Summary
Здесь мы познакомим вас с принципом, структурой и инструкцией интеллектуальной высокопроизводительной системы тестирования чувствительности к противомикробным препаратам/скрининга фагов. Его применение проиллюстрировано на примере сальмонеллы , выделенной от домашней птицы в провинции Шаньдун, Китай. Рассчитан индекс Лара и всесторонне рассмотрено его значение в оценке антимикробной резистентности.
Abstract
Для повышения эффективности тестирования на чувствительность к противомикробным препаратам (AST) и высокопроизводительного скрининга фагов на резистентные бактерии, а также для снижения затрат на обнаружение, была разработана интеллектуальная высокопроизводительная система AST/фагового скрининга, включающая 96-точечный матричный инокулятор, преобразователь получения изображений и соответствующее программное обеспечение, в соответствии с критериями AST и точками разрыва резистентности (R), сформулированными Институтом клинических и лабораторных стандартов (CLSI). АСТ и статистические данные о распределении минимальной ингибирующей концентрации (МПК) (от R/8 до 8R) 1500 штаммов сальмонеллы , выделенных от домашней птицы в Шаньдуне, Китай, по сравнению с 10 антимикробными агентами были проведены с помощью интеллектуальной высокопроизводительной системы скрининга АСТ/фагов. Индекс Лара, означающий «меньше антибиотика, меньше резистентности и остаточный до тех пор, пока антибиотика мало», был получен путем вычисления средневзвешенного значения каждого МПК и деления на R. Такой подход повышает точность по сравнению с использованием показателя распространенности резистентности для характеристики степени устойчивости к противомикробным препаратам (УПП) штаммов с высокой устойчивостью. Для штаммов сальмонелл с высоким УПП литические фаги были эффективно отобраны из библиотеки фагов с помощью этой системы, а также рассчитан и проанализирован спектр лизиса. Результаты показали, что интеллектуальная высокопроизводительная система скрининга АСТ/фагов является работоспособной, точной, высокоэффективной, недорогой и простой в обслуживании. В сочетании с Шаньдунской ветеринарной системой мониторинга устойчивости к противомикробным препаратам эта система была пригодна для научных исследований и клинического выявления УПП.
Introduction
Поскольку противомикробные препараты широко используются для профилактики бактериальных инфекционных заболеваний, устойчивость к противомикробным препаратам (УПП) стала глобальной проблемой общественногоздравоохранения1. Борьба с УПП в настоящее время является основной миссией мониторинга УПП эпидемиологических патогенов и синергической терапии чувствительных антимикробных препаратов и литических бактериофагов2.
Тестирование чувствительности к противомикробным препаратам in vitro (АСТ) является основой для мониторинга терапии и определения уровня УПП. Это важная часть фармакологии противомикробных препаратов и важнейшая основа для клинических препаратов. Институт клинических и лабораторных стандартов (CLSI) Соединенных Штатов Америки и Европейский комитет по тестированию на чувствительность к противомикробным препаратам (EUCAST) сформулировали и пересмотрели международные критерии АСТ, а также постоянно модифицировали и дополняли методы АСТ и контрольные точки для определения МПК одной определенной комбинации «организм-антимикробный агент» как чувствительного (S), резистентного (R) или промежуточного (I)3. 4. См.
В период с 1980-х по 1990-е годы были быстро разработаны и применены в клинической практике автоматические приборы для разведения микробульона, в том числе Alfred 60AST, VITEK System, PHOENIXTM и Cobasbact 5,6,7. Однако эти приборы были дорогими, требовали дорогостоящих расходных материалов, а их диапазоны обнаружения были рассчитаны на клиническое лечение пациентов 5,6,7. По этим причинам они не подходят для ветеринарного клинического обследования и выявления больших количеств высокорезистентных штаммов. В данном исследовании была разработана интеллектуальная высокопроизводительная система скрининга АСТ/фагов, включающая 96-точечный матричный инокулятор (рис. 1), преобразователь получения изображений (рис. 2) и соответствующее программное обеспечение8, для проведения АСТ для партии штаммов бактерий против нескольких антимикробных агентов одновременно методом агарового разведения. Кроме того, система также использовалась для обнаружения и анализа паттернов лизиса фагов против устойчивых к противомикробным препаратам бактерий9, а литические фаги были эффективно отобраны из библиотеки фагов. Эта система оказалась эффективной, доступной и простой в эксплуатации.
Рисунок 1: Структурная схема 96-точечного матричного инокулятора. 1: Штифтовая пластина для прививки; 2: Оператор мобильной связи; 3: Исходный блок; 4: Инкубационная пластина; 5: База; 6: Рукоятка управления; 7: Ограничительный штифт. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Структурная схема конвертера для получения изображений. 1: Оболочка; 2: Экран дисплея; 3: Помещение для получения изображений; 4: Основание платы детектирования; 5: Доска обнаружения на складе и за его пределами; 6: Пульт управления; 7: Устройство преобразования изображения; 8: Источник света; 9: Сканер изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Штаммы сальмонеллы, использованные в этом исследовании, были получены от домашней птицы в провинции Шаньдун, Китай, после получения одобрения от Комитета по биобезопасности Института животноводства и ветеринарной медицины Шаньдунской академии сельскохозяйственных наук, Китай.
1. Применение интеллектуальной высокопроизводительной системы АСТ8
- Подготовка посевного материала
- Инкубируют микроорганизм контроля качества Escherichia coli и 93 штамма сальмонеллы для тестирования на АСТ на планшетах из агара Мюллера-Хинтона (MHA) в течение 16-18 ч при 37 °C3.
- Приготовьте посевной материал каждого штамма в соответствии со стандартом мутности 0,5 по Мак-Фарланду на основе метода, указанного в стандарте CLSI3, а затем разбавьте в 10 раз.
- Поместите 200 мкл стерильного физиологического раствора в горизонтальную 1-ю лунку (А1) 96-луночной планшета в качестве отрицательного контроля, две суспензии микроорганизма контроля качества в горизонтальные 2-ю и3-ю лунки (А2 и А3) в качестве положительного контроля и контроля качества, соответственно. Добавьте 200 мкл разбавленной суспензии посевного материала каждого испытуемого пятна в соответствующие 93 лунки в 96-луночном семенном блоке.
- Приготовление антимикробной агаровой пластины
- Установите диапазоны концентраций различных антибактериальных средств, тестируемых в соответствии с диапазоном расчета индекса Лара (от 0,125R до 8R). Концентрация колеблется от диапазона контроля качества или 0,0625R (в зависимости от нижнего диапазона) до 8R.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если индекс Лара не рассчитан, диапазон концентраций антибиотиков может быть установлен в соответствии с потребностями АСТ. - Выполняйте схему удвоения log2 для раствора антибиотика, начиная с подходящей концентрации запаса на основе метода разбавления агара, указанного в стандартеCLSI 3.
- Стерилизовать стеклянные флаконы объемом 50 мл, содержащие 18 мл агаровой среды Мюллера-Хинтона. Добавьте 2 мл соответствующих разведений противомикробного раствора к 18 мл расплавленной среды, охлажденной до 45-50 °C, тщательно перемешайте и разлейте по тарелкам в шкафу биобезопасности.
- Дайте агару застыть при комнатной температуре (RT), оставьте зазор под крышкой инкубированных планшетов и продуйте, чтобы высушить поверхность агара перед инокуляцией.
- Маркируйте типы противомикробных агентов и их концентрации на обратной стороне инкубированных планшетов. Расположите несколько инкубационных планшетов каждого противомикробного препарата в стопку в порядке удвоения log2.
- Подготовьте две безлекарственные агаровые пластины в качестве контрольных для каждого противомикробного средства.
- Установите диапазоны концентраций различных антибактериальных средств, тестируемых в соответствии с диапазоном расчета индекса Лара (от 0,125R до 8R). Концентрация колеблется от диапазона контроля качества или 0,0625R (в зависимости от нижнего диапазона) до 8R.
- Этапы инокуляции для 96-точечного матричного инокулятора
- Установите булавочную пластину для автоклавного инокуляции на опору 96-точечного матричного инокулятора в шкафу биобезопасности.
- Подготовленный семенной блок с испытуемыми штаммами и агаровую инкубационную пластину помещают на подвижный носитель с одинаковым углом позиционирования для двух планшетов.
- Сдвиньте передвижной держатель так, чтобы семенной блок находился прямо под пластиной инокуляционного штифта.
- Нажмите на рукоятку управления, переместите пластину инокуляционного штифта вниз и направьте штифты 96 на инокуляцию в 96 лунок семенного блока.
- Отпустите рукоятку управления с управлением, затем сбросьте пластину штифта прививки под действием пружины.
- Нажмите на ручку управления 2-3 раза, чтобы хорошо перемешать каждый посевной материал и окунуть. Надавите и переместите несущую пластину так, чтобы инкубационная пластина находилась прямо под пластиной для прививки.
- Нажмите на рукоятку управления, переместите пластину инокуляционного штифта вниз и остановитесь на 1-2 с, чтобы инокуляционные штифты полностью соприкоснулись с поверхностью инкубируемой планшета.
- Отпустите рукоятку управления. На этом одна прививка завершена. Замените другую инкубационную чашку и продолжайте цикл до тех пор, пока не закончится одна группа антимикробных агаровых планшетов.
- Замените другую инокуляционную контактную пластину и семенной блок и инокуляцию другой группы тестируемых штаммов. Цикл до тех пор, пока все прививки не будут завершены.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сначала засейте контрольную агаровую пластину (без антимикробного агента), затем планшет в порядке концентрации препарата от низкой до высокой и вторую контрольную агаровую пластину последней, чтобы убедиться в отсутствии загрязнения или переноса антимикробного агента. Объем инокуляции зависит от объема естественного осаждения каждого штифта, составляющего примерно 2 мкл.
- Инкубация антимикробных агаровых планшетов
- Инкубируют модифицированные антимикробные агаровые пластины при РТ до тех пор, пока влага в пятнах посева не впитается в агар.
- Переверните планшеты и инкубируйте их в течение 16-20 ч при 37 °C для испытуемых штаммов, чтобы убедиться, что неингибированные бактерии образуют колонии.
- Получение изображений и статистика данных
- Дважды щелкните по 96-точечной матричной системе получения изображений AST , чтобы открыть программу.
- Нажмите « Тестовая информация » на панели задач. Нажмите « Создать », чтобы создать новое тестовое задание, и заполните информацию в соответствии с подсказками, включая код, название, источник, бактерии, количество штаммов, антибиотиков и градиент.
- Нажмите на пункт Data Collection > Photograph > Test , чтобы выбрать новую созданную задачу. Нажмите « Антибиотики », чтобы выбрать название антибиотика, и нажмите « Градиент », чтобы выбрать начальную концентрацию этого антибиотика.
- Нажмите « Подключиться», чтобы подключиться к конвертеру для получения изображений.
- Поместите соответствующие инкубированные планшеты на основание планшета обнаружения так, чтобы недостающий угол был справа спереди для ориентации, и вставьте их в конвертер для получения изображений.
- Нажмите на Коллекцию , чтобы получить изображения. Градиент антибиотика автоматически перейдет к следующему градиенту. Поместите следующую тарелку по очереди и продолжайте нажимать на «Сбор » до тех пор, пока не будут собраны пластины для этого антибиотика.
- Нажмите « Антибиотики» и выберите следующий набор инкубационных планшетов. Нажмите на Градиент, чтобы выбрать начальный градиент и перейти к следующему раунду сбора изображений.
- После завершения всех коллекций нажмите « Отправить». Программа автоматически распознает количество белых пикселей, отформатированных в каждой точке посева на изображениях, определит, есть ли образование колоний, и преобразует изображения в значения MIC.
- Нажмите « Запрос», чтобы получить все результаты МПК штаммов против тестируемых антибиотиков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Интеллектуальная высокопроизводительная система AST подходит для определения MICs больших партий бактериальных штаммов. Процесс тестирования, включая подготовку, посев, инкубацию и считывание результатов, занимает 3 дня. Типы антибиотиков и диапазоны обнаружения МПК могут быть установлены в соответствии с соответствующими потребностями, а основные расходные материалы могут быть использованы повторно.
- Расчет индекса Лара
- Точно определите индекс Лара по формуле: , где:
MICi: минимальная ингибирующая концентрация.
Диапазон распределений МПК от MIC-3 до MIC3 представляет собой последовательные двойные концентрации, центрированные на R: 0,125R, 0,25R, 0,5R, R, 2R, 4R и 8R.
равен 2i, а диапазон i равен -3 до 3.
R: точки разрыва резистентности бактерий к антимикробным препаратам, стандартизированные CLSI.
f: частотное распределение микрофона.
ПРИМЕЧАНИЕ: Общий индекс Лара представляет собой среднее арифметическое всех индексов Лара. После вычисления индекса Lar округлите итоговое значение до двух значащих цифр после запятой.
- Точно определите индекс Лара по формуле: , где:
равен 2i, а диапазон i равен -3 до 3.2. Интеллектуальная высокопроизводительная система фагового скрининга9
- Подготовка фагового затравочного блока и двухслойных инкубационных планшетов, содержащих бактерии.
- Для получения различных фагов используют метод10 двухслойного агара или метод11 жидкого культивирования. Разбавляют до подходящей параллельной концентрации с титром 1 x 104-5 КОЕ/мл и добавляют 200 мкл фагового посевного материала в 96-луночный посевной блок.
- Изготовьте двухслойные пластины с бактериями (10 мл нижней агаровой среды [агар 12 г/л] и 6 мл верхней полуагарной среды [6 г/л] со 100 мкл бактерий [0,5 Макфарланда]) для испытания.
- Сделайте двухслойную инкубационную пластину для каждого тестируемого штамма. Оставьте зазор под крышкой двухслойной пластины и выдуйте для просушки поверхность агара в шкафу биобезопасности.
- Скрининговый тест
- Подготовленный фаговый затравочный блок и двухслойную пластину поместить на мобильный носитель 96-точечного матричного инокулятора и перенести весь фаговый посевной материал на поверхность полуагара. Продолжайте циклы до тех пор, пока не будут завершены все тестируемые штаммы.
- Оставьте модифицированные двухслойные пластины на RT до тех пор, пока влага в пятнах посева полностью не впитается в полуагар.
- Переверните планшеты и инкубируйте в условиях, подходящих для испытуемых штаммов, в течение 4-6 ч, чтобы обеспечить образование четких литических пятен.
- Анализ данных
- Получение и сохранение изображения экспериментального результата каждой двухслойной пластины с помощью преобразователя получения изображений (шаги 1.5.4-1.5.6).
- Запишите количество и морфологию пятен различной формы в электронную таблицу на основе полученных изображений и рассчитайте соответствующие пропорции различных видов фагов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Следуя протоколу интеллектуальной высокопроизводительной системы АСТ, ее применение было проиллюстрировано на примере сальмонеллы домашней птицы в провинции Шаньдун, Китай.
Рост штаммов сальмонелл на агаровых пластинах с ампициллином (R 32 мкг/мл) в концентрациях от 2 до 256 мкг/мл, определяемых конвертером для получения изображений, показан на рисунке 3. Горизонтальная1-я скважина А1 была отрицательным контролем и не показала роста колоний; Штаммы А2 и А3 были контролем качества с МПК 4 мкг/мл (образуя колонию на агаровой пластине с ампициллином 2 мкг/мл, но не на 4 мкг/мл), в пределах диапазона контроля качества, стандартизированного CLSI (2-8 мкг/мл). МПК штамма сальмонеллы в А4 составил 64 мкг/мл, а А5 – 16 мкг/мл. Распределение МПК 93 штаммов сальмонеллы против ампициллина было рассчитано автоматически с помощью программного обеспечения.
Рисунок 3: Морфология сальмонелл на серии культуральных планшетов с ампициллином. 8 горизонтальных: A-H, 12 вертикальных: 1-12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Высокопроизводительная система АСТ была применена для определения УПП штаммов сальмонеллы от животных в провинции Шаньдун. Данные ВПК были загружены в базу данных Varms (http://www.varms.cn/)12. Статистические результаты приведены в таблице 1. В общей сложности 10 противомикробных агентов были протестированы против 300-1500 штаммов сальмонеллы , что показало преимущества этой системы в высокой пропускной способности.
По резистентным точкам разрыва стандарта CLSI коэффициент резистентности (R%) рассчитывали в процентах штаммов с МПК ≥ R среди испытуемых штаммов (табл. 1). Значения R% ампициллина, ципрофлоксацина и амоксициллина-клавулановой кислоты были выше 50%, значения R% доксициклина, флорфениколя, цефотаксима и энрофлоксацина составляли 30%-50%, а значения R% гентамицина, амикацина и меропенема составляли менее 30%. Меропенем не применялся у животных, выращенных в промышленных условиях, и показал R% 7%.
R% указывал на долю бактериальных штаммов с MICs выше, чем R, в то время как распределения MIC показывали количество штаммов с каждым MIC, чтобы более точно описать общий AMR сальмонеллы . Например, R% ампициллина составил 73%, а максимальное количество образцов (916 штаммов) было сосредоточено с МПК ≥ 256 мкг/мл, что свидетельствует о том, что резистентность сальмонеллы к ампициллину была достаточно серьезной.
Таблица 1: Распределения MIC, R% и значения индекса Lar сальмонеллы животных провинции Шаньдун. MIC, соответствующие жирному шрифту, являются значениями R противомикробных препаратов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Для единообразия и сопоставимости 3 градиента были расширены вперед и назад, центрированные на R каждого препарата. По распределениям ВПК семи градиентов индекс Лара рассчитывался по формуле:
.
Например, для ампициллина R-значение составило 32 мкг/мл, количество образцов – 1,414, а Лар = (4/32) х (245/1414) + (8/32) × (16/1414) + (16/32) × (117/1414) + (32/32) × (27/1414) + (64/32) × (36/1414) + (128/32) × (57/1414) + (2566) /32) × (916/1414) = 2-3 × (245/1414) + 2-2 × (16/1414) + 2-1 × (117/1414) + 20 × (27/1414) + 21 × (36/1414) + 2 2 × (57/1414) + 2 3 × (916/1414) = 5,48. По этой формуле были рассчитаны индексы Lar других антимикробных средств, которые приведены в таблице 1.
Значение индекса Лара заключалось в том, чтобы точно указать степень тяжести УПП. Если взять в качестве примера ципрофлоксацин и амоксициллин-клавулановую кислоту, то их значения R% были схожими, на уровне 68% и 65% соответственно, но их индексы Lar значительно различались — 4,57 и 1,76 соответственно. Причину этого наглядно иллюстрирует распределение высоких значений МПК в таблице 1, в котором 71,3% ципрофлоксацин-резистентных штаммов были распределены в 8R (32 мкг/мл), в то время как МПК штаммов, устойчивых к амоксициллину-клавулановой кислоте, были в основном сосредоточены на R и 2R, а доля 8R была низкой (8,69%). Таким образом, индекс Lar ципрофлоксацина был выше, чем у амоксициллина-клавулановой кислоты, что указывает на то, что доля высокорезистентных к ципрофлоксацину штаммов была выше, чем у штаммов, устойчивых к амоксициллину-клавулановой кислоте. Индекс Лара был более точным индикатором степени УПП, чем показатель сопротивления.
Согласно формуле индекса Лара, если бы ВПК всех штаммов по отношению к определенному препарату были R, индекс Лара был бы равен 1; если бы MICs всех штаммов были равны 2R, индекс Lar был бы равен 2. Таким образом, индекс Лара показал множественные взаимосвязи между комплексными MICs и соответствующим значением R, за исключением краевых концентраций. Для оценки степени УПП использовали индекс Лара, и преимущество было более выраженным, если УПП был выше. Для единообразия и сопоставимости диапазон расчета индекса Лара составлял 7 MIC с передним и задним 3 градиентами, центрированными на значении R, а средневзвешенное значение было получено путем интегрирования различных антимикробных агентов, количества штаммов и распределений MIC. Таким образом, диапазон значений индекса Lar составлял 0,125-8. Чем ближе был Lar к 0,125, тем ниже AMR, а чем ближе к 8, тем выше AMR. Однако пропорциональной зависимости между Lar и R в краевой концентрации не было. Когда антимикробные препараты и диапазон расчета индекса Лара были определены, общий Лар был нормализован до интуитивно понятного всеобъемлющего значения, используемого для непосредственного сравнения и оценки степени и тенденции изменения УПП в различных условиях различных бактерий, пользователей, лет, регионов и т. д.
В соответствии с протоколом интеллектуальной системы фагового скрининга применение было продемонстрировано на примере 96 фагов сальмонелл для лизиса штаммов AMR Salmonella , а также проанализирован фаговый литический рисунок.
Девяносто шесть фагов были перенесены на двухслойные планшеты, содержащие сальмонеллу, с помощью 96-точечного матричного инокулятора. Морфология образовавшихся пятен показана на рисунке 4. Выделялось четыре основных типа (хотя и не ограничиваясь четырьмя): чистое круглое пятно (●), скопление бляшек (), мутное литическое пятно () и отсутствие литического пятна (
○).
Рисунок 4: Морфология пятен сальмонеллы на двухслойных агаровых пластинах. 1 и 2: паттерны, продуцируемые 96 фагами на различных штаммах сальмонеллы. "●" круглое чистое пятно, "" скопление бляшек, "" мутное литическое пятно, "○" нет литического пятна) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
На двухслойных пластинах литические пятна различных фагов на разных бактериях-хозяевах были различны по морфологии10. «Круглое чистое литическое пятно» возникло в результате появления фага, который мог надежно убить хозяина на пластине, но который мог или не мог успешно размножаться за счет этого хозяина. В этом случае потребовалось дальнейшее разведение для окончательного определения типа. «Коллекцию бляшек» составляли настоящие бляшки. Каждая отдельная зона лизиса явно производилась из одного инфекционного центра, что свидетельствовало о том, что фаг реплицировался за счет бактерий на пластине. «Мутное литическое пятно» возникло из-за фага, который не убил хозяина на планшете и который может успешно размножаться, а может и не размножаться за счет этого хозяина. В данном случае существовало более одной возможности, что требовало подтверждения, основанного на дальнейших исследовательских интересах. «Нет литического пятна» указывало на нелитическую природу.
Более того, использование этой системы для предварительного тестирования позволило по существу определить, дублируются ли штаммы и бактериофаги. Если были выбраны разные виды сальмонелл и паттерны двух бактериофагов были идентичны, это указывало на то, что бактериофаги могут дублироваться. Если неповторяющиеся бактериофаги были отобраны для заражения неизвестных видов сальмонелл из клинических источников, и фаговая картина была одинаковой, это указывало на то, что штаммы сальмонеллы могут быть одним и тем же штаммом. Кроме того, количество и доля дубликатов имели референсные значения для эпидемиологического расследования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод разбавления агаром хорошо зарекомендовал себя и широко используется. Принцип работы высокопроизводительной системы АСТ был основан на методе разбавления агара. Одним из важнейших шагов в рамках протокола была точная высокопроизводительная передача 96 инокулей за один раз, которая выполнялась несколько раз подряд. Чтобы завершить этот важный шаг, выводы 96-точечного матричного инокулятора были однородными и очень гладкими. Естественное осаждение каждого штифта представляло собой объем около 2 мкл, который агрегировался в мелкие капли на поверхности агаровой среды, которые быстро впитывались в агар, не растекались и не разбрызгивались, вызывая перекрестное загрязнение. Вторым важным этапом стала статистическая обработка больших данных АСТ. При высокопроизводительной инокуляции необходимо было определить данные испытаний, а рабочая нагрузка была огромной. Интеллектуальный анализ и статистические результаты, полученные с помощью интеллектуального конвертера для получения изображений и вспомогательного программного обеспечения, стали идеальным решением этой проблемы. Результаты AST были автоматически загружены непосредственно в базу данных Varms. Были повышены эффективность и точность интерпретации результатов, а также снижены ошибки, вызванные человеческимфактором13.
Третьим важным шагом было предложение индекса УПП Лара. В настоящее время в мире существует несколько комплексных оценочных показателей УПП. Согласно литературным данным, индекс лекарственной устойчивости (DRI) был описан Лакшминараяном и Клагманом для измерения изменений эффективности антибиотиков14,15. Он объединил распространенность резистентности и относительную частоту назначения лекарств, но не смог охарактеризовать степень УПП и оценить изменения в высоких уровнях лекарственной устойчивости. Индекс эффективности лекарственного средства (DEI)16, еще один индекс, полученный из DRI, имеет тот же недостаток, что и DRI. Таким образом, был предложен индекс Лара, который состоял из трех этапов: (1) ВПК штаммов бактерий нормировали на основе соответствующего R-значения, устраняя различия в антимикробных агентах, вызванные разными значениями R стандарта АСТ; (2) В соответствии с распределениями МПК средневзвешенные значения были рассчитаны таким образом, чтобы более точно отражать степень УПП, чем уровень резистентности; (3) Среднее арифметическое индексов Lar нескольких противомикробных препаратов, т.е. общее значение Lar, может отражать всестороннюю ситуацию с УПП, обеспечивая удобство оценки и сравнения УПП на разных уровнях.
Аппаратная конструкция этих аппаратов была разумной и простой в эксплуатации, и все детали работали без сбоев. Проблем с заклиниванием или неисправностей не было. Дизайн вспомогательного программного обеспечения соответствовал индивидуальным требованиям АСТ и фагового скрининга и был прост в эксплуатации и использовании. Один прибор был оснащен 4-5 коробками с инокуляционными штифтами для нескольких применимых сценариев пакетного переноса бактерий. Основными компонентами этого прибора были пластина для инокуляции и штифты из нержавеющей стали, которые можно было адаптировать к различным условиям и можно было автоклавировать, разбирать и заменять. Штифты для прививки были спроектированы таким образом, чтобы их можно было комбинировать любым способом.
Крайне важно создать систему мониторинга УПП в связи с распространенностью резистентных патогенов, вызванных неправильным использованием антибиотиков. С 2008 года группа общественного здравоохранения Института зоотехнии и ветеринарной медицины Шаньдунской академии сельскохозяйственных наук последовательно проводит мониторинг УПП животных в провинции Шаньдун1 2 13 и 17. Необходимо было эффективно выявлять ВПК возбудителей для регулирования применения антимикробных препаратов из-за высокого уровня ветеринарной резистентности и большого объема мониторинга. Однако соответствующие инструменты для АСТ стоят дорого, а стоимость эксплуатации и расходных материалов высока и не подходит для широкого круга крупных фермерских хозяйств. По этой причине разработка интеллектуальной высокопроизводительной системы АСТ и стандартизация ее применения способствовали созданию надежной системы мониторинга УПП. Согласно предыдущим исследованиям12,13, интеллектуальная высокопроизводительная система АСТ достигла хорошей воспроизводимости и стабильности в соответствии со стандартом CLSI и была применена для АСТ и анализа клинических патогенных бактерий у животных. На сегодняшний день накоплены исчерпывающие данные по УПП по более чем 20 000 эпидемическихштаммов12. Для резистентных бактерий, обнаруженных в процессе мониторинга, эта система также может быть использована для быстрого высокопроизводительного скрининга литических фагов для взаимодействия с противомикробными агентами для снижения УПП. Применение 96-точечного матричного инокулятора и преобразователя получения изображений для скрининга лизиса фагов было расширенной функцией, и другие приборы в этой области ранее не применялись.
Интеллектуальная высокопроизводительная система скрининга АСТ/фагов объединила АСТ с литическими бактериофагами для достижения мониторинга, контроля и снижения УПП. В то же время индекс Лара более интуитивно и лаконично использовался для оценки вклада различных факторов и новых антибактериальных технологий в снижение УПП.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yuqing Liu et al. подали заявки на китайские патенты на 96-точечный матричный инокулятор и преобразователь для получения изображений и их применение (патент No ZL 201610942866.3 и патент No ZL 201910968255.X).
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке Национального проекта по ключевым исследованиям и разработкам (2019YFA0904003); Современная сельскохозяйственная промышленная система в провинции Шаньдун (SDAIT-011-09); Проект по оптимизации платформы международного сотрудничества (CXGC2023G15); Основные инновационные задачи сельскохозяйственной науки и техники, инновационный проект Академии сельскохозяйственных наук, Шаньдун, Китай (CXGC2023G03).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well culture plate | Beijing lanjieke Technology Co., Ltd | 11510 | |
| 96-dot matrix AST image acquisition system | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| 96-dot matrix inoculator | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Agar | Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd | HB8274-1 | |
| Amikacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A857053 | |
| Amoxicillin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A822839 | |
| Ampicillin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A830931 | |
| Analytical balance | Sartorius | BSA224S | |
| Automated calculation software for Lar index of AMR | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Bacteria Salmonella strains | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Animal origin |
| Bacterial resistance Lar index certification management system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Ceftiofur | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C873619 | |
| Ciprofloxacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C824343 | |
| Clavulanic acid | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C824181 | |
| Clean worktable | Suzhou purification equipment Co., Ltd | SW-CJ-2D | |
| Colistin sulfate | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C805491 | |
| Culture plate | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Doxycycline | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | D832390 | |
| Enrofloxacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | E809130 | |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SLGP033RB | |
| Florfenicol | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | F809685 | |
| Gentamicin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | G810322 | |
| Glass bottle 50 mL | Xuzhou Qianxing Glass Technology Co., Ltd | QX-7 | |
| High-throughput resistance detection system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Image acquisition converter | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Meropenem | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | M861173 | |
| Mueller-Hinton agar | Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd | HB6232 | |
| Petri dish 60 mm x 15 mm | Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd | 16021-1 | |
| Petri dish 90 mm x 15 mm | Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd | 16001-1 | |
| Salmonella phages | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | |
| Shaker incubator | Shanghai Minquan Instrument Co., Ltd | MQD-S2R | |
| Turbidimeter | Shanghai XingBai Biotechnology Co., Ltd | F-TC2015 | |
| Varms base type library system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Vertical high-pressure steam sterilizer | Shanghai Shen'an medical instrument factory | LDZX-75L | |
| Veterinary pathogen resistance testing management system | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Veterinary resistance cloud monitoring and phage control platform V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright |
References
- Ramanan, L., et al. Antimicrobial resistance-the need for global solutions. The Lancet Infectious Diseases. 13 (12), 1057-1098 (2013).
- Xiaonan, Z., Qing, Z., Thomas, S. P., Yuqing, L., Martha, R. J. C. inPhocus: Perspectives of the application of bacteriophages in poultry and aquaculture industries based on Varms in China. PHAGE: Therapy, Applications, and Research. 2 (2), 69-74 (2021).
- CLSI. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. CLSI document M100. , M100 32nd edition, Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA . (2022).
- Yuqing, L., et al. Antimicrobial Sensitivity Testing Standard of EUCAST. , China Standards Press, Beijing. (2017).
- Barnini, S., et al. A new rapid method for direct antimicrobial susceptibility testing of bacteria from positive blood cultures. BMC Microbiology. 16 (1), 185-192 (2016).
- Höring, S., Massarani, A. S., Löffler, B., Rödel, J. Rapid antimicrobial susceptibility testing in blood culture diagnostics performed by direct inoculation using the VITEK®-2 and BD PhoenixTM platforms. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (3), 471-478 (2019).
- Dupuis, G. Evaluation of the Cobasbact automated antimicrobial susceptibility testing system. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 4 (2), 119-122 (1985).
- A system of bacterial antimicrobial resistance detection and its operation method. China Patent. Liu, Y., et al. , ZL 201610942866.3 (2019).
- A high throughput test plate for screening bacteriophage of zoonotic pathogens and its application. China Patent. Liu, Y. , ZL 201910968255.X (2022).
- Adams, M. H. Bacteriophages. , Interscience Publishers, New York. (1959).
- Nair, A., Ghugare, G. S., Khairnar, K. An appraisal of bacteriophage isolation techniques from environment. Microbial Ecology. 83 (3), 519-535 (2022).
- Shandong veterinary antibiotic resistance system. , http://www.varms.cn (2023).
- Ming, H., et al. Comparison of the results of 96-dot agar dilution method and broth microdilution method. Chinese Journal of Antibiotics. 43 (6), 729-733 (2018).
- Laxminarayan, R., Klugman, K. P. Communicating trends in resistance using a drug resistance index. BMJ Open. 1 (2), e000135 (2011).
- Chen, Y., et al. Assessing antibiotic therapy effectiveness against the major bacterial pathogens in a hospital using an integrated index. Future Microbiology. 12, 853-866 (2017).
- Ciccolini, M., Spoorenberg, V., Geerlings, S. E., Prins, J. M., Grundmann, H. Using an index-based approach to assess the population-level appropriateness of empirical antibiotic therapy. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (1), 286-293 (2015).
- Yanbo, L., et al. Preliminary application of inoculation system for high-throughput drug susceptibility test. China Poultry. 42 (6), 52-57 (2020).
