Summary
Hier introduceren we het principe, de structuur en de instructie van het intelligente high-throughput antimicrobiële gevoeligheidstest-/faagscreeningsysteem. De toepassing ervan wordt geïllustreerd aan de hand van Salmonella geïsoleerd uit pluimvee in Shandong, China, als voorbeeld. De Lar-index wordt berekend en de betekenis ervan bij het evalueren van antimicrobiële resistentie wordt uitgebreid besproken.
Abstract
Om de efficiëntie van antimicrobiële gevoeligheidstesten (AST) en faagscreening op resistente bacteriën te verbeteren en de detectiekosten te verlagen, werd een intelligent AST/faagscreeningsysteem met hoge doorvoer, inclusief een 96-dot matrix-inoculator, beeldacquisitieconverter en bijbehorende software, ontwikkeld volgens de AST-criteria en de breekpunten van resistentie (R) geformuleerd door het Clinical & Laboratory Standards Institute (CLSI). AST en statistieken van minimale remmende concentratie (MIC)-verdelingen (van R/8 tot 8R) van 1.500 Salmonella-stammen geïsoleerd uit pluimvee in Shandong, China, tegen 10 antimicrobiële middelen werden uitgevoerd door het intelligente high-throughput AST/faagscreeningsysteem. De Lar-index, wat betekent "minder antibiose, minder resistentie en residu tot weinig antibiose", werd verkregen door het gewogen gemiddelde van elke MIC te berekenen en te delen door R. Deze benadering verbetert de nauwkeurigheid in vergelijking met het gebruik van de prevalentie van resistentie om de mate van antimicrobiële resistentie (AMR) van zeer resistente stammen te karakteriseren. Voor de stammen van Salmonella met een hoge AMR werden lytische fagen door dit systeem efficiënt gescreend uit de fagenbibliotheek en werd het lysisspectrum berekend en geanalyseerd. De resultaten toonden aan dat het intelligente AST/faagscreeningsysteem met hoge doorvoer bedienbaar, nauwkeurig, zeer efficiënt, goedkoop en gemakkelijk te onderhouden was. In combinatie met het veterinaire antimicrobiële resistentiemonitoringsysteem van Shandong was het systeem geschikt voor wetenschappelijk onderzoek en klinische detectie met betrekking tot AMR.
Introduction
Aangezien antimicrobiële middelen op grote schaal worden gebruikt om bacteriële infectieziekten te voorkomen, is antimicrobiële resistentie (AMR) een wereldwijd probleem voor de volksgezondheidgeworden1. De bestrijding van AMR is momenteel de belangrijkste taak van het monitoren van AMR van epidemiologische pathogenen en synergetische therapie van gevoelige antimicrobiële stoffen en lytische bacteriofagen2.
In vitro antimicrobiële gevoeligheidstesten (AST) zijn de steunpilaar voor het monitoren van de therapie en het detecteren van het niveau van AMR. Het is een belangrijk onderdeel van de antimicrobiële farmacologie en de cruciale basis voor klinische medicatie. Het Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) van de Verenigde Staten en het Europees Comité voor antimicrobiële gevoeligheidstests (EUCAST) hebben internationale criteria voor ASAT geformuleerd en herzien en de AST-methoden en de breekpunten om de MIC van een bepaalde combinatie van "organisme-antimicrobieel middel" te bepalen als gevoelig (S), resistent (R) of intermediair (I)3 voortdurend gewijzigd en aangevuld; 4. okt.
Van de jaren 1980 tot de jaren 1990 werden automatische instrumenten voor het verdunnen van microbouillon snel ontwikkeld en toegepast in de klinische praktijk, met voorbeelden als Alfred 60AST, VITEK System, PHOENIXTM en Cobasbact 5,6,7. Deze instrumenten waren echter duur, vereisten dure verbruiksartikelen en hun detectiebereik was ontworpen voor klinische medicatie voor patiënten 5,6,7. Om deze redenen zijn ze niet geschikt voor veterinair klinisch onderzoek en detectie van grote hoeveelheden zeer resistente stammen. In deze studie werd een intelligent AST/faag-screeningsysteem met hoge doorvoer, inclusief een matrixinoculator met 96 dots (Figuur 1), beeldacquisitieconverter (Afbeelding 2) en bijbehorende software8, ontwikkeld om ASAT uit te voeren voor een batch bacteriestammen tegen meerdere antimicrobiële middelen tegelijk door middel van de agarverdunningsmethode. Bovendien werd het systeem ook gebruikt om de lysispatronen van fagen tegen antimicrobieel resistente bacteriën te detecteren ente analyseren 9, en werden lytische fagen efficiënt geselecteerd uit de faagbibliotheek. Dit systeem bleek efficiënt, betaalbaar en eenvoudig te bedienen te zijn.
Figuur 1: Structureel diagram van de 96-dot matrix inoculator. 1: Inoculatie pin plaat; 2: Mobiele provider; 3: Zaadblok; 4: Geïncubeerde plaat; 5: Basis; 6: Bedieningshendel; 7: Limietpin. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Constructieschema van de beeldacquisitieconverter. 1: Schelp; 2: Het scherm van de vertoning; 3: Beeldacquisitie ruimte; 4: De basis van de opsporingsraad; 5: Opsporingsraad in en uit pakhuis; 6: Besturingskaart; 7: Het omzettingsapparaat van de beeldverwerving; 8: Lichtbron; 9: Beeldscanner. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De Salmonella-stammen die in deze studie werden gebruikt, werden verzameld bij pluimvee in Shandong, China, na goedkeuring van het Bioveiligheidscomité van het Institute of Animal Sciences and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences, China.
1. Toepassing van het intelligente AST-systeem met hoge doorvoer8
- Entmateriaal bereiding
- Incubeer het kwaliteitscontrole-organisme Escherichia coli en 93 Salmonellastammen die op ASAT moeten worden getest op Mueller-Hinton-agarplaten (MHA) gedurende 16-18 uur bij 37 °C3.
- Bereid het inoculum van elke stam voor zodat het overeenkomt met de 0,5 McFarland-troebelheidsnorm op basis van de methode gespecificeerd in de CLSI-norm3en verdun vervolgens 10 keer.
- Plaats 200 μL steriele normale zoutoplossing in het horizontale 1e putje (A1) van de plaat met 96 putjes als negatieve controle, twee suspensies van het kwaliteitscontroleorganisme in het horizontale 2e en 3eputje (A2 en A3) als respectievelijk de positieve controle, en kwaliteitscontrole. Voeg 200 μl van de verdunde inoculumsuspensies van elke geteste kleuring toe aan de overeenkomstige 93 putjes in het zaadblok met 96 putjes.
- Bereiding van antimicrobiële agarplaat
- Stel de concentratiebereiken van verschillende geteste antibacteriële middelen in volgens het berekeningsbereik van de Lar-index (van 0.125R tot 8R). De concentraties variëren van het kwaliteitscontrolebereik of 0,0625R (afhankelijk van het lagere bereik) tot 8R.
OPMERKING: Als de Lar-index niet wordt berekend, kan het bereik van de antibioticaconcentraties worden ingesteld op basis van de behoeften van AST. - Voer een log2-verdubbelingsverdunningsschema uit voor een antibiotische oplossing, te beginnen met een geschikte voorraadconcentratie op basis van de agarverdunningsmethode gespecificeerd in de CLSI-standaard3.
- Steriliseer glazen flessen van 50 ml met 18 ml Mueller-Hinton-agarmedia. Voeg 2 ml van de juiste verdunningen van de antimicrobiële oplossing toe aan 18 ml gesmolten media afgekoeld tot 45-50 °C, meng grondig en giet in de platen in de bioveiligheidskast.
- Laat de agar stollen bij kamertemperatuur (RT), laat een opening onder het deksel van geïncubeerde platen en blaas om het agaroppervlak te drogen voordat u het inoculeert.
- Label de soorten antimicrobiële middelen en concentraties op de achterkant van de geïncubeerde platen. Schik de meerdere geïncubeerde platen van elk antimicrobieel middel in een stapel in log2-verdubbelende verdunningsvolgorde.
- Bereid twee medicijnvrije agarplaten voor als controles voor elk antimicrobieel middel.
- Stel de concentratiebereiken van verschillende geteste antibacteriële middelen in volgens het berekeningsbereik van de Lar-index (van 0.125R tot 8R). De concentraties variëren van het kwaliteitscontrolebereik of 0,0625R (afhankelijk van het lagere bereik) tot 8R.
- Inoculatiestappen voor 96-dot matrix inoculator
- Installeer de geautoclaveerde inoculatiepenplaat op de steun van een 96-dot matrix-inoculator in de bioveiligheidskast.
- Plaats het voorbereide zaadblok met geteste stammen en een met agar geïncubeerde plaat op de mobiele drager, met dezelfde positioneringshoek voor de twee platen.
- Duw de mobiele drager zo dat het zaadblok zich direct onder de inoculatiepenplaat bevindt.
- Druk op de bedieningshendel, beweeg de inoculatiepenplaat naar beneden en richt de 96 pennen op de inocula in 96 putjes van het zaadblok.
- Laat de bedieningshendel met bediening los en reset vervolgens de inoculatiepenplaat onder invloed van de veer.
- Druk 2-3 keer op de bedieningshendel om elk entmateriaal goed te roeren en onder te dompelen. Duw en verplaats de draagplaat zodat de geïncubeerde plaat zich direct onder de inoculatiepenplaat bevindt.
- Druk op de bedieningshendel, beweeg de inoculatiepenplaat naar beneden en stop 1-2 s om de inoculatiepennen volledig in contact te laten komen met het oppervlak van de geïncubeerde plaat.
- Laat de bedieningshendel los. Hiermee is één inenting voltooid. Plaats een andere geïncubeerde plaat terug en ga door met de cyclus totdat een groep antimicrobiële agarplaten klaar is.
- Vervang een andere inoculatiepenplaat en een zaadblok en inoculeer een andere groep geteste stammen. Cyclus totdat alle inentingen zijn voltooid.
OPMERKING: Inoculeer eerst een controle-agarplaat (geen antimicrobieel middel), vervolgens de plaat in volgorde van geneesmiddelconcentratie van laag naar hoog, en een tweede controle-agarplaat als laatste om ervoor te zorgen dat er geen besmetting of overdracht van antimicrobiële middelen plaatsvindt. Het inoculatievolume is afhankelijk van het volume van de natuurlijke afzetting van elke pin van ongeveer 2 μL.
- Incubatie van de antimicrobiële agarplaten
- Incubeer de geïnoculeerde antimicrobiële agarplaten bij RT totdat het vocht in de inoculumplekken in de agar is opgenomen.
- Keer de platen om en incubeer ze gedurende 16-20 uur bij 37 °C voor de geteste stammen om ervoor te zorgen dat de ongeremde bacteriën kolonies vormen.
- Beeldacquisitie en datastatistieken
- Dubbelklik op het AST-beeldacquisitiesysteem met 96 dots om het programma te openen.
- Klik op Testinformatie in de taakbalk. Klik op Nieuw om een nieuwe testtaak aan te maken en vul de informatie in volgens de aanwijzingen, inclusief de code, naam, bron, bacteriën, aantal stammen, antibiotica en gradiënt.
- Klik op Gegevensverzameling > Foto > Testitem om de nieuwe taak te selecteren die is gemaakt. Klik op Antibiotica om de naam van het antibioticum te selecteren en klik op Gradiënt om de beginconcentratie van dit antibioticum te selecteren.
- Klik op Verbinden om verbinding te maken met de beeldacquisitieconverter.
- Plaats de bijbehorende geïncubeerde platen op de basis van de detectieplaat met de ontbrekende hoek rechtsvoor ter oriëntatie en duw ze in de beeldacquisitieconverter.
- Klik op Collectie om de afbeeldingen te verkrijgen. De antibioticagradiënt springt automatisch naar de volgende gradiënt. Plaats om de beurt het volgende bord en blijf klikken op Verzamelen totdat de platen voor dit antibioticum zijn verzameld.
- Klik op Antibiotica en selecteer de volgende set geïncubeerde platen. Klik op Verloop om het startverloop te selecteren en door te gaan naar de volgende ronde van het verzamelen van afbeeldingen.
- Klik na het voltooien van alle collecties op Verzenden. Het programma herkent automatisch het aantal witte pixels dat op elk inoculatiepunt in de afbeeldingen is geformatteerd, bepaalt of er kolonievorming is en zet de afbeeldingen om in MIC-waarden.
- Klik op Query om alle MIC-resultaten van de stammen tegen de geteste antibiotica te verkrijgen.
OPMERKING: Het intelligente AST-systeem met hoge doorvoer is geschikt voor het bepalen van MIC's van grote partijen bacteriestammen. Het testproces, inclusief voorbereiding, inenting, incubatie en het lezen van de resultaten, duurt 3 dagen. De soorten antibiotica en MIC-detectiebereiken kunnen worden ingesteld op basis van de respectieve behoeften, en de belangrijkste verbruiksartikelen kunnen worden hergebruikt.
- Berekening van de Lar-index
- Bepaal de Lar-index nauwkeurig met de formule: , waarbij:
MICi: minimale remmende concentratie.
Het bereik van MIC-distributies van MIC-3 tot MIC3 vertegenwoordigt seriële tweevoudige concentraties gecentreerd op R: 0.125R, 0.25R, 0.5R, R, 2R, 4R en 8R.
is 2 i, en het bereik vani is -3 tot 3.
R: de breekpunten van resistentie van bacteriën tegen antimicrobiële middelen gestandaardiseerd door CLSI.
f: de MIC-frequentieverdeling.
OPMERKING: De algemene Lar-index is het rekenkundig gemiddelde van alle Lar-indices. Nadat de Lar-index is berekend, rondt u de eindwaarde af op twee significante cijfers achter de komma.
- Bepaal de Lar-index nauwkeurig met de formule: , waarbij:
is 2 i, en het bereik vani is -3 tot 3.2. Intelligent faagscreeningsysteem met hoge doorvoer9
- Voorbereiding van het faagzaadblok en dubbellaagse geïncubeerde platen met bacteriën.
- Gebruik de dubbellaagse agarmethode10 of vloeibare cultuurmethode11 voor het maken van verschillende fagen. Verdun tot een geschikte parallelle concentratie met een titer van 1 x 104-5 pfu/ml en voeg 200 μL van het faaginoculum toe aan het zaadblok met 96 putjes.
- Maak dubbellaagse platen met bacteriën (10 ml onderste agarmedia [agar 12 g/L] en 6 ml bovenste semi-agarmedia [6 g/L] met 100 μL bacteriën [0,5 McFarland]) om te testen.
- Maak een dubbellaagse geïncubeerde plaat voor elke te testen stam. Laat een opening onder het deksel van de dubbellaagse plaat en blaas om het agaroppervlak in de bioveiligheidskast te drogen.
- Screeningtest
- Plaats het voorbereide faagzaadblok en de dubbellaagse plaat op de mobiele drager van de 96-dot matrix-inoculator en breng alle faaginocula over naar het semi-agar-oppervlak. Ga door met de cycli totdat alle geteste stammen zijn voltooid.
- Laat de geënte dubbellaagse platen op RT blijven totdat het vocht in de entplekken volledig is opgenomen in de semi-agar.
- Keer de platen om en incubeer gedurende 4-6 uur onder geschikte omstandigheden voor de geteste stammen om ervoor te zorgen dat er duidelijke lytische vlekken ontstaan.
- Gegevens analyseren
- Verkrijg en bewaar het beeld van het experimentele resultaat van elke dubbellaagse plaat met behulp van de beeldacquisitieconverter (stappen 1.5.4-1.5.6).
- Noteer het aantal en de morfologieën van de verschillende vormen van vlekken in een spreadsheet op basis van de verkregen afbeeldingen en bereken de respectieve verhoudingen van de verschillende soorten fagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In navolging van het protocol van het intelligente high-throughput AST-systeem, werd de toepassing ervan geïllustreerd door Salmonella van pluimvee in Shandong, China, als voorbeeld.
De groei van Salmonella-stammen op agarplaten met ampicilline (R van 32 μg/ml) in concentraties van 2 tot 256 μg/ml, bepaald door de beeldacquisitieconverter, wordt weergegeven in figuur 3. De horizontale 1e put A1 was de negatieve controle en vertoonde geen koloniegroei; A2 en A3 waren de kwaliteitscontrolestammen met MIC 4 μg/ml (die een kolonie vormden op de agarplaat met 2 μg/ml ampicilline, maar niet op die van 4 μg/ml), binnen het door CLSI gestandaardiseerde kwaliteitscontrolebereik (2-8 μg/ml). De MIC van de Salmonella-stam in A4 was 64 μg/ml, terwijl die van A5 16 μg/ml was. MIC-verdelingen van 93 Salmonella-stammen tegen ampicilline werden automatisch berekend door de software.
Figuur 3: Morfologie van Salmonella op een reeks kweekplaten met ampicilline. 8 horizontaal: A-H, 12 verticaal: 1-12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Het high-throughput AST-systeem werd toegepast om de AMR van Salmonella-stammen van dieren in de provincie Shandong te bepalen. De MIC-gegevens werden geüpload naar de database van Varms (http://www.varms.cn/)12. De statistische resultaten zijn weergegeven in tabel 1. In totaal werden 10 antimicrobiële middelen getest tegen 300-1.500 Salmonella-stammen , wat de voordelen van dit systeem met een hoge doorvoer aantoont.
Volgens de resistente breekpunten van de CLSI-standaard werd het resistentiepercentage (R%) berekend als een percentage van stammen met MIC ≥ R onder de geteste stammen (tabel 1). De R%-waarden van ampicilline, ciprofloxacine en amoxicilline-clavulaanzuur waren hoger dan 50%, de R%-waarden van doxycycline, florfenicol, cefotaxime en enrofloxacine waren 30%-50% en de R%-waarden van gentamicine, amikacine en meropenem waren minder dan 30%. Meropenem werd niet gebruikt bij industrieel gefokte dieren en vertoonde een R% van 7%.
De R% gaf het aandeel van de bacteriestammen met MIC's hoger dan R aan, terwijl MIC-verdelingen het aantal stammen met elke MIC lieten zien om de algehele AMR van Salmonella nauwkeuriger te beschrijven. De R% van ampicilline was bijvoorbeeld 73% en het maximale aantal monsters (916 stammen) was geconcentreerd met MIC ≥ 256 μg/ml, wat aangeeft dat de resistentie van Salmonella tegen ampicilline vrij ernstig was.
Tabel 1: MIC-verdelingen, R% en Lar-indexwaarden van Salmonella van dieren in de provincie Shandong. MIC's die overeenkomen met vetgedrukt lettertype zijn de R-waarden van antimicrobiële middelen. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Voor uniformiteit en vergelijkbaarheid werden 3 gradiënten naar voren en naar achteren verlengd, gecentreerd op de R van elk medicijn. Volgens de MIC-verdelingen van zeven gradiënten werd de Lar-index berekend met de formule:
.
Voor ampicilline was de R-waarde bijvoorbeeld 32 μg/ml, het aantal monsters was 1,414, en Lar = (4/32) x (245/1414) + (8/32) × (16/1414) + (16/32) × (117/1414) + (32/32) × (27/1414) + (64/32) × (36/1414) + (128/32) × (57/1414) + (256) /32) × (916/1414) = 2-3 × (245/1414) + 2-2 × (16/1414) + 2-1 × (117/1414) + 20 × (27/1414) + 21 × (36/1414) + 2 2 × (57/1414) + 2 3 × (916/1414) = 5,48. Met behulp van deze formule werden Lar-indices van andere antimicrobiële middelen berekend en deze worden weergegeven in tabel 1.
Het belang van de Lar-index was om de ernst van AMR nauwkeurig aan te geven. Als we ciprofloxacine en amoxicilline-clavulaanzuur als voorbeeld nemen, waren hun R%-waarden vergelijkbaar, respectievelijk 68% en 65%, maar hun Lar-indices verschilden aanzienlijk, respectievelijk 4,57 en 1,76. De reden hiervoor werd duidelijk geïllustreerd door de verdeling van de hoge MIC-waarden in tabel 1, waarin 71,3% van de ciprofloxacine-resistente stammen werd verdeeld in 8R (32 μg/ml), terwijl de MIC's van amoxicilline-clavulaanzuurresistente stammen meestal geconcentreerd waren op R en 2R, en het aandeel 8R laag was (8,69%). Daarom was de Lar-index van ciprofloxacine hoger dan die van amoxicilline-clavulaanzuur, wat aangeeft dat het aandeel van sterk ciprofloxacine-resistente stammen hoger was dan dat van amoxicilline-clavulaanzuurresistente stammen. De Lar-index was een nauwkeurigere indicator van de mate van AMR dan de weerstandsgraad.
Volgens de formule van de Lar-index, als de MIC's van alle stammen met betrekking tot een bepaald medicijn R waren, zou de Lar-index 1 zijn; als de MIC's van alle stammen 2R waren, zou de Lar-index 2 zijn. Daarom vertoonde de Lar-index meerdere relaties tussen de uitgebreide MIC's en de bijbehorende R-waarde, met uitzondering van de randconcentraties. De Lar-index werd gebruikt om de mate van AMR te beoordelen, en het voordeel was meer uitgesproken als AMR hoger was. Voor uniformiteit en vergelijkbaarheid was het berekeningsbereik van de Lar-index zeven MIC's met de voorste en achterste 3 gradiënten gecentreerd rond de R-waarde, en het gewogen gemiddelde werd verkregen door de verschillende antimicrobiële middelen, het aantal stammen en MIC-verdelingen te integreren. Daarom was het waardebereik van de Lar-index 0,125-8. Hoe dichter de Lar bij 0,125 was, hoe lager de AMR, en hoe dichter hij bij 8 was, hoe hoger de AMR. Er was echter geen evenredige relatie tussen Lar en R bij de randconcentratie. Toen de antimicrobiële middelen en het berekeningsbereik van de Lar-index definitief waren, werd de algemene Lar genormaliseerd naar een intuïtieve uitgebreide waarde die werd gebruikt om de mate en veranderingstrend van AMR onder de verschillende omstandigheden van verschillende bacteriën, gebruikers, jaren, regio's, enz. direct te vergelijken en te evalueren.
Volgens het protocol van het intelligente faagscreeningsysteem werd de toepassing gedemonstreerd door 96 fagen van Salmonella te nemen om AMR Salmonella-stammen als voorbeeld te lyseren, en het lytische patroon van de faag werd geanalyseerd.
Zesennegentig fagen werden overgebracht naar dubbellaagse platen met Salmonella door een 96-dot matrix inoculator. De morfologie van de gevormde vlekken is weergegeven in figuur 4. Er waren vier hoofdtypen (hoewel niet beperkt tot vier): duidelijke ronde vlek (●), verzameling plaques (), troebele lytische vlek () en geen lytische vlek (
○).
Figuur 4: Morfologie van Salmonellavlekken op dubbellaagse agarplaten. 1 en 2: de patronen geproduceerd door 96 fagen op verschillende Salmonella-stammen. "●" ronde heldere vlek, "" verzameling plaques, "" troebele lytische vlek, "○" geen lytische vlek) Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Op de dubbellaagse platen waren de lytische vlekken van verschillende fagen op verschillende gastheerbacteriën divers in morfologie10. De "ronde heldere lytische vlek" was het resultaat van een faag die de gastheer op de plaat betrouwbaar kon doden, maar die al dan niet met succes repliceerde ten koste van die gastheer. In dit geval was verdere verdunning nodig om het type definitief te bepalen. De "verzameling plaquettes" werd gevormd door echte plaquettes. Elke individuele lysiszone werd duidelijk geproduceerd vanuit een enkel infectieus centrum, wat aantoonde dat de faag zich had gerepliceerd ten koste van de bacteriën op de plaat. De "troebele lytische vlek" was het gevolg van een faag die de gastheer op de plaat niet betrouwbaar doodde en die al dan niet met succes repliceerde ten koste van die gastheer. In dit geval was er meer dan één mogelijkheid, waardoor bevestiging nodig was op basis van verdere onderzoeksinteresses. De "geen lytische plek" duidde op een niet-lytische aard.
Bovendien zou het gebruik van dit systeem voor voorlopige tests in wezen kunnen bepalen of de stammen en bacteriofagen werden gedupliceerd. Als verschillende Salmonella-soorten werden geselecteerd en de patronen van twee bacteriofagen identiek waren, gaf dit aan dat de bacteriofagen mogelijk werden gedupliceerd. Als niet-repetitieve bacteriofagen werden geselecteerd om onbekende Salmonella-soorten uit klinische bronnen te infecteren en het faagpatroon hetzelfde was, gaf dit aan dat Salmonella-stammen dezelfde stam zouden kunnen zijn. Bovendien hadden het aantal en het aandeel duplicaten referentiewaarden voor epidemiologisch onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De agarverdunningsmethode is goed ingeburgerd en wordt op grote schaal gebruikt. Het principe van het AST-systeem met hoge doorvoer was dat van de agarverdunningsmethode. Een van de cruciale stappen binnen het protocol was de nauwkeurige overdracht met hoge doorvoer van 96 inocula tegelijk, die meerdere keren achter elkaar werd uitgevoerd. Om deze kritieke stap te voltooien, waren de pinnen van de 96-dot matrix-inoculator uniform en zeer glad. De natuurlijke afzetting van elke pin was een volume van ongeveer 2 μL, dat zich samenklonterde tot kleine druppeltjes op het oppervlak van het agarmedium om snel in de agar te worden opgenomen, niet stromend of spetterend om kruisbesmetting te veroorzaken. De tweede cruciale stap was de statistische verwerking van grote AST-gegevens. Bij high-throughput inoculatie moesten testgegevens worden bepaald en was de werklast enorm. De intelligente analyse en statistische resultaten van de intelligente beeldacquisitieconverter en ondersteunende software waren een perfecte oplossing voor dit probleem. De AST-resultaten werden automatisch rechtstreeks geüpload naar de Varms-database. De efficiëntie en nauwkeurigheid van de interpretatie van de resultaten werden verbeterd en de fouten veroorzaakt door menselijke factoren werden verminderd13.
De derde cruciale stap was het voorstellen van de Lar-index van AMR. Op dit moment zijn er in de wereld maar weinig uitgebreide evaluatie-indices van AMR. Volgens de literatuur werd door Laxminarayan en Klugman een geneesmiddelresistentie-index (DRI) beschreven om veranderingen in de effectiviteit van antibiotica te meten14,15. Het combineerde de prevalentie van resistentie en relatieve voorschrijffrequenties, maar kon de mate van AMR niet karakteriseren en de veranderingen in hoge resistentieniveaus tegen geneesmiddelen niet evalueren. De drug effectiveness index (DEI)16, een andere index die is afgeleid van de DRI, heeft hetzelfde nadeel als de DRI. Daarom werd de Lar-index voorgesteld, die uit drie stappen bestond: (1) De MIC's van bacteriestammen werden genormaliseerd op basis van de respectieve R-waarde, waardoor de verschillen in antimicrobiële middelen veroorzaakt door verschillende R-waarden van de AST-standaard werden geëlimineerd; (2) Volgens de MIC-verdelingen werden de gewogen gemiddelde waarden berekend om de mate van AMR nauwkeuriger weer te geven dan de weerstandsgraad; (3) Het rekenkundig gemiddelde van Lar-indices van meerdere antimicrobiële middelen, d.w.z. de algemene Lar, zou de alomvattende situatie van AMR kunnen weerspiegelen en de beoordeling en vergelijking van AMR op verschillende niveaus vergemakkelijken.
Het hardwareontwerp van deze apparaten was redelijk en eenvoudig te bedienen, en alle onderdelen liepen soepel. Er was geen storingsprobleem of fout. Het ontwerp van de ondersteunende software voldeed aan de gepersonaliseerde eisen van AST- en faagscreening en was eenvoudig te bedienen en te gebruiken. Eén instrument was uitgerust met 4-5 dozen met inoculatiepennen voor meerdere toepasbare scenario's van batch-bacterieoverdracht. De kerncomponenten van dit instrument waren de inoculatiepenplaat en pennen van roestvrij staal, die konden worden aangepast aan verschillende omgevingen en konden worden geautoclaveerd, gedemonteerd en vervangen. De inoculatiepennen zijn ontworpen om op welke manier dan ook te worden gecombineerd.
Het was absoluut noodzakelijk om een AMR-monitoringsysteem op te zetten vanwege de prevalentie van resistente ziekteverwekkers als gevolg van misbruik van antibiotica. Sinds 2008 heeft het volksgezondheidsteam van het Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences, achtereenvolgens AMR-monitoring van dieren uitgevoerd in de provincie Shandong1 2,13,17. Het was noodzakelijk om MIC's van pathogenen efficiënt te detecteren om het gebruik van antimicrobiële middelen te reguleren vanwege de hoge mate van veterinaire resistentie en het grote monitoringvolume. De relevante instrumenten voor AST zijn echter duur en de kosten van de exploitatie en verbruiksartikelen zijn hoog en niet geschikt voor een breed scala aan grootschalige landbouwbedrijven. Om deze reden waren de ontwikkeling van het intelligente AST-systeem met hoge doorvoer en de standaardisatie van de toepassing ervan bevorderlijk voor het bevorderen van de oprichting van een degelijk systeem voor AMR-bewakingstechnologie. Volgens eerder onderzoek12,13 bereikte het intelligente AST-systeem met hoge doorvoer een goede herhaalbaarheid en stabiliteit om te voldoen aan de CLSI-standaard en werd het toegepast op AST en analyse van klinisch pathogene bacteriën bij dieren. Tot op heden zijn uitgebreide AMR-gegevens verzameld voor meer dan 20.000 epidemische stammen12. Voor de resistente bacteriën die in het monitoringproces worden aangetroffen, kan dit systeem ook worden gebruikt voor snelle high-throughput screening van lytische fagen om samen te werken met antimicrobiële middelen om AMR te verminderen. De toepassing van de 96-dot matrix inoculator en de beeldacquisitieconverter voor faaglysisscreening was een uitgebreide functie, en er waren nog geen andere instrumenten op dit gebied toegepast.
Het intelligente AST/faagscreeningsysteem met hoge doorvoer combineerde AST met lytische bacteriofagen om AMR-bewaking, -controle en -reductie te bereiken. Tegelijkertijd werd de Lar-index intuïtiever en beknopter gebruikt om de bijdragen van verschillende factoren en nieuwe antibacteriële technologieën aan de vermindering van AMR te evalueren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yuqing Liu et al. hebben Chinese patenten aangevraagd voor de 96-dot matrix inoculator en image acquisition converter en hun toepassingen (patentnummer ZL 201610942866.3 en patentnummer ZL 201910968255.X).
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het National Key Research and Development Project (2019YFA0904003); Modern agrarisch industrieel systeem in de provincie Shandong (SDAIT-011-09); Optimalisatieproject voor het platform voor internationale samenwerking (CXGC2023G15); Belangrijke innovatietaken van landbouwwetenschaps- en technologie-innovatieproject van de Academie voor Landbouwwetenschappen Shandong, China (CXGC2023G03).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well culture plate | Beijing lanjieke Technology Co., Ltd | 11510 | |
| 96-dot matrix AST image acquisition system | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| 96-dot matrix inoculator | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Agar | Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd | HB8274-1 | |
| Amikacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A857053 | |
| Amoxicillin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A822839 | |
| Ampicillin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A830931 | |
| Analytical balance | Sartorius | BSA224S | |
| Automated calculation software for Lar index of AMR | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Bacteria Salmonella strains | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Animal origin |
| Bacterial resistance Lar index certification management system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Ceftiofur | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C873619 | |
| Ciprofloxacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C824343 | |
| Clavulanic acid | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C824181 | |
| Clean worktable | Suzhou purification equipment Co., Ltd | SW-CJ-2D | |
| Colistin sulfate | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C805491 | |
| Culture plate | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Doxycycline | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | D832390 | |
| Enrofloxacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | E809130 | |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SLGP033RB | |
| Florfenicol | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | F809685 | |
| Gentamicin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | G810322 | |
| Glass bottle 50 mL | Xuzhou Qianxing Glass Technology Co., Ltd | QX-7 | |
| High-throughput resistance detection system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Image acquisition converter | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Meropenem | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | M861173 | |
| Mueller-Hinton agar | Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd | HB6232 | |
| Petri dish 60 mm x 15 mm | Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd | 16021-1 | |
| Petri dish 90 mm x 15 mm | Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd | 16001-1 | |
| Salmonella phages | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | |
| Shaker incubator | Shanghai Minquan Instrument Co., Ltd | MQD-S2R | |
| Turbidimeter | Shanghai XingBai Biotechnology Co., Ltd | F-TC2015 | |
| Varms base type library system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Vertical high-pressure steam sterilizer | Shanghai Shen'an medical instrument factory | LDZX-75L | |
| Veterinary pathogen resistance testing management system | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Veterinary resistance cloud monitoring and phage control platform V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright |
References
- Ramanan, L., et al. Antimicrobial resistance-the need for global solutions. The Lancet Infectious Diseases. 13 (12), 1057-1098 (2013).
- Xiaonan, Z., Qing, Z., Thomas, S. P., Yuqing, L., Martha, R. J. C. inPhocus: Perspectives of the application of bacteriophages in poultry and aquaculture industries based on Varms in China. PHAGE: Therapy, Applications, and Research. 2 (2), 69-74 (2021).
- CLSI. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. CLSI document M100. , M100 32nd edition, Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA . (2022).
- Yuqing, L., et al. Antimicrobial Sensitivity Testing Standard of EUCAST. , China Standards Press, Beijing. (2017).
- Barnini, S., et al. A new rapid method for direct antimicrobial susceptibility testing of bacteria from positive blood cultures. BMC Microbiology. 16 (1), 185-192 (2016).
- Höring, S., Massarani, A. S., Löffler, B., Rödel, J. Rapid antimicrobial susceptibility testing in blood culture diagnostics performed by direct inoculation using the VITEK®-2 and BD PhoenixTM platforms. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (3), 471-478 (2019).
- Dupuis, G. Evaluation of the Cobasbact automated antimicrobial susceptibility testing system. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 4 (2), 119-122 (1985).
- A system of bacterial antimicrobial resistance detection and its operation method. China Patent. Liu, Y., et al. , ZL 201610942866.3 (2019).
- A high throughput test plate for screening bacteriophage of zoonotic pathogens and its application. China Patent. Liu, Y. , ZL 201910968255.X (2022).
- Adams, M. H. Bacteriophages. , Interscience Publishers, New York. (1959).
- Nair, A., Ghugare, G. S., Khairnar, K. An appraisal of bacteriophage isolation techniques from environment. Microbial Ecology. 83 (3), 519-535 (2022).
- Shandong veterinary antibiotic resistance system. , http://www.varms.cn (2023).
- Ming, H., et al. Comparison of the results of 96-dot agar dilution method and broth microdilution method. Chinese Journal of Antibiotics. 43 (6), 729-733 (2018).
- Laxminarayan, R., Klugman, K. P. Communicating trends in resistance using a drug resistance index. BMJ Open. 1 (2), e000135 (2011).
- Chen, Y., et al. Assessing antibiotic therapy effectiveness against the major bacterial pathogens in a hospital using an integrated index. Future Microbiology. 12, 853-866 (2017).
- Ciccolini, M., Spoorenberg, V., Geerlings, S. E., Prins, J. M., Grundmann, H. Using an index-based approach to assess the population-level appropriateness of empirical antibiotic therapy. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (1), 286-293 (2015).
- Yanbo, L., et al. Preliminary application of inoculation system for high-throughput drug susceptibility test. China Poultry. 42 (6), 52-57 (2020).
