Summary
כאן אנו מציגים את העיקרון, המבנה וההוראה של המערכת החכמה לבדיקת רגישות מיקרוביאלית בתפוקה גבוהה/מערכת סינון פאגים. היישום שלה מודגם על ידי שימוש בסלמונלה שבודדה מעופות בשאנדונג, סין, כדוגמה. מדד Lar מחושב, ומשמעותו בהערכת עמידות מיקרוביאלית נידונה באופן מקיף.
Abstract
כדי לשפר את היעילות של בדיקות רגישות מיקרוביאלית (AST) ובדיקות פאגים בתפוקה גבוהה עבור חיידקים עמידים ולהפחית את עלות האיתור, פותחה מערכת סינון חכמה של AST/פאגים בתפוקה גבוהה, הכוללת חיסון מטריצה של 96 נקודות, ממיר רכישת תמונה ותוכנה מתאימה, על פי קריטריוני AST ונקודות השבירה של התנגדות (R) שגובשו על ידי מכון התקנים הקליני והמעבדה (CLSI). AST וסטטיסטיקה של התפלגות ריכוז מעכב מינימלי (MIC) (מ-R/8 עד 8R) של 1,500 זני סלמונלה שבודדו מעופות בשאנדונג, סין, כנגד 10 חומרים אנטי-מיקרוביאליים בוצעו על ידי מערכת סינון AST/פאגים חכמה בעלת תפוקה גבוהה. מדד Lar, שמשמעותו "פחות אנטיביוזה, פחות עמידות ושאריות עד מעט אנטיביוזה", התקבל על ידי חישוב הממוצע המשוקלל של כל מיקרופון וחלוקה ב-R. גישה זו משפרת את הדיוק בהשוואה לשימוש בשכיחות העמידות כדי לאפיין את מידת העמידות האנטי-מיקרוביאלית (AMR) של זנים עמידים מאוד. עבור זני סלמונלה עם AMR גבוה, פאגים ליטיים נבדקו ביעילות מספריית הפאגים על ידי מערכת זו, וספקטרום הליזיס חושב ונותח. התוצאות הראו כי מערכת סינון AST/פאגים חכמה בעלת תפוקה גבוהה הייתה ניתנת להפעלה, מדויקת, יעילה מאוד, זולה וקלה לתחזוקה. בשילוב עם מערכת ניטור עמידות מיקרוביאלית וטרינרית בשאנדונג, המערכת התאימה למחקר מדעי ולזיהוי קליני הקשור ל- AMR.
Introduction
מכיוון שחומרים אנטי-מיקרוביאליים נמצאים בשימוש נרחב למניעת מחלות זיהומיות חיידקיות, עמידות מיקרוביאלית (AMR) הפכה לבעיה עולמית של בריאות הציבור1. המאבק ב-AMR הוא המשימה העיקרית הנוכחית של ניטור AMR של פתוגנים אפידמיולוגיים וטיפול סינרגטי בחומרים אנטי-מיקרוביאליים רגישים ובקטריופאג'ים ליטיים2.
בדיקת רגישות אנטי-מיקרוביאלית במבחנה (AST) היא עמוד התווך לניטור הטיפול ולזיהוי רמת AMR. זהו חלק חשוב בפרמקולוגיה מיקרוביאלית והבסיס הקריטי לתרופות קליניות. המכון לתקנים קליניים ומעבדתיים (CLSI) של ארצות הברית והוועדה האירופית לבדיקות רגישות מיקרוביאלית (EUCAST) ניסחו ותיקנו קריטריונים בינלאומיים של AST ושינו והשלימו ללא הרף שיטות AST ואת נקודות השבירה כדי לקבוע את המיקרופון של שילוב מסוים של "אורגניזם-סוכן מיקרוביאלי" כרגיש (S), עמיד (R) או ביניים (I)3, 4.
משנות השמונים ועד שנות התשעים, מכשירים אוטומטיים לדילול מרק מיקרו פותחו במהירות ויושמו בפרקטיקה קלינית, עם דוגמאות כולל אלפרד 60AST, VITEK System, PHOENIXTM ו- Cobasbact 5,6,7. עם זאת, מכשירים אלה היו יקרים, דרשו חומרים מתכלים בעלות גבוהה, וטווחי הגילוי שלהם תוכננו עבור תרופות קליניותלחולים 5,6,7. מסיבות אלה, הם אינם מתאימים לבדיקה קלינית וטרינרית ולאיתור כמויות גדולות של זנים עמידים במיוחד. במחקר זה, מערכת סינון חכמה של AST/פאגים בעלת תפוקה גבוהה, הכוללת מחסנים של מטריצת 96 נקודות (איור 1), ממיר רכישת תמונה (איור 2) ותוכנה מקבילה8, פותחה כדי לבצע AST עבור קבוצה של זני חיידקים נגד מספר גורמים אנטי-מיקרוביאליים בו זמנית בשיטת דילול אגר. יתר על כן, המערכת שימשה גם כדי לזהות ולנתח את דפוסי הליזה של פאגים כנגד חיידקים עמידים מיקרוביאלית9, ופאגים ליטיים נבחרו ביעילות מספריית הפאגים. מערכת זו נמצאה יעילה, משתלמת וקלה לתפעול.
איור 1: תרשים מבני של חיסון המטריצה בן 96 הנקודות. 1: צלחת סיכת חיסון; 2: ספק סלולרי; 3: בלוק זרעים; 4: צלחת מודגרת; 5: בסיס; 6: ידית הפעלה; 7: הגבל את הסיכה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: דיאגרמה מבנית של ממיר רכישת התמונות. 1: מעטפת; 2: מסך תצוגה; 3: חדר רכישת תמונות; 4: בסיס לוח איתור; 5: לוח איתור במחסן ומחוצה לו; 6: לוח בקרה; 7: מכשיר המרה לרכישת תמונות; 8: מקור אור; 9: סורק תמונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
זני הסלמונלה ששימשו במחקר זה נאספו מעופות בשאנדונג, סין, לאחר קבלת אישור מוועדת הבטיחות הביולוגית של המכון למדעי בעלי חיים ורפואה וטרינרית, האקדמיה למדעי החקלאות של שאנדונג, סין.
1. יישום מערכת AST חכמה בעלת תפוקה גבוהה8
- הכנת Inoculum
- לדגור על אורגניזם בקרת האיכות Escherichia coli ו -93 זני סלמונלה כדי להיבדק עבור AST על לוחות אגר מולר-הינטון (MHA) במשך 16-18 שעות ב 37 ° C3.
- הכינו את החיסון של כל זן כך שיתאים לתקן העכירות 0.5 McFarland על פי השיטה שצוינה בתקן CLSI3ולאחר מכן לדלל 10 פעמים.
- מקמו 200 μL של מלוחים רגילים סטריליים בבאר1 st האופקית (A1) של צלחת 96 בארות כבקרה שלילית, שני מתלים של אורגניזם בקרת איכותלתוך הבארות האופקיות 2nd ו -3 rd (A2 ו- A3) כבקרה חיובית, ובקרת איכות, בהתאמה. הוסף 200 μL של מתלי החיסון המדוללים של כל כתם נבדק לתוך 93 הבארות המתאימות בבלוק הזרעים של 96 בארות.
- הכנת צלחת אגר מיקרוביאלית
- הגדר את טווחי הריכוז של חומרים אנטיבקטריאליים שונים שנבדקו על פי טווח החישוב של מדד Lar (מ 0.125R ל 8R). הריכוזים נעים בין טווח בקרת האיכות או 0.0625R (בכפוף לטווח הנמוך יותר) ל-8R.
הערה: אם מדד Lar אינו מחושב, ניתן לקבוע את טווח ריכוזי האנטיביוטיקה בהתאם לצרכים של AST. - ביצוע תוכנית דילול הכפלת log2 לתמיסה אנטיביוטית החל מריכוז מלאי מתאים המבוסס על שיטת דילול אגר המפורטת בתקן CLSI3.
- יש לעקר בקבוקי זכוכית בנפח 50 מ"ל המכילים 18 מ"ל של אגר מדיה של מולר-הינטון. הוסף 2 מ"ל של דילולים מתאימים של תמיסה מיקרוביאלית ל 18 מ"ל של מדיה מותכת מקורר ל 45-50 ° C, לערבב היטב, ויוצקים לתוך הצלחות בארון בטיחות ביולוגית.
- מניחים לאגר להתמצק בטמפרטורת החדר (RT), משאירים רווח מתחת למכסה הצלחות המודגרות ונושפים לייבוש משטח האגר לפני החיסון.
- תייגו את סוגי החומרים האנטי-מיקרוביאליים ואת הריכוזים בצד האחורי של הצלחות המודגרות. סדרו את לוחות הדגירה המרובים של כל סוכן אנטי-מיקרוביאלי בערימה בסדר דילול log2-doubleing.
- הכינו שתי צלחות אגר ללא תרופות כבקרות עבור כל סוכן אנטי-בקטריאלי.
- הגדר את טווחי הריכוז של חומרים אנטיבקטריאליים שונים שנבדקו על פי טווח החישוב של מדד Lar (מ 0.125R ל 8R). הריכוזים נעים בין טווח בקרת האיכות או 0.0625R (בכפוף לטווח הנמוך יותר) ל-8R.
- שלבי חיסון לחיסון מטריצה 96 נקודות
- התקן את לוחית סיכת החיסון האוטומטית על התמיכה של חיסון מטריצה של 96 נקודות בארון הבטיחות הביולוגית.
- מניחים את גוש הזרעים המוכן עם זנים בדוקים וצלחת דגירה אגר על המוביל הנייד, עם זווית מיקום זהה עבור שתי הצלחות.
- דחפו את המוביל הסלולרי כך שגוש הזרעים יהיה ישירות מתחת לצלחת סיכת החיסון.
- לחץ על ידית הניתוח, הזז את צלחת סיכת החיסון כלפי מטה, וכוון את 96 הפינים לחיסון ב-96 בארות של גוש הזרעים.
- שחרר את ידית ההפעלה עם שליטה, ולאחר מכן אפס את לוחית סיכת החיסון תחת פעולת הקפיץ.
- לחץ על ידית הניתוח 2-3 פעמים כדי לערבב היטב כל חיסון ולטבול. דחפו והזיזו את צלחת המוביל כך שהצלחת המודגרת תהיה ישירות מתחת לצלחת סיכת החיסון.
- לחץ על ידית ההפעלה, הזז את צלחת סיכת החיסון כלפי מטה, ועצור למשך 1-2 שניות כדי לגרום לפינים של החיסון לבוא במגע מלא עם פני השטח של הצלחת המודגרת.
- שחרר את נקודת האחיזה להפעלה. זה משלים חיסון אחד. החליפו צלחת מודגרת אחרת והמשיכו את המחזור עד לסיום קבוצה אחת של צלחות אגר אנטי-מיקרוביאליות.
- החליפו צלחת סיכת חיסון אחרת ובלוק זרעים, וחסנו קבוצה אחרת של זנים שנבדקו. מחזור עד להשלמת כל החיסונים.
הערה: חסן תחילה צלחת אגר בקרה (ללא חומר אנטי-מיקרוביאלי), לאחר מכן את הצלחת לפי סדר ריכוז התרופה מנמוך לגבוה, וצלחת אגר בקרה שנייה אחרונה כדי להבטיח שאין זיהום או חומר אנטי-מיקרוביאלי. נפח החיסון מסתמך על נפח התצהיר הטבעי של כל סיכה של כ-2 מיקרוליטר.
- דגירה על צלחות אגר אנטי-מיקרוביאליות
- יש לדגור על לוחות האגר האנטי-מיקרוביאליים המחוסנים ב-RT עד שהלחות בכתמי החיסון נספגת באגר.
- הפכו את הצלחות ודגרו עליהן במשך 16-20 שעות בטמפרטורה של 37°C עבור הזנים שנבדקו כדי להבטיח שהחיידקים חסרי העכבות יוצרים מושבות.
- רכישת תמונות וסטטיסטיקות נתונים
- לחץ פעמיים על מערכת רכישת תמונות AST של מטריצת 96 נקודות כדי לפתוח את התוכנית.
- לחץ על Test Information בשורת המשימות. לחץ על חדש כדי ליצור משימת בדיקה חדשה, ומלא את המידע בהתאם להנחיות, כולל הקוד, השם, המקור, החיידקים, מספר הזנים, אנטיביוטיקה ומדרג.
- לחץ על איסוף נתונים > צילום > פריט בדיקה כדי לבחור את המשימה החדשה שנוצרה. לחץ על אנטיביוטיקה כדי לבחור את שם האנטיביוטיקה, ולחץ על Gradient כדי לבחור את הריכוז הראשוני של אנטיביוטיקה זו.
- לחץ על התחבר כדי להתחבר לממיר רכישת התמונות.
- מקם את לוחות הדגירה המתאימים על בסיס לוחית הזיהוי עם הזווית החסרה בחזית הימנית לצורך התמצאות ודחוף לתוך ממיר רכישת התמונה.
- לחץ על אוסף כדי להשיג את התמונות. שיפוע האנטיביוטיקה יקפוץ אוטומטית לשיפוע הבא. מניחים את הצלחת הבאה בתורו וממשיכים ללחוץ על איסוף עד שהצלחות לאנטיביוטיקה זו נאספות.
- לחץ על אנטיביוטיקה, ובחר את הקבוצה הבאה של צלחות מודגרות. לחץ על Gradient כדי לבחור את מעבר הצבע ההתחלתי ולהמשיך לסבב הבא של אוסף תמונות.
- לאחר השלמת כל האוספים, לחץ על שלח. התוכנית תזהה באופן אוטומטי את מספר הפיקסלים הלבנים המעוצבים בכל נקודת חיסון בתמונות, תקבע אם יש היווצרות מושבה ותמיר את התמונות לערכי MIC.
- לחץ על שאילתה כדי לקבל את כל תוצאות המיקרופון של הזנים כנגד האנטיביוטיקה שנבדקה.
הערה: מערכת AST החכמה בעלת התפוקה הגבוהה מתאימה לקביעת MICs של קבוצות גדולות של זני חיידקים. תהליך הבדיקה, כולל הכנה, חיסון, דגירה וקריאת תוצאות, אורך 3 ימים. ניתן להגדיר את סוגי האנטיביוטיקה וטווחי זיהוי המיקרופון בהתאם לצרכים המתאימים, וניתן לעשות שימוש חוזר בחומרים המתכלים העיקריים.
- חישוב מדד Lar
- קבע את מדד Lar במדויק באמצעות הנוסחה: , כאשר:
MICi: ריכוז מעכב מינימלי.
טווח התפלגויות ה-MIC מ-MIC-3 ל-MIC 3 מייצג ריכוזים כפולים סדרתיים שבמרכזם R: 0.125R, 0.25R, 0.5R, R, 2R, 4R ו-8R.
הוא 2 i, והטווח שלi הוא -3 עד 3.
R: נקודות השבירה של עמידות חיידקים נגד חומרים אנטי-מיקרוביאליים המתוקננים על ידי CLSI.
f: התפלגות התדרים של MIC.
הערה: מדד Lar הכללי הוא הממוצע האריתמטי של כל מדדי Lar. לאחר חישוב מדד Lar, עגל את הערך הסופי לשתי ספרות משמעותיות אחרי הנקודה העשרונית.
- קבע את מדד Lar במדויק באמצעות הנוסחה: , כאשר:
הוא 2 i, והטווח שלi הוא -3 עד 3.2. מערכת סינון פאגים חכמה בתפוקה גבוהה9
- הכנת בלוק זרעי פאגים וצלחות מודגרות דו-שכבתיות המכילות חיידקים.
- השתמש בשיטת אגר דו-שכבתית10 או בשיטת תרבית נוזלית11 להכנת פאגים שונים. לדלל לריכוז מקביל מתאים עם טיטר של 1 x 104-5 pfu/mL, ולהוסיף 200 μL של פאג inoculum לתוך בלוק זרעים 96 באר.
- הכינו צלחות דו-שכבתיות עם חיידקים (10 מ"ל של אגר מדיה תחתון [אגר 12 גרם / ליטר] ו -6 מ"ל של מדיה חצי אגר עליונה [6 גרם / ליטר] עם 100 מיקרוליטר חיידקים [0.5 מקפרלנד]) לבדיקה.
- הכינו צלחת דגירה דו-שכבתית עבור כל זן לבדיקה. השאירו רווח מתחת למכסה של הצלחת הדו-שכבתית ונשפו לייבוש משטח האגר בארון הבטיחות הביולוגית.
- בדיקת סקר
- הניחו את גוש זרעי הפאגים המוכן ואת הצלחת הדו-שכבתית על המוביל הנייד של חיסון המטריצה בן 96 הנקודות, והעבירו את כל אינוקולה הפאג'ים למשטח החצי-אגר. המשך את המחזורים עד להשלמת כל הזנים שנבדקו.
- הניחו לצלחות הדו-שכבתיות המחוסנות להישאר ב-RT עד שהלחות בכתמי החיסון תיספג במלואה לתוך האגר למחצה.
- הפוך את הצלחות ודגר בתנאים מתאימים עבור הזנים שנבדקו במשך 4-6 שעות כדי להבטיח כי כתמים ליטיים ברורים נוצרים.
- ניתוח נתונים
- השג ושמור את התמונה של תוצאת הניסוי של כל לוח דו-שכבתי על-ידי ממיר רכישת התמונה (שלבים 1.5.4-1.5.6).
- רשום את המספר והמורפולוגיה של צורות הכתמים השונות לתוך גיליון אלקטרוני בהתבסס על התמונות שהתקבלו, וחשב את הפרופורציות המתאימות של סוגי הפאגים השונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעקבות הפרוטוקול של מערכת AST חכמה בעלת תפוקה גבוהה, היישום שלה הודגם על ידי סלמונלה מעופות בשאנדונג, סין, כדוגמה.
הגידול של זני סלמונלה על לוחות אגר עם אמפיצילין (R של 32 מיקרוגרם/מ"ל) בריכוזים של 2 עד 256 מיקרוגרם/מ"ל שנקבעו על-ידי ממיר רכישת התמונה מוצג באיור 3. בארהרחוב האופקית A1 הייתה הבקרה השלילית ולא הראתה צמיחת מושבה; A2 ו-A3 היו זני בקרת האיכות עם מיקרופון של 4 מק"ג/מ"ל (יצירת מושבה על לוחית האגר עם אמפיצילין של 2 מק"ג/מ"ל, אך לא על זה של 4 מק"ג/מ"ל), בטווח בקרת האיכות המתוקנן על ידי CLSI (2-8 מק"ג/מ"ל). המיקרופון של זן הסלמונלה ב-A4 היה 64 מיקרוגרם/מ"ל, בעוד זה של A5 היה 16 מיקרוגרם/מ"ל. התפלגות MIC של 93 זני סלמונלה כנגד אמפיצילין חושבה אוטומטית על ידי התוכנה.
איור 3: מורפולוגיה של סלמונלה על סדרה של לוחות תרבית עם אמפיצילין. 8 אופקי: A-H, 12 אנכי: 1-12. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
מערכת AST בעלת תפוקה גבוהה יושמה כדי לקבוע את AMR של זני סלמונלה מבעלי חיים במחוז שאנדונג. נתוני המיקרופון הועלו למסד הנתונים של Varms (http://www.varms.cn/)12. התוצאות הסטטיסטיות מוצגות בטבלה 1. בסך הכל נבדקו 10 חומרים אנטי-מיקרוביאליים מול 300-1,500 זני סלמונלה , מה שמראה את יתרונות התפוקה הגבוהה של מערכת זו.
על פי נקודות השבירה העמידות של תקן CLSI, שיעור ההתנגדות (R%) חושב כאחוז הזנים עם MIC ≥ R מבין הזנים שנבדקו (טבלה 1). ערכי R% של ampicillin, ciprofloxacin, וחומצה amoxicillin-clavulanic היו גבוהים מ 50%, ערכי R% של דוקסיציקלין, florfenicol, cefotaxime, ו enrofloxacin היו 30%-50%, ואת ערכי R% של gentamicin, amikacin, ו meropenem היו פחות מ 30%. מרופנם לא היה בשימוש בבעלי חיים שגודלו בתעשייה והראה R% של 7%.
ה-R% הצביע על שיעור זני החיידקים עם MICs גבוה מ-R, בעוד שהתפלגויות ה-MIC הראו את מספר הזנים עם כל מיקרופון כדי לתאר את ה-AMR הכולל של סלמונלה בצורה מדויקת יותר. לדוגמה, R% של אמפיצילין היה 73%, והמספר המרבי של דגימות (916 זנים) היה מרוכז עם MIC ≥ 256 מיקרוגרם / מ"ל, מה שמצביע על כך שהעמידות של סלמונלה לאמפיצילין הייתה רצינית למדי.
טבלה 1: התפלגות MIC, R% וערכי מדד Lar של סלמונלה מבעלי חיים במחוז שאנדונג. MICs המתאימים לגופן מודגש הם ערכי R של סוכנים מיקרוביאליים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
לצורך אחידות והשוואה, 3 שיפועים הורחבו קדימה ואחורה, מרוכזים ב-R של כל תרופה. על פי התפלגות MIC של שבעה שיפועים, מדד Lar חושב לפי הנוסחה:
.
כדוגמה לאמפיצילין, ערך ה-R היה 32 מיקרוגרם/מ"ל, מספר הדגימות היה 1,414, ו- Lar = (4/32) x (245/1414) + (8/32) × (16/1414) + (16/32) × (117/1414) + (32/32) × (27/1414) + (64/32) × (36/1414) + (128/32) × (57/1414) + (2566/32) /32) × (916/1414) = 2-3 × (245/1414) + 2-2 × (16/1414) + 2-1 × (117/1414) + 20 × (27/1414) + 21 × (36/1414) + 2 2× (57/1414) + 2 3 × (916/1414) = 5.48. לפי נוסחה זו חושבו מדדי Lar של חומרים אנטי-מיקרוביאליים אחרים והם מוצגים בטבלה 1.
חשיבותו של מדד Lar הייתה לציין את דרגת החומרה של AMR במדויק. אם ניקח את ciprofloxacin וחומצה amoxicillin-clavulanic כדוגמאות, ערכי R% שלהם היו דומים, 68% ו 65%, בהתאמה, אבל מדדי Lar שלהם היו שונים באופן משמעותי, 4.57 ו 1.76, בהתאמה. הסיבה לכך הודגמה בבירור על ידי התפלגות ערכי ה-MIC הגבוהים בטבלה 1, שבה 71.3% מהזנים העמידים לציפרופלוקסצין התפזרו ב-8R (32 מיקרוגרם/מ"ל), בעוד שה-MICs של זנים עמידים לחומצה אמוקסיצילין-קלאבולנית התרכזו בעיקר ב-R וב-2R, והשיעור של 8R היה נמוך (8.69%). לכן, מדד Lar של ciprofloxacin היה גבוה מזה של חומצה amoxicillin-clavulanic, המציין כי חלקם של זנים עמידים מאוד ciprofloxacin היה גבוה מזה של זנים עמידים חומצה amoxicillin-clavulanic. מדד Lar היה אינדיקטור מדויק יותר למידת AMR מאשר שיעור ההתנגדות.
על פי הנוסחה של מדד Lar, אם ה-MICs של כל הזנים ביחס לתרופה מסוימת היו R, מדד Lar יהיה 1; אם ה-MICs של כל הזנים היו 2R, מדד Lar היה 2. לכן, מדד Lar הראה קשרים מרובים בין ה-MICs המקיפים לבין ערך ה-R המתאים, למעט ריכוזי הקצה. מדד Lar שימש להערכת מידת AMR, והיתרון היה בולט יותר אם AMR היה גבוה יותר. לשם אחידות והשוואה, טווח החישוב של מדד Lar היה שבעה MICs כאשר 3 שיפועים קדמיים ואחוריים מרוכזים בערך R, והממוצע המשוקלל התקבל על ידי שילוב החומרים האנטי-מיקרוביאליים השונים, מספר הזנים והתפלגויות MIC. לכן, טווח הערכים של מדד Lar היה 0.125-8. ככל שה-Lar היה קרוב יותר ל-0.125, כך ה-AMR היה נמוך יותר, וככל שהוא היה קרוב יותר ל-8, כך ה-AMR היה גבוה יותר. עם זאת, לא היה קשר פרופורציונלי בין Lar ו-R בריכוז הקצה. כאשר הסוכנים האנטי-מיקרוביאליים וטווח החישוב של מדד Lar היו מוגדרים, ה-Lar הכללי נורמל לערך אינטואיטיבי מקיף המשמש להשוואה ישירה והערכה של מידת ומגמת השינוי של AMR בתנאים שונים של חיידקים, משתמשים, שנים, אזורים שונים וכו '.
בעקבות הפרוטוקול של מערכת סינון הפאגים החכמה, היישום הודגם על ידי לקיחת 96 פאגים של סלמונלה לזני סלמונלה AMR כדוגמה, והתבנית הליטית של הפאגים נותחה.
תשעים ושישה פאגים הועברו לצלחות דו-שכבתיות המכילות סלמונלה על ידי חיסון מטריצה בעל 96 נקודות. המורפולוגיה של הכתמים שנוצרו מוצגת באיור 4. היו ארבעה סוגים עיקריים (אם כי לא מוגבל לארבעה): נקודה עגולה ברורה (●), אוסף של לוחות (), נקודה ליטית עכורה (), ולא נקודה ליטית (
○).
איור 4: מורפולוגיה של כתמי סלמונלה על לוחות אגר דו-שכבתיים. 1 ו-2: הדפוסים המיוצרים על ידי 96 פאגים על זני סלמונלה שונים. "●" נקודה ברורה עגולה, "" אוסף לוחות, "" נקודה ליטית עכורה, "○" ללא נקודה ליטית) אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
על הלוחות הדו-שכבתיים, הכתמים הליטיים של פאגים שונים על חיידקים מארחים שונים היו מגוונים במורפולוגיה10. "הכתם הליטי העגול והברור" נוצר כתוצאה מפאג' שיכול להרוג באופן אמין את הפונדקאי שעל הצלחת, אך עשוי להשתכפל בהצלחה על חשבונו של אותו מארח. במקרה זה, דילול נוסף היה צורך לקבוע באופן סופי את הסוג. "אוסף הלוחות" נוצר על ידי לוחות אמיתיים. כל אזור בודד של ליזה הופק בבירור ממרכז זיהומי יחיד, מה שהראה שהפאגים השתכפלו על חשבון החיידקים בצלחת. "הכתם הליטי העכור" נוצר כתוצאה מפאג' שלא הרג באופן אמין את הפונדקאי שעל הצלחת ואשר עשוי להשתכפל בהצלחה על חשבונו של אותו מארח. במקרה זה, הייתה יותר מאפשרות אחת, ולכן נדרש אישור על סמך תחומי מחקר נוספים. ה"אין נקודה ליטית" הצביעה על אופי לא ליטי.
יתר על כן, שימוש במערכת זו לבדיקות ראשוניות יכול למעשה לקבוע אם הזנים והבקטריופאג'ים שוכפלו. אם נבחרו זני סלמונלה שונים והדפוסים של שני בקטריופאג'ים היו זהים, הדבר הצביע על כך שהבקטריופאג'ים עשויים להיות משוכפלים. אם בקטריופאג'ים לא חוזרים נבחרו להדביק זני סלמונלה לא ידועים ממקורות קליניים ודפוס הפאגים היה זהה, זה הצביע על כך שזני סלמונלה עשויים להיות אותו זן. יתר על כן, למספר ושיעור הכפילויות היו ערכי ייחוס לחקירה אפידמיולוגית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטת דילול אגר כבר מבוססת היטב בשימוש נרחב. העיקרון של מערכת AST בתפוקה גבוהה היה זה של שיטת דילול אגר. אחד השלבים הקריטיים בפרוטוקול היה העברה מדויקת בתפוקה גבוהה של 96 חיסונים בו זמנית, שבוצעה מספר פעמים ברציפות. כדי להשלים את השלב הקריטי הזה, הפינים של חיסון המטריצה בן 96 הנקודות היו אחידים וחלקים מאוד. התצהיר הטבעי של כל סיכה היה נפח של כ-2 מיקרוליטר, שהצטבר לטיפות קטנות על פני השטח של מצע האגר כדי להיספג במהירות לתוך האגר, ולא לזרום או להתיז כדי לגרום לזיהום צולב. השלב הקריטי השני היה עיבוד סטטיסטי של נתוני AST גדולים. עם חיסון בתפוקה גבוהה, היה צורך לקבוע את נתוני הבדיקה, ועומס העבודה היה עצום. הניתוח החכם והתוצאות הסטטיסטיות שהופקו על ידי ממיר רכישת התמונה החכם והתוכנה התומכת היו פתרון מושלם לבעיה זו. תוצאות AST הועלו באופן אוטומטי ישירות למסד הנתונים של Varms. היעילות והדיוק של פירוש התוצאות שופרו, והטעויות שנגרמו על ידי גורמים אנושיים צומצמו13.
הצעד הקריטי השלישי היה להציע את מדד Lar של AMR. נכון לעכשיו, ישנם מעט מדדי הערכה מקיפים של AMR בעולם. על פי הספרות, מדד עמידות לתרופות (DRI) תואר על ידי Laxminarayan ו Klugman כדי למדוד שינויים ביעילות אנטיביוטיקה14,15. המחקר שילב את שכיחות העמידות ואת התדירויות היחסיות של תרופות מרשם, אך לא הצליח לאפיין את מידת ה-AMR ולהעריך את השינויים ברמות העמידות הגבוהות לתרופות. מדד יעילות התרופה (DEI)16, מדד נוסף הנגזר מה-DRI, הוא בעל חיסרון זהה לזה של ה-DRI. לפיכך, הוצע מדד Lar, שהורכב משלושה שלבים: (1) ה-MICs של זני חיידקים נורמלו על בסיס ערך R בהתאמה, תוך ביטול ההבדלים בחומרים אנטי-מיקרוביאליים שנגרמו על ידי ערכי R שונים של תקן AST; (2) על פי התפלגות ה-MIC, הערכים הממוצעים המשוקללים חושבו כך שישקפו את מידת ה-AMR בצורה מדויקת יותר משיעור ההתנגדות; (3) הממוצע האריתמטי של מדדי Lar של חומרים אנטי-מיקרוביאליים מרובים, כלומר Lar הכללי, יכול לשקף את המצב הכולל של AMR, ולהציע נוחות להערכה והשוואה של AMR ברמות שונות.
תכנון החומרה של מנגנונים אלה היה סביר ופשוט לתפעול, וכל החלקים פעלו בצורה חלקה. לא הייתה שום בעיית חסימה או תקלה. העיצוב של התוכנה התומכת תאם את הדרישות המותאמות אישית של AST וסינון פאגים והיה קל לתפעול ולשימוש. מכשיר אחד צויד ב-4-5 קופסאות של סיכות חיסון לתרחישים ישימים מרובים של העברת חיידקי אצווה. מרכיבי הליבה של מכשיר זה היו לוח סיכות החיסון וסיכות עשויות נירוסטה, אשר היו ניתנות להתאמה למגוון סביבות וניתן היה לנטרל, לפרק ולהחליף. סיכות החיסון תוכננו להיות משולבות בכל דרך שהיא.
היה הכרח להקים מערכת ניטור AMR בגלל השכיחות של פתוגנים עמידים הנגרמים כתוצאה משימוש לרעה באנטיביוטיקה. מאז 2008, צוות בריאות הציבור של המכון למדעי בעלי חיים ורפואה וטרינרית, האקדמיה למדעי החקלאות של שאנדונג, ביצע ניטור AMR של בעלי חיים ברציפות במחוז שאנדונג1 2,13,17. היה צורך לזהות ביעילות MICs של פתוגנים כדי לווסת את השימוש בסוכנים מיקרוביאליים בגלל הרמה הגבוהה של עמידות וטרינרית ונפח ניטור גדול. עם זאת, המכשירים הרלוונטיים עבור AST הם יקרים, ואת עלות הפעולה ואת המתכלים הוא גבוה ולא מתאים למגוון רחב של חוות בקנה מידה גדול. מסיבה זו, הפיתוח של מערכת AST חכמה בעלת תפוקה גבוהה והסטנדרטיזציה של היישום שלה תרמו לקידום הקמת מערכת קול לטכנולוגיית ניטור AMR. על פי מחקר קודם12,13, מערכת AST חכמה בעלת תפוקה גבוהה השיגה יכולת חזרה טובה ויציבות כדי להתאים לתקן CLSI ויושמה על AST וניתוח של חיידקים פתוגניים קליניים בבעלי חיים. עד כה הצטברו12 נתוני AMR מקיפים של יותר מ-20,000 זני מגיפה. עבור החיידקים העמידים שנמצאים בתהליך הניטור, מערכת זו יכולה לשמש גם לסינון מהיר בתפוקה גבוהה של פאגים ליטיים כדי לשתף פעולה עם חומרים אנטי-מיקרוביאליים כדי להפחית AMR. היישום של חיסון המטריצה 96 הנקודות וממיר רכישת התמונה לבדיקת פאגים ליזה היה פונקציה מורחבת, ולא יושמו מכשירים אחרים בתחום זה קודם לכן.
מערכת סינון AST/פאגים חכמה בעלת תפוקה גבוהה שילבה AST עם בקטריופאג'ים ליטיים כדי להשיג ניטור, בקרה והפחתה של AMR. במקביל, מדד Lar שימש באופן אינטואיטיבי ותמציתי יותר כדי להעריך את התרומות של גורמים שונים וטכנולוגיות אנטיבקטריאליות חדשות להפחתת AMR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yuqing Liu et al. הגישו פטנטים סיניים עבור 96-dot מטריקס חיסון וממיר רכישת תמונה ואת היישומים שלהם (פטנט מספר ZL 201610942866.3 ופטנט מספר ZL 201910968255.X).
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט המחקר והפיתוח הלאומי (2019YFA0904003); מערכת תעשייתית חקלאית מודרנית במחוז שאנדונג (SDAIT-011-09); פרויקט אופטימיזציה של פלטפורמת שיתוף פעולה בינלאומי (CXGC2023G15); משימות חדשנות עיקריות של פרויקט חדשנות מדעית וטכנולוגית חקלאית של האקדמיה למדעי החקלאות שאנדונג, סין (CXGC2023G03).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well culture plate | Beijing lanjieke Technology Co., Ltd | 11510 | |
| 96-dot matrix AST image acquisition system | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| 96-dot matrix inoculator | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Agar | Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd | HB8274-1 | |
| Amikacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A857053 | |
| Amoxicillin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A822839 | |
| Ampicillin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A830931 | |
| Analytical balance | Sartorius | BSA224S | |
| Automated calculation software for Lar index of AMR | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Bacteria Salmonella strains | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Animal origin |
| Bacterial resistance Lar index certification management system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Ceftiofur | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C873619 | |
| Ciprofloxacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C824343 | |
| Clavulanic acid | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C824181 | |
| Clean worktable | Suzhou purification equipment Co., Ltd | SW-CJ-2D | |
| Colistin sulfate | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C805491 | |
| Culture plate | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Doxycycline | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | D832390 | |
| Enrofloxacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | E809130 | |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SLGP033RB | |
| Florfenicol | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | F809685 | |
| Gentamicin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | G810322 | |
| Glass bottle 50 mL | Xuzhou Qianxing Glass Technology Co., Ltd | QX-7 | |
| High-throughput resistance detection system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Image acquisition converter | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Meropenem | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | M861173 | |
| Mueller-Hinton agar | Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd | HB6232 | |
| Petri dish 60 mm x 15 mm | Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd | 16021-1 | |
| Petri dish 90 mm x 15 mm | Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd | 16001-1 | |
| Salmonella phages | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | |
| Shaker incubator | Shanghai Minquan Instrument Co., Ltd | MQD-S2R | |
| Turbidimeter | Shanghai XingBai Biotechnology Co., Ltd | F-TC2015 | |
| Varms base type library system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Vertical high-pressure steam sterilizer | Shanghai Shen'an medical instrument factory | LDZX-75L | |
| Veterinary pathogen resistance testing management system | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Veterinary resistance cloud monitoring and phage control platform V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright |
References
- Ramanan, L., et al. Antimicrobial resistance-the need for global solutions. The Lancet Infectious Diseases. 13 (12), 1057-1098 (2013).
- Xiaonan, Z., Qing, Z., Thomas, S. P., Yuqing, L., Martha, R. J. C. inPhocus: Perspectives of the application of bacteriophages in poultry and aquaculture industries based on Varms in China. PHAGE: Therapy, Applications, and Research. 2 (2), 69-74 (2021).
- CLSI. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. CLSI document M100. , M100 32nd edition, Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA . (2022).
- Yuqing, L., et al. Antimicrobial Sensitivity Testing Standard of EUCAST. , China Standards Press, Beijing. (2017).
- Barnini, S., et al. A new rapid method for direct antimicrobial susceptibility testing of bacteria from positive blood cultures. BMC Microbiology. 16 (1), 185-192 (2016).
- Höring, S., Massarani, A. S., Löffler, B., Rödel, J. Rapid antimicrobial susceptibility testing in blood culture diagnostics performed by direct inoculation using the VITEK®-2 and BD PhoenixTM platforms. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (3), 471-478 (2019).
- Dupuis, G. Evaluation of the Cobasbact automated antimicrobial susceptibility testing system. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 4 (2), 119-122 (1985).
- A system of bacterial antimicrobial resistance detection and its operation method. China Patent. Liu, Y., et al. , ZL 201610942866.3 (2019).
- A high throughput test plate for screening bacteriophage of zoonotic pathogens and its application. China Patent. Liu, Y. , ZL 201910968255.X (2022).
- Adams, M. H. Bacteriophages. , Interscience Publishers, New York. (1959).
- Nair, A., Ghugare, G. S., Khairnar, K. An appraisal of bacteriophage isolation techniques from environment. Microbial Ecology. 83 (3), 519-535 (2022).
- Shandong veterinary antibiotic resistance system. , http://www.varms.cn (2023).
- Ming, H., et al. Comparison of the results of 96-dot agar dilution method and broth microdilution method. Chinese Journal of Antibiotics. 43 (6), 729-733 (2018).
- Laxminarayan, R., Klugman, K. P. Communicating trends in resistance using a drug resistance index. BMJ Open. 1 (2), e000135 (2011).
- Chen, Y., et al. Assessing antibiotic therapy effectiveness against the major bacterial pathogens in a hospital using an integrated index. Future Microbiology. 12, 853-866 (2017).
- Ciccolini, M., Spoorenberg, V., Geerlings, S. E., Prins, J. M., Grundmann, H. Using an index-based approach to assess the population-level appropriateness of empirical antibiotic therapy. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (1), 286-293 (2015).
- Yanbo, L., et al. Preliminary application of inoculation system for high-throughput drug susceptibility test. China Poultry. 42 (6), 52-57 (2020).
