seg på magneten i 3 min.
- Fjern supernatanten, send den negative fraksjonen til et nytt 2,0 ml rør og reserver på is. For hvert positivt fraksjonsrør, fjern røret fra magneten og resuspender innholdet i 1 ml NPB.
- Plasser røret på magneten i 1 min, og kast supernatanten. Fjern røret fra magneten, og resuspender den vaskede perlekjerneblandingen i 1 ml NPB.
- Gjenta trinn 2.3.8 for totalt tre vasker. Etter ferdigstillelse av tre vasker, resuspender den positive fraksjonen perlekjerneblanding i 30 μL NPB.
- For hvert negative fraksjonsrør, sentrifuger kjernesuspensjonen fra trinn 2.3.7 ved 500 x g i 7 minutter ved 4 °C. Aspirer forsiktig og kast supernatanten. Resuspender den negative fraksjonskjernepelleten i 30 μL NPB.
- Oppbevar kjernene fra inngangen (trinn 2.2.9), den negative fraksjonen (trinn 2.3.10) og den positive fraksjonen (trinn 2.3.9) i en fryser på -80 °C til de er klare for nukleær DNA- eller RNA-isolasjon.
MERK: Kjernene skal ikke fryses for protokoller som krever intakte kjerner som input (dvs. analyse for transposase-tilgjengelig kromatin, kromatinimmunoprecipitation).
3. Isolering av mRNA fra spesifikke eggstokkcelletyper
- Klargjøre bufferne
- TRAP-bufferbase: Forbered 100 ml TRAP-bufferbase ved å kombinere 78,8 ml RNase-fritt vann, 5 ml 1 M Tris-HCl (endelig konsentrasjon: 50 mM Tris [pH 7,5]), 5 ml 2 M KCl (100 mM KCl), 1,2 ml 1 M MgCl 2 (12 mM MgCl2) og 10 ml 10% NP-40 (1% NP-40). Oppbevares ved 4 °C i opptil 1 måned.
- Høy saltbufferbase: Forbered 100 ml høy saltbufferbase ved å kombinere 68,8 ml RNase-fritt vann, 5 ml 1 M Tris-HCl (endelig konsentrasjon: 50 mM Tris [pH 7,5]), 15 ml 2 M KCl (300 mM KCl), 1,2 ml 1M MgCl 2 (12 mM MgCl2) og 10 ml 10% NP-40 (1% NP-40). Oppbevares ved 4 °C i opptil 1 måned.
- TRAP homogeniseringsbuffer (komplett): Forbered 1,5 ml per prøve på dagen for vevsinnsamling. Klargjør 10 ml TRAP-homogeniseringsbuffer ved å kombinere 10 ml TRAP-bufferbase (fra trinn 3.1.1) med 10 μL 100 mg/ml cykloheksimid (endelig konsentrasjon: 100 μg/ml cykloheksimid), 10 mg natriumheparin (1 mg/ml natriumheparin), 20 μL 0,5 M DTT (1 mM DTT), 50 μL 40 U/μL RNasehemmer (200 U/ml RNasehemmer), 200 μL 0,1 M spermidin (2 mM spermidin), og én EDTA-fri proteasehemmertablett (1x).
- Vaskebuffer med lavt saltinnhold (komplett): Lag 1,5 ml per prøve på dagen for vevsoppsamling. For å lage 10 ml vaskebuffer med lavt saltinnhold, kombiner 10 ml TRAP-bufferbase (fra trinn 3.1.1) med 10 μL 100 mg/ml cykloheksimid (100 μg/ml cykloheksimid) og 20 μL 0,5 M DTT (1 mM DTT).
- Høy saltvaskebuffer (komplett): Lag 1,5 ml per prøve på den andre dagen av TRAP-isolasjon. For å lage 10 ml vaskebuffer med høyt saltinnhold, kombiner 10 ml høy saltbufferbase (fra trinn 3.1.2) med 10 μL 100 mg/ml cykloheksimid og 20 μL 0,5 M DTT.
- Utføre oversettelse av ribosomaffinitetsrensing (TRAP)
- Samle den andre eggstokken fra en Cyp17-NuTRAP-mus (eller annen relevant Cre-NuTRAP) og plasser den i et 1,5 ml RNase-fritt rør som inneholder 100 μL iskald TRAP-homogeniseringsbuffer (fra trinn 3.1.3). Hakk eggstokken i åtte deler i bufferen ved hjelp av selvåpnende mikrosaks.
- Bruk brede borespisser for å overføre eggstokken og 100 μL homogeniseringsbuffer til et glass Dounce homogenisator. Homogeniser 10x-20x med løs pestle A. Tilsett 400 μL TRAP homogeniseringsbuffer, vask pestle A.
- Overfør homogenatet til et 2 ml rundbunnsrør. Vask Dounce-homogenisatoren med ytterligere 1 ml TRAP-homogeniseringsbuffer, og overfør det vaskede volumet til 2 ml rundbunnsrøret.
- Sentrifuge homogenatet ved 12 000 x g i 10 minutter ved 4 °C. Overfør den ryddede supernatanten til et nytt 2 ml rundbunnsrør. Kast pelleten.
- Overfør 100 μL av det ryddede homogenatet til et nytt 2 ml rundbunnsrør, og reserver som input på is.
- Inkuber resten av det ryddede homogenatet (fra trinn 3.2.4) med et anti-GFP-antistoff (5 μg/ml) i 1 time ved 4 °C mens det roterer ende-over-ende. Inkuber inndataprøven under de samme forholdene.
- I de siste 15 minuttene av inkubasjonen, vask protein G magnetiske perler i vaskebufferen med lite salt ved hjelp av følgende trinn (3.2.8-3.2.11).
- Vortex hetteglasset med protein G magnetiske perler i 30 s for å fullstendig resuspendere. Overfør 50 μL av protein G magnetiske perler for hver prøve (opptil 10 prøver kan vaskes i ett rør) til et 2 ml rundbunnsrør.
- Tilsett 500 μL vaskebuffer med lite salt i kulene, og pipett forsiktig for å blande. Plasser røret i et magnetisk stativ i 1 min for å samle perlene mot siden av røret. Fjern og kast supernatanten.
- Fjern røret fra magnetstativet, og tilsett 1 ml vaskebuffer med lite salt til røret. Pipett forsiktig for å blande. Plasser røret i et magnetisk stativ i 1 min for å samle perlene mot siden av røret. Fjern og kast supernatanten.
- Gjenta trinn 3.2.10 for totalt tre vasker. Etter den siste vasken, fjern røret fra magnetstativet, og resuspender perlene i startvolumet av vaskebuffer med lite salt (50 μL per prøve).
- Overfør de resuspenderte vaskede perlene (50 μL) til antigenprøven/antistoffblandingen, og inkuber ved 4 °C over natten mens du roterer i en ende-over-ende-mikser. Inkuber inngangsprøvene som roterer ende-over-ende ved 4 °C over natten for å opprettholde ekvivalente forhold.
- Etter inkubasjonen over natten, fjern rørene fra rotatoren, og separer magnetkulene med målribosomene / RNA (positiv fraksjon) fra supernatanten (negativ fraksjon) ved hjelp av magnetstativet i 2,5-3 minutter. Aspirer den negative fraksjonen, legg den i et friskt 2 ml rundbunnsrør, og sett det til side på is mens du behandler den positive fraksjonen.
- Tilsett 500 μL vaskebuffer med høyt salt (fra trinn 3.1.5) til røret med den positive fraksjonen, og pipetter forsiktig for å blande. Plasser røret på et magnetstativ som holdes på is i 1 min for å skille perlene. Kast supernatanten, og fjern slangen fra magneten.
- Gjenta trinn 3.2.14 for totalt tre vasker. Etter den siste vasken, resuspender perlene i 350 μL RNA-lysisbuffer supplert med 3,5 μL 2-merkaptoetanol (BME). Inkuber rørene ved romtemperatur mens du blander i 10 minutter ved 900 o / min i en digital shaker.
- Separer perlene fra løsningen som nå inneholder målribosomene/RNA med magnetstativ i 1 min ved romtemperatur. Samle den eluerte positive fraksjonen (supernatant) i et friskt 1,5 ml rør, og tilsett 350 μL 100% etanol. Inverter for å blande. Fortsett til RNA-isolasjonen.
- Valgfritt: For å isolere RNA fra inngangsprøven (trinn 3.2.5) og negativ fraksjon (trinn 3.2.13), overfør 100 μL av inngangen og negative fraksjoner til ferske 1,5 ml rør. Legg til 350 μL RNA-lysisbuffer supplert med 3,5 μL BME til hver prøve. Inverter for å blande. Tilsett 250 μL 100% etanol til hvert rør, og inverter for å blande. Fortsett til RNA-isolasjonen.
- RNA-isolasjon
- Overfør 700 μL av den positive fraksjonen og eventuelt inngang og/eller negativ fraksjon til en RNA-spinnkolonne. Følg produsentens instruksjoner for å isolere RNA fra spinnkolonnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et skjema over TRAP- og INTAKT-protokollene er vist i figur 1. Her er spesifisiteten til Cyp17-NuTRAP-musemodellen til ovarial stromal/theca-celler demonstrert ved immunfluorescerende avbildning og RNA-Seq fra TRAP-isolert RNA. Først ble immunfluorescensavbildning av eGFP-signalet i eggstokken og lokalisering av eGFP-signalet til theca- og stromale celler utført. Kort fortalt ble 5 μm seksjoner deparaffinisert med en xylen- og etanolgradient. For bedre eGFP-signalering ble eGFP-proteinet farget ved hjelp av geitanti-GFP primærantistoff og Alexa 488 esel-anti-geit sekundært antistoff, og kjernene ble farget med DAPI15. Bildene ble tatt på fluorescensmikroskop ved 20x forstørrelse (figur 2A). Deretter ble TRAP utført på eggstokkene fra 4 måneder gamle Cyp17-NuTRAP-mus for å isolere ribosombundet RNA spesifikt fra theca / stromale celler. Det TRAP-isolerte RNA (positiv fraksjon) og helvevs RNA (inngang) ble brukt til å konstruere strandede RNA-sekvenseringsbiblioteker for å sekvensere på en neste generasjons sequencer. RNA-Seq trimming, justering og normalisering (DESeq2) ble utført, som tidligere beskrevet 7,8. Prinsipal komponentanalyse (PCA) viste sterk separasjon av input og positiv fraksjon i den første komponenten, noe som tyder på distinkte transkriptomiske profiler (figur 2B). Det var 2009 differensielt uttrykte gener mellom inngangen og positive fraksjoner, som sett i vulkanplottet (paret t-test, Benjamini-Hochberg multippel testkorreksjon FDR < 0,05, foldeendring >2; Figur 2C). Av de differensielt uttrykte genene kunne man observere anrikning av stromale og thekacellemarkører (Col3a1, Star, Fbn1, C1s) og uttømming av oocytt (Gdf9, Oosp1, Ooep), granulosa (Amhr2, Serpine2, Eml5), immuncelle (C1qa, C1qb, Fcerg1) og glatt muskelcelle (Mfap5) gener16 (figur 2D).
Figur 1: Isolering av celletypespesifikke kjerner og mRNA fra Cyp17-NuTRAP-modellen ved hjelp av INTAKT- og TRAP-metodene. (A) Genereringen av Cyp17-NuTRAP-linjen oppnås ved å krysse en NuTRAP flox/flox-hunn med en Cyp17iCre+/+ -hann. (B) Skjematisk fremstilling av TRAP- og INTAKT-metodene for å isolere kjerner og polysomer fra stromal/theca-cellene til Cyp17-NuTRAP-musen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Validering av Cyp17-NuTRAP-musemodellen. (A) Immunfluorescens ble utført på de parafiniserte eggstokkene til Cyp17-Cre+/−NuTRAP flox/WT og Cyp17-Cre−/−NuTRAPflox/WT-mus. eGFP-protein ble farget ved hjelp av geit anti-GFP primær antistoff og Alexa 488 esel anti-geit sekundært antistoff, og kjernene ble farget med DAPI. Bildene ble tatt på fluorescensmikroskop ved 20x forstørrelse. (VG Nett) Input og TRAP positiv fraksjon RNA ble isolert fra Cyp17-Cre+/−NuTRAPflox/WT museeggstokkene (n = 4), brukt til å forberede strandede RNA-Seq-biblioteker, som tidligere gjort7, og sekvensert på en paret måte. RNA-Seq trimming, justering og normalisering (DESeq2) ble utført, som tidligere gjort 7,8. (B) Hovedkomponentanalysen (PCA) av alle de uttrykte genene viste en separasjon av TRAP-inngangen og positive fraksjoner i den første komponenten (51,4% forklart varians). (C) Vulkanplott av differensielt uttrykte gener mellom inngang og positive fraksjoner (paret t-test, Benjamini-Hochberg multippel testkorreksjon FDR < 0,05, foldeendring >2). (D) Sammenligningen av den positive TRAP-fraksjonen med inngangen (log2[fold change ([ositive fraction/Input)]) viste en samlet anrikning av stromal/theca-cellemarkørgenene og uttømmingen av markørgenene for oocytt, granulosa, immun og glatt muskelcelle (SMC) i TRAP-positiv fraksjon (ratioparet t-test, Benjamini-Hochberg multippel testkorreksjon FDR < 0,10, n = 4). Stolpene representerer gjennomsnittlig log2[fold change (positiv fraction/input)] ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NuTRAP-musemodell6 er en kraftig transgen merkingsmetode for parret undersøkelse av transkriptomet og epigenomet fra spesifikke celletyper som kan tilpasses alle celletyper med en tilgjengelig Cre-driver. Her demonstrerer vi spesifisiteten til Cyp17-NuTRAP-musemodellen ved målretting mot ovarieteca og stromale celler. Cyp17-NuTRAP-modellen kan brukes til å ytterligere belyse theca- og stromalcellespesifikke epigenetiske mekanismer involvert i aldring av eggstokkene, kreft og sykdom.
Når du velger en Cre-driver, anbefales det å validere cellespesifisiteten til det Cre-medierte NuTRAP-uttrykket ved hjelp av flere ortogonale tilnærminger. Cyp17a1-Cre er konstitutivt uttrykt. NuTRAP-modellen kan også krysses med induserbare Cre-linjer for å unngå forbigående ekspresjon av gener i ikke-målceller under utvikling. Siden de fleste eggstokkceller er svært følsomme for hormonelle svingninger, bør brunstsyklusstaging også vurderes17.
NuTRAP-tilnærmingen har mange fordeler sammenlignet med tradisjonelle cellesorteringsteknikker. For det første er cellesorteringsteknikker avhengige av opprettelsen av enkeltcellesuspensjoner, noe som kan forårsake induksjon av ex vivo aktiveringsartefakter8. I tillegg er cellesortering avhengig av celleoverflatemarkører, som kan endres med alder eller sykdomstilstander, og dermed stille spørsmål ved om populasjonene av celler som sammenlignes mellom to eksperimentelle grupper, faktisk er ekvivalente. Merking av celleoverflatemarkører er også avhengig av identifisering av pålitelige antistoffer for immunfarging18.
I løpet av det siste tiåret har det vært en utvidelse i enkeltcelle / kjerner transkriptomiske 19,20,21,22,23 og epigenomiske24,25,26 teknikker for å utforske heterogeniteten til cellepopulasjoner. Selv om disse tilnærmingene har ført til en større forståelse av cellulær heterogenitet, lider de ofte av mangel på følsomhet og genomisk dekning, noe som kan begrense dybden av analyser. For eksempel oppdager enkeltcelle transkriptomiske (scRNA) teknikker bare ~ 1,000-5,000 gener per celle27, mens NuTRAP-teknikken som ble brukt i denne studien oppdaget 14,980 gener. I tillegg er flere scRNA-teknikker avhengige av 3' eller 5' merking 20,21,22,28,29,30, som ikke tillater analyse av spesifikke RNA-isoformer tilgjengelig ved bruk av TRAP-seq-metodikken.
Mens encelletranskriptomikk har blitt vanlig i molekylærbiologi (gjennomgått i Aldridge og Teichmann31), har det epigenetiske feltet ligget bak. De fleste enkeltcellede epigenomiske teknikker er avhengige av FACS-avsetning av celler eller mikrofluidiske teknikker etterfulgt av bibliotekforberedelse fra enkeltceller. Som sådan er gjennomstrømningen for enkeltcelle epigenomiske teknikker generelt lavere enn for dråpeinnkapslingsmetodene som vanligvis brukes til enkeltcelle RNA-Seq32. Den nylige tilsetningen av en enkeltcelle (sc) eller enkeltkjerner (sn) analyse for transponerbart tilgjengelig kromatin (ATAC-Seq) til 10x genomikkfamilien av enkeltcelleløsninger representerer den første dråpebaserte metoden som muliggjør undersøkelse av et epigenomisk endepunkt (kromatintilgjengelighet) ved enkeltcelleoppløsning. Multipleksingsteknikker, som CoBATCH-Seq24 for histonmodifikasjoner, har økt gjennomstrømningen dramatisk, men ikke til nivået av dråpebaserte tilnærminger. Enkeltkjerner metylsekvensering (snmC-Seq) er utført ved hjelp av fluorescensaktiverte kjernesortering i individuelle brønner og BS-Seq bibliotekforberedelse25,26. Den harde bisulfatkonverteringen fører imidlertid til sparsom genomdekning, noe som nødvendiggjør stor genomisk binning under dataanalyse (~ 100 kb) og forårsaker at den genomiske konteksten som er nødvendig for å gjøre robuste vitenskapelige konklusjoner, går tapt. NuTRAP-musemodellen tillater sensitiv analyse av epigenom og transkriptom av spesifikke celletyper.
Når det gjelder TRAP-prosedyren, er det noen hensyn å ta for å sikre vellykket isolasjon. Først må eggstokken kuttes før homogenisering for å bryte den ytre membranen og tillate fullstendig dissosiasjon. Eggstokken er et fibrøst vev, spesielt hos eldre mus, noe som gjør det vanskelig å homogenisere fullt ut. Under optimaliseringen av denne protokollen resulterte aggressiv homogenisering under TRAP-protokollen imidlertid i forurensning av RNA-isolatene, med synlige DNA-bånd vist ved kapillær elektroforese. For å løse dette problemet ble 2 mM spermidin inkludert i TRAP-homogeniseringsbufferen for å stabilisere kjernemembranen33. I tillegg homogeniserte vi bare TRAP-prøvene med løs pestel A for å forhindre forstyrrelse av kjernemembranen. Det er viktig å sjekke RNA-prøvene på en bioanalysator eller TapeStation etter isolasjon for å sikre et RNA-integritetsnummer >7 før du fortsetter til sekvenseringsapplikasjoner.
For INACT-prosedyren bør eggstokken også kuttes før homogenisering. I tillegg har vi funnet ut at et kort, lavhastighets spinn (200 x g i 1,5 min) etter homogenisering er effektivt for å fjerne udissosiert vev og blodkar, slik det tidligere ble gjort 7,14. Hvis kjerne-RNA er et ønsket endepunkt, bør en RNase-hemmer inkluderes i INTAKT-bufferne. Nukleær RNA-Seq eller RT-qPCR kan brukes til å teste cellespesifisiteten til INTAKT-isolasjonene. Streptavidinperler har en utrolig høy affinitet for biotin, noe som gjør det vanskelig å skille kulene fra biotin+-kjerner etter INTAKT-protokollen, og dette bør vurderes når du planlegger nedstrømsapplikasjoner. I tillegg til å isolere celletypespesifikke kjerner fra NuTRAP-modeller ved hjelp av INTAKT, kan kjerner også sorteres basert på eGFP-uttrykk for nedstrømsapplikasjoner. INTAKT-prosedyren for isolering av kjerner kan brukes til å vurdere flere endepunkter, inkludert nukleær transkriptomikk, epigenomikk og proteomikk.
De nevnte teknikkene er gode verktøy for ovarie aldring vurderinger. Ovarian aldring er en bekymring ikke bare fra et reproduktivt perspektiv, men også fra et helseperspektiv. Overgangsalder, som er opphør av eggstokkfunksjonen, er forbundet med akselerasjonen av biologiske klokker34, og tidlig overgangsalder er forbundet med kortere levetid og økt risiko for sykdommer hos kvinner35,36. Oocyte aldring er kjent for å være direkte relatert til en nedgang i ovarial fitness. Imidlertid antas andre celletyper også å spille roller i nedgangen i ovariehelsespennet og en økning i ovariesenescens og betennelse37. En bedre forståelse av hvilke celler som er involvert i denne prosessen og hvordan du kan bremse den er nøkkelen. Selv om det er ubestridelige forskjeller mellom menneskelig og murine ovariedynamikk, forblir musemodeller viktige verktøy for å undersøke eggstokkbiologi. I denne sammenheng kan Cre-NuTRAP-modellene være nyttige verktøy for å identifisere de mest effektive celletypemålene for forsøk på å bremse aldring av eggstokkene og overgangsalderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health (NIH) (R01AG070035, R01AG069742, T32AG052363), BrightFocus Foundation (M2020207) og Presbyterian Health Foundation. Dette arbeidet ble også delvis støttet av MERIT-prisen I01BX003906 og en Shared Equipment Evaluation Program (ShEEP)-pris ISIBX004797 fra USA Institutt for veteransaker, Biomedisinsk laboratorieforskning og utviklingstjeneste. Forfatterne vil også takke Clinical Genomics Center (OMRF) og Imaging Core Facility (OMRF) for hjelp og instrumentbruk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Spermidine | Sigma-Aldrich | 05292-1ML-F | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Scientific | AM9530G | |
| 10% NP-40 | Thermo Scientific | 85124 | |
| 100 mg/mL Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C4859-1ML | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| 30 µm cell strainer | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
| anti-GFP antibody | Abcam | Ab290 | For TRAP and IHC (Rabbit polyclonal to GFP) |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | RNA Lysis Buffer in protocol |
| cOmplete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablet | Roche | 11836170001 | For TRAP Homogenization Buffer |
| Cyp17iCre mouse model | The Jackson Laboratory | 28547 | B6;SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J |
| DynaMag-2 magnet | Invitrogen | 12321D | |
| Genotyping Primers | IDT | Custom | Generic Cre - Jackson Laboratory protocol 22392, Primers: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339 |
| Cyp17iCre - Jackson Laboratory protocol 30847, Primers: 21218, 31704, 31705, 35663 | |||
| NuTRAP - Jackson Laboratory protocol 21509, Primers: 21306, 24493, 32625, 32626 | |||
| Halt Protease Inhibitor cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861278 | For NPB Buffer |
| M-280 Streptavidin Dynabeads | Invitrogen | 11205D | 2.8 µm bead diameter |
| MixMate | Eppendorf | 5353000529 | |
| Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma-Aldrich | Nuc101 | Contains Nuclei Lysis Buffer and Nuclei Storage Buffer |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9760G | |
| 2M KCl | Thermo Scientific | AM9640G | |
| 0.5 M EDTA | Thermo Scientific | AM9260G | |
| 0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
| NuTRAP mouse model | The Jackson Laboratory | 29899 | B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J |
| Pierce DTT No-Weigh Format | Thermo Scientific | A39255 | |
| Protein G Dynabeads | ThermoFisher | 10004D | For TRAP |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| Sodium Heparin | Fisher Scientific | BP2425 | |
| Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| VWR Tube Rotator | Fisher Scientific | NC9854190 |
References
- Broekmans, F. J., Soules, M. R., Fauser, B. C. Ovarian aging: Mechanisms and clinical consequences. Endocrine Reviews. 30 (5), 465-493 (2009).
- Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: Theory, technical considerations, and future applications. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).
- Morris, M. E., et al. A single-cell atlas of the cycling murine ovary. eLife. 11, 77239 (2022).
- Kendrick, H., et al. Transcriptome analysis of mammary epithelial subpopulations identifies novel determinants of lineage commitment and cell fate. BMC Genomics. 9, 591 (2008).
- Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. Does FACS perturb gene expression. Cytometry A. 87 (2), 166-175 (2015).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).
- Ocanas, S. R., et al. Minimizing the ex vivo confounds of cell-isolation techniques on transcriptomic and translatomic profiles of purified microglia. eNeuro. 9 (2), (2022).
- Raus, A. M., Nelson, N. E., Fuller, T. D., Ivy, A. S. 34;SIT" with Emx1-NuTRAP mice: Simultaneous INTACT and TRAP for paired transcriptomic and epigenetic sequencing. Current Protocols. 2 (10), 570 (2022).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Translatomic response of retinal Muller glia to acute and chronic stress. Neurobiology Disease. 175, 105931 (2022).
- Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), 13259 (2020).
- Briley, S. M., et al. Reproductive age-associated fibrosis in the stroma of the mammalian ovary. Reproduction. 152 (3), 245-260 (2016).
- Umehara, T., et al. Female reproductive life span is extended by targeted removal of fibrotic collagen from the mouse ovary. Science Advances. 8 (24), (2022).
- Lopez-Sanchez, N., Frade, J. M. Cell cycle analysis in the vertebrate brain using immunolabeled fresh cell nuclei. Bio-Protocol. 3 (22), 973 (2013).
- Saccon, T. D., et al. Primordial follicle reserve, DNA damage and macrophage infiltration in the ovaries of the long-living Ames dwarf mice. Experimental Gerontology. 132, 110851 (2020).
- Kinnear, H. M., et al. The ovarian stroma as a new frontier. Reproduction. 160 (3), 25-39 (2020).
- Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6, 5 (2020).
- Tighe, R. M., et al. Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American Thoracic Society workshop report. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61 (2), 150-161 (2019).
- Zhang, X., et al. Comparative analysis of droplet-based ultra-high-throughput single-cell RNA-Seq systems. Molecular Cell. 73 (1), 130-142 (2019).
- Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049 (2017).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Prakadan, S. M., Shalek, A. K., Weitz, D. A. Scaling by shrinking: Empowering single-cell 'omics' with microfluidic devices. Nature Reviews Genetics. 18 (6), 345-361 (2017).
- Wang, Q., et al. CoBATCH for high-throughput single-cell epigenomic profiling. Molecular Cell. 76 (1), 206-216 (2019).
- Luo, C., et al. Robust single-cell DNA methylome profiling with snmC-seq2. Nature Communications. 9, 3824 (2018).
- Liu, H., et al. DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution. Nature. 598 (7879), 120-128 (2021).
- Yamawaki, T. M., et al. Systematic comparison of high-throughput single-cell RNA-seq methods for immune cell profiling. BMC Genomics. 22 (1), 66 (2021).
- Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77 (2016).
- Natarajan, K. N. Single-cell tagged reverse transcription (STRT-Seq). Methods in Molecular Biology. 1979, 133-153 (2019).
- Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
- Aldridge, S., Teichmann, S. A. Single cell transcriptomics comes of age. Nature Communications. 11, 4307 (2020).
- Clark, S. J., Lee, H. J., Smallwood, S. A., Kelsey, G., Reik, W. Single-cell epigenomics: Powerful new methods for understanding gene regulation and cell identity. Genome Biology. 17, 72 (2016).
- Christensson, E., Lewan, L. The use of spermidine for the isolation of nuclei from mouse liver. Studies of purity and yield during different physiological conditions. Zeitschrift für Naturforschung. Section C, Biosciences. 29 (5-6), 267-271 (1974).
- Levine, M. E., et al.
- Ossewaarde, M. E., et al. Age at menopause, cause-specific mortality and total life expectancy. Epidemiology. 16 (4), 556-562 (2005).
- Wellons, M., Ouyang, P., Schreiner, P. J., Herrington, D. M., Vaidya, D. Early menopause predicts future coronary heart disease and stroke: the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis. Menopause. 19 (10), 1081-1087 (2012).
- Camaioni, A., et al. The process of ovarian aging: It is not just about oocytes and granulosa cells. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 39 (4), 783-792 (2022).
