Summary
Här introducerar vi principen, strukturen och instruktionen för det intelligenta antimikrobiella känslighetstestnings-/fagscreeningssystemet med hög genomströmning. Dess tillämpning illustreras genom att använda salmonella isolerad från fjäderfä i Shandong, Kina, som ett exempel. Lar-indexet beräknas och dess betydelse för bedömningen av antimikrobiell resistens diskuteras ingående.
Abstract
För att förbättra effektiviteten hos antimikrobiell resistensbestämning (AST) och screening av faghögkapacitetsscreening för resistenta bakterier och för att minska detektionskostnaden, utvecklades ett intelligent AST/fagscreeningsystem med hög kapacitet, inklusive en 96-punktsmatrisinokulator, bildinsamlingsomvandlare och motsvarande programvara, enligt AST-kriterier och brytpunkterna för resistens (R) som formulerats av Clinical & Laboratory Standards Institute (CLSI). ASAT och statistik över fördelningen av minsta hämmande koncentration (MIC) (från R/8 till 8R) för 1 500 salmonellastammar isolerade från fjäderfä i Shandong, Kina, jämfört med 10 antimikrobiella medel utfördes av det intelligenta AST/fagscreeningsystemet med hög kapacitet. Lar-indexet, som betyder "mindre antibios, mindre resistens och kvarvarande till lite antibios", erhölls genom att beräkna det viktade genomsnittet för varje MIC och dividera med R. Detta tillvägagångssätt förbättrar noggrannheten jämfört med att använda förekomsten av resistens för att karakterisera graden av antimikrobiell resistens (AMR) hos mycket resistenta stammar. För stammar av Salmonella med hög AMR screenades lytiska fager effektivt från fagbiblioteket av detta system, och lysspektrumet beräknades och analyserades. Resultaten visade att det intelligenta screeningsystemet för ASAT/med hög kapacitet var användbart, exakt, mycket effektivt, billigt och lätt att underhålla. I kombination med Shandongs veterinära system för övervakning av antimikrobiell resistens var systemet lämpligt för vetenskaplig forskning och klinisk upptäckt i samband med antimikrobiell resistens.
Introduction
Eftersom antimikrobiella medel har använts i stor utsträckning för att förebygga bakteriella infektionssjukdomar har antimikrobiell resistens blivit ett globalt folkhälsoproblem1. Att bekämpa antimikrobiell resistens är den nuvarande huvuduppgiften, nämligen att övervaka antimikrobiell resistens mot epidemiologiska patogener och synergistisk behandling av känsliga antimikrobiella medel och lytiska bakteriofager2.
In vitro-testning av antimikrobiell känslighet (AST) är grundpelaren för att övervaka behandlingen och upptäcka nivån av antimikrobiell resistens. Det är en viktig del av antimikrobiell farmakologi och den kritiska grunden för klinisk medicinering. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) i USA och European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) har formulerat och reviderat internationella kriterier för AST och kontinuerligt modifierat och kompletterat AST-metoder och brytpunkter för att bestämma MIC för en viss kombination av "organism-antimikrobiellt medel" som känslig (S), resistent (R) eller intermediär (I)3. 4. veckor
Från 1980-talet till 1990-talet utvecklades snabbt automatiska mikrobuljongspädningsinstrument och tillämpades i klinisk praxis, med exempel som Alfred 60AST, VITEK System, PHOENIXTM och Cobasbact 5,6,7. Dessa instrument var dock dyra, krävde dyra förbrukningsvaror och deras detektionsintervall var utformade för klinisk patientmedicinering 5,6,7. Av dessa skäl är de inte lämpliga för veterinärmedicinsk klinisk undersökning och påvisande av stora mängder mycket resistenta stammar. I denna studie utvecklades ett intelligent AST/fagscreeningsystem med hög kapacitet, inklusive en 96-punkts matrisinokulator (figur 1), bildinsamlingsomvandlare (figur 2) och motsvarande programvara8, för att utföra ASAT för en sats bakteriestammar mot flera antimikrobiella medel samtidigt med agarspädningsmetoden. Dessutom användes systemet också för att detektera och analysera fagers lysmönster mot antimikrobiellt resistenta bakterier9, och lytiska fager valdes effektivt från fagbiblioteket. Detta system visade sig vara effektivt, prisvärt och lätt att använda.
Figur 1: Strukturdiagram över 96-punkts matrisinokulatorn. 1: Inokuleringsstiftplatta; 2: Mobiloperatör; 3: Frö block; 4: Inkuberad platta; 5: Bas; 6: Manöverhandtag; 7: Begränsa stiftet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Strukturdiagram över bildtagningskonverteraren. 1: Skal; 2: Bildskärm; 3: Bildinsamlingsrum; 4: Detektionskortets bas; 5: Detektionstavla in och ut ur lager; 6: Styrkort; 7: Anordning för konvertering av bildinsamling; 8: Ljuskälla; 9: Bildskanner. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Salmonellastammarna som användes i denna studie samlades in från fjäderfä i Shandong, Kina, efter att ha fått godkännande från biosäkerhetskommittén vid Institute of Animal Sciences and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Kina.
1. Tillämpning av det intelligenta AST-systemet med hög kapacitet8
- Förberedelse av inokulat
- Inkubera kvalitetskontrollorganismen Escherichia coli och 93 Salmonellastammar som ska undersökas med avseende på ASAT på Mueller-Hinton-agar (MHA)plattor i 16–18 timmar vid 37 °C3.
- Bered inokulet för varje stam så att det motsvarar 0,5 McFarlands grumlighetsstandard baserat på den metod som anges i CLSI-standard3och späd sedan 10 gånger.
- Placera 200 μl steril normal koksaltlösning i den horisontella 1:abrunnen (A1) på 96-hålsplattan som negativ kontroll, två suspensioner av kvalitetskontrollorganismen i den horisontella 2:a och 3:e brunnen (A2 och A3) som positiv kontroll, respektive kvalitetskontroll. Tillsätt 200 μl av de utspädda inokulatsuspensionerna från varje testad fläck till motsvarande 93 brunnar i fröblocket med 96 brunnar.
- Beredning av antimikrobiell agarplatta
- Ställ in koncentrationsintervallen för olika testade antibakteriella medel enligt beräkningsintervallet för Lar-indexet (från 0,125R till 8R). Koncentrationerna sträcker sig från kvalitetskontrollområdet eller 0,0625R (med förbehåll för det nedre intervallet) till 8R.
OBS: Om LAR-indexet inte beräknas kan intervallet för antibiotikakoncentrationer ställas in enligt AST:s behov. - Utför ett log2-fördubblingsutspädningsschema för antibiotikalösning som börjar med en lämplig stamkoncentration baserad på den agarspädningsmetod som specificeras i CLSI-standard3.
- Sterilisera 50 ml glasflaskor som innehåller 18 ml Mueller-Hinton agarmedia. Tillsätt 2 ml av lämpliga spädningar av den antimikrobiella lösningen till 18 ml smält medium som kylts till 45–50 °C, blanda noggrant och häll i plattorna i biosäkerhetsskåpet.
- Låt agarn stelna vid rumstemperatur (RT), lämna ett mellanrum under locket på de inkuberade plattorna och blås för att torka agarytan innan inokulering.
- Märk typerna av antimikrobiella medel och koncentrationerna på baksidan av de inkuberade plattorna. Ordna de multipla inkuberade plattorna av varje antimikrobiellt medel i en stapel i log2-fördubblingsspädningsordning.
- Förbered två läkemedelsfria agarplattor som kontroller för varje antimikrobiellt medel.
- Ställ in koncentrationsintervallen för olika testade antibakteriella medel enligt beräkningsintervallet för Lar-indexet (från 0,125R till 8R). Koncentrationerna sträcker sig från kvalitetskontrollområdet eller 0,0625R (med förbehåll för det nedre intervallet) till 8R.
- Inokuleringssteg för 96-punkts matrisinokulator
- Montera den autoklaverade inokuleringsstiftplattan på stödet av en 96-punkts matrisinokulator i biosäkerhetsskåpet.
- Placera det förberedda fröblocket med testade stammar och en agar-inkuberad platta på mobilbäraren, med samma positioneringsvinkel för de två plattorna.
- Skjut den mobila bäraren så att fröblocket är direkt under inokuleringsstiftplattan.
- Tryck på manöverhandtaget, flytta inokuleringsstiftplattan nedåt och rikta de 96 stiften mot inokuleringen i 96 brunnar i fröblocket.
- Släpp manöverhandtaget med kontroll och återställ sedan inokuleringsstiftplattan under fjäderns inverkan.
- Tryck på manöverhandtaget 2-3 gånger för att röra om varje inokulum väl och doppa. Tryck och flytta bärplattan så att den inkuberade plattan är direkt under inokuleringsstiftplattan.
- Tryck på manöverhandtaget, flytta inokuleringsstiftplattan nedåt och stanna i 1-2 s för att få inokuleringsstiften att komma i kontakt med ytan på den inkuberade plattan helt.
- Släpp manöverhandtaget. Detta slutför en inokulering. Byt ut en annan inkuberad platta och fortsätt cykeln tills en grupp antimikrobiella agarplattor är färdiga.
- Byt ut en annan inokuleringsstiftplatta och fröblock och inokulera en annan grupp testade stammar. Cykla tills alla vaccinationer är avslutade.
OBS: Inokulera först en kontrollagarplatta (inget antimikrobiellt medel), sedan plattan i ordning efter läkemedelskoncentration från låg till hög, och en andra kontrollagarplatta sist för att säkerställa ingen kontaminering eller överföring av antimikrobiella medel. Inokuleringsvolymen är beroende av volymen av den naturliga depositionen av varje stift på cirka 2 μL.
- Inkubation av de antimikrobiella agarplattorna
- Inkubera de inokulerade antimikrobiella agarplattorna vid RT tills fukten i inokulatfläckarna absorberas i agar.
- Vänd plattorna upp och ner och inkubera dem i 16–20 timmar vid 37 °C för de testade stammarna för att säkerställa att de ohämmade bakterierna bildar kolonier.
- Bildinsamling och datastatistik
- Dubbelklicka på 96-punkts matris AST-bildinsamlingssystem för att öppna programmet.
- Klicka på Testinformation i aktivitetsfältet. Klicka på Ny för att skapa en ny testuppgift och fyll i informationen enligt anvisningarna, inklusive kod, namn, källa, bakterier, antal stammar, antibiotika och gradient.
- Klicka på Datainsamling > Fotografi > testobjekt för att välja den nya uppgiften som skapats. Klicka på Antibiotika för att välja namnet på antibiotikan och klicka på Gradient för att välja den initiala koncentrationen av detta antibiotikum.
- Klicka på Anslut för att ansluta till bildinsamlingskonverteraren.
- Placera motsvarande inkuberade plattor på detekteringsplattans bas med den saknade vinkeln till höger framtill för orientering och tryck in i bildinsamlingskonverteraren.
- Klicka på Samling för att hämta bilderna. Den antibiotiska gradienten hoppar automatiskt till nästa gradient. Placera nästa tallrik i tur och ordning och fortsätt att klicka på Samling tills plattorna för detta antibiotikum har samlats in.
- Klicka på Antibiotika och välj nästa uppsättning inkuberade plattor. Klicka på Gradient för att välja startgradient och gå vidare till nästa omgång av bildsamlingen.
- När du har slutfört alla samlingar klickar du på Skicka. Programmet kommer automatiskt att känna igen antalet vita pixlar som formaterats vid varje inokuleringspunkt i bilderna, avgöra om det finns kolonibildning och konvertera bilderna till MIC-värden.
- Klicka på Fråga för att få alla MIC-resultat för stammarna mot de testade antibiotika.
OBS: Det intelligenta AST-systemet med hög genomströmning är lämpligt för bestämning av MIC:er för stora partier av bakteriestammar. Testprocessen, inklusive beredning, inokulering, inkubation och resultatavläsning, tar 3 dagar. Typerna av antibiotika och MIC-detektionsintervallen kan ställas in efter respektive behov, och de viktigaste förbrukningsvarorna kan återanvändas.
- Beräkning av Lar-index
- Bestäm Lar-indexet exakt med formeln: , där:
MICi: minsta hämmande koncentration.
Intervallet för MIC-fördelningar från MIC-3 till MIC3 representerar seriella tvåfaldiga koncentrationer centrerade på R: 0,125R, 0,25R, 0,5R, R, 2R, 4R och 8R.
är 2 i, och intervallet föri är -3 till 3.
R: brytpunkterna för bakteriers resistens mot antimikrobiella medel standardiserade av CLSI.
f: MIC-frekvensfördelningen.
OBS: Det allmänna Lar-indexet är det aritmetiska medelvärdet av alla Lar-index. När Lar-indexet har beräknats avrundar du det slutliga värdet till två signifikanta siffror efter decimaltecknet.
- Bestäm Lar-indexet exakt med formeln: , där:
är 2 i, och intervallet föri är -3 till 3.2. Intelligent system för fagscreening med hög genomströmning9
- Förberedelse av fagfröblocket och dubbelskiktsinkuberade plattor som innehåller bakterier.
- Använd dubbelskiktsagarmetoden10 eller vätskeodlingsmetoden11 för att göra olika fager. Späd till en lämplig parallell koncentration med en titer på 1 x 104-5 pfu/ml och tillsätt 200 μl faginokulat i fröblocket med 96 brunnar.
- Gör dubbelskiktade plattor med bakterier (10 ml bottenagarmedia [agar 12 g/L] och 6 ml övre semiagarmedia [6 g/L] med 100 μL bakterier [0,5 McFarland]) som ska testas.
- Gör en dubbelskiktsinkuberad platta för varje stam som ska testas. Lämna en glipa under locket på den dubbelskiktade plattan och blås för att torka agarytan i biosäkerhetsskåpet.
- Screeningtest
- Placera det förberedda fagfröblocket och dubbelskiktsplattan på den mobila bäraren av 96-punktsmatrisinokulatorn och överför all faginokulering till semiagarytan. Fortsätt cyklerna tills alla testade stammar är avslutade.
- Låt de inokulerade dubbelskiktsplattorna ligga kvar vid RT tills fukten i inokulatfläckarna har absorberats helt i semiagar.
- Vänd plattorna och inkubera under lämpliga förhållanden för de testade stammarna i 4-6 timmar för att säkerställa att tydliga lytiska fläckar bildas.
- Analysera data
- Erhåll och spara bilden av det experimentella resultatet av varje dubbelskiktsplatta med hjälp av bildinsamlingskonverteraren (steg 1.5.4-1.5.6).
- Anteckna antalet och morfologierna för de olika formerna av fläckar i ett kalkylblad baserat på de erhållna bilderna och beräkna respektive proportioner av de olika typerna av fager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I enlighet med protokollet för det intelligenta AST-systemet med hög kapacitet illustrerades dess tillämpning med salmonella från fjäderfä i Shandong, Kina, som ett exempel.
Tillväxten av Salmonella-stammar på agarplattor med ampicillin (R på 32 μg/ml) vid koncentrationer från 2 till 256 μg/ml, bestämd med bildtagningsomvandlaren, visas i figur 3. Den horisontella 1:a brunnen A1 var den negativa kontrollen och visade ingen kolonitillväxt; A2 och A3 var kvalitetskontrollstammarna med MIC 4 μg/ml (som bildade en koloni på agarplattan med 2 μg/ml ampicillin, men inte på 4 μg/ml), inom kvalitetskontrollområdet som standardiserats av CLSI (2-8 μg/ml). MIC för Salmonella-stammen i A4 var 64 μg/ml, medan den för A5 var 16 μg/ml. MIC-fördelningar av 93 Salmonellastammar mot ampicillin beräknades automatiskt av programvaran.
Figur 3: Salmonellas morfologi på en serie odlingsplattor med ampicillin. 8 horisontellt: A-H, 12 vertikalt: 1-12. Klicka här för att se en större version av denna figur.
AST-systemet med hög kapacitet användes för att bestämma antimikrobiell resistens hos salmonellastammar från djur i Shandongprovinsen. MIC-data laddades upp till Varms (http://www.varms.cn/)12:s databas. De statistiska resultaten visas i tabell 1. Totalt 10 antimikrobiella medel testades mot 300-1 500 salmonellastammar , vilket visar fördelarna med detta system med hög genomströmning.
Enligt de resistenta brytpunkterna i CLSI-standarden beräknades resistansgraden (R%) som en procentandel av stammar med MIC ≥ R bland de testade stammarna (tabell 1). R%-värdena för ampicillin, ciprofloxacin och amoxicillin-klavulansyra var högre än 50 %, R%-värdena för doxycyklin, florfenikol, cefotaxim och enrofloxacin var 30-50 % och R%-värdena för gentamicin, amikacin och meropenem var mindre än 30 %. Meropenem användes inte till industriellt uppfödda djur och uppvisade en R% på 7 %.
R% indikerade andelen bakteriestammar med MIC-värden högre än R, medan MIC-fördelningar visade antalet stammar med varje MIC för att beskriva den totala AMR av Salmonella mer exakt. Till exempel var R% för ampicillin 73 %, och det maximala antalet prover (916 stammar) var koncentrerat med MIC ≥ 256 μg/ml, vilket tyder på att Salmonellas resistens mot ampicillin var ganska allvarlig.
Tabell 1: MIC-fördelningar, R% och Lar-indexvärden för Salmonella från djur i Shandongprovinsen. MIC-värden som motsvarar fetstil är R-värdena för antimikrobiella medel. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
För enhetlighet och jämförbarhet förlängdes 3 gradienter framåt och bakåt, centrerade på R för varje läkemedel. Enligt MIC-fördelningarna för sju gradienter beräknades Lar-indexet med formeln:
.
Som ett exempel för ampicillin var R-värdet 32 μg/ml, antalet prover var 1,414 och Lar = (4/32) x (245/1414) + (8/32) × (16/1414) + (16/32) × (117/1414) + (32/32) × (27/1414) + (64/32) × (36/1414) + (128/32) × (57/1414) + (256) /32) × (916/1414) = 2-3 × (245/1414) + 2-2 × (16/1414) + 2-1 × (117/1414) + 20 × (27/1414) + 21 × (36/1414) + 2 2 × (57/1414) + 2 3 × (916/1414) = 5,48. Med hjälp av denna formel beräknades Lar-index för andra antimikrobiella medel, som visas i tabell 1.
Betydelsen av Lar-indexet var att indikera svårighetsgraden av AMR på ett korrekt sätt. Om man tar ciprofloxacin och amoxicillin-klavulansyra som exempel var deras R%-värden likartade, 68 % respektive 65 %, men deras Lar-index skilde sig signifikant, 4,57 respektive 1,76. Orsaken till detta illustrerades tydligt av fördelningen av de höga MIC-värdena i tabell 1, där 71,3 % av ciprofloxacinresistenta stammar var fördelade i 8R (32 μg/ml), medan MIC-värdena för amoxicillin-klavulansyraresistenta stammar främst var koncentrerade till R och 2R, och andelen 8R var låg (8,69 %). Därför var Lar-indexet för ciprofloxacin högre än för amoxicillin-klavulansyra, vilket tyder på att andelen starkt ciprofloxacinresistenta stammar var högre än för amoxicillin-klavulansyraresistenta stammar. Lar-indexet var en mer exakt indikator på graden av AMR än resistensfrekvensen.
Enligt formeln för Lar-indexet, om MIC-värdena för alla stammar med avseende på ett visst läkemedel var R, skulle Lar-indexet vara 1; Om MIC-värdena för alla stammar var 2R skulle Lar-indexet vara 2. Därför visade Lar-indexet flera samband mellan de omfattande MIC:erna och motsvarande R-värde, med undantag för kantkoncentrationerna. Lar-indexet användes för att bedöma graden av AMR, och fördelen var mer uttalad om AMR var högre. För enhetlighet och jämförbarhet var beräkningsintervallet för Lar-indexet sju MIC-enheter med de främre och bakre 3 gradienterna centrerade på R-värdet, och det viktade genomsnittet erhölls genom att integrera de olika antimikrobiella medlen, antalet stammar och MIC-fördelningar. Därför var värdeintervallet för Lar-indexet 0,125-8. Ju närmare Lar var 0,125, desto lägre var AMR, och ju närmare 8 den var, desto högre var AMR. Det fanns dock inget proportionellt samband mellan Lar och R vid kantkoncentrationen. När de antimikrobiella medlen och beräkningsintervallet för Lar-indexet var definitiva normaliserades den allmänna Lar till ett intuitivt omfattande värde som användes för att direkt jämföra och utvärdera graden och förändringstrenden för AMR under olika förhållanden för olika bakterier, användare, år, regioner etc.
I enlighet med protokollet för det intelligenta fagscreeningsystemet demonstrerades tillämpningen genom att ta 96 fager av Salmonella för att lysera AMR-salmonellastammar som ett exempel, och faglytmönstret analyserades.
Nittiosex fager överfördes till dubbelskiktade plattor innehållande Salmonella med hjälp av en 96-punkts matrisinokulator. Morfologin hos de bildade fläckarna visas i figur 4. Det fanns fyra huvudtyper (men inte begränsat till fyra): klar rund fläck (●), placksamling (), grumlig lytisk fläck () och ingen lytisk fläck (
○).
Figur 4: Morfologi av Salmonellafläckar på agarplattor med dubbla lager. 1 och 2: mönstren som produceras av 96 fager på olika Salmonella-stammar. "●" rund fläck, "" samling av plack, "" grumlig lytisk fläck, "○" ingen lytisk fläck) Klicka här för att se en större version av denna figur.
På dubbelskiktsplattorna var de lytiska fläckarna hos olika fager på olika värdbakterier olika i morfologi10. Den "runda klara lytiska fläcken" var resultatet av en som på ett tillförlitligt sätt kunde döda värden på plattan, men som kanske eller kanske inte lyckas replikera på värdens bekostnad. I detta fall var ytterligare utspädning nödvändig för att slutgiltigt bestämma typen. "Samlingen av plaketter" utgjordes av äkta plaketter. Varje enskild lyszon producerades tydligt från ett enda smitthärd, vilket visade att fagen hade replikerat på bekostnad av bakterierna på plattan. Den "grumliga lytiska fläcken" berodde på en som inte på ett tillförlitligt sätt dödade värden på plattan och som kanske eller kanske inte lyckas replikera på värdens bekostnad. I det här fallet fanns det mer än en möjlighet, vilket krävde bekräftelse baserat på ytterligare forskningsintressen. "Ingen lytisk fläck" indikerade icke-lytisk natur.
Genom att använda detta system för preliminära tester kunde man dessutom i huvudsak avgöra om stammarna och bakteriofagerna duplicerades. Om olika Salmonella-arter valdes ut och mönstren hos två bakteriofager var identiska, tydde det på att bakteriofagerna kunde dupliceras. Om icke-repetitiva bakteriofager valdes ut för att infektera okända salmonellaarter från kliniska källor och fagmönstret var detsamma, indikerade det att salmonellastammar kan vara samma stam. Dessutom hade antalet och andelen dubbletter referensvärden för epidemiologisk undersökning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Agarspädningsmetoden är väletablerad och används i stor utsträckning. Principen för AST-systemet med hög kapacitet var agarspädningsmetoden. Ett av de kritiska stegen i protokollet var den noggranna överföringen av 96 inokulat med hög genomströmning på en gång, vilket utfördes flera gånger i rad. För att slutföra detta kritiska steg var stiften på 96-punkts matrisinokulatorn enhetliga och mycket släta. Den naturliga depositionen av varje stift var en volym på cirka 2 μL, som aggregerades till små droppar på ytan av agarmediet för att snabbt absorberas i agar, utan att flyta eller stänka för att orsaka korskontaminering. Det andra kritiska steget var den statistiska bearbetningen av stora AST-data. Med vaccinering med hög genomströmning behövde testdata fastställas och arbetsbelastningen var enorm. Den intelligenta analysen och de statistiska resultaten som producerades av den intelligenta bildinsamlingskonverteraren och den stödjande programvaran var en perfekt lösning på detta problem. AST-resultaten laddades automatiskt upp direkt till Varms-databasen. Effektiviteten och noggrannheten i tolkningen av resultaten förbättrades och de fel som orsakas av den mänskliga faktorn minskade13.
Det tredje kritiska steget var att föreslå Lar-indexet för antimikrobiell resistens. För närvarande finns det få heltäckande index för antimikrobiell resistens i världen. Enligt litteraturen beskrevs ett läkemedelsresistensindex (DRI) av Laxminarayan och Klugman för att mäta förändringar i antibiotikaeffektivitet14,15. Den kombinerade prevalensen av resistens och relativa frekvenser av förskrivning men kunde inte karakterisera graden av AMR och utvärdera förändringarna i höga läkemedelsresistensnivåer. Index för läkemedelseffektivitet (DEI)16, ett annat index som härrör från DRI, har samma nackdel som DRI. Således föreslogs Lar-indexet, som bestod av tre steg: (1) MIC-värdena för bakteriestammar normaliserades baserat på respektive R-värde, vilket eliminerade skillnaderna i antimikrobiella medel orsakade av olika R-värden i AST-standarden; (2) Enligt MIC-fördelningarna beräknades de viktade medelvärdena så att de bättre återspeglade graden av antimikrobiell resistens än resistensnivån. (3) Det aritmetiska medelvärdet av Lar-index för flera antimikrobiella medel, dvs. den allmänna Lar-nivån, skulle kunna återspegla den övergripande situationen när det gäller antimikrobiell resistens och göra det lättare att bedöma och jämföra antimikrobiell resistens på olika nivåer.
Hårdvarudesignen för dessa apparater var rimlig och enkel att använda, och alla delar fungerade smidigt. Det fanns inget störningsproblem eller fel. Utformningen av den stödjande programvaran matchade de personliga kraven för AST- och fagscreening och var lätt att använda och använda. Ett instrument var utrustat med 4-5 lådor med inokuleringsstift för flera tillämpliga scenarier för batch-bakterieöverföring. Kärnkomponenterna i detta instrument var inokuleringsstiftplattan och stiften av rostfritt stål, som kunde anpassas till en mängd olika miljöer och kunde autoklaveras, demonteras och bytas ut. Inokuleringsstiften är utformade för att kunna kombineras på vilket sätt som helst.
Det var absolut nödvändigt att inrätta ett system för övervakning av antimikrobiell resistens på grund av förekomsten av resistenta patogener som orsakas av missbruk av antibiotika. Sedan 2008 har folkhälsoteamet vid Institutet för husdjursvetenskap och veterinärmedicin, Shandong Academy of Agricultural Sciences, successivt utfört övervakning av antimikrobiell resistens hos djur i Shandongprovinsen1 2,13,17. Det var nödvändigt att effektivt upptäcka MIC-värden för patogener för att reglera användningen av antimikrobiella medel på grund av den höga nivån av veterinärresistens och den stora övervakningsvolymen. De relevanta instrumenten för AST är dock dyra, och kostnaderna för driften och förbrukningsvarorna är höga och inte lämpliga för ett brett spektrum av storskaliga jordbruk. Av denna anledning bidrog utvecklingen av det intelligenta AST-systemet med hög kapacitet och standardiseringen av dess tillämpning till att främja inrättandet av ett bra system för teknik för övervakning av antimikrobiell resistens. Enligt tidigare forskning12,13 uppnådde det intelligenta AST-systemet med hög kapacitet god repeterbarhet och stabilitet för att matcha standarden för CLSI och tillämpades på ASAT och analys av kliniskt patogena bakterier hos djur. Hittills har omfattande data om antimikrobiell resistens för mer än 20 000 epidemistammar samlats in12. För de resistenta bakterier som påträffas i övervakningsprocessen skulle detta system också kunna användas för snabb screening av lytiska fager med hög kapacitet för att samarbeta med antimikrobiella medel för att minska antimikrobiell resistens. Tillämpningen av 96-punktsmatrisinokulatorn och bildinsamlingsomvandlaren för faglysscreening var en utökad funktion, och inga andra instrument hade tidigare tillämpats inom detta område.
Det intelligenta screeningsystemet för ASAT/fager med hög kapacitet kombinerade ASAT med lytiska bakteriofager för att uppnå övervakning, kontroll och minskning av antimikrobiell resistens. Samtidigt användes Lar-indexet mer intuitivt och koncist för att utvärdera hur olika faktorer och nya antibakteriella tekniker bidrar till att minska antimikrobiell resistens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yuqing Liu et al. har lämnat in kinesiska patent för 96-punkts matrisinokulatorn och bildinsamlingskonverteraren och deras tillämpningar (patentnummer ZL 201610942866.3 och patentnummer ZL 201910968255.X).
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av det nationella nyckelforsknings- och utvecklingsprojektet (2019YFA0904003); Modernt jordbruksindustriellt system i Shandongprovinsen (SDAIT-011-09); Optimeringsprojekt för internationella samarbetsplattformar (CXGC2023G15). Stora innovationsuppgifter för jordbruksvetenskaps- och teknikinnovationsprojekt vid Academy of Agricultural Sciences Shandong, Kina (CXGC2023G03).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well culture plate | Beijing lanjieke Technology Co., Ltd | 11510 | |
| 96-dot matrix AST image acquisition system | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| 96-dot matrix inoculator | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Agar | Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd | HB8274-1 | |
| Amikacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A857053 | |
| Amoxicillin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A822839 | |
| Ampicillin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A830931 | |
| Analytical balance | Sartorius | BSA224S | |
| Automated calculation software for Lar index of AMR | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Bacteria Salmonella strains | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Animal origin |
| Bacterial resistance Lar index certification management system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Ceftiofur | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C873619 | |
| Ciprofloxacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C824343 | |
| Clavulanic acid | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C824181 | |
| Clean worktable | Suzhou purification equipment Co., Ltd | SW-CJ-2D | |
| Colistin sulfate | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C805491 | |
| Culture plate | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Doxycycline | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | D832390 | |
| Enrofloxacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | E809130 | |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SLGP033RB | |
| Florfenicol | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | F809685 | |
| Gentamicin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | G810322 | |
| Glass bottle 50 mL | Xuzhou Qianxing Glass Technology Co., Ltd | QX-7 | |
| High-throughput resistance detection system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Image acquisition converter | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Meropenem | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | M861173 | |
| Mueller-Hinton agar | Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd | HB6232 | |
| Petri dish 60 mm x 15 mm | Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd | 16021-1 | |
| Petri dish 90 mm x 15 mm | Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd | 16001-1 | |
| Salmonella phages | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | |
| Shaker incubator | Shanghai Minquan Instrument Co., Ltd | MQD-S2R | |
| Turbidimeter | Shanghai XingBai Biotechnology Co., Ltd | F-TC2015 | |
| Varms base type library system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Vertical high-pressure steam sterilizer | Shanghai Shen'an medical instrument factory | LDZX-75L | |
| Veterinary pathogen resistance testing management system | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Veterinary resistance cloud monitoring and phage control platform V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright |
References
- Ramanan, L., et al. Antimicrobial resistance-the need for global solutions. The Lancet Infectious Diseases. 13 (12), 1057-1098 (2013).
- Xiaonan, Z., Qing, Z., Thomas, S. P., Yuqing, L., Martha, R. J. C. inPhocus: Perspectives of the application of bacteriophages in poultry and aquaculture industries based on Varms in China. PHAGE: Therapy, Applications, and Research. 2 (2), 69-74 (2021).
- CLSI. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. CLSI document M100. , M100 32nd edition, Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA . (2022).
- Yuqing, L., et al. Antimicrobial Sensitivity Testing Standard of EUCAST. , China Standards Press, Beijing. (2017).
- Barnini, S., et al. A new rapid method for direct antimicrobial susceptibility testing of bacteria from positive blood cultures. BMC Microbiology. 16 (1), 185-192 (2016).
- Höring, S., Massarani, A. S., Löffler, B., Rödel, J. Rapid antimicrobial susceptibility testing in blood culture diagnostics performed by direct inoculation using the VITEK®-2 and BD PhoenixTM platforms. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (3), 471-478 (2019).
- Dupuis, G. Evaluation of the Cobasbact automated antimicrobial susceptibility testing system. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 4 (2), 119-122 (1985).
- A system of bacterial antimicrobial resistance detection and its operation method. China Patent. Liu, Y., et al. , ZL 201610942866.3 (2019).
- A high throughput test plate for screening bacteriophage of zoonotic pathogens and its application. China Patent. Liu, Y. , ZL 201910968255.X (2022).
- Adams, M. H. Bacteriophages. , Interscience Publishers, New York. (1959).
- Nair, A., Ghugare, G. S., Khairnar, K. An appraisal of bacteriophage isolation techniques from environment. Microbial Ecology. 83 (3), 519-535 (2022).
- Shandong veterinary antibiotic resistance system. , http://www.varms.cn (2023).
- Ming, H., et al. Comparison of the results of 96-dot agar dilution method and broth microdilution method. Chinese Journal of Antibiotics. 43 (6), 729-733 (2018).
- Laxminarayan, R., Klugman, K. P. Communicating trends in resistance using a drug resistance index. BMJ Open. 1 (2), e000135 (2011).
- Chen, Y., et al. Assessing antibiotic therapy effectiveness against the major bacterial pathogens in a hospital using an integrated index. Future Microbiology. 12, 853-866 (2017).
- Ciccolini, M., Spoorenberg, V., Geerlings, S. E., Prins, J. M., Grundmann, H. Using an index-based approach to assess the population-level appropriateness of empirical antibiotic therapy. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (1), 286-293 (2015).
- Yanbo, L., et al. Preliminary application of inoculation system for high-throughput drug susceptibility test. China Poultry. 42 (6), 52-57 (2020).
