Summary
여기에서는 지능형 고처리량 항균 감도 검사/파지 스크리닝 시스템의 원리, 구조 및 지침을 소개합니다. 그 응용은 중국 산둥성의 가금류에서 분리한 살모넬라균 을 예로 들어 설명합니다. Lar 지수를 계산하고 항생제 내성 평가에 대한 중요성을 종합적으로 논의합니다.
Abstract
내성 박테리아에 대한 항균제 감수성 검사(AST) 및 파지 고처리량 스크리닝의 효율성을 개선하고 검출 비용을 줄이기 위해 96도트 매트릭스 접종기, 이미지 획득 변환기 및 해당 소프트웨어를 포함한 지능형 고처리량 AST/파지 스크리닝 시스템이 AST 기준 및 CLSI(Clinical & Laboratory Standards Institute)에서 공식화한 내성(R) 중단점에 따라 개발되었습니다. 중국 산둥성의 가금류에서 분리한 1,500개의 살모넬라 균주의 최소 억제 농도(MIC) 분포(R/8에서 8R까지)와 10개의 항균제에 대한 통계는 지능형 고처리량 AST/파지 스크리닝 시스템에 의해 수행되었습니다. "항생제가 적고, 내성이 적고, 항생제가 거의 없을 때까지 잔류한다"는 의미의 Lar 지수는 각 MIC의 가중 평균을 계산하고 R로 나누어 구했습니다. 이 접근법은 내성이 강한 균주의 항생제 내성(AMR) 정도를 특성화하기 위해 내성 유병률을 사용하는 것과 비교하여 정확도를 향상시킵니다. AMR이 높은 살모넬라 균주의 경우, 이 시스템에 의해 파지 라이브러리에서 용해 파지를 효율적으로 스크리닝하고 용해 스펙트럼을 계산 및 분석했습니다. 그 결과 지능형 고처리량 AST/파지 스크리닝 시스템이 작동 가능하고, 정확하고, 매우 효율적이며, 저렴하고, 유지 관리가 용이하다는 것을 보여주었습니다. 산둥성 수의학 항생제 내성 모니터링 시스템과 결합된 이 시스템은 AMR과 관련된 과학 연구 및 임상 검출에 적합했습니다.
Introduction
세균성 전염병을 예방하기 위해 항생제가 널리 사용됨에 따라 항생제 내성(AMR)은 전 세계적인 공중 보건 문제가 되었습니다1. 항생제 내성 퇴치는 역학적 병원체의 항생제 내성 모니터링과 민감한 항균제 및 용해성 박테리오파지의 시너지 요법의 현재 주요 임무이다2.
체외 항생제 감수성 검사(AST)는 요법을 모니터링하고 항생제 내성 수치를 감지하기 위한 핵심입니다. 이는 항균 약리학의 중요한 부분이며 임상 약물의 중요한 기초입니다. 미국의 CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)와 EUCAST(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing)는 AST의 국제 기준을 공식화 및 개정하고 AST 방법 및 중단점을 지속적으로 수정 및 보완하여 특정 "유기체-항균제" 조합의 MIC를 민감성(S), 내성(R) 또는 중간체(I)로 결정합니다.3, 4입니다.
1980년대부터 1990년대까지 자동 마이크로 브로트 희석 기기가 빠르게 개발되어 임상 실습에 적용되었으며, Alfred 60AST, VITEK System, PHOENIXTM 및 Cobasbact 5,6,7 등이 그 예입니다. 그러나 이러한 기기는 고가의 소모품이 필요하고 검출 범위는 임상 환자 약물 5,6,7을 위해 설계되었습니다. 이러한 이유로 수의학 임상 검사 및 대량의 고내성 균주 검출에는 적합하지 않습니다. 이 연구에서는 96도트 매트릭스 접종기(그림 1), 이미지 획득 변환기(그림 2) 및 해당 소프트웨어8을 포함한 지능형 고처리량 AST/파지 스크리닝 시스템을 개발하여 한천 희석 방법으로 한 번에 여러 항균제에 대해 박테리아 균주 배치에 대해 AST를 수행했습니다. 또한, 이 시스템은 항생제 내성 박테리아9에 대한 파지의 용해 패턴을 검출하고 분석하는 데에도 사용되었으며, 파지 라이브러리에서 용해 파지를 효율적으로 선택했습니다. 이 시스템은 효율적이고 저렴하며 작동하기 쉬운 것으로 밝혀졌습니다.
그림 1: 96 도트 매트릭스 접종기의 구조도. 1: 접종 핀 플레이트; 2: 이동 통신사; 3 : 시드 블록; 4 : 배양 된 판; 5: 베이스; 6 : 작동 핸들; 7: 한계 핀. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 이미지 획득 컨버터의 구조도. 1: 쉘; 2 : 디스플레이 화면; 3 : 이미지 획득실; 4 : 검출 보드 베이스 ; 5: 창고 안팎의 감지 보드; 6 : 제어반 ; 7 : 영상 취득 변환 장치; 8 : 광원; 9: 이미지 스캐너. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Protocol
이 연구에 사용된 살모넬라 균주는 중국 산둥성 농업과학원 동물과학 및 수의학 연구소 생물안전위원회의 승인을 받은 후 중국 산둥성의 가금류에서 수집되었습니다.
1. 지능형 고처리량 AST 시스템 적용8
- 접종 준비
- 품질 관리 유기체 대장균과 93개의 살모넬라 균주를 배양하여 37°C에서 16-18시간 동안 Mueller-Hinton 한천(MHA) 플레이트에서 AST를 테스트합니다3.
- CLSI 표준3에 명시된 방법에 따라 0.5 McFarland 탁도 기준에 맞게 각 균주의 접종물을 준비한 후 10회 희석합니다.
- 멸균 생리식염수 200μL를 96웰 플레이트의 수평 1차 웰(A1)에 음성 대조군으로 배치하고, 품질 관리 유기체의 두 가지 현탁액을 각각 양성 대조군으로 수평 2차 및 3차 웰(A2 및 A3)에 배치하고 품질 관리를 수행합니다. 테스트된 각 염색제의 희석된 접종 현탁액 200μL를 96웰 시드 블록의 해당 93웰에 추가합니다.
- 항균 한천 플레이트의 제조
- Lar 지수의 계산 범위(0.125R에서 8R까지)에 따라 테스트한 다양한 항균제의 농도 범위를 설정합니다. 농도 범위는 품질 관리 범위 또는 0.0625R(더 낮은 범위에 따름)에서 8R입니다.
알림: Lar 지수가 계산되지 않은 경우 AST의 필요에 따라 항생제 농도 범위를 설정할 수 있습니다. - CLSI 표준3에 지정된 한천 희석 방법에 따라 적절한 스톡 농도로 시작하여 항생제 용액에 대한 log2 이중 희석 계획을 실행합니다.
- 18mL의 Mueller-Hinton 한천 배지가 들어 있는 50mL 유리병을 멸균합니다. 45-50 °C로 냉각된 용융 배지 18mL에 적절한 항균 용액 2mL를 희석하여 넣고 완전히 혼합한 다음 생물 안전 캐비닛의 플레이트에 붓습니다.
- 한천이 실온(RT)에서 응고되도록 하고 배양된 접시의 뚜껑 아래에 틈을 두고 불어서 한천 표면을 건조시킨 후 접종합니다.
- 항균제의 종류와 농도를 배양 플레이트의 뒷면에 표시하십시오. 각 항균제의 여러 배양 플레이트를 log2-doublebling 희석 순서로 스택에 배열합니다.
- 각 항균제에 대한 대조군으로 두 개의 약물이 없는 한천 플레이트를 준비합니다.
- Lar 지수의 계산 범위(0.125R에서 8R까지)에 따라 테스트한 다양한 항균제의 농도 범위를 설정합니다. 농도 범위는 품질 관리 범위 또는 0.0625R(더 낮은 범위에 따름)에서 8R입니다.
- 96 도트 매트릭스 접종기의 접종 단계
- 생물 안전 캐비닛의 96점 매트릭스 접종기 지지대에 고압멸균 접종 핀 플레이트를 설치합니다.
- 테스트된 균주와 한천 배양 플레이트가 있는 준비된 시드 블록을 두 플레이트에 대해 동일한 위치 각도로 모바일 캐리어에 놓습니다.
- 시드 블록이 접종 핀 플레이트 바로 아래에 오도록 이동 통신사를 밉니다.
- 작동 핸들을 누르고 접종 핀 플레이트를 아래로 이동한 다음 96개의 핀을 종자 블록의 96웰에 있는 접종물에 향하게 합니다.
- 제어 상태에서 작동 핸들을 놓은 다음 스프링의 작용으로 접종 핀 플레이트를 재설정합니다.
- 작동 손잡이를 2-3회 눌러 각 접종물을 잘 저어주고 담그십시오. 배양된 플레이트가 접종 핀 플레이트 바로 아래에 오도록 캐리어 플레이트를 밀고 이동합니다.
- 작동 핸들을 누르고 접종 핀 플레이트를 아래로 이동한 다음 1-2초 동안 정지하여 접종 핀이 배양 플레이트의 표면에 완전히 닿도록 합니다.
- 작동 핸들을 놓습니다. 이것으로 1회의 접종이 완료됩니다. 다른 배양 플레이트를 교체하고 한 그룹의 항균 한천 플레이트가 완성될 때까지 사이클을 계속합니다.
- 다른 접종 핀 플레이트와 시드 블록을 교체하고 테스트된 다른 균주 그룹을 접종합니다. 모든 접종이 완료될 때까지 순환합니다.
알림: 대조군 한천 플레이트(항균제 없음)를 먼저 접종한 다음 약물 농도가 낮은 것부터 높은 것까지 플레이트를 접종하고 두 번째 대조군 한천 플레이트를 마지막에 접종하여 오염 또는 항균제 이월이 없도록 합니다. 접종 부피는 약 2μL의 각 핀의 자연 증착 부피에 의존합니다.
- 항균 한천 플레이트 배양
- 접종 지점의 수분이 한천에 흡수될 때까지 접종된 항균 한천 플레이트를 RT에서 배양합니다.
- 플레이트를 뒤집고 테스트된 균주에 대해 37°C에서 16-20시간 동안 배양하여 억제되지 않은 박테리아가 콜로니를 형성하도록 합니다.
- 이미지 수집 및 데이터 통계
- 96 도트 매트릭스 AST 이미지 수집 시스템을 두 번 클릭하여 프로그램을 엽니다.
- 작업 표시줄에서 테스트 정보를 클릭합니다. 새로 만들기 를 클릭하여 새 테스트 작업을 만들고 프롬프트에 따라 코드, 이름, 출처, 박테리아, 균주 수, 항생제 및 그래디언트를 포함한 정보를 입력합니다.
- 데이터 수집> 사진 > 테스트 항목을 클릭하여 생성된 새 작업을 선택합니다. 항생제(Antibiotics)를 클릭하여 항생제의 이름을 선택하고 그라데이션(Gradient)을 클릭하여 이 항생제의 초기 농도를 선택합니다.
- Connect( 연결 )를 클릭하여 이미지 획득 변환기와 연결합니다.
- 해당 배양된 플레이트를 검출 플레이트 베이스에 놓고 방향을 위해 오른쪽 전면에 누락된 각도를 두고 이미지 획득 변환기에 밀어 넣습니다.
- 컬렉션을 클릭하여 이미지를 가져옵니다. 항생제 그라데이션은 자동으로 다음 그라데이션으로 이동합니다. 다음 플레이트를 차례로 놓고 이 항생제의 플레이트가 수집될 때까지 수집을 계속 클릭합니다.
- Antibiotics(항생제)를 클릭하고 다음 배양 플레이트 세트를 선택합니다. 그라디언트를 클릭하여 시작 그라디언트를 선택하고 이미지 컬렉션의 다음 라운드로 진행합니다.
- 모든 수집을 완료한 후 제출을 클릭합니다. 이 프로그램은 이미지의 각 접종 지점에서 포맷된 흰색 픽셀의 수를 자동으로 인식하고 콜로니 형성이 있는지 확인하고 이미지를 MIC 값으로 변환합니다.
- Query( 쿼리 )를 클릭하면 테스트된 항생제에 대한 균주의 모든 MIC 결과를 얻을 수 있습니다.
참고: 지능형 고처리량 AST 시스템은 대규모 박테리아 균주의 MIC를 결정하는 데 적합합니다. 준비, 접종, 배양 및 결과 판독을 포함한 테스트 과정은 3일이 소요됩니다. 항생제의 종류와 MIC 검출 범위는 각각의 필요에 따라 설정할 수 있으며 주요 소모품을 재사용할 수 있습니다.
- Lar 지수 계산
- 다음 공식을 사용하여 Lar 지수를 정확하게 결정하십시오.
MICi: 최소 억제 농도.
MIC-3에서 MIC3까지의 MIC 분포 범위는 R을 중심으로 한 직렬 2중 농도(0.125R, 0.25R, 0.5R, R, 2R, 4R 및 8R)를 나타냅니다.
는 2 i이고,i의 범위는 -3 내지 3이다.
R : CLSI에 의해 표준화 된 항균제에 대한 박테리아의 내성 중단 점.
f: MIC 주파수 분포.
참고: 일반 Lar 지수는 모든 Lar 지수의 산술 평균입니다. Lar 지수를 계산한 후 최종 값을 소수점 뒤의 유효 두 자리로 반올림합니다.
- 다음 공식을 사용하여 Lar 지수를 정확하게 결정하십시오.
는 2 i이고,i의 범위는 -3 내지 3이다.2. 지능형 고처리량 파지 스크리닝 시스템9
- 파지 종자 블록과 박테리아를 포함하는 이중층 배양 플레이트를 준비합니다.
- 다른 파지를 만들기 위해 이중층 한천 방법10 또는 액체 배양 방법11 을 사용하십시오. 1 x 104-5 pfu/mL의 역가를 사용하여 적절한 병렬 농도로 희석하고 200μL의 파지 접종물을 96웰 종자 블록에 추가합니다.
- 테스트할 박테리아(10mL의 하단 한천 배지[한천 12g/L] 및 6mL의 상부 세미 한천 배지[6g/L]와 100μL의 박테리아[0.5 McFarland])가 있는 이중층 플레이트를 만듭니다.
- 테스트할 각 균주에 대해 이중층 배양 플레이트를 만듭니다. 이중층 플레이트의 뚜껑 아래에 틈을 두고 불어서 생물 안전 캐비닛의 한천 표면을 건조시킵니다.
- 선별 검사
- 준비된 파지 종자 블록과 이중층 플레이트를 96점 매트릭스 접종기의 이동 캐리어에 놓고 모든 파지 접종물을 반한천 표면으로 옮깁니다. 테스트된 모든 균주가 완료될 때까지 사이클을 계속합니다.
- 접종 부위의 수분이 반 한천에 완전히 흡수 될 때까지 접종 된 이중층 플레이트를 RT에 유지하십시오.
- 플레이트를 뒤집고 4-6시간 동안 테스트된 균주에 적합한 조건에서 배양하여 명확한 용해 반점이 형성되도록 합니다.
- 데이터 분석
- 이미지 획득 변환기(1.5.4-1.5.6단계)를 사용하여 각 이중층 플레이트의 실험 결과 이미지를 얻고 저장합니다.
- 획득한 이미지를 기반으로 다양한 모양의 반점의 수와 형태를 스프레드시트에 기록하고 다양한 종류의 파지의 각 비율을 계산합니다.
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Representative Results
지능형 고처리량 AST 시스템의 프로토콜에 따라 중국 산둥성 가금류의 살모넬라균 을 예로 들 수 있습니다.
이미지 획득 변환기에 의해 측정된 2 - 256 μg/mL 농도에서 암피실린(R 32 μg/mL)이 포함된 한천 플레이트에서 살모넬라 균주의 성장은 그림 3에 나와 있습니다. 수평 1st웰 A1은 음성 대조군이었고 콜로니 성장을 보여주지 않았습니다. A2 및 A3은 CLSI(2-8μg/mL)에 의해 표준화된 품질 관리 범위 내에서 MIC 4μg/mL(2μg/mL 암피실린으로 한천 플레이트에 콜로니를 형성하지만 4μg/mL의 암피실린에는 형성되지 않음)를 사용한 품질 관리 균주였습니다. A4의 살모넬라 균주의 MIC는 64μg/mL인 반면, A5의 MIC는 16μg/mL였습니다. 암피실린에 대한 93개의 살모넬라 균주의 MIC 분포는 소프트웨어에 의해 자동으로 계산되었습니다.
그림 3: 암피실린이 있는 일련의 배양 플레이트에서 살모넬라균의 형태. 8 수평: AH, 12 수직: 1-12. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
고처리량 AST 시스템은 산둥성의 동물에서 추출한 살모넬라 균주의 AMR을 측정하기 위해 적용되었습니다. MIC 데이터는 Varms (http://www.varms.cn/)12의 데이터베이스에 업로드되었습니다. 통계 결과를 표 1에 나타내었다. 총 10개의 항균제가 300-1,500개의 살모넬라 균주에 대해 테스트되어 이 시스템의 고처리량 이점을 보여주었습니다.
CLSI 표준의 내성 중단점에 따라 저항률(R%)은 테스트된 균주 중 MIC ≥ R이 있는 균주의 백분율로 계산되었습니다(표 1). 암피실린, 시프로플록사신, 아목시실린-클라불란산의 R%값은 50% 이상, 독시사이클린, 플로르페니콜, 세포탁심, 엔로플록사신의 R%값은 30%-50%, 겐타마이신, 아미카신, 메로페넴의 R%값은 30% 미만이었다. 메로페넴은 산업적으로 사육된 동물에 사용되지 않았으며 7%의 R%를 보였다.
R%는 MIC가 R보다 높은 박테리아 균주의 비율을 나타내는 반면, MIC 분포는 살모넬라 균의 전체 AMR을 보다 정확하게 설명하기 위해 각 MIC의 균주 수를 나타냅니다. 예를 들어, 암피실린의 R%는 73%였고, 최대 샘플 수(916개 균주)는 256μg/mL≥ MIC로 농축되어 암피실린에 대한 살모넬라 균의 내성이 상당히 심각했음을 나타냅니다.
표 1: 산둥성 동물의 살모넬라균 의 MIC 분포, R% 및 Lar 지수 값. 굵은 글꼴에 해당하는 MIC는 항균제의 R 값입니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
균일성과 비교성을 위해 각 약물의 R을 중심으로 3개의 그래디언트를 앞뒤로 확장했습니다. 7개의 기울기의 MIC 분포에 따르면 Lar 지수는 다음 공식으로 계산되었습니다.
.
암피실린의 예를 들어, R-값은 32μg/mL이고, 샘플 수는 1,1,입니다. 414, 그리고 Lar = (4/32) x (245/1414) + (8/32) × (16/1414) + (16/32) × (117/1414) + (32/32) × (27/1414) + (64/32) × (36/1414) + (128/32) × (57/1414) + (256) /32) × (916/1414) = 2-3 × (245/1414) + 2-2 × (16/1414) + 2-1 × (117/1414) + 20 × (27/1414) + 21 × (36/1414) + 2 2× (57/1414) + 2 3 × (916/1414) = 5.48입니다. 이 공식에 의해, 다른 항균제의 Lar 지수를 계산하였고, 표 1에 나타내었다.
Lar 지수의 중요성은 AMR의 심각도 정도를 정확하게 나타내는 것입니다. 시프로플록사신과 아목시실린-클라불란산을 예로 들면, R% 값은 각각 68%와 65%로 비슷했지만, Lar 지수는 각각 4.57과 1.76으로 크게 달랐습니다. 그 이유는 표 1에서 높은 MIC 값의 분포에 의해 명확하게 설명되었는데, 시프로플록사신 내성 균주의 71.3%가 8R(32μg/mL)에 분포한 반면, 아목시실린-클라불란산 내성 균주의 MIC는 대부분 R과 2R에 집중되어 8R의 비율이 낮았다(8.69%). 따라서, 시프로플록사신의 Lar 지수는 아목시실린-클라불란산의 Lar 지수보다 높았으며, 이는 시프로플록사신 내성이 높은 균주의 비율이 아목시실린-클라불란산 내성 균주의 비율보다 높다는 것을 나타낸다. Lar 지수는 저항률보다 AMR의 정도를 더 정확하게 나타내는 지표였습니다.
Lar 지수의 공식에 따르면 특정 약물에 대한 모든 균주의 MIC가 R이면 Lar 지수는 1이 됩니다. 모든 균주의 MIC가 2R인 경우 Lar 지수는 2가 됩니다. 따라서 Lar 지수는 에지 농도를 제외하고 포괄적인 MIC와 해당 R 값 간의 여러 관계를 보여주었습니다. Lar 지수는 AMR의 정도를 평가하는 데 사용되었으며, AMR이 높을수록 이점이 더 두드러졌습니다. 균일성 및 비교성을 위해 Lar 지수의 계산 범위는 R값을 중심으로 전방 및 후방 3개의 기울기를 갖는 7개의 MIC였으며, 가중 평균은 서로 다른 항균제, 균주 수 및 MIC 분포를 통합하여 구했습니다. 따라서 Lar 지수의 값 범위는 0.125-8입니다. Lar가 0.125에 가까울수록 AMR이 낮아지고 8에 가까울수록 AMR이 높습니다. 그러나 가장자리 농도에서 Lar와 R 사이에는 비례 관계가 없었습니다. 항균제와 Lar 지수의 계산 범위가 명확할 때, 일반적인 Lar는 박테리아, 사용자, 연도, 지역 등의 다양한 조건에서 AMR의 정도와 변화 경향을 직접 비교하고 평가하는 데 사용되는 직관적인 종합 값으로 정규화되었습니다.
지능형 파지 스크리닝 시스템의 프로토콜에 따라 AMR 살모넬라 균주를 용해하기 위해 살모넬라균 96파지를 예로 들어 적용을 시연하고 파지 용해 패턴을 분석했습니다.
96개의 파지를 96도트 매트릭스 접종기에 의해 살모넬라균을 함유한 이중층 플레이트로 옮겼습니다. 형성된 반점의 형태는 그림 4에 나와 있습니다. 크게 4가지 유형(4가지에 한정되지는 않지만)이 있었는데, 맑은 둥근 반점(●), 플라크의 집합(), 탁한 용해 반점(), 용해 반점이 없는 것(
○)이 있습니다.
그림 4: 이중층 한천 플레이트의 살모넬라 반점의 형태. 1 및 2: 서로 다른 살모넬라 균주에 대한 96개의 파지에 의해 생성된 패턴. "●"둥근 맑은 반점, ""플라크 모음", "혼탁한 용해 반점", "○"용해 반점 없음)이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이중층 플레이트에서, 상이한 숙주 박테리아에 대한 상이한 파지의 용해 반점은 형태학적으로 다양하였다10. "둥글고 맑은 용해 반점"은 플레이트에서 숙주를 안정적으로 죽일 수 있지만 숙주의 비용으로 성공적으로 복제할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있는 파지에서 비롯되었습니다. 이 경우 유형을 결정적으로 결정하기 위해 추가 희석이 필요했습니다. "명패 수집"은 진정한 명판에 의해 형성되었습니다. 용해의 각 개별 영역은 단일 감염 센터에서 명확하게 생성되었으며, 이는 파지가 플레이트의 박테리아를 희생시켜 복제되었음을 보여주었습니다. "탁한 용해 반점"은 플레이트의 숙주를 안정적으로 죽이지 않고 숙주의 비용으로 성공적으로 복제할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있는 파지로 인해 발생합니다. 이 경우 하나 이상의 가능성이 있으므로 추가 연구 관심사에 따라 확인이 필요했습니다. "용해 반점 없음"은 비용해 특성을 나타냅니다.
더욱이, 예비 테스트를 위해 이 시스템을 사용하면 균주와 박테리오파지가 복제되었는지 여부를 본질적으로 결정할 수 있습니다. 서로 다른 살모넬라 종을 선택하고 두 박테리오파지의 패턴이 동일하다면 박테리오파지가 복제될 수 있음을 나타냅니다. 임상적 원인에서 알려지지 않은 살모넬라 종을 감염시키기 위해 비반복적 박테리오파지를 선택하고 파지 패턴이 동일하다면 살모넬라 균주가 동일한 균주일 수 있음을 나타냅니다. 또한 중복의 수와 비율은 역학조사를 위한 기준값을 가졌다.
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Discussion
한천 희석 방법은 잘 확립되어 널리 사용되고 있습니다. 고처리량 AST 시스템의 원리는 한천 희석 방법의 원리였습니다. 프로토콜 내에서 중요한 단계 중 하나는 한 번에 96개의 접종물을 정확하게 고처리량으로 이전하는 것이었고, 이는 연속으로 여러 번 수행되었습니다. 이 중요한 단계를 완료하기 위해 96 도트 매트릭스 접종기의 핀은 균일하고 매우 매끄러웠습니다. 각 핀의 자연 증착은 약 2μL의 부피였으며, 이는 한천 매체 표면의 작은 물방울로 응집되어 한천으로 빠르게 흡수되어 흐르거나 튀어 교차 오염을 일으키지 않았습니다. 두 번째 중요한 단계는 대규모 AST 데이터의 통계적 처리였습니다. 고처리량 접종의 경우 테스트 데이터를 결정해야 했고 작업량도 엄청났습니다. 지능형 이미지 수집 컨버터 및 지원 소프트웨어에 의해 생성된 지능형 분석 및 통계 결과는 이 문제에 대한 완벽한 솔루션이었습니다. AST 결과는 자동으로 Varms 데이터베이스에 직접 업로드되었습니다. 결과 해석의 효율성과 정확성이 향상되고 인적 요인으로 인한 오류가 감소했습니다13.
세 번째 중요한 단계는 AMR의 Lar 지수를 제안하는 것이었습니다. 현재 전 세계적으로 AMR에 대한 종합 평가 지표는 거의 없습니다. 문헌에 따르면, 항생제 효과의 변화를 측정하기 위해 Laxminarayan과 Klugman에 의해 약물 내성 지수(DRI)가 기술되었습니다14,15. 내성 유병률과 처방의 상대적 빈도를 결합했지만 항생제 내성의 정도를 특성화하고 높은 약물 내성 수준의 변화를 평가할 수 없었습니다. DRI에서 파생된 또 다른 지수인 약물 유효성 지수(DEI)16은 DRI와 동일한 단점이 있습니다. 따라서, 세 단계로 구성된 Lar 지수가 제안되었습니다 : (1) 박테리아 균주의 MIC는 각각의 R- 값을 기반으로 정규화되어 AST 표준의 다른 R 값으로 인한 항균제의 차이를 제거했습니다. (2) MIC 분포에 따라 가중 평균값은 저항률보다 AMR의 정도를 더 정확하게 반영하도록 계산되었습니다. (3) 여러 항균제의 Lar 지수의 산술 평균, 즉 일반적인 Lar는 AMR의 포괄적인 상황을 반영할 수 있어 다양한 수준에서 AMR의 평가 및 비교에 편리함을 제공합니다.
이 장치의 하드웨어 설계는 합리적이고 작동이 간단했으며 모든 부품이 원활하게 작동했습니다. 걸림 문제나 결함이 없었습니다. 지원 소프트웨어의 설계는 AST 및 파지 스크리닝의 개인화된 요구 사항과 일치했으며 작동 및 사용이 쉬웠습니다. 하나의 기기에는 배치 박테리아 이동의 여러 적용 가능한 시나리오를 위해 4-5개의 접종 핀 상자가 장착되었습니다. 이 기기의 핵심 구성 요소는 다양한 환경에 적응할 수 있고 고압멸균, 분해 및 교체가 가능한 스테인리스강으로 만든 접종 핀 플레이트와 핀이었습니다. 접종 핀은 어떤 식으로든 결합되도록 설계되었습니다.
항생제 오용으로 인한 내성 병원체의 만연으로 인해 AMR 모니터링 시스템을 구축하는 것이 필수적이었습니다. 2008년부터 산둥성 농업과학원 축산수의학연구소 공중보건팀은 산둥성1 2,13,17에서 연속적으로 동물에 대한 AMR 모니터링을 실시했다. 항균제의 사용을 조절하기 위해 병원체의 MIC를 효율적으로 검출하는 것이 필요했는데, 이는 높은 수준의 수의학적 내성과 대규모 모니터링 볼륨으로 인해 필요했습니다. 그러나 AST용 관련 기기는 비싸고 운영 및 소모품 비용이 높으며 광범위한 대규모 농장에는 적합하지 않습니다. 이러한 이유로, 지능형 고처리량 AST 시스템의 개발과 그 적용의 표준화는 AMR 모니터링 기술을 위한 사운드 시스템의 구축을 촉진하는 데 도움이 되었습니다. 선행 연구12,13에 따르면, 지능형 고처리량 AST 시스템은 CLSI의 표준에 부합하는 우수한 반복성과 안정성을 달성했으며 AST 및 동물의 임상 병원성 박테리아 분석에 적용되었습니다. 현재까지 20,000개 이상의 전염병 균주에 대한 포괄적인 AMR 데이터가 축적되었습니다12. 모니터링 공정에서 발견되는 내성 박테리아의 경우, 이 시스템은 항균제와 협력하여 AMR을 줄이기 위해 용해 파지의 신속한 고처리량 스크리닝에도 사용할 수 있습니다. 파지 용해 스크리닝을 위한 96도트 매트릭스 접종기와 이미지 획득 변환기의 적용은 확장된 기능이었으며, 이전에는 이 분야에 다른 기기가 적용되지 않았습니다.
지능형 고처리량 AST/파지 스크리닝 시스템은 AST와 용해성 박테리오파지를 결합하여 AMR 모니터링, 제어 및 감소를 달성했습니다. 동시에 Lar 지수는 AMR 감소에 대한 다양한 요인과 새로운 항균 기술의 기여도를 평가하기 위해 보다 직관적이고 간결하게 사용되었습니다.
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Disclosures
Yuqing Liu et al.은 96도트 매트릭스 접종기 및 이미지 획득 컨버터 및 그 응용 분야에 대한 중국 특허를 출원했습니다(특허 번호 ZL 201610942866.3 및 특허 번호 ZL 201910968255.X).
Acknowledgments
이 작업은 국가 핵심 연구 개발 프로젝트(2019YFA0904003)의 지원을 받았습니다. 산동성의 현대 농업 산업 시스템(SDAIT-011-09); 국제 협력 플랫폼 최적화 프로젝트 (CXGC2023G15); 중국 산둥성 농업과학원 농업과학기술혁신사업의 주요혁신과제(CXGC2023G03).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well culture plate | Beijing lanjieke Technology Co., Ltd | 11510 | |
| 96-dot matrix AST image acquisition system | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| 96-dot matrix inoculator | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Agar | Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd | HB8274-1 | |
| Amikacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A857053 | |
| Amoxicillin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A822839 | |
| Ampicillin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A830931 | |
| Analytical balance | Sartorius | BSA224S | |
| Automated calculation software for Lar index of AMR | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Bacteria Salmonella strains | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Animal origin |
| Bacterial resistance Lar index certification management system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Ceftiofur | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C873619 | |
| Ciprofloxacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C824343 | |
| Clavulanic acid | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C824181 | |
| Clean worktable | Suzhou purification equipment Co., Ltd | SW-CJ-2D | |
| Colistin sulfate | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C805491 | |
| Culture plate | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Doxycycline | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | D832390 | |
| Enrofloxacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | E809130 | |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SLGP033RB | |
| Florfenicol | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | F809685 | |
| Gentamicin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | G810322 | |
| Glass bottle 50 mL | Xuzhou Qianxing Glass Technology Co., Ltd | QX-7 | |
| High-throughput resistance detection system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Image acquisition converter | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Meropenem | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | M861173 | |
| Mueller-Hinton agar | Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd | HB6232 | |
| Petri dish 60 mm x 15 mm | Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd | 16021-1 | |
| Petri dish 90 mm x 15 mm | Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd | 16001-1 | |
| Salmonella phages | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | |
| Shaker incubator | Shanghai Minquan Instrument Co., Ltd | MQD-S2R | |
| Turbidimeter | Shanghai XingBai Biotechnology Co., Ltd | F-TC2015 | |
| Varms base type library system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Vertical high-pressure steam sterilizer | Shanghai Shen'an medical instrument factory | LDZX-75L | |
| Veterinary pathogen resistance testing management system | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Veterinary resistance cloud monitoring and phage control platform V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright |
References
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