Summary
Aquí presentamos el principio, la estructura y las instrucciones del sistema inteligente de detección de fagos / pruebas de sensibilidad antimicrobiana de alto rendimiento. Su aplicación se ilustra utilizando como ejemplo la Salmonella aislada de aves de corral en Shandong, China. Se calcula el índice Lar y se discute exhaustivamente su importancia en la evaluación de la resistencia a los antimicrobianos.
Abstract
Para mejorar la eficiencia de las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos (AST) y el cribado de alto rendimiento de fagos para bacterias resistentes y para reducir el coste de detección, se desarrolló un sistema inteligente de cribado de AST/fagos de alto rendimiento, que incluye un inoculador de matriz de 96 puntos, un convertidor de adquisición de imágenes y el software correspondiente, de acuerdo con los criterios AST y los puntos de ruptura de resistencia (R) formulados por el Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI). La AST y las estadísticas de las distribuciones de la concentración inhibitoria mínima (CMI) (de R/8 a 8R) de 1.500 cepas de Salmonella aisladas de aves de corral en Shandong, China, frente a 10 agentes antimicrobianos se llevaron a cabo mediante el sistema inteligente de cribado de ast/fagos de alto rendimiento. El índice Lar, que significa "menos antibiosis, menos resistencia y residual hasta poca antibiosis", se obtuvo calculando la media ponderada de cada CMI y dividiéndola por R. Este enfoque mejora la precisión en comparación con el uso de la prevalencia de resistencia para caracterizar el grado de resistencia a los antimicrobianos (RAM) de cepas altamente resistentes. Para las cepas de Salmonella con alta resistencia a los antimicrobianos, los fagos líticos se seleccionaron eficientemente de la biblioteca de fagos mediante este sistema, y se calculó y analizó el espectro de lisis. Los resultados mostraron que el sistema inteligente de cribado de fagos y AST de alto rendimiento era operable, preciso, altamente eficiente, económico y fácil de mantener. En combinación con el sistema de monitoreo de la resistencia a los antimicrobianos veterinarios de Shandong, el sistema era adecuado para la investigación científica y la detección clínica relacionada con la resistencia a los antimicrobianos.
Introduction
Dado que los agentes antimicrobianos se han utilizado ampliamente para prevenir enfermedades infecciosas bacterianas, la resistencia a los antimicrobianos (RAM) se ha convertido en un problema de salud pública mundial1. La lucha contra la resistencia a los antimicrobianos es la misión principal actual de seguimiento de la resistencia a los antimicrobianos de patógenos epidemiológicos y la terapia sinérgica de agentes antimicrobianos sensibles y bacteriófagos líticos2.
Las pruebas de sensibilidad antimicrobiana (AST) in vitro son el pilar para monitorizar el tratamiento y detectar el nivel de RAM. Es una parte importante de la farmacología antimicrobiana y la base crítica de la medicación clínica. El Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI) de los Estados Unidos y el Comité Europeo de Pruebas de Susceptibilidad a los Antimicrobianos (EUCAST) han formulado y revisado los criterios internacionales de AST y han modificado y complementado continuamente los métodos AST y los puntos de corte para determinar la CMI de una determinada combinación de "organismo-agente antimicrobiano" como sensible (S), resistente (R) o intermedio (I)3, 4.
Desde la década de 1980 hasta la década de 1990, los instrumentos automáticos de dilución de microcaldo se desarrollaron rápidamente y se aplicaron a la práctica clínica, con ejemplos como Alfred 60AST, VITEK System, PHOENIXTM y Cobasbact 5,6,7. Sin embargo, estos instrumentos eran costosos, requerían consumibles de alto costo y sus rangos de detección fueron diseñados para la medicación clínicade pacientes 5,6,7. Por estas razones, no son adecuados para el examen clínico veterinario y la detección de grandes cantidades de cepas altamente resistentes. En este estudio, se desarrolló un sistema inteligente de cribado de AST/fagos de alto rendimiento, que incluye un inoculador de matriz de 96 puntos (Figura 1), un convertidor de adquisición de imágenes (Figura 2) y el software correspondiente8, para realizar AST para un lote de cepas de bacterias contra múltiples agentes antimicrobianos a la vez mediante el método de dilución en agar. Además, el sistema también se utilizó para detectar y analizar los patrones de lisis de los fagos frente a bacterias resistentes a los antimicrobianos9, y los fagos líticos se seleccionaron de forma eficiente de la biblioteca de fagos. Se comprobó que este sistema era eficiente, asequible y fácil de operar.
Figura 1: Diagrama estructural del inoculador de matriz de 96 puntos. 1: Placa de clavija de inoculación; 2: Operador de telefonía móvil; 3: Bloque de semillas; 4: Placa incubada; 5: Base; 6: Mango de operación; 7: Pin de límite. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Diagrama estructural del convertidor de adquisición de imágenes. 1: Concha; 2: Pantalla de visualización; 3: Sala de adquisición de imágenes; 4: Base de la placa de detección; 5: Tablero de detección dentro y fuera del almacén; 6: Tablero de control; 7: Dispositivo de conversión de adquisición de imágenes; 8: Fuente de luz; 9: Escáner de imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Protocol
Las cepas de Salmonella utilizadas en este estudio se recolectaron de aves de corral en Shandong, China, después de obtener la aprobación del Comité de Bioseguridad del Instituto de Ciencias Animales y Medicina Veterinaria de la Academia de Ciencias Agrícolas de Shandong, China.
1. Aplicación del sistema inteligente AST de alto rendimiento8
- Preparación del inóculo
- Incubar el organismo de control de calidad Escherichia coli y 93 cepas de Salmonella para someterlas a ensayo de AST en placas de agar Mueller-Hinton (MHA) durante 16-18 h a 37 °C3.
- Prepare el inóculo de cada cepa para que coincida con el estándar de turbidez de McFarland de 0,5 según el método especificado en el estándar CLSI3y luego diluya 10 veces.
- Coloque 200 μL de solución salina normal estéril en el 1er pocillo horizontal (A1) de la placa de 96 pocillos como control negativo, dos suspensiones del organismo de control de calidad enlos pocillos horizontales 2º y3º (A2 y A3) como control positivo y control de calidad, respectivamente. Agregue 200 μL de las suspensiones de inóculo diluidas de cada tinción analizada en los 93 pocillos correspondientes en el bloque de semillas de 96 pocillos.
- Preparación de la placa de agar antimicrobiano
- Establezca los rangos de concentración de los diferentes agentes antibacterianos probados de acuerdo con el rango de cálculo del índice Lar (de 0,125R a 8R). Las concentraciones van desde el rango de control de calidad o 0.0625R (sujeto al rango inferior) hasta 8R.
NOTA: Si no se calcula el índice Lar, el rango de concentraciones de antibióticos se puede establecer de acuerdo con las necesidades de AST. - Ejecute un esquema de dilución de duplicación log2 para la solución antibiótica comenzando con una concentración de stock adecuada basada en el método de dilución en agar especificado en la norma CLSI3.
- Esterilice botellas de vidrio de 50 ml que contengan 18 ml de medio de agar Mueller-Hinton. Añadir 2 ml de las diluciones adecuadas de la solución antimicrobiana a 18 ml de medio fundido enfriado a 45-50 °C, mezclar bien y verter en las placas de la cabina de bioseguridad.
- Deje que el agar se solidifique a temperatura ambiente (RT), deje un espacio debajo de la tapa de las placas incubadas y sople para secar la superficie del agar antes de inocularlo.
- Etiquete los tipos de agentes antimicrobianos y las concentraciones en el reverso de las placas incubadas. Coloque las múltiples placas incubadas de cada agente antimicrobiano en una pila en un orden de dilución log2-duplicado.
- Prepare dos placas de agar sin fármacos como controles para cada agente antimicrobiano.
- Establezca los rangos de concentración de los diferentes agentes antibacterianos probados de acuerdo con el rango de cálculo del índice Lar (de 0,125R a 8R). Las concentraciones van desde el rango de control de calidad o 0.0625R (sujeto al rango inferior) hasta 8R.
- Pasos de inoculación para el inoculador de matriz de 96 puntos
- Instale la placa de clavijas de inoculación esterilizada en autoclave sobre el soporte de un inoculador de matriz de 96 puntos en el gabinete de bioseguridad.
- Coloque el bloque de semillas preparado con cepas probadas y una placa de agar incubada en el portador móvil, con el mismo ángulo de posicionamiento para las dos placas.
- Empuje el transportador móvil de modo que el bloque de semillas quede directamente debajo de la placa de clavijas de inoculación.
- Presione la manija de operación, mueva la placa de clavijas de inoculación hacia abajo y dirija las 96 clavijas a los inóculos en 96 pocillos del bloque de semillas.
- Suelte la manija de operación con control, luego restablezca la placa del pasador de inoculación bajo la acción del resorte.
- Presione la manija de operación 2-3 veces para revolver bien cada inóculo y sumergirlo. Empuje y mueva la placa portadora de modo que la placa incubada quede directamente debajo de la placa de clavijas de inoculación.
- Presione la manija de operación, mueva la placa de clavijas de inoculación hacia abajo y deténgase durante 1-2 segundos para que las clavijas de inoculación entren en contacto con la superficie de la placa incubada por completo.
- Suelte la manija de operación. Con esto se completa una inoculación. Reemplace otra placa incubada y continúe el ciclo hasta que termine un grupo de placas de agar antimicrobiano.
- Reemplace otra placa de clavijas de inoculación y un bloque de semillas, e inocule otro grupo de cepas probadas. Realice un ciclo hasta que se completen todas las inoculaciones.
NOTA: Inocular primero una placa de agar de control (sin agente antimicrobiano), luego la placa en orden de concentración del fármaco de baja a alta, y una segunda placa de agar de control al final para garantizar que no haya contaminación ni arrastre de agentes antimicrobianos. El volumen de inoculación se basa en el volumen de la deposición natural de cada pin de aproximadamente 2 μL.
- Incubación de las placas de agar antimicrobiano
- Incubar las placas de agar antimicrobiano inoculadas en RT hasta que la humedad de las manchas de inóculo sea absorbida por el agar.
- Invierta las placas e incube durante 16-20 h a 37 °C para las cepas probadas para asegurarse de que las bacterias desinhibidas formen colonias.
- Adquisición de imágenes y estadísticas de datos
- Haga doble clic en el sistema de adquisición de imágenes AST de matriz de 96 puntos para abrir el programa.
- Haga clic en Información de prueba en la barra de tareas. Haga clic en Nuevo para crear una nueva tarea de prueba y complete la información de acuerdo con las indicaciones, incluido el código, el nombre, la fuente, las bacterias, el número de cepas, los antibióticos y el gradiente.
- Haga clic en Recopilación de datos > Fotografía > elemento de prueba para seleccionar la nueva tarea creada. Haga clic en Antibióticos para seleccionar el nombre del antibiótico y haga clic en Gradiente para seleccionar la concentración inicial de este antibiótico.
- Haga clic en Conectar para conectarse con el convertidor de adquisición de imágenes.
- Coloque las placas incubadas correspondientes en la base de la placa de detección con el ángulo que falta en la parte delantera derecha para orientarse y empújelas en el convertidor de adquisición de imágenes.
- Haga clic en Colección para obtener las imágenes. El gradiente de antibióticos saltará automáticamente al siguiente gradiente. Coloque la siguiente placa por turnos y continúe haciendo clic en Recolección hasta que se hayan recolectado las placas para este antibiótico.
- Haga clic en Antibióticos y seleccione el siguiente conjunto de placas incubadas. Haga clic en Degradado para seleccionar el degradado inicial y pasar a la siguiente ronda de recopilación de imágenes.
- Después de completar todas las colecciones, haga clic en Enviar. El programa reconocerá automáticamente el número de píxeles blancos formateados en cada punto de inoculación de las imágenes, determinará si hay formación de colonias y convertirá las imágenes en valores MIC.
- Haga clic en Consulta para obtener todos los resultados de MIC de las cepas frente a los antibióticos probados.
NOTA: El sistema inteligente AST de alto rendimiento es adecuado para determinar las CMI de grandes lotes de cepas bacterianas. El proceso de prueba, que incluye la preparación, la inoculación, la incubación y la lectura de los resultados, dura 3 días. Los tipos de antibióticos y los rangos de detección de MIC se pueden configurar de acuerdo con las necesidades respectivas, y los principales consumibles se pueden reutilizar.
- Cálculo del índice Lar
- Determine el índice Lar con precisión con la fórmula: , donde:
CMIi: concentración mínima inhibitoria.
El rango de distribuciones de MIC de MIC-3 a MIC3 representa concentraciones dobles en serie centradas en R: 0.125R, 0.25R, 0.5R, R, 2R, 4R y 8R.
es 2 i, y el rango dei es de -3 a 3.
R: los puntos de ruptura de la resistencia de las bacterias a los agentes antimicrobianos estandarizados por CLSI.
f: la distribución de frecuencias de la MIC.
NOTA: El índice Lar general es la media aritmética de todos los índices Lar. Después de calcular el índice Lar, redondee el valor final a dos dígitos significativos después del punto decimal.
- Determine el índice Lar con precisión con la fórmula: , donde:
es 2 i, y el rango dei es de -3 a 3.2. Sistema inteligente de detección de fagos de alto rendimiento9
- Preparación del bloque de semillas de fagos y placas incubadas de doble capa que contienen bacterias.
- Utilice el método de agar de doble capa10 o el método de cultivo líquido11 para fabricar diferentes fagos. Diluir a una concentración paralela adecuada con un título de 1 x 104-5 ufp/mL, y añadir 200 μL del inóculo de fagos en el bloque de semillas de 96 pocillos.
- Hacer placas de doble capa con bacterias (10 mL de medio de agar inferior [agar 12 g/L] y 6 mL de medio semiagar superior [6 g/L] con 100 μL de bacterias [0,5 McFarland]) para ser analizadas.
- Haga una placa de incubación de doble capa para cada cepa que se va a probar. Deje un espacio debajo de la tapa de la placa de doble capa y sople para secar la superficie del agar en el gabinete de bioseguridad.
- Prueba de cribado
- Coloque el bloque de semillas de fagos preparado y la placa de doble capa en el portador móvil del inoculador de matriz de 96 puntos y transfiera todos los inóculos de fagos a la superficie de semiagar. Continúe los ciclos hasta que se completen todas las cepas probadas.
- Deje que las placas de doble capa inoculadas permanezcan en RT hasta que la humedad en las manchas de inóculo se absorba completamente en el semiagar.
- Invertir las placas e incubar en condiciones adecuadas para las cepas probadas durante 4-6 h para asegurarse de que se formen manchas líticas claras.
- Análisis de datos
- Obtener y guardar la imagen del resultado experimental de cada placa de doble capa mediante el convertidor de adquisición de imágenes (pasos 1.5.4-1.5.6).
- Registre el número y las morfologías de las diferentes formas de manchas en una hoja de cálculo basada en las imágenes obtenidas y calcule las proporciones respectivas de los diferentes tipos de fagos.
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Representative Results
Siguiendo el protocolo del sistema inteligente AST de alto rendimiento, su aplicación se ilustró con la Salmonella de aves de corral en Shandong, China, como ejemplo.
En la Figura 3 se muestra el crecimiento de cepas de Salmonella en placas de agar con ampicilina (R de 32 μg/mL) a concentraciones de 2 a 256 μg/mL determinadas por el convertidor de adquisición de imágenes. El1er pozo horizontal A1 fue el testigo negativo y no mostró crecimiento de colonias; A2 y A3 fueron las cepas de control de calidad con CMI 4 μg/mL (formando una colonia en la placa de agar con 2 μg/mL de ampicilina, pero no en la de 4 μg/mL), dentro del rango de control de calidad estandarizado por CLSI (2-8 μg/mL). La CMI de la cepa de Salmonella en A4 fue de 64 μg/mL, mientras que la de A5 fue de 16 μg/mL. Las distribuciones de CMI de 93 cepas de Salmonella frente a la ampicilina fueron calculadas automáticamente por el software.
Figura 3: Morfología de Salmonella en una serie de placas de cultivo con ampicilina. 8 horizontales: A-H, 12 verticales: 1-12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Se aplicó el sistema AST de alto rendimiento para determinar la resistencia a los antimicrobianos de las cepas de Salmonella de animales de la provincia de Shandong. Los datos del MIC se cargaron en la base de datos de Varms (http://www.varms.cn/)12. Los resultados estadísticos se muestran en la Tabla 1. Se probaron un total de 10 agentes antimicrobianos contra 300-1.500 cepas de Salmonella , lo que demuestra las ventajas de alto rendimiento de este sistema.
De acuerdo con los puntos de rotura resistentes de la norma CLSI, la tasa de resistencia (R%) se calculó como porcentaje de cepas con MIC ≥ R entre las cepas ensayadas (Tabla 1). Los valores de R% de ampicilina, ciprofloxacina y amoxicilina-ácido clavulánico fueron superiores al 50%, los valores de R% de doxiciclina, florfenicol, cefotaxima y enrofloxacina fueron del 30%-50%, y los valores de R% de gentamicina, amikacina y meropenem fueron inferiores al 30%. El meropenem no se utilizó en animales criados industrialmente y mostró un R% del 7%.
El R% indicó la proporción de cepas bacterianas con CMI superiores a R, mientras que las distribuciones de CMI mostraron el número de cepas con cada CMI para describir la RAM general de Salmonella con mayor precisión. Por ejemplo, el R% de ampicilina fue del 73%, y el número máximo de muestras (916 cepas) se concentró con MIC ≥ 256 μg/mL, lo que indica que la resistencia de Salmonella a la ampicilina era bastante grave.
Tabla 1: Distribuciones de MIC, R% y valores del índice Lar de Salmonella en animales de la provincia de Shandong. Los MIC correspondientes a la fuente en negrita son los valores R de los agentes antimicrobianos. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Para uniformidad y comparabilidad, se extendieron 3 gradientes hacia adelante y hacia atrás, centrados en la R de cada fármaco. De acuerdo con las distribuciones MIC de siete gradientes, el índice Lar se calculó mediante la fórmula:
.
Como ejemplo para la ampicilina, el valor R fue de 32 μg/mL, el número de muestras fue de 1,414, y Lar = (4/32) x (245/1414) + (8/32) × (16/1414) + (16/32) × (117/1414) + (32/32) × (27/1414) + (64/32) × (36/1414) + (128/32) × (57/1414) + (2566) /32) × (916/1414) = 2-3 × (245/1414) + 2-2 × (16/1414) + 2-1 × (117/1414) + 20 × (27/1414) + 21 × (36/1414) + 22 × (57/1414) + 2 3 × (916/1414) = 5,48. Con esta fórmula, se calcularon los índices Lar de otros agentes antimicrobianos que se muestran en la Tabla 1.
La importancia del índice Lar fue indicar con precisión el grado de gravedad de la RAM. Tomando como ejemplos la ciprofloxacina y la amoxicilina-ácido clavulánico, sus valores de R% fueron similares, con 68% y 65%, respectivamente, pero sus índices de Lar difirieron significativamente, con 4,57 y 1,76, respectivamente. La razón de esto quedó claramente ilustrada por la distribución de los valores altos de CMI en la Tabla 1, en la que el 71,3% de las cepas resistentes a ciprofloxacino se distribuyeron en 8R (32 μg/mL), mientras que las CMI de las cepas resistentes a amoxicilina-ácido clavulánico se concentraron mayoritariamente en R y 2R, y la proporción de 8R fue baja (8,69%). Por lo tanto, el índice Lar de ciprofloxacina fue mayor que el de amoxicilina-ácido clavulánico, lo que indica que la proporción de cepas altamente resistentes a ciprofloxacino fue mayor que la de cepas resistentes a amoxicilina-ácido clavulánico. El índice Lar fue un indicador más preciso del grado de resistencia a los antimicrobianos que la tasa de resistencia.
De acuerdo con la fórmula del índice Lar, si las CMI de todas las cepas con respecto a un determinado fármaco fueran R, el índice Lar sería 1; si las CMI de todas las cepas fueran 2R, el índice Lar sería 2. Por lo tanto, el índice Lar mostró múltiples relaciones entre los CMI completos y el valor R correspondiente, excepto para las concentraciones de borde. Se utilizó el índice Lar para evaluar el grado de RAM, y la ventaja fue más pronunciada cuanto mayor fue la RAM. Para uniformidad y comparabilidad, el rango de cálculo del índice Lar fue de siete CMI con los 3 gradientes delantero y trasero centrados en el valor R, y el promedio ponderado se obtuvo integrando los diferentes agentes antimicrobianos, el número de cepas y las distribuciones de CIM. Por lo tanto, el rango de valores del índice Lar fue de 0,125-8. Cuanto más cerca estaba el Lar de 0,125, menor era el AMR, y cuanto más cerca estaba de 8, mayor era el AMR. Sin embargo, no hubo relación proporcional entre Lar y R en la concentración de bordes. Cuando los agentes antimicrobianos y el rango de cálculo del índice Lar fueron definidos, el Lar general se normalizó a un valor integral intuitivo que se utilizó para comparar y evaluar directamente el grado y la tendencia de cambio de la RAM en las diferentes condiciones de diferentes bacterias, usuarios, años, regiones, etc.
Siguiendo el protocolo del sistema inteligente de cribado de fagos, se demostró la aplicación tomando como ejemplo 96 fagos de Salmonella para lisar cepas de Salmonella AMR, y se analizó el patrón lítico de los fagos.
Noventa y seis fagos fueron transferidos a placas de doble capa que contenían Salmonella mediante un inoculador de matriz de 96 puntos. La morfología de las manchas formadas se muestra en la Figura 4. Había cuatro tipos principales (aunque no limitados a cuatro): mancha redonda clara (●), colección de placas (), mancha lítica turbia () y sin mancha lítica (
○).
Figura 4: Morfología de las manchas de Salmonella en placas de agar de doble capa. 1 y 2: los patrones producidos por 96 fagos en diferentes cepas de Salmonella. "●" mancha redonda clara, "" colección de placas, "" mancha lítica turbia, "○" sin mancha lítica) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
En las placas de doble capa, las manchas líticas de diferentes fagos en diferentes bacterias hospederas fueron diversas en morfología10. La "mancha lítica redonda y clara" fue el resultado de un fago que podía matar de manera confiable al huésped en la placa, pero que puede o no replicarse con éxito a expensas de ese huésped. En este caso, fue necesaria una dilución adicional para determinar de manera concluyente el tipo. La "colección de placas" estaba formada por placas verdaderas. Cada zona individual de lisis se produjo claramente a partir de un único centro infeccioso, lo que demostró que el fago se había replicado a expensas de las bacterias de la placa. La "mancha lítica turbia" fue el resultado de un fago que no mató de manera confiable al huésped en la placa y que puede o no replicarse con éxito a expensas de ese huésped. En este caso, había más de una posibilidad, por lo que era necesario confirmarla en función de otros intereses de investigación. La "mancha no lítica" indicaba naturaleza no lítica.
Además, el uso de este sistema para pruebas preliminares podría determinar esencialmente si las cepas y los bacteriófagos estaban duplicados. Si se seleccionaban diferentes especies de Salmonella y los patrones de dos bacteriófagos eran idénticos, indicaba que los bacteriófagos podrían estar duplicados. Si se seleccionaron bacteriófagos no repetitivos para infectar especies desconocidas de Salmonella de fuentes clínicas y el patrón de fagos fue el mismo, indicó que las cepas de Salmonella podrían ser la misma cepa. Además, el número y la proporción de duplicados tenían valores de referencia para la investigación epidemiológica.
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Discussion
El método de dilución en agar está bien establecido y se utiliza ampliamente. El principio del sistema AST de alto rendimiento era el del método de dilución en agar. Uno de los pasos críticos dentro del protocolo fue la transferencia precisa de alto rendimiento de 96 inóculos a la vez, que se realizó varias veces seguidas. Para completar este paso crítico, los pines del inoculador de matriz de 96 puntos eran uniformes y muy suaves. La deposición natural de cada pin fue de un volumen de aproximadamente 2 μL, que se agregó en pequeñas gotas en la superficie del medio de agar para ser absorbidas rápidamente por el agar, sin fluir ni salpicar para causar contaminación cruzada. El segundo paso crítico fue el procesamiento estadístico de grandes cantidades de datos AST. Con la inoculación de alto rendimiento, era necesario determinar los datos de las pruebas y la carga de trabajo era enorme. El análisis inteligente y los resultados estadísticos producidos por el convertidor inteligente de adquisición de imágenes y el software de soporte fueron una solución perfecta a este problema. Los resultados de AST se cargaron automáticamente directamente en la base de datos de Varms. Se mejoró la eficiencia y precisión de la interpretación de los resultados y se redujeron los errores causados por factores humanos13.
El tercer paso crítico fue proponer el índice Lar de la RAM. En la actualidad, existen pocos índices de evaluación exhaustiva de la resistencia a los antimicrobianos en el mundo. De acuerdo con la literatura, un índice de resistencia a medicamentos (IDR) fue descrito por Laxminarayan y Klugman para medir los cambios en la efectividad de los antibióticos14,15. Se combinó la prevalencia de resistencia y las frecuencias relativas de prescripción, pero no se pudo caracterizar el grado de resistencia a los antimicrobianos ni evaluar los cambios en los niveles altos de resistencia a los medicamentos. El índice de efectividad de medicamentos (DEI)16, otro índice derivado del DRI, tiene la misma desventaja que el DRI. Así, se propuso el índice Lar, el cual constó de tres pasos: (1) Los CMI de las cepas bacterianas se normalizaron con base en el respectivo valor R, eliminando las diferencias en los agentes antimicrobianos causadas por diferentes valores R del estándar AST; (2) De acuerdo con las distribuciones de la CIM, los valores medios ponderados se calcularon para reflejar el grado de resistencia a los antimicrobianos con mayor precisión que la tasa de resistencia; (3) La media aritmética de los índices Lar de múltiples agentes antimicrobianos, es decir, el Lar general, podría reflejar la situación global de la RAM, lo que facilitaría la evaluación y comparación de la RAM a diferentes niveles.
El diseño de hardware de estos aparatos era razonable y simple de operar, y todas las piezas funcionaban sin problemas. No hubo ningún problema de interferencia o fallo. El diseño del software de soporte se ajustaba a los requisitos personalizados de AST y cribado de fagos y era fácil de manejar y utilizar. Un instrumento estaba equipado con 4-5 cajas de clavijas de inoculación para múltiples escenarios aplicables de transferencia bacteriana por lotes. Los componentes principales de este instrumento eran la placa de clavijas de inoculación y las clavijas de acero inoxidable, que se adaptaban a una variedad de entornos y podían esterilizarse en autoclave, desmontarse y reemplazarse. Los pines de inoculación fueron diseñados para ser combinados de cualquier manera.
Era imperativo establecer un sistema de vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos debido a la prevalencia de patógenos resistentes causados por el uso indebido de antibióticos. Desde 2008, el equipo de salud pública del Instituto de Ciencia Animal y Medicina Veterinaria de la Academia de Ciencias Agrícolas de Shandong ha llevado a cabo el monitoreo de la resistencia a los antimicrobianos de los animales sucesivamente en la provincia de Shandong1 2,13,17. Fue necesario detectar eficientemente los CMI de patógenos para regular el uso de agentes antimicrobianos debido al alto nivel de resistencia veterinaria y al gran volumen de monitoreo. Sin embargo, los instrumentos relevantes para AST son costosos, y el costo de la operación y los consumibles es alto y no es adecuado para una amplia gama de granjas a gran escala. Por esta razón, el desarrollo del sistema inteligente AST de alto rendimiento y la estandarización de su aplicación fueron propicios para promover el establecimiento de un sistema sólido para la tecnología de monitoreo de AMR. De acuerdo con investigaciones previas12,13, el sistema inteligente AST de alto rendimiento logró una buena repetibilidad y estabilidad para coincidir con el estándar de CLSI y se aplicó a AST y al análisis de bacterias patógenas clínicas en animales. Hasta la fecha, se han acumulado datos exhaustivos sobre la resistencia a los antimicrobianos de más de 20.000 cepas epidémicas12. En el caso de las bacterias resistentes encontradas en el proceso de monitorización, este sistema también podría utilizarse para el cribado rápido de alto rendimiento de fagos líticos para cooperar con los agentes antimicrobianos y reducir la resistencia a los antimicrobianos. La aplicación del inoculador de matriz de 96 puntos y el convertidor de adquisición de imágenes para el cribado de lisis de fagos era una función ampliada, y no se habían aplicado otros instrumentos anteriormente en este campo.
El sistema inteligente de cribado de AST/fagos de alto rendimiento combinó AST con bacteriófagos líticos para lograr la monitorización, el control y la reducción de la resistencia a los antimicrobianos. Al mismo tiempo, el índice Lar se utilizó de forma más intuitiva y concisa para evaluar las contribuciones de diversos factores y nuevas tecnologías antibacterianas a la reducción de la RAM.
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Disclosures
Yuqing Liu et al. han presentado patentes chinas para el inoculador de matriz de 96 puntos y el convertidor de adquisición de imágenes y sus aplicaciones (número de patente ZL 201610942866.3 y número de patente ZL 201910968255.X).
Acknowledgments
Este trabajo contó con el apoyo del Proyecto Nacional de Investigación y Desarrollo Clave (2019YFA0904003); Sistema Agrícola Industrial Moderno en la Provincia de Shandong (SDAIT-011-09); Proyecto de Optimización de la Plataforma de Cooperación Internacional (CXGC2023G15); Principales tareas de innovación del proyecto de innovación científica y tecnológica agrícola de la Academia de Ciencias Agrícolas de Shandong, China (CXGC2023G03).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well culture plate | Beijing lanjieke Technology Co., Ltd | 11510 | |
| 96-dot matrix AST image acquisition system | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| 96-dot matrix inoculator | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Agar | Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd | HB8274-1 | |
| Amikacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A857053 | |
| Amoxicillin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A822839 | |
| Ampicillin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A830931 | |
| Analytical balance | Sartorius | BSA224S | |
| Automated calculation software for Lar index of AMR | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Bacteria Salmonella strains | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Animal origin |
| Bacterial resistance Lar index certification management system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Ceftiofur | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C873619 | |
| Ciprofloxacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C824343 | |
| Clavulanic acid | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C824181 | |
| Clean worktable | Suzhou purification equipment Co., Ltd | SW-CJ-2D | |
| Colistin sulfate | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C805491 | |
| Culture plate | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Doxycycline | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | D832390 | |
| Enrofloxacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | E809130 | |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SLGP033RB | |
| Florfenicol | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | F809685 | |
| Gentamicin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | G810322 | |
| Glass bottle 50 mL | Xuzhou Qianxing Glass Technology Co., Ltd | QX-7 | |
| High-throughput resistance detection system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Image acquisition converter | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Meropenem | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | M861173 | |
| Mueller-Hinton agar | Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd | HB6232 | |
| Petri dish 60 mm x 15 mm | Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd | 16021-1 | |
| Petri dish 90 mm x 15 mm | Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd | 16001-1 | |
| Salmonella phages | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | |
| Shaker incubator | Shanghai Minquan Instrument Co., Ltd | MQD-S2R | |
| Turbidimeter | Shanghai XingBai Biotechnology Co., Ltd | F-TC2015 | |
| Varms base type library system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Vertical high-pressure steam sterilizer | Shanghai Shen'an medical instrument factory | LDZX-75L | |
| Veterinary pathogen resistance testing management system | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Veterinary resistance cloud monitoring and phage control platform V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright |
References
- Ramanan, L., et al. Antimicrobial resistance-the need for global solutions. The Lancet Infectious Diseases. 13 (12), 1057-1098 (2013).
- Xiaonan, Z., Qing, Z., Thomas, S. P., Yuqing, L., Martha, R. J. C. inPhocus: Perspectives of the application of bacteriophages in poultry and aquaculture industries based on Varms in China. PHAGE: Therapy, Applications, and Research. 2 (2), 69-74 (2021).
- CLSI. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. CLSI document M100. , M100 32nd edition, Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA . (2022).
- Yuqing, L., et al. Antimicrobial Sensitivity Testing Standard of EUCAST. , China Standards Press, Beijing. (2017).
- Barnini, S., et al. A new rapid method for direct antimicrobial susceptibility testing of bacteria from positive blood cultures. BMC Microbiology. 16 (1), 185-192 (2016).
- Höring, S., Massarani, A. S., Löffler, B., Rödel, J. Rapid antimicrobial susceptibility testing in blood culture diagnostics performed by direct inoculation using the VITEK®-2 and BD PhoenixTM platforms. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (3), 471-478 (2019).
- Dupuis, G. Evaluation of the Cobasbact automated antimicrobial susceptibility testing system. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 4 (2), 119-122 (1985).
- A system of bacterial antimicrobial resistance detection and its operation method. China Patent. Liu, Y., et al. , ZL 201610942866.3 (2019).
- A high throughput test plate for screening bacteriophage of zoonotic pathogens and its application. China Patent. Liu, Y. , ZL 201910968255.X (2022).
- Adams, M. H. Bacteriophages. , Interscience Publishers, New York. (1959).
- Nair, A., Ghugare, G. S., Khairnar, K. An appraisal of bacteriophage isolation techniques from environment. Microbial Ecology. 83 (3), 519-535 (2022).
- Shandong veterinary antibiotic resistance system. , http://www.varms.cn (2023).
- Ming, H., et al. Comparison of the results of 96-dot agar dilution method and broth microdilution method. Chinese Journal of Antibiotics. 43 (6), 729-733 (2018).
- Laxminarayan, R., Klugman, K. P. Communicating trends in resistance using a drug resistance index. BMJ Open. 1 (2), e000135 (2011).
- Chen, Y., et al. Assessing antibiotic therapy effectiveness against the major bacterial pathogens in a hospital using an integrated index. Future Microbiology. 12, 853-866 (2017).
- Ciccolini, M., Spoorenberg, V., Geerlings, S. E., Prins, J. M., Grundmann, H. Using an index-based approach to assess the population-level appropriateness of empirical antibiotic therapy. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (1), 286-293 (2015).
- Yanbo, L., et al. Preliminary application of inoculation system for high-throughput drug susceptibility test. China Poultry. 42 (6), 52-57 (2020).
