Summary
نقدم هنا مبدأ وهيكل وتعليمات نظام اختبار حساسية مضادات الميكروبات / فحص العاثيات الذكي عالي الإنتاجية. يتضح تطبيقه باستخدام السالمونيلا المعزولة من الدواجن في شاندونغ ، الصين ، كمثال. يتم حساب مؤشر لار ، وتناقش أهميته في تقييم مقاومة مضادات الميكروبات بشكل شامل.
Abstract
لتحسين كفاءة اختبار الحساسية لمضادات الميكروبات (AST) وفحص العاثيات عالية الإنتاجية للبكتيريا المقاومة وتقليل تكلفة الكشف ، تم تطوير نظام ذكي عالي الإنتاجية لفحص AST / phage ، بما في ذلك ملقح مصفوفة 96 نقطة ، ومحول الحصول على الصور ، والبرامج المقابلة ، وفقا لمعايير AST ونقاط توقف المقاومة (R) التي صاغها معهد المعايير السريرية والمخبرية (CLSI). تم إجراء AST وإحصائيات توزيعات الحد الأدنى للتركيز المثبط (MIC) (من R / 8 إلى 8R) ل 1500 سلالة من السالمونيلا المعزولة من الدواجن في شاندونغ ، الصين ، ضد 10 عوامل مضادة للميكروبات بواسطة نظام فحص AST / phage الذكي عالي الإنتاجية. تم الحصول على مؤشر لار ، الذي يعني "مضادات حيوية أقل ، ومقاومة أقل وبقايا حتى القليل من المضادات الحيوية" ، عن طريق حساب المتوسط المرجح لكل MIC والقسمة على R. يحسن هذا النهج الدقة مقارنة باستخدام انتشار المقاومة لتوصيف درجة مقاومة مضادات الميكروبات (AMR) للسلالات عالية المقاومة. بالنسبة لسلالات السالمونيلا ذات مقاومة مضادات الميكروبات العالية ، تم فحص العاثيات المحللة بكفاءة من مكتبة العاثيات بواسطة هذا النظام ، وتم حساب طيف التحلل وتحليله. أظهرت النتائج أن نظام فحص AST / phage الذكي عالي الإنتاجية كان قابلا للتشغيل ودقيقا وعالي الكفاءة وغير مكلف وسهل الصيانة. وإلى جانب نظام شاندونغ لرصد مقاومة مضادات الميكروبات البيطرية، كان النظام مناسبا للبحث العلمي والكشف السريري المتعلق بمقاومة مضادات الميكروبات.
Introduction
نظرا لاستخدام العوامل المضادة للميكروبات على نطاق واسع للوقاية من الأمراض المعدية البكتيرية ، أصبحت مقاومة مضادات الميكروبات (AMR) مشكلة صحية عامة عالمية1. مكافحة مقاومة مضادات الميكروبات هي المهمة الرئيسية الحالية لرصد مقاومة مضادات الميكروبات لمسببات الأمراض الوبائية والعلاج التآزري للعوامل الحساسة المضادة للميكروبات والبكتيريا المحللة2.
اختبار حساسية مضادات الميكروبات في المختبر (AST) هو الدعامة الأساسية لرصد العلاج والكشف عن مستوى مقاومة مضادات الميكروبات. إنه جزء مهم من علم الأدوية المضادة للميكروبات والأساس الحاسم للطب السريري. قام معهد المعايير السريرية والمخبرية (CLSI) التابع للولايات المتحدة واللجنة الأوروبية لاختبار الحساسية لمضادات الميكروبات (EUCAST) بصياغة وتنقيح المعايير الدولية ل AST وتعديل واستكمال طرق AST ونقاط التوقف باستمرار لتحديد MIC لمزيج معين من "العامل المضاد للميكروبات" باعتباره حساسا (S) أو مقاوما (R) أو وسيطا (I) 3 ، 4.
من ثمانينيات القرن العشرين إلى تسعينيات القرن العشرين ، تم تطوير أدوات التخفيف الدقيقة الأوتوماتيكية بسرعة وتطبيقها على الممارسة السريرية ، مع أمثلة تشمل Alfred 60AST و VITEK System و PHOENIXTM و Cobasbact5،6،7. ومع ذلك ، كانت هذه الأدوات باهظة الثمن ، وتتطلب مواد استهلاكية عالية التكلفة ، وتم تصميم نطاقات الكشف الخاصة بها لأدوية المرضى السريرية5،6،7. لهذه الأسباب ، فهي ليست مناسبة للفحص السريري البيطري والكشف عن كميات كبيرة من السلالات شديدة المقاومة. في هذه الدراسة ، تم تطوير نظام فحص AST / phage ذكي عالي الإنتاجية ، بما في ذلك ملقح مصفوفة 96 نقطة (الشكل 1) ، ومحول الحصول على الصور (الشكل 2) ، والبرنامجالمقابل 8 ، لإجراء AST لمجموعة من سلالات البكتيريا ضد عوامل متعددة مضادة للميكروبات في وقت واحد بواسطة طريقة تخفيف أجار. علاوة على ذلك ، تم استخدام النظام أيضا للكشف عن أنماط تحلل العاثيات وتحليلها ضد البكتيريا المقاومة لمضادات الميكروبات9 ، وتم اختيار العاثيات المحللة بكفاءة من مكتبة العاثيات. تم العثور على هذا النظام ليكون فعالا وبأسعار معقولة وسهل التشغيل.
الشكل 1: مخطط إنشائي لملقح المصفوفة المكون من 96 نقطة. 1: لوحة دبوس التلقيح. 2: الناقل المحمول. 3: كتلة البذور. 4: لوحة حضن. 5: قاعدة. 6: مقبض التشغيل. 7: دبوس الحد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مخطط هيكلي لمحول الحصول على الصور. 1: قذيفة. 2: شاشة عرض. 3: غرفة الحصول على الصور. 4: قاعدة لوحة الكشف. 5: لوحة الكشف داخل وخارج المستودع. 6: لوحة التحكم. 7: جهاز تحويل الحصول على الصور. 8: مصدر الضوء. 9: ماسح الصور. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم جمع سلالات السالمونيلا المستخدمة في هذه الدراسة من الدواجن في شاندونغ ، الصين ، بعد الحصول على موافقة من لجنة السلامة الحيوية التابعة لمعهد علوم والطب البيطري ، أكاديمية شاندونغ للعلوم الزراعية ، الصين.
1. تطبيق نظام AST الذكي عالي الإنتاجية8
- إعداد اللقاح
- احتضان كائن مراقبة الجودة الإشريكية القولونية و 93 سلالة من السالمونيلا ليتم اختبارها ل AST على ألواح مولر هينتون أجار (MHA) لمدة 16-18 ساعة عند 37 درجة مئوية3.
- قم بإعداد لقاح كل سلالة لمطابقة معيار التعكر 0.5 McFarland بناء على الطريقة المحددة في معيار CLSI3ثم قم بتخفيفه 10 مرات.
- ضع 200 ميكرولتر من المياه المالحة العادية المعقمة فيالبئر الأفقي الأول (A1) للوحة 96 بئرا كعنصر تحكم سلبي ، وتعليقين لكائن مراقبة الجودةفي البئرين الأفقيين 2 و 3 (A2و A3) كتحكم إيجابي ، ومراقبة الجودة ، على التوالي. أضف 200 ميكرولتر من معلقات اللقاح المخففة لكل بقعة تم اختبارها في 93 بئرا المقابلة في كتلة البذور المكونة من 96 بئرا.
- تحضير لوحة أجار مضادات الميكروبات
- اضبط نطاقات تركيز العوامل المضادة للبكتيريا المختلفة التي تم اختبارها وفقا لنطاق حساب مؤشر لار (من 0.125R إلى 8R). تتراوح التركيزات من نطاق مراقبة الجودة أو 0.0625R (يخضع للنطاق الأدنى) إلى 8R.
ملاحظة: إذا لم يتم حساب مؤشر لار ، يمكن تعيين نطاق تركيزات المضادات الحيوية وفقا لاحتياجات AST. - تنفيذ مخطط تخفيف مضاعفة log2 لمحلول المضادات الحيوية بدءا من تركيز مخزون مناسب بناء على طريقة تخفيف الآجار المحددة في معيار CLSI3.
- تعقيم عبوات زجاجية سعة 50 مل تحتوي على 18 مل من وسائط أجار مولر-هينتون. أضف 2 مل من التخفيفات المناسبة للمحلول المضاد للميكروبات إلى 18 مل من الوسائط المنصهرة المبردة إلى 45-50 درجة مئوية ، واخلطها جيدا ، واسكبها في الألواح في خزانة السلامة الأحيائية.
- اسمح للأجار بالتصلب في درجة حرارة الغرفة (RT) ، واترك فجوة تحت غطاء الألواح المحتضنة وانفخ لتجفيف سطح الآجار قبل التلقيح.
- قم بتسمية أنواع العوامل المضادة للميكروبات والتركيزات على الجانب الخلفي من الألواح المحتضنة. رتب الألواح المحتضنة المتعددة لكل عامل مضاد للميكروبات في كومة بترتيب تخفيف مضاعف log2.
- قم بإعداد لوحين أجار خاليين من الأدوية كعناصر تحكم لكل عامل مضاد للميكروبات.
- اضبط نطاقات تركيز العوامل المضادة للبكتيريا المختلفة التي تم اختبارها وفقا لنطاق حساب مؤشر لار (من 0.125R إلى 8R). تتراوح التركيزات من نطاق مراقبة الجودة أو 0.0625R (يخضع للنطاق الأدنى) إلى 8R.
- خطوات التلقيح لملقح المصفوفة 96 نقطة
- قم بتركيب لوحة دبوس التلقيح المعقم على دعم ملقح مصفوفة 96 نقطة في خزانة السلامة البيولوجية.
- ضع كتلة البذور المحضرة مع سلالات مختبرة وصفيحة محتضنة أجار على الناقل المحمول ، بنفس زاوية تحديد المواقع للوحتين.
- ادفع الناقل المحمول بحيث تكون كتلة البذور أسفل لوحة دبوس التلقيح مباشرة.
- اضغط على مقبض التشغيل ، وحرك لوحة دبوس التلقيح لأسفل ، وقم بتوجيه 96 دبابيس إلى اللقاح في 96 بئرا من كتلة البذور.
- حرر مقبض التشغيل مع التحكم ، ثم أعد ضبط لوحة دبوس التلقيح تحت تأثير الزنبرك.
- اضغط على مقبض التشغيل 2-3 مرات لتحريك كل لقاح جيدا وغمسه. ادفع وحرك اللوحة الحاملة بحيث تكون اللوحة المحتضنة أسفل لوحة دبوس التلقيح مباشرة.
- اضغط على مقبض التشغيل ، وحرك لوحة دبوس التلقيح لأسفل ، وتوقف لمدة 1-2 ثانية لجعل دبابيس التلقيح تلامس سطح اللوحة المحتضنة بالكامل.
- حرر مقبض التشغيل. هذا يكمل تلقيح واحد. استبدل صفيحة محتضنة أخرى واستمر في الدورة حتى تنتهي مجموعة واحدة من ألواح أجار مضادات الميكروبات.
- استبدل صفيحة دبوس تلقيح أخرى وكتلة بذور ، وقم بتلقيح مجموعة أخرى من السلالات المختبرة. دورة حتى يتم الانتهاء من جميع التطعيمات.
ملاحظة: قم بتلقيح صفيحة أجار تحكم (بدون عامل مضاد للميكروبات) أولا ، ثم اللوحة بترتيب تركيز الدواء من الأقل إلى الأعلى ، ولوحة أجار التحكم الثانية أخيرا لضمان عدم وجود تلوث أو ترحيل عامل مضاد للميكروبات. يعتمد حجم التلقيح على حجم الترسب الطبيعي لكل دبوس يبلغ حوالي 2 ميكرولتر.
- احتضان ألواح أجار المضادة للميكروبات
- احتضان ألواح الآجار المضادة للميكروبات الملقحة في RT حتى يتم امتصاص الرطوبة الموجودة في بقع اللقاح في الآجار.
- اقلب الألواح واحتضنها لمدة 16-20 ساعة عند 37 درجة مئوية للسلالات المختبرة للتأكد من أن البكتيريا غير المقيدة تشكل مستعمرات.
- الحصول على الصور وإحصاءات البيانات
- انقر نقرا مزدوجا فوق نظام الحصول على صور AST مصفوفة 96 نقطة لفتح البرنامج.
- انقر فوق معلومات الاختبار في شريط المهام. انقر فوق جديد لإنشاء مهمة اختبار جديدة ، واملأ المعلومات وفقا للمطالبات ، بما في ذلك الرمز والاسم والمصدر والبكتيريا وعدد السلالات والمضادات الحيوية والتدرج.
- انقر فوق جمع البيانات > عنصر اختبار > الصورة لتحديد المهمة الجديدة التي تم إنشاؤها. انقر فوق المضادات الحيوية لتحديد اسم المضاد الحيوي ، وانقر فوق التدرج لتحديد التركيز الأولي لهذا المضاد الحيوي.
- انقر فوق اتصال للاتصال بمحول الحصول على الصور.
- ضع الألواح المحتضنة المقابلة على قاعدة لوحة الكشف مع الزاوية المفقودة في المقدمة اليمنى للتوجيه وادفع إلى محول التقاط الصور.
- انقر فوق مجموعة للحصول على الصور. سوف يقفز تدرج المضادات الحيوية تلقائيا إلى التدرج التالي. ضع اللوحة التالية بدورها واستمر في النقر فوق المجموعة حتى يتم جمع لوحات هذا المضاد الحيوي.
- انقر فوق المضادات الحيوية ، وحدد المجموعة التالية من اللوحات المحتضنة. انقر فوق التدرج لتحديد تدرج البداية وانتقل إلى الجولة التالية من مجموعة الصور.
- بعد الانتهاء من جميع المجموعات ، انقر فوق إرسال. سيتعرف البرنامج تلقائيا على عدد وحدات البكسل البيضاء المنسقة في كل نقطة تلقيح في الصور ، ويحدد ما إذا كان هناك تكوين مستعمرة ويحول الصور إلى قيم MIC.
- انقر فوق استعلام للحصول على جميع نتائج MIC للسلالات ضد المضادات الحيوية المختبرة.
ملاحظة: نظام AST الذكي عالي الإنتاجية مناسب لتحديد MICs لدفعات كبيرة من السلالات البكتيرية. تستغرق عملية الاختبار ، بما في ذلك التحضير والتلقيح والحضانة وقراءة النتائج ، 3 أيام. يمكن ضبط أنواع المضادات الحيوية ونطاقات الكشف عن MIC وفقا للاحتياجات الخاصة ، ويمكن إعادة استخدام المواد الاستهلاكية الرئيسية.
- حساب مؤشر لار
- حدد مؤشر لار بدقة باستخدام الصيغة: ، حيث:
MICi: الحد الأدنى من التركيز المثبط.
يمثل نطاق توزيعات MIC من MIC-3 إلى MIC3 تركيزات تسلسلية مزدوجة تتمحور حول R: 0.125R و 0.25R و 0.5R و R و 2R و 4R و 8R.
هو 2 i ، ونطاقi هو -3 إلى 3.
R: نقاط توقف مقاومة البكتيريا ضد العوامل المضادة للميكروبات الموحدة بواسطة CLSI.
f: توزيع تردد هيئة التصنيع العسكري.
ملاحظة: مؤشر لار العام هو المتوسط الحسابي لجميع مؤشرات لار. بعد حساب مؤشر لار ، قم بتقريب القيمة النهائية إلى رقمين مهمين بعد الفاصلة العشرية.
- حدد مؤشر لار بدقة باستخدام الصيغة: ، حيث:
هو 2 i ، ونطاقi هو -3 إلى 3.2. نظام ذكي عالي الإنتاجية لفحص العاثيات9
- تحضير كتلة بذور العاثية وألواح محتضنة مزدوجة الطبقة تحتوي على بكتيريا.
- استخدم طريقة أجار الطبقةالمزدوجة 10 أو طريقة الاستزراع السائل11 لصنع عاثيات مختلفة. خفف إلى تركيز مواز مناسب مع عيار 1 × 104-5 pfu / mL ، وأضف 200 ميكرولتر من لقاح العاثية إلى كتلة البذور المكونة من 96 بئرا.
- اصنع صفائح مزدوجة الطبقات من البكتيريا (10 مل من وسائط أجار القاع [أجار 12 جم / لتر] و 6 مل من وسائط شبه أجار العلوية [6 جم / لتر] مع 100 ميكرولتر من البكتيريا [0.5 ماكفارلاند]) ليتم اختبارها.
- اصنع صفيحة محتضنة مزدوجة الطبقة لكل سلالة ليتم اختبارها. اترك فجوة تحت غطاء اللوحة ذات الطبقات المزدوجة وانفخ لتجفيف سطح أجار في خزانة السلامة الحيوية.
- اختبار الفحص
- ضع كتلة بذور العاثية المحضرة ولوحة الطبقة المزدوجة على الناقل المتحرك للقاح المصفوفة المكون من 96 نقطة ، وانقل كل لقاح العاثيات إلى سطح شبه أجار. استمر في الدورات حتى تكتمل جميع السلالات المختبرة.
- اترك الألواح ذات الطبقة المزدوجة الملقحة تبقى في RT حتى يتم امتصاص الرطوبة الموجودة في بقع اللقاح بالكامل في شبه أجار.
- اقلب الألواح واحتضانها في ظل ظروف مناسبة للسلالات المختبرة لمدة 4-6 ساعات لضمان تكوين بقع تحلل واضحة.
- تحليل البيانات
- احصل على صورة النتيجة التجريبية لكل لوحة مزدوجة الطبقة واحفظها بواسطة محول الحصول على الصور (الخطوات 1.5.4-1.5.6).
- سجل عدد وأشكال الأشكال المختلفة للبقع في جدول بيانات بناء على الصور التي تم الحصول عليها ، واحسب النسب الخاصة بالأنواع المختلفة من العاثيات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باتباع بروتوكول نظام AST الذكي عالي الإنتاجية ، تم توضيح تطبيقه بواسطة السالمونيلا من الدواجن في شاندونغ ، الصين ، كمثال.
يوضح الشكل 3 نمو سلالات السالمونيلا على ألواح الآجار مع الأمبيسلين (R من 32 ميكروغرام / مل) بتركيزات من 2 إلى 256 ميكروغرام / مل يحددها محول الحصول على الصور. كانالبئر الأفقي الأول A1 هو التحكم السلبي ولم يظهر أي نمو للمستعمرة. كانت A2 و A3 سلالات مراقبة الجودة مع MIC 4 ميكروغرام / مل (تشكيل مستعمرة على صفيحة أجار مع 2 ميكروغرام / مل أمبيسلين ، ولكن ليس على 4 ميكروغرام / مل) ، ضمن نطاق مراقبة الجودة الموحد بواسطة CLSI (2-8 ميكروغرام / مل). كان MIC لسلالة السالمونيلا في A4 64 ميكروغرام / مل ، في حين أن A5 كان 16 ميكروغرام / مل. تم حساب توزيعات MIC ل 93 سلالة من السالمونيلا ضد الأمبيسلين تلقائيا بواسطة البرنامج.
الشكل 3: مورفولوجيا السالمونيلا على سلسلة من لوحات الاستزراع مع الأمبيسلين. 8 أفقي: A-H ، 12 عمودي: 1-12. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم تطبيق نظام AST عالي الإنتاجية لتحديد مقاومة مضادات الميكروبات لسلالات السالمونيلا من في مقاطعة شاندونغ. تم تحميل بيانات MIC إلى قاعدة بيانات Varms (http://www.varms.cn/)12. وترد النتائج الإحصائية في الجدول 1. تم اختبار ما مجموعه 10 عوامل مضادة للميكروبات ضد 300-1500 سلالة من السالمونيلا ، مما يدل على المزايا عالية الإنتاجية لهذا النظام.
وفقا لنقاط التوقف المقاومة لمعيار CLSI ، تم حساب معدل المقاومة (R٪) كنسبة مئوية من السلالات مع MIC ≥ R بين السلالات المختبرة (الجدول 1). كانت قيم R٪ للأمبيسيلين وسيبروفلوكساسين وحمض أموكسيسيلين كلافولانيك أعلى من 50٪ ، وكانت قيم R٪ للدوكسيسيكلين والفلورفينيكول والسيفوتاكسيم والإنروفلوكساسين 30٪ -50٪ ، وكانت قيم R٪ للجنتاميسين والأميكاسين والميروبينيم أقل من 30٪. لم يتم استخدام Meropenem في التي يتم تربيتها صناعيا وأظهر R٪ بنسبة 7٪.
أشارت نسبة R٪ إلى نسبة السلالات البكتيرية ذات العناصر المتوسطة الدخل أعلى من R ، بينما أظهرت توزيعات MIC عدد السلالات مع كل MIC لوصف مقاومة مضادات الميكروبات الإجمالية للسالمونيلا بشكل أكثر دقة. على سبيل المثال ، كان R٪ من الأمبيسلين 73٪ ، وكان الحد الأقصى لعدد العينات (916 سلالة) مركزا مع MIC ≥ 256 ميكروغرام / مل ، مما يشير إلى أن مقاومة السالمونيلا للأمبيسيلين كانت خطيرة للغاية.
الجدول 1: توزيعات MIC ، R٪ وقيم مؤشر لار للسالمونيلا من في مقاطعة شاندونغ. MICs المقابلة للخط الغامق هي قيم R للعوامل المضادة للميكروبات. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
من أجل التوحيد وقابلية المقارنة ، تم تمديد 3 تدرجات للأمام والخلف ، تتمحور حول R لكل دواء. وفقا لتوزيعات MIC لسبعة تدرجات ، تم حساب مؤشر لار بالصيغة:
.
كمثال على الأمبيسلين ، كانت قيمة R 32 ميكروغرام / مل ، وكان عدد العينات 1 ، 414 ، ولار = (4/32) × (245/1414) + (8/32) × (16/1414) + (16/32) × (117/1414) + (32/32) × (27/1414) + (64/32) × (36/1414) + (128/32) × (57/1414) + (256/32) /32) × (916/1414) = 2-3 × (245/1414) + 2-2 × (16/1414) + 2-1 × (117/1414) + 20 × (27/1414) + 21 × (36/1414) + 2 2 × (57/1414) + 2 3 × (916/1414) = 5.48. بهذه الصيغة ، تم حساب مؤشرات لار للعوامل المضادة للميكروبات الأخرى وتظهر في الجدول 1.
كانت أهمية مؤشر لار هي الإشارة إلى درجة شدة مقاومة مضادات الميكروبات بدقة. بأخذ سيبروفلوكساسين وحمض أموكسيسيلين كلافولانيك كأمثلة ، كانت قيم R٪ متشابهة ، عند 68٪ و 65٪ على التوالي ، لكن مؤشرات لار الخاصة بهم اختلفت بشكل كبير ، عند 4.57 و 1.76 على التوالي. وقد تجلى السبب في ذلك بوضوح من خلال توزيع القيم العالية ل MIC في الجدول 1 ، حيث تم توزيع 71.3٪ من السلالات المقاومة للسيبروفلوكساسين في 8R (32 ميكروغرام / مل) ، في حين أن MICs للسلالات المقاومة لحمض الأموكسيسيلين - clavulanic تركزت في الغالب على R و 2R ، وكانت نسبة 8R منخفضة (8.69٪). لذلك ، كان مؤشر لار للسيبروفلوكساسين أعلى من مؤشر حمض الأموكسيسيلين كلافولانيك ، مما يشير إلى أن نسبة السلالات شديدة المقاومة للسيبروفلوكساسين كانت أعلى من نسبة السلالات المقاومة لحمض الأموكسيسيلين-كلافولانيك. كان مؤشر لار مؤشرا أكثر دقة لدرجة مقاومة مضادات الميكروبات من معدل المقاومة.
ووفقا لصيغة مؤشر لار، إذا كانت البلدان المتوسطة الدخل لجميع السلالات فيما يتعلق بعقار معين هي R، فإن مؤشر لار سيكون 1؛ إذا كانت البلدان المتوسطة الدخل لجميع السلالات 2R ، فإن مؤشر لار سيكون 2. ولذلك، أظهر مؤشر لار علاقات متعددة بين البلدان المتوسطة الدخل الشاملة وقيمة R المقابلة، باستثناء تركيزات الحافة. تم استخدام مؤشر لار لتقييم درجة مقاومة مضادات الميكروبات ، وكانت الميزة أكثر وضوحا إذا كان AMR أعلى. من أجل التوحيد وقابلية المقارنة ، كان نطاق حساب مؤشر لار سبعة MICs مع تدرجات 3 أمامية وخلفية تتمحور حول قيمة R ، وتم الحصول على المتوسط المرجح من خلال دمج العوامل المضادة للميكروبات المختلفة ، وعدد السلالات ، وتوزيعات MIC. لذلك ، كان نطاق قيمة مؤشر لار 0.125-8. كلما اقترب لار من 0.125 ، انخفض معدل مقاومة مضادات الميكروبات ، وكلما اقترب من 8 ، ارتفع معدل مقاومة مضادات الميكروبات. ومع ذلك ، لم تكن هناك علاقة تناسبية بين Lar و R عند تركيز الحافة. عندما تم تحديد العوامل المضادة للميكروبات ونطاق حساب مؤشر لار ، تم تطبيع لار العام إلى قيمة شاملة بديهية تستخدم لمقارنة وتقييم درجة وتغيير اتجاه مقاومة مضادات الميكروبات بشكل مباشر في ظل الظروف المختلفة للبكتيريا المختلفة ، والمستخدمين ، والسنوات ، والمناطق ، وما إلى ذلك.
باتباع بروتوكول نظام فحص العاثيات الذكي ، تم إثبات التطبيق من خلال أخذ 96 عاثية من السالمونيلا لتحلل سلالات السالمونيلا AMR كمثال ، وتم تحليل نمط تحلل العاثيات.
تم نقل ستة وتسعين عاثية إلى ألواح مزدوجة الطبقات تحتوي على السالمونيلا بواسطة ملقح مصفوفة 96 نقطة. يظهر الشكل 4 مورفولوجيا البقع المتكونة. كان هناك أربعة أنواع رئيسية (على الرغم من عدم اقتصارها بأربعة): بقعة مستديرة واضحة (●) ، وجمع اللويحات () ، وبقعة حالية عكرة () ، وعدم وجود بقعة lytic (
○).
الشكل 4: مورفولوجيا بقع السالمونيلا على ألواح أجار مزدوجة الطبقة. 1 و 2: الأنماط التي تنتجها 96 عاثية على سلالات مختلفة من السالمونيلا. "●" بقعة واضحة مستديرة ، "" مجموعة من اللويحات ، "" بقعة عكرة lytic ، "○" لا بقعة lytic) الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
على الصفائح ذات الطبقة المزدوجة ، كانت البقع الانحلالية للعاثيات المختلفة على البكتيريا المضيفة المختلفة متنوعة في التشكل10. نتجت "البقعة المستديرة الواضحة" عن عاثية يمكن أن تقتل المضيف بشكل موثوق على اللوحة ولكنها قد تتكاثر أو لا تتكرر بنجاح على حساب هذا المضيف. في هذه الحالة ، كان من الضروري إجراء مزيد من التخفيف لتحديد النوع بشكل قاطع. تم تشكيل "مجموعة اللوحات" بواسطة لوحات حقيقية. تم إنتاج كل منطقة فردية من التحلل بوضوح من مركز معدي واحد ، مما يدل على أن العاثية قد تضاعفت على حساب البكتيريا الموجودة على اللوحة. نتجت "البقعة العكرة العكرة" عن عاثية لم تقتل المضيف بشكل موثوق على اللوحة والتي قد تتكاثر أو لا تتكاثر بنجاح على حساب هذا المضيف. في هذه الحالة ، كان هناك أكثر من احتمال واحد ، وبالتالي يتطلب تأكيدا بناء على مزيد من الاهتمامات البحثية. تشير "البقعة اللاإرادية" إلى الطبيعة غير الحمضية.
علاوة على ذلك ، فإن استخدام هذا النظام للاختبار الأولي يمكن أن يحدد بشكل أساسي ما إذا كانت السلالات والبكتيريا متضاعفة. إذا تم اختيار أنواع مختلفة من السالمونيلا وكانت أنماط اثنين من البكتيريا متطابقة ، فهذا يشير إلى أن البكتيريا قد تتكرر. إذا تم اختيار البكتيريا غير المتكررة لإصابة أنواع السالمونيلا غير المعروفة من المصادر السريرية وكان نمط العاثية هو نفسه ، فهذا يشير إلى أن سلالات السالمونيلا قد تكون نفس السلالة. وعلاوة على ذلك، كان لعدد ونسبة التكرارات قيم مرجعية للتحري الوبائي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم تأسيس طريقة تخفيف الآجار واستخدامها على نطاق واسع. كان مبدأ نظام AST عالي الإنتاجية هو مبدأ طريقة تخفيف أجار. كانت إحدى الخطوات الحاسمة في البروتوكول هي النقل الدقيق عالي الإنتاجية ل 96 لقاحا في وقت واحد ، والذي تم إجراؤه عدة مرات متتالية. لإكمال هذه الخطوة الحاسمة ، كانت دبابيس ملقح المصفوفة المكونة من 96 نقطة موحدة وسلسة للغاية. كان الترسب الطبيعي لكل دبوس بحجم 2 ميكرولتر تقريبا ، والذي تم تجميعه في قطرات صغيرة على سطح وسط الآجار ليتم امتصاصه بسرعة في الأجار ، ولا يتدفق أو يتناثر ليسبب تلوثا متبادلا. وكانت الخطوة الحاسمة الثانية هي المعالجة الإحصائية لبيانات AST الكبيرة. مع التلقيح عالي الإنتاجية ، يجب تحديد بيانات الاختبار ، وكان عبء العمل ضخما. كان التحليل الذكي والنتائج الإحصائية التي ينتجها محول الحصول على الصور الذكي والبرامج الداعمة حلا مثاليا لهذه المشكلة. تم تحميل نتائج AST تلقائيا مباشرة إلى قاعدة بيانات Varms. تم تحسين كفاءة ودقة تفسير النتائج ، وتم تقليل الأخطاء التي تسببها العوامل البشرية13.
وكانت الخطوة الحاسمة الثالثة هي اقتراح مؤشر لار لمقاومة مضادات الميكروبات. وفي الوقت الحاضر، هناك عدد قليل من مؤشرات التقييم الشامل لمقاومة مضادات الميكروبات في العالم. وفقا للأدبيات ، تم وصف مؤشر مقاومة الأدوية (DRI) من قبل Laxminarayan و Klugman لقياس التغيرات في فعالية المضادات الحيوية14,15. وقد جمع بين انتشار المقاومة والتواتر النسبي للوصفات الطبية، ولكنه لم يستطع وصف درجة مقاومة مضادات الميكروبات وتقييم التغيرات في المستويات العالية لمقاومة الأدوية. مؤشر فعالية الدواء (DEI)16 ، وهو مؤشر آخر مشتق من DRI، له نفس عيوب DRI. وهكذا ، تم اقتراح مؤشر لار ، والذي يتألف من ثلاث خطوات: (1) تم تطبيع العناصر المتوسطة الدخل للسلالات البكتيرية بناء على قيمة R ذات الصلة ، مما أدى إلى القضاء على الاختلافات في العوامل المضادة للميكروبات التي تسببها قيم R المختلفة لمعيار AST ؛ (2) وفقا لتوزيعات MIC ، تم حساب القيم المتوسطة المرجحة لتعكس درجة مقاومة مضادات الميكروبات بشكل أدق من معدل المقاومة ؛ (3) يمكن أن يعكس المتوسط الحسابي لمؤشرات لار للعوامل المتعددة المضادة للميكروبات، أي لار العام، الوضع الشامل لمقاومة مضادات الميكروبات، مما يوفر الراحة لتقييم ومقارنة مقاومة مضادات الميكروبات على مختلف المستويات.
كان تصميم الأجهزة لهذه الأجهزة معقولا وبسيطا في التشغيل ، وكانت جميع الأجزاء تعمل بسلاسة. لم تكن هناك مشكلة تشويش أو خطأ. تطابق تصميم البرنامج الداعم مع المتطلبات الشخصية لفحص AST و phage وكان سهل التشغيل والاستخدام. تم تجهيز أحد الأجهزة ب 4-5 صناديق من دبابيس التلقيح لسيناريوهات متعددة قابلة للتطبيق لنقل البكتيريا على دفعة. كانت المكونات الأساسية لهذه الأداة هي لوحة دبوس التلقيح والدبابيس المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ ، والتي كانت قابلة للتكيف مع مجموعة متنوعة من البيئات وكانت قادرة على تعقيمها وتفكيكها واستبدالها. تم تصميم دبابيس التلقيح ليتم دمجها بأي شكل من الأشكال.
ومن الضروري إنشاء نظام لرصد مقاومة مضادات الميكروبات بسبب انتشار مسببات الأمراض المقاومة الناجمة عن إساءة استخدام المضادات الحيوية. منذ عام 2008 ، قام فريق الصحة العامة التابع لمعهد علوم والطب البيطري ، أكاديمية شاندونغ للعلوم الزراعية ، بمراقبة مقاومة مضادات الميكروبات للحيوانات على التوالي في مقاطعة شاندونغ12،13،17. وكان من الضروري الكشف بكفاءة عن العوامل المتوسطة الدخل لمسببات الأمراض لتنظيم استخدام العوامل المضادة للميكروبات بسبب ارتفاع مستوى المقاومة البيطرية وحجم الرصد الكبير. ومع ذلك ، فإن الأدوات ذات الصلة ب AST باهظة الثمن ، وتكلفة العملية والمواد الاستهلاكية مرتفعة وغير مناسبة لمجموعة واسعة من المزارع الكبيرة. ولهذا السبب، فإن تطوير نظام AST الذكي عالي الإنتاجية وتوحيد تطبيقه كان يفضي إلى تعزيز إنشاء نظام صوتي لتكنولوجيا رصد مقاومة مضادات الميكروبات. وفقا للبحث السابق12,13 ، حقق نظام AST الذكي عالي الإنتاجية قابلية جيدة للتكرار والاستقرار لمطابقة معيار CLSI وتم تطبيقه على AST وتحليل البكتيريا المسببة للأمراض السريرية في. وحتى الآن، تم تجميع بيانات شاملة عن مقاومة مضادات الميكروبات لأكثر من 20000 سلالة وبائية12. بالنسبة للبكتيريا المقاومة الموجودة في عملية المراقبة ، يمكن أيضا استخدام هذا النظام للفحص السريع عالي الإنتاجية للعاثيات المحللة للتعاون مع العوامل المضادة للميكروبات لتقليل مقاومة مضادات الميكروبات. كان تطبيق ملقح المصفوفة 96 نقطة ومحول الحصول على الصور لفحص تحلل العاثيات وظيفة موسعة ، ولم يتم تطبيق أي أدوات أخرى سابقا في هذا المجال.
يجمع نظام فحص AST / phage الذكي عالي الإنتاجية بين AST والبكتيريا lytic لتحقيق مراقبة AMR والتحكم والتقليل. في الوقت نفسه ، تم استخدام مؤشر لار بشكل أكثر حدسية وإيجازا لتقييم مساهمات العوامل المختلفة والتقنيات الجديدة المضادة للبكتيريا في الحد من مقاومة مضادات الميكروبات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yuqing Liu et al. قدموا براءات اختراع صينية لملقح المصفوفة 96 نقطة ومحول الحصول على الصور وتطبيقاتهم (رقم براءة الاختراع ZL 201610942866.3 ورقم براءة الاختراع ZL 201910968255.X).
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل المشروع الوطني للبحث والتطوير الرئيسي (2019YFA0904003) ؛ النظام الصناعي الزراعي الحديث في مقاطعة شاندونغ (SDAIT-011-09) ؛ مشروع تحسين منصة التعاون الدولي (CXGC2023G15)؛ مهام الابتكار الرئيسية لمشروع ابتكار العلوم والتكنولوجيا الزراعية التابع لأكاديمية العلوم الزراعية شاندونغ ، الصين (CXGC2023G03).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well culture plate | Beijing lanjieke Technology Co., Ltd | 11510 | |
| 96-dot matrix AST image acquisition system | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| 96-dot matrix inoculator | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Agar | Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd | HB8274-1 | |
| Amikacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A857053 | |
| Amoxicillin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A822839 | |
| Ampicillin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A830931 | |
| Analytical balance | Sartorius | BSA224S | |
| Automated calculation software for Lar index of AMR | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Bacteria Salmonella strains | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Animal origin |
| Bacterial resistance Lar index certification management system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Ceftiofur | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C873619 | |
| Ciprofloxacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C824343 | |
| Clavulanic acid | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C824181 | |
| Clean worktable | Suzhou purification equipment Co., Ltd | SW-CJ-2D | |
| Colistin sulfate | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C805491 | |
| Culture plate | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Doxycycline | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | D832390 | |
| Enrofloxacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | E809130 | |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SLGP033RB | |
| Florfenicol | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | F809685 | |
| Gentamicin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | G810322 | |
| Glass bottle 50 mL | Xuzhou Qianxing Glass Technology Co., Ltd | QX-7 | |
| High-throughput resistance detection system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Image acquisition converter | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Meropenem | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | M861173 | |
| Mueller-Hinton agar | Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd | HB6232 | |
| Petri dish 60 mm x 15 mm | Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd | 16021-1 | |
| Petri dish 90 mm x 15 mm | Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd | 16001-1 | |
| Salmonella phages | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | |
| Shaker incubator | Shanghai Minquan Instrument Co., Ltd | MQD-S2R | |
| Turbidimeter | Shanghai XingBai Biotechnology Co., Ltd | F-TC2015 | |
| Varms base type library system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Vertical high-pressure steam sterilizer | Shanghai Shen'an medical instrument factory | LDZX-75L | |
| Veterinary pathogen resistance testing management system | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Veterinary resistance cloud monitoring and phage control platform V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright |
References
- Ramanan, L., et al. Antimicrobial resistance-the need for global solutions. The Lancet Infectious Diseases. 13 (12), 1057-1098 (2013).
- Xiaonan, Z., Qing, Z., Thomas, S. P., Yuqing, L., Martha, R. J. C. inPhocus: Perspectives of the application of bacteriophages in poultry and aquaculture industries based on Varms in China. PHAGE: Therapy, Applications, and Research. 2 (2), 69-74 (2021).
- CLSI. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. CLSI document M100. , M100 32nd edition, Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA . (2022).
- Yuqing, L., et al. Antimicrobial Sensitivity Testing Standard of EUCAST. , China Standards Press, Beijing. (2017).
- Barnini, S., et al. A new rapid method for direct antimicrobial susceptibility testing of bacteria from positive blood cultures. BMC Microbiology. 16 (1), 185-192 (2016).
- Höring, S., Massarani, A. S., Löffler, B., Rödel, J. Rapid antimicrobial susceptibility testing in blood culture diagnostics performed by direct inoculation using the VITEK®-2 and BD PhoenixTM platforms. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (3), 471-478 (2019).
- Dupuis, G. Evaluation of the Cobasbact automated antimicrobial susceptibility testing system. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 4 (2), 119-122 (1985).
- A system of bacterial antimicrobial resistance detection and its operation method. China Patent. Liu, Y., et al. , ZL 201610942866.3 (2019).
- A high throughput test plate for screening bacteriophage of zoonotic pathogens and its application. China Patent. Liu, Y. , ZL 201910968255.X (2022).
- Adams, M. H. Bacteriophages. , Interscience Publishers, New York. (1959).
- Nair, A., Ghugare, G. S., Khairnar, K. An appraisal of bacteriophage isolation techniques from environment. Microbial Ecology. 83 (3), 519-535 (2022).
- Shandong veterinary antibiotic resistance system. , http://www.varms.cn (2023).
- Ming, H., et al. Comparison of the results of 96-dot agar dilution method and broth microdilution method. Chinese Journal of Antibiotics. 43 (6), 729-733 (2018).
- Laxminarayan, R., Klugman, K. P. Communicating trends in resistance using a drug resistance index. BMJ Open. 1 (2), e000135 (2011).
- Chen, Y., et al. Assessing antibiotic therapy effectiveness against the major bacterial pathogens in a hospital using an integrated index. Future Microbiology. 12, 853-866 (2017).
- Ciccolini, M., Spoorenberg, V., Geerlings, S. E., Prins, J. M., Grundmann, H. Using an index-based approach to assess the population-level appropriateness of empirical antibiotic therapy. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (1), 286-293 (2015).
- Yanbo, L., et al. Preliminary application of inoculation system for high-throughput drug susceptibility test. China Poultry. 42 (6), 52-57 (2020).
