Anvendelse af det intelligente antimikrobielle følsomhedstestsystem med høj kapacitet/fagscreeningssystemet og Lar-indekset for antimikrobiel resistens

Summary

Her introducerer vi princippet, strukturen og instruktionen af det intelligente high-throughput antimikrobielle følsomhedstest/fagscreeningssystem. Dens anvendelse illustreres ved at bruge salmonella isoleret fra fjerkræ i Shandong, Kina, som et eksempel. Lar-indekset beregnes, og dets betydning for evaluering af antibiotikaresistens diskuteres udførligt.

Abstract

For at forbedre effektiviteten af antimikrobiel følsomhedstest (AST) og-high-throughput screening for resistente bakterier og for at reducere detektionsomkostningerne blev der udviklet et intelligent AST/fagscreeningssystem med høj kapacitet, herunder en 96-punkts matrixinokulator, billedoptagelseskonverter og tilsvarende software, i henhold til AST-kriterier og brudpunkterne for resistens (R) formuleret af Clinical &; Laboratory Standards Institute (CLSI). ASAT og statistik over fordeling af mindste hæmmende koncentration (MIC) (fra R/8 til 8R) af 1.500 salmonellastammer isoleret fra fjerkræ i Shandong, Kina, mod 10 antimikrobielle stoffer blev udført af det intelligente AST/fagscreeningssystem med høj kapacitet. Lar-indekset, der betyder "mindre antibiose, mindre resistens og resterende indtil lidt antibiose", blev opnået ved at beregne det vægtede gennemsnit af hver MIC og dividere med R. Denne fremgangsmåde forbedrer nøjagtigheden sammenlignet med at anvende forekomsten af resistens til at karakterisere graden af antimikrobiel resistens (AMR) af stærkt resistente stammer. For stammerne af salmonella med høj AMR blev lytiske fager effektivt screenet fra fagbiblioteket af dette system, og lysisspektret blev beregnet og analyseret. Resultaterne viste, at det intelligente AST/fagscreeningssystem med høj kapacitet var funktionsdygtigt, nøjagtigt, yderst effektivt, billigt og let at vedligeholde. Kombineret med Shandongs veterinære overvågningssystem for antimikrobiel resistens var systemet egnet til videnskabelig forskning og klinisk påvisning relateret til AMR.

Introduction

Da antimikrobielle stoffer i vid udstrækning er blevet anvendt til forebyggelse af bakterielle infektionssygdomme, er antimikrobiel resistens (AMR) blevet et globalt folkesundhedsproblem¹. Bekæmpelse af antimikrobiel resistens er den nuværende hovedopgave med overvågning af epidemiologiske patogeners antimikrobiel resistens og synergistisk behandling af følsomme antimikrobielle stoffer og lytiske bakteriofaer².

In vitro-test for antimikrobiel følsomhed (ASAT) er grundpillen i overvågningen af behandlingen og påvisningen af AMR-niveauet. Det er en vigtig del af antimikrobiel farmakologi og det kritiske grundlag for klinisk medicinering. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) i USA og European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) har formuleret og revideret internationale AST-kriterier og løbende ændret og suppleret AST-metoder og breakpoints til bestemmelse af MIC for en bestemt kombination af "organism-antimikrobielt stof" som følsom (S), resistent (R) eller intermediær (I)^{3. 4}.

Fra 1980'erne til 1990'erne blev automatiske mikro bouillonfortyndingsinstrumenter hurtigt udviklet og anvendt til klinisk praksis, med eksempler som Alfred 60AST, VITEK System, PHOENIXTM og Cobasbact ^5,6,7. Disse instrumenter var imidlertid dyre, krævede dyre forbrugsstoffer, og deres detektionsområder var designet til klinisk patientmedicin ^5,6,7. Af disse grunde er de ikke egnede til veterinær klinisk undersøgelse og påvisning af store mængder stærkt resistente stammer. I denne undersøgelse blev der udviklet et intelligent AST/fagscreeningssystem med høj kapacitet, herunder en 96-punkts matrixinokulator (figur 1), billedoptagelseskonverter (figur 2) og tilsvarende software⁸, til at udføre AST for et parti bakteriestammer mod flere antimikrobielle midler ad gangen ved agarfortyndingsmetoden. Desuden blev systemet også brugt til at detektere og analysere fagernes lyseringsmønstre mod antibiotikaresistente bakterier⁹, og lytiske fager blev valgt effektivt fra fagbiblioteket. Dette system viste sig at være effektivt, overkommeligt og let at betjene.

Figur 1: Strukturdiagram over 96-punkts matrixinokulatoren. 1: Inokulationsstiftplade; 2: Mobiloperatør; 3: Frøblok; 4: Inkuberet plade; 5: Grundlag; 6: Betjening af håndtag; 7: Begræns stift. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Strukturdiagram over billedoptagelseskonverteren. 1: Skal; 2: Skærm; 3: Billedoptagelsesrum; 4: Detekteringstavle base; 5: Detekteringstavle ind og ud af lager; 6: Kontrolkort; 7: Enhed til konvertering af billedoptagelse; 8: Lyskilde; 9: Billedscanner. Klik her for at se en større version af denne figur.

Protocol

De salmonellastammer, der blev anvendt i denne undersøgelse, blev indsamlet fra fjerkræ i Shandong, Kina, efter at have opnået godkendelse fra Biosafety Committee of Institute of Animal Sciences and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Kina.

1. Anvendelse af det intelligente AST-system med høj kapacitet⁸

1. Forberedelse af podning
   1. Kvalitetskontrolorganismen Escherichia coli og 93 salmonellastammer , der skal undersøges for AST, inkuberes på Mueller-Hinton agarplader (MHA) i 16-18 timer ved 37 °C³.
   2. Forbered podningen af hver stamme til at matche 0,5 McFarland turbiditetsstandard baseret på metoden specificeret i CLSI-standarden³, og fortynd derefter 10 gange.
   3. 200 μL sterilt normalt saltvand anbringes i den vandrette 1. brønd (A1) på 96-brøndpladen som negativ kontrol, to suspensioner af kvalitetskontrolorganismen i den vandrette 2. og 3^{. brønd (}A2 og A3) som henholdsvis positiv kontrol og kvalitetskontrol^. Der tilsættes 200 μL af suspensionerne af fortyndet podning af hver testet plet i de tilsvarende 93 huller i frøblokken med 96 huller.
2. Fremstilling af antimikrobiel agarplade
   1. Indstil koncentrationsområderne for forskellige antibakterielle midler, der testes i henhold til beregningsområdet for Lar-indekset (fra 0,125R til 8R). Koncentrationerne spænder fra kvalitetskontrolområdet eller 0,0625R (underlagt det lavere område) til 8R.
      BEMÆRK: Hvis Lar-indekset ikke beregnes, kan intervallet for antibiotikakoncentrationer indstilles i henhold til AST's behov.
   2. Der udføres en log2-fordoblingsfortyndingsplan for antibiotikaopløsning, begyndende med en passende stamkoncentration baseret på agarfortyndingsmetoden, der er specificeret i CLSI-standard³.
   3. Steriliser 50 ml glasflasker indeholdende 18 ml Mueller-Hinton agarmedier. Der tilsættes 2 ml af passende fortyndinger af den antimikrobielle opløsning til 18 ml smeltet medie afkølet til 45-50 °C, blandes grundigt og hældes i pladerne i biosikkerhedskabinettet.
   4. Lad agaren størkne ved stuetemperatur (RT), efterlad et hul under låget på inkuberede plader og blæs for at tørre agaroverfladen inden podning.
   5. Mærk typerne af antimikrobielle midler og koncentrationer på bagsiden af de inkuberede plader. De mange inkuberede plader af hvert antimikrobielt middel anbringes i en stak i log2-fordobling af fortyndingsrækkefølgen.
   6. Forbered to lægemiddelfrie agarplader som kontrol for hvert antimikrobielt middel.
3. Podningstrin for 96-punkts matrixinokulator
   1. Installer den autoklaverede podningsstiftplade på understøttelsen af en 96-punkts matrixinokulator i biosikkerhedsskabet.
   2. Den forberedte frøblok med testede stammer og en agarinkuberet plade anbringes på den mobile bærer med samme positioneringsvinkel for de to plader.
   3. Tryk på mobilholderen, så frøblokken er direkte under podningsstiftpladen.
   4. Tryk på betjeningshåndtaget, flyt podningsstiftpladen ned, og ret de 96 stifter til podningen i 96 brønde i frøblokken.
   5. Slip betjeningshåndtaget med kontrol, og nulstil derefter podningsstiftpladen under fjederens virkning.
   6. Tryk på betjeningshåndtaget 2-3 gange for at røre hvert poderum godt og dyppe. Skub og flyt bærepladen, så den inkuberede plade er direkte under podningsstiftpladen.
   7. Tryk på betjeningshåndtaget, flyt podestiftpladen ned, og stop i 1-2 s for at få podningsstifterne til at berøre overfladen af den inkuberede plade helt.
   8. Slip betjeningshåndtaget. Dette fuldender en podning. Udskift en anden inkuberet plade, og fortsæt cyklussen, indtil en gruppe antimikrobielle agarplader er færdig.
   9. Udskift en anden podningsstiftplade og frøblok, og pod en anden gruppe testede stammer. Cyklus, indtil alle vaccinationer er afsluttet.
      BEMÆRK: Pod først en kontrolagarplade (intet antimikrobielt middel), derefter pladen i rækkefølge efter lægemiddelkoncentration fra lav til høj og en anden kontrolagarplade sidst for at sikre, at der ikke overføres kontaminering eller antimikrobielt middel. Det inokulerende volumen afhænger af volumenet af den naturlige aflejring af hver stift på ca. 2 μL.
4. Inkubation af de antimikrobielle agarplader
   1. De podede antimikrobielle agarplader inkuberes ved RT, indtil fugtigheden i podepletterne absorberes i agaren.
   2. Pladerne vendes om og inkuberes i 16-20 timer ved 37 °C for de testede stammer for at sikre, at de uhæmmede bakterier danner kolonier.
5. Billedoptagelse og datastatistik
   1. Dobbeltklik på 96-dot matrix AST billedoptagelsessystem for at åbne programmet.
   2. Klik på Test information på proceslinjen. Klik på Ny for at oprette en ny testopgave, og udfyld oplysningerne i henhold til vejledningen, herunder kode, navn, kilde, bakterier, antal stammer, antibiotika og gradient.
   3. Klik på Dataindsamling > Fotografi > Testelement for at vælge den nye opgave, der oprettes. Klik på Antibiotika for at vælge navnet på antibiotika, og klik på Gradient for at vælge den indledende koncentration af dette antibiotikum.
   4. Klik på Opret forbindelse for at oprette forbindelse til billedoptagelseskonverteren.
   5. Placer de tilsvarende inkuberede plader på detekteringspladebasen med den manglende vinkel på højre front for orientering, og skub ind i billedoptagelseskonverteren.
   6. Klik på Samling for at hente billederne. Antibiotikagradienten springer automatisk til næste gradient. Placer den næste plade efter tur, og fortsæt med at klikke på Opsamling , indtil pladerne til dette antibiotikum er opsamlet.
   7. Klik på Antibiotika, og vælg det næste sæt inkuberede plader. Klik på Gradient for at vælge startgradienten og fortsætte til næste runde af billedindsamling.
   8. Når du har gennemført alle samlinger, skal du klikke på Send. Programmet genkender automatisk antallet af hvide pixels, der er formateret ved hvert podningspunkt i billederne, bestemmer, om der er kolonidannelse og konverterer billederne til MIC-værdier.
   9. Klik på Forespørgsel for at få alle MIC-resultater af stammerne mod de testede antibiotika.
      BEMÆRK: Det intelligente AST-system med høj kapacitet er velegnet til bestemmelse af MIC'er for store partier bakteriestammer. Testprocessen, herunder forberedelse, podning, inkubation og resultatlæsning, tager 3 dage. Typerne af antibiotika og MIC-detektionsområder kan indstilles efter respektive behov, og de vigtigste forbrugsstoffer kan genbruges.
6. Beregning af Lar-indekset
   1. Bestem Lar-indekset nøjagtigt med formlen: , hvor:
      MIC_i: mindste hæmmende koncentration.
      Området for _{MIC-fordelinger fra MIC-3} til MIC₃ repræsenterer serielle dobbelte koncentrationer centreret om R: 0,125R, 0,25R, 0,5R, R, 2R, 4R og 8R.
      er 2 i, og intervalletⁱ er -3 til 3.
      R: brudpunkterne for resistens af bakterier mod antimikrobielle midler standardiseret af CLSI.
      f: MIC-frekvensfordelingen.
      BEMÆRK: Det generelle Lar-indeks er det aritmetiske gennemsnit af alle Lar-indekser. Når Lar-indekset er beregnet, afrundes den endelige værdi til to betydende cifre efter decimaltegnet.

2. Intelligent fagscreeningssystem med høj kapacitet⁹

1. Forberedelse af fagfrøblokken og dobbeltlags inkuberede plader indeholdende bakterier.
   1. Brug dobbeltlags agarmetode¹⁰ eller flydende kulturmetode¹¹ til fremstilling af forskellige fager. Fortynd til en passende parallel koncentration med en titer på 1 x 10^4-5 pfu/ml, og tilsæt 200 μL faginokulum i frøblokken med 96 brønde.
   2. Lav dobbeltlagsplader med bakterier (10 ml bundagarmedier [agar 12 g / L] og 6 ml øvre semiagarmedier [6 g / L] med 100 μL bakterier [0,5 McFarland]), der skal testes.
   3. Lav en dobbeltlags inkuberet plade for hver stamme, der skal testes. Efterlad et hul under låget på den dobbeltlagede plade og blæs for at tørre agaroverfladen i biosikkerhedsskabet.
2. Screeningtest
   1. Placer den forberedte fagfrøblok og dobbeltlagsplade på mobilbæreren af 96-punktmatrixinokulatoren, og overfør alle faginokula til halvagaroverfladen. Fortsæt cyklusserne, indtil alle testede stammer er afsluttet.
   2. Lad de podede dobbeltlagsplader forblive ved RT, indtil fugtigheden i podepletterne absorberes fuldt ud i halvagaren.
   3. Pladerne vendes om, og de inkuberes under passende betingelser for de testede stammer i 4-6 timer for at sikre, at der dannes klare lytiske pletter.
3. Analyse af data
   1. Billedet af forsøgsresultatet for hver dobbeltlagsplade hentes og gemmes af billedoptagelseskonverteren (trin 1.5.4-1.5.6).
   2. Optag antallet og morfologierne af de forskellige former for pletter i et regneark baseret på de opnåede billeder, og beregn de respektive proportioner af de forskellige slags fager.

Representative Results

I overensstemmelse med protokollen for det intelligente AST-system med høj kapacitet blev dets anvendelse illustreret med salmonella fra fjerkræ i Shandong i Kina, som et eksempel.

Væksten af salmonellastammer på agarplader med ampicillin (R på 32 μg/ml) i koncentrationer fra 2 til 256 μg/ml bestemt af billedoptagelseskonverteren er vist i figur 3. Den vandrette 1^{. brønd} A1 var den negative kontrol og viste ingen kolonivækst; A2 og A3 var kvalitetskontrolstammerne med MIC 4 μg/ml (danner en koloni på agarpladen med 2 μg/ml ampicillin, men ikke på 4 μg/ml), inden for kvalitetskontrolområdet standardiseret af CLSI (2-8 μg/ml). MIC for salmonellastammen i A4 var 64 μg/ml, mens MIC for A5 var 16 μg/ml. MIC-fordelinger af 93 salmonellastammer mod ampicillin blev beregnet automatisk af softwaren.

Figur 3: Morfologi af salmonella på en række dyrkningsplader med ampicillin. 8 vandret: A-H, 12 lodret: 1-12. Klik her for at se en større version af denne figur.

AST-systemet med høj kapacitet blev anvendt til at bestemme AMR for salmonellastammer fra dyr i Shandong-provinsen. MIC-dataene blev uploadet til Varms database (http://www.varms.cn/)¹². De statistiske resultater fremgår af tabel 1. I alt 10 antimikrobielle stoffer blev testet mod 300-1.500 salmonellastammer , hvilket viser fordelene ved dette system med høj kapacitet.

I henhold til de resistente brudpunkter i CLSI-standarden blev modstandshastigheden (R%) beregnet som en procentdel af stammer med MIC ≥ R blandt de testede stammer (tabel 1). R% -værdierne for ampicillin, ciprofloxacin og amoxicillin-clavulansyre var højere end 50%, R% -værdierne for doxycyclin, florfenicol, cefotaxim og enrofloxacin var 30% -50%, og R% -værdierne for gentamicin, amikacin og meropenem var mindre end 30%. Meropenem blev ikke anvendt til industrielt opdrættede dyr og viste en R% på 7%.

R% angav andelen af bakteriestammer med MIC højere end R, mens MIC-fordelinger viste antallet af stammer med hver MIC for at beskrive den samlede AMR af Salmonella mere præcist. For eksempel var R% af ampicillin 73%, og det maksimale antal prøver (916 stammer) var koncentreret med MIC ≥ 256 μg / ml, hvilket indikerer, at Salmonellas resistens over for ampicillin var ret alvorlig.

Tabel 1: MIC-fordelinger, R% og Lar-indeksværdier for salmonella fra dyr i Shandong-provinsen. MIC'er svarende til fed skrift er R-værdierne for antimikrobielle midler. Klik her for at downloade denne tabel.

For ensartethed og sammenlignelighed blev 3 gradienter forlænget fremad og bagud, centreret på R'et for hvert lægemiddel. Ifølge MIC-fordelingerne af syv gradienter blev Lar-indekset beregnet ved hjælp af formlen:

.

Som et eksempel for ampicillin var R-værdien 32 μg/ml, antallet af prøver var 1,414, og Lar = (4/32) x (245/1414) + (8/32) × (16/1414) + (16/32) × (117/1414) + (32/32) × (27/1414) + (64/32) × (36/1414) + (128/32) × (57/1414) + (256) /32) × (916/1414) = 2-3 × (245/1414) + 2-2 × (16/1414) + ^2-1 × (117/1414) + 2⁰ × (27/1414) + 2¹ × (36/1414) + 2² × (57/1414) + ^{2 3} × (916/1414) = 5,48. Ved denne formel blev Lar-indeks for andre antimikrobielle stoffer beregnet og vist i tabel 1.

Betydningen af Lar-indekset var at angive sværhedsgraden af AMR nøjagtigt. Hvis man tager ciprofloxacin og amoxicillin-clavulansyre som eksempler, var deres R% -værdier ens, henholdsvis 68% og 65%, men deres Lar-indekser adskilte sig signifikant på henholdsvis 4,57 og 1,76. Årsagen til dette blev tydeligt illustreret ved fordelingen af de høje MIC-værdier i tabel 1, hvor 71,3% af ciprofloxacinresistente stammer blev fordelt i 8R (32 μg/ml), mens MIC'erne for amoxicillin-clavulansyreresistente stammer hovedsagelig var koncentreret om R og 2R, og andelen af 8R var lav (8,69%). Lar-indekset for ciprofloxacin var derfor højere end for amoxicillin-clavulansyre, hvilket indikerer, at andelen af stærkt ciprofloxacinresistente stammer var højere end andelen af amoxicillin-clavulansyreresistente stammer. Lar-indekset var en mere præcis indikator for graden af AMR end modstandsraten.

Ifølge formlen for Lar-indekset, hvis MIC'erne for alle stammer med hensyn til et bestemt lægemiddel var R, ville Lar-indekset være 1; hvis MIC'erne for alle stammer var 2R, ville Lar-indekset være 2. Lar-indekset viste derfor flere relationer mellem de omfattende MIC'er og den tilsvarende R-værdi, bortset fra kantkoncentrationerne. Lar-indekset blev brugt til at vurdere graden af AMR, og fordelen var mere udtalt, hvis AMR var højere. For ensartethed og sammenlignelighed var beregningsområdet for Lar-indekset syv MIC'er med de forreste og bageste 3 gradienter centreret om R-værdien, og det vægtede gennemsnit blev opnået ved at integrere de forskellige antimikrobielle midler, antallet af stammer og MIC-fordelinger. Derfor var værdiområdet for Lar-indekset 0, 125-8. Jo tættere Lar var på 0, 125, jo lavere AMR, og jo tættere den var på 8, jo højere AMR. Der var imidlertid ingen proportional sammenhæng mellem Lar og R ved kantkoncentrationen. Da de antimikrobielle stoffer og beregningsområdet for Lar-indekset var bestemt, blev den generelle Lar normaliseret til en intuitiv omfattende værdi, der blev brugt til direkte at sammenligne og evaluere graden og ændringstendensen for AMR under de forskellige betingelser for forskellige bakterier, brugere, år, regioner osv.

Efter protokollen for det intelligente fagscreeningssystem blev applikationen demonstreret ved at tage 96 fager Salmonella for at lyse AMR Salmonella-stammer som et eksempel, og faglytisk mønster blev analyseret.

Seksoghalvfems fager blev overført til dobbeltlagsplader indeholdende salmonella af en 96-dot matrixinokulator. Morfologien af de dannede pletter er vist i figur 4. Der var fire hovedtyper (men ikke begrænset til fire): klar rund plet (●), samling af plaques (), uklar lytisk plet () og ingen lytisk plet (○).

Figur 4: Morfologi af salmonellapletter på dobbeltlags agarplader. 1 og 2: mønstrene produceret af 96 fager på forskellige salmonellastammer. "●" rund klar plet, "" samling af plaques, "" uklar lytisk plet, "○" ingen lytisk plet) Klik her for at se en større version af denne figur.

På dobbeltlagspladerne var de lytiske pletter af forskellige fager på forskellige værtsbakterier forskellige i morfologi¹⁰. Den "runde, klare lytiske plet" skyldtes en, der pålideligt kunne dræbe værten på pladen, men som måske eller måske ikke med succes replikerer på værtens bekostning. I dette tilfælde var yderligere fortynding nødvendig for endeligt at bestemme typen. "Samlingen af plaques" blev dannet af ægte plaques. Hver enkelt lysiszone blev tydeligt produceret fra et enkelt infektiøst center, hvilket viste, at fagen havde replikeret på bekostning af bakterierne på pladen. Den "uklare lytiske plet" skyldtes en, der ikke pålideligt dræbte værten på pladen, og som måske eller måske ikke med succes replikerer på værtens bekostning. I dette tilfælde var der mere end én mulighed, hvilket krævede bekræftelse baseret på yderligere forskningsinteresser. Den "ingen lytiske plet" angav ikke-lytisk natur.

Desuden kunne brugen af dette system til indledende test i det væsentlige afgøre, om stammerne og bakteriofagerne blev duplikeret. Hvis forskellige salmonellaarter blev udvalgt, og mønstrene for to bakteriofager var identiske, indikerede det, at bakteriofagerne kunne duplikeres. Hvis ikke-gentagne bakteriofager blev udvalgt til at inficere ukendte salmonellaarter fra kliniske kilder, og fagmønsteret var det samme, indikerede det, at salmonellastammer kunne være den samme stamme. Desuden havde antallet og andelen af dubletter referenceværdier for epidemiologisk undersøgelse.

Discussion

Agarfortyndingsmetoden er veletableret og anvendes bredt. Princippet i AST-systemet med høj kapacitet var agarfortyndingsmetoden. Et af de kritiske trin i protokollen var den nøjagtige overførsel med høj gennemstrømning af 96 inokula ad gangen, som blev udført flere gange i træk. For at fuldføre dette kritiske trin var stifterne på 96-punkts matrixinokulatoren ensartede og meget glatte. Den naturlige aflejring af hver stift var et volumen på ca. 2 μL, som aggregerede i små dråber på overfladen af agarmediet, der hurtigt absorberes i agaren og ikke flyder eller sprøjter for at forårsage krydskontaminering. Det andet kritiske trin var den statistiske behandling af store AST-data. Med podning med høj kapacitet skulle testdata bestemmes, og arbejdsbyrden var enorm. Den intelligente analyse og statistiske resultater produceret af den intelligente billedoptagelseskonverter og understøttende software var en perfekt løsning på dette problem. AST-resultaterne blev automatisk uploadet direkte til Värms-databasen. Effektiviteten og nøjagtigheden af resultatfortolkningen blev forbedret, og fejlene forårsaget af menneskelige faktorer blev reduceret¹³.

Det tredje kritiske skridt var at foreslå Lar-indekset for AMR. På nuværende tidspunkt findes der kun få omfattende evalueringsindekser for antimikrobiel resistens i verden. Ifølge litteraturen blev et lægemiddelresistensindeks (DRI) beskrevet af Laxminarayan og Klugman for at måle ændringer i antibiotikaeffektivitet^14,15. Det kombinerede forekomsten af resistens og relative hyppigheder af ordinering, men kunne ikke karakterisere graden af AMR og evaluere ændringerne i høje lægemiddelresistensniveauer. Lægemiddeleffektivitetsindekset (DEI)¹⁶, et andet indeks afledt af DRI, har samme ulempe som DRI. Således blev Lar-indekset foreslået, som bestod af tre trin: (1) MIC'erne for bakteriestammer blev normaliseret baseret på den respektive R-værdi, hvilket eliminerede forskellene i antimikrobielle midler forårsaget af forskellige R-værdier i AST-standarden; (2) Ifølge MIC-fordelingerne blev de vægtede gennemsnitsværdier beregnet således, at de afspejler AMR-graden mere nøjagtigt end resistensraten. (3) Det aritmetiske gennemsnit af Lar-indekserne for flere antimikrobielle stoffer, dvs. den generelle Lar, kan afspejle AMR's samlede situation og gøre det lettere at vurdere og sammenligne AMR på forskellige niveauer.

Hardwaredesignet af disse apparater var rimeligt og enkelt at betjene, og alle dele løb glat. Der var ingen fastklemningsproblem eller fejl. Designet af den understøttende software matchede de personlige krav til AST- og fagscreening og var let at betjene og bruge. Et instrument var udstyret med 4-5 kasser podningsstifter til flere anvendelige scenarier for batchbakterieoverførsel. Kernekomponenterne i dette instrument var podningsstiftpladen og stifterne lavet af rustfrit stål, som kunne tilpasses forskellige miljøer og kunne autoklaveres, adskilles og udskiftes. Inokulationsstifterne blev designet til at blive kombineret på nogen måde.

Det var bydende nødvendigt at etablere et AMR-overvågningssystem på grund af forekomsten af resistente patogener forårsaget af misbrug af antibiotika. Siden 2008 har folkesundhedsteamet ved Institut for Husdyrvidenskab og Veterinærmedicin, Shandong Academy of Agricultural Sciences, udført AMR-overvågning af dyr successivt i Shandong-provinsen¹ 2,13,17. Det var nødvendigt effektivt at påvise MIC'er af patogener for at regulere brugen af antimikrobielle stoffer på grund af det høje niveau af veterinærresistens og den store overvågningsmængde. De relevante instrumenter til AST er imidlertid dyre, og omkostningerne ved drift og forbrugsvarer er høje og ikke egnede til en lang række store bedrifter. Af denne grund var udviklingen af det intelligente AST-system med høj kapacitet og standardiseringen af dets anvendelse befordrende for at fremme etableringen af et sundt system til AMR-overvågningsteknologi. Ifølge tidligere forskning^12,13 opnåede det intelligente AST-system med høj kapacitet god repeterbarhed og stabilitet for at matche standarden for CLSI og blev anvendt til AST og analyse af kliniske patogene bakterier hos dyr. Til dato er omfattende AMR-data for mere end 20.000 epidemiske stammer blevet akkumuleret¹². For de resistente bakterier, der findes i overvågningsprocessen, kan dette system også bruges til hurtig high-throughput screening af lytiske fager for at samarbejde med antimikrobielle midler for at reducere AMR. Anvendelsen af 96-punkts matrixinokulatoren og billedoptagelseskonverteren til faglysescreening var en udvidet funktion, og ingen andre instrumenter var tidligere blevet anvendt på dette område.

Det intelligente AST/fagscreeningssystem med høj kapacitet kombinerede AST med lytiske bakteriofager for at opnå AMR-overvågning, kontrol og reduktion. Samtidig blev Lar-indekset mere intuitivt og kortfattet brugt til at evaluere bidragene fra forskellige faktorer og nye antibakterielle teknologier til reduktionen af AMR.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well  culture plate	Beijing lanjieke Technology Co., Ltd	11510
96-dot matrix AST image acquisition system	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	In-house software copyright
96-dot matrix inoculator	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	N/A	Patented product
Agar	Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd	HB8274-1
Amikacin	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	A857053
Amoxicillin	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	A822839
Ampicillin	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	A830931
Analytical balance	Sartorius	BSA224S
Automated calculation software for Lar index of AMR	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	In-house software copyright
Bacteria Salmonella strains	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	N/A	Animal origin
Bacterial resistance Lar index certification management system V1.0	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	In-house software copyright
Ceftiofur	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	C873619
Ciprofloxacin	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	C824343
Clavulanic acid	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	C824181
Clean worktable	Suzhou purification equipment Co., Ltd	SW-CJ-2D
Colistin sulfate	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	C805491
Culture plate	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	N/A	Patented product
Doxycycline	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	D832390
Enrofloxacin	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	E809130
Filter 0.22 μm	Millipore	SLGP033RB
Florfenicol	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	F809685
Gentamicin	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	G810322
Glass bottle 50 mL	Xuzhou Qianxing Glass Technology Co., Ltd	QX-7
High-throughput resistance detection system V1.0	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	In-house software copyright
Image acquisition converter	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	N/A	Patented product
Meropenem	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	M861173
Mueller-Hinton agar	Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd	HB6232
Petri dish 60 mm x 15 mm	Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd	16021-1
Petri dish 90 mm x 15 mm	Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd	16001-1
Salmonella phages	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	N/A
Shaker incubator	Shanghai Minquan Instrument Co., Ltd	MQD-S2R
Turbidimeter	Shanghai XingBai Biotechnology Co., Ltd	F-TC2015
Varms base type library system V1.0	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	In-house software copyright
Vertical high-pressure steam sterilizer	Shanghai Shen'an medical instrument factory	LDZX-75L
Veterinary pathogen resistance testing management system	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	In-house software copyright
Veterinary resistance cloud monitoring and phage control platform V1.0	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	In-house software copyright