Summary
Her introduserer vi prinsippet, strukturen og instruksjonen til det intelligente antimikrobielle følsomhetstestings- / fagscreeningssystemet med høy gjennomstrømning. Dens søknad er illustrert ved å bruke Salmonella isolert fra fjærfe i Shandong, Kina, som et eksempel. Lar-indeksen beregnes, og dens betydning for evaluering av antibiotikaresistens diskuteres grundig.
Abstract
For å forbedre effektiviteten av antimikrobiell følsomhetstesting (AST) og høy gjennomstrømningsscreening for resistente bakterier og for å redusere deteksjonskostnadene, ble et intelligent ASAT / screeningsystem med høy gjennomstrømning, inkludert en 96-punkts matriseinokulator, bildeoppkjøpsomformer og tilhørende programvare, utviklet i henhold til AST-kriterier og brytningspunktene for motstand (R) formulert av Clinical & Laboratory Standards Institute (CLSI). AST og statistikk over minste hemmende konsentrasjon (MIC) distribusjoner (fra R / 8 til 8R) på 1,500 Salmonella-stammer isolert fra fjærfe i Shandong, Kina, mot 10 antimikrobielle midler ble utført av det intelligente høykapasitets ASAT / screeningssystemet. Lar-indeksen, som betyr "mindre antibiose, mindre resistens og rest til lite antibiose", ble oppnådd ved å beregne det vektede gjennomsnittet av hver MIC og dividere med R. Denne tilnærmingen forbedrer nøyaktigheten sammenlignet med å bruke forekomsten av resistens for å karakterisere antimikrobiell resistens (AMR) grad av svært resistente stammer. For stammer av Salmonella med høy AMR ble lytiske fager effektivt screenet fra fagbiblioteket av dette systemet, og lysispekteret ble beregnet og analysert. Resultatene viste at det intelligente AST / fagscreeningssystemet med høy gjennomstrømning var operativt, nøyaktig, svært effektivt, billig og enkelt å vedlikeholde. Kombinert med Shandong veterinære antimikrobielle resistensovervåkingssystem, var systemet egnet for vitenskapelig forskning og klinisk deteksjon relatert til AMR.
Introduction
Siden antimikrobielle midler har vært mye brukt for å forebygge bakterielle infeksjonssykdommer, har antimikrobiell resistens (AMR) blitt et globalt folkehelseproblem1. Bekjempelse av AMR er den nåværende hovedoppgaven med å overvåke AMR av epidemiologiske patogener og synergistisk terapi av sensitive antimikrobielle midler og lytiske bakteriofager2.
In vitro testing av antimikrobiell følsomhet (ASAT) er bærebjelken for å overvåke behandling og oppdage AMR-nivå. Det er en viktig del av antimikrobiell farmakologi og det kritiske grunnlaget for klinisk medisinering. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) i USA og European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) har formulert og revidert internasjonale kriterier for AST og kontinuerlig modifisert og supplert AST-metoder og brytningspunktene for å bestemme MIC for en bestemt "organisme-antimikrobiell middel" -kombinasjon som sensitiv (S), resistent (R) eller mellomliggende (I) 3, 4.
Fra 1980-tallet til 1990-tallet ble automatiske mikrobuljongfortynningsinstrumenter raskt utviklet og brukt i klinisk praksis, med eksempler som Alfred 60AST, VITEK System, PHOENIXTM og Cobasbact 5,6,7. Imidlertid var disse instrumentene dyre, krevde høye forbruksvarer, og deres deteksjonsområder ble designet for klinisk pasientmedisin 5,6,7. Av disse grunner er de ikke egnet for veterinær klinisk undersøkelse og påvisning av store mengder svært resistente stammer. I denne studien ble et intelligent ASAT/fagscreeningssystem med høy gjennomstrømning, inkludert en 96-punkts matriseinokulator (figur 1), bildeinnsamlingsomformer (figur 2) og tilsvarende programvare8, utviklet for å utføre AST for en gruppe bakteriestammer mot flere antimikrobielle midler samtidig ved agarfortynningsmetoden. Videre ble systemet også brukt til å oppdage og analysere lysismønstre av fager mot antimikrobielle resistente bakterier9, og lytiske fager ble valgt effektivt fra fagbiblioteket. Dette systemet ble funnet å være effektivt, rimelig og enkelt å betjene.
Figur 1: Strukturdiagram over 96-punkts matriseinokulatoren. 1: Inokulasjonspinneplate; 2: Mobiloperatør; 3: Frø blokk; 4: Inkubert plate; 5: Base; 6: Betjeningshåndtak; 7: Begrens pinnen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Strukturdiagram over bildeinnsamlingsomformeren. 1: Skall; 2: Skjerm; 3: Bildeoppkjøpsrom; 4: Deteksjon bord base; 5: Deteksjonstavle inn og ut av lager; 6: Kontrolltavle; 7: Konverteringsenhet for bildeoppkjøp; 8: Lyskilde; 9: Bildeskanner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Salmonella-stammene som ble brukt i denne studien ble samlet inn fra fjærfe i Shandong, Kina, etter å ha fått godkjenning fra Biosafety Committee ved Institutt for dyrevitenskap og veterinærmedisin, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Kina.
1. Anvendelse av det intelligente AST-systemet med høy gjennomstrømning8
- Inokulum forberedelse
- Inkubere kvalitetskontrollorganismen Escherichia coli og 93 Salmonella-stammer som skal testes for AST på Mueller-Hinton agar (MHA) plater i 16-18 timer ved 37 ° C3.
- Forbered inokulumet for hver stamme slik at den samsvarer med 0,5 McFarland turbiditetsstandard basert på metoden spesifisert i CLSI-standarden3og fortynn deretter 10 ganger.
- Plasser 200 μL sterilt normalt saltvann i den horisontale 1. brønnen (A1) på 96-brønnsplaten som negativ kontroll, to suspensjoner av kvalitetskontrollorganismen i henholdsvis de horisontale 2. og 3. brønnene (A2 og A3) som den positive kontrollen, og kvalitetskontroll. Tilsett 200 μL av de fortynnede inokulumsuspensjonene av hver testet flekk i de tilsvarende 93 brønnene i 96-brønns frøblokken.
- Fremstilling av antimikrobiell agarplate
- Angi konsentrasjonsområdene for forskjellige antibakterielle midler testet i henhold til beregningsområdet for Lar-indeksen (fra 0, 125R til 8R). Konsentrasjonene varierer fra kvalitetskontrollområdet eller 0,0625R (underlagt det nedre området) til 8R.
MERK: Hvis Lar-indeksen ikke beregnes, kan rekkevidden av antibiotikakonsentrasjoner settes i henhold til ASATs behov. - Utfør et log2-doblingsfortynningsskjema for antibiotikaoppløsning som begynner med en passende stamkonsentrasjon basert på agarfortynningsmetoden spesifisert i CLSI-standarden3.
- Steriliser 50 ml glassflasker inneholdende 18 ml Mueller-Hinton agar media. Tilsett 2 ml passende fortynning av den antimikrobielle oppløsningen til 18 ml smeltede medier avkjølt til 45-50 °C, bland godt og hell i platene i biosikkerhetsskapet.
- La agar størkne ved romtemperatur (RT), la det være et gap under lokket på inkuberte plater og blås for å tørke agaroverflaten før inokulering.
- Merk typer antimikrobielle midler og konsentrasjoner på baksiden av de inkuberte platene. Ordne de flere inkuberte platene av hvert antimikrobielt middel i en stabel i log2-dobling fortynningsrekkefølge.
- Forbered to stofffrie agarplater som kontroller for hvert antimikrobielt middel.
- Angi konsentrasjonsområdene for forskjellige antibakterielle midler testet i henhold til beregningsområdet for Lar-indeksen (fra 0, 125R til 8R). Konsentrasjonene varierer fra kvalitetskontrollområdet eller 0,0625R (underlagt det nedre området) til 8R.
- Inokuleringstrinn for 96-punkts matriseinokulator
- Monter den autoklaverte inokulasjonsstiftplaten på støtten til en 96-punkts matriseinokulator i biosikkerhetsskapet.
- Plasser den tilberedte frøblokken med testede stammer og en agar-inkubert plate på mobilbæreren, med samme posisjoneringsvinkel for de to platene.
- Skyv mobiloperatøren slik at frøblokken er rett under inokulasjonsstiftplaten.
- Trykk på betjeningshåndtaket, flytt inokulasjonsstiftplaten ned og rett de 96 pinnene til inokulaen i 96 brønner i frøblokken.
- Slipp betjeningshåndtaket med kontroll, og tilbakestill deretter inokulasjonsstiftplaten under fjærens handling.
- Trykk betjeningshåndtaket 2-3 ganger for å røre hver inokulum godt og dypp. Skyv og flytt bæreplaten slik at den inkuberte platen er rett under inokulasjonsstiftplaten.
- Trykk på betjeningshåndtaket, flytt inokulasjonsstiftplaten ned og stopp i 1-2 s for å få inokulasjonspinnene til å kontakte overflaten på den inkuberte platen helt.
- Slipp betjeningshåndtaket. Dette fullfører en inokulasjon. Bytt ut en annen inkubert plate og fortsett syklusen til en gruppe antimikrobielle agarplater er ferdig.
- Bytt ut en annen inokulasjonsstiftplate og frøblokk, og inokuler en annen gruppe testede stammer. Syklus til alle inokulasjoner er fullført.
MERK: Inokuler en kontroll-agarplate (ingen antimikrobielt middel) først, deretter platen i rekkefølge av legemiddelkonsentrasjon fra lav til høy, og en andre kontrollagarplate sist for å sikre ingen forurensning eller overføring av antimikrobielt middel. Inokuleringsvolumet er avhengig av volumet av den naturlige avsetningen av hver pinne på ca. 2 μL.
- Inkubering av de antimikrobielle agarplatene
- Inkuber de inokulerte antimikrobielle agarplatene ved RT til fuktigheten i inokulumflekkene absorberes i agar.
- Inverter platene og inkuber dem i 16-20 timer ved 37 ° C for de testede stammene for å sikre at de uhemmede bakteriene danner kolonier.
- Bildeinnsamling og datastatistikk
- Dobbeltklikk på 96-punkts matrise AST image acquisition system for å åpne programmet.
- Klikk på Testinformasjon på oppgavelinjen. Klikk på Ny for å opprette en ny testoppgave, og fyll ut informasjonen i henhold til instruksjonene, inkludert kode, navn, kilde, bakterier, antall stammer, antibiotika og gradient.
- Klikk på Datainnsamling > Fotografi > Testelement for å velge den nye oppgaven som er opprettet. Klikk på Antibiotika for å velge navnet på antibiotika, og klikk på Gradient for å velge den opprinnelige konsentrasjonen av dette antibiotika.
- Klikk på Koble til for å koble til bildeoppkjøpsomformeren.
- Plasser de tilsvarende inkuberte platene på deteksjonsplatebasen med den manglende vinkelen foran for orientering og skyv inn i bildeopptaksomformeren.
- Klikk på Samling for å hente bildene. Den antibiotiske gradienten vil automatisk hoppe til neste gradient. Plasser neste plate etter tur og fortsett å klikke på Samling til platene for dette antibiotika er samlet.
- Klikk på Antibiotika, og velg neste sett med inkuberte plater. Klikk på Gradient for å velge startgradient og gå videre til neste runde av bildesamlingen.
- Etter å ha fullført alle samlingene, klikk på Send. Programmet vil automatisk gjenkjenne antall hvite piksler formatert på hvert inokulasjonspunkt i bildene, avgjøre om det er kolonidannelse og konvertere bildene til MIC-verdier.
- Klikk på Query for å få alle MIC-resultatene av stammene mot de testede antibiotika.
MERK: Det intelligente AST-systemet med høy gjennomstrømning er egnet for å bestemme MIC for store grupper av bakteriestammer. Testprosessen, inkludert forberedelse, inokulering, inkubasjon og resultatavlesning, tar 3 dager. Typene antibiotika og MIC-deteksjonsområder kan stilles inn i henhold til respektive behov, og hovedforbruksvarer kan gjenbrukes.
- Beregning av Lar-indeksen
- Bestem Lar-indeksen nøyaktig med formelen: , hvor:
MICi: minste hemmende konsentrasjon.
Utvalget av MIC-distribusjoner fra MIC-3 til MIC3 representerer serielle todelte konsentrasjoner sentrert på R: 0,125R, 0,25R, 0,5R, R, 2R, 4R og 8R.
er 2 i, og områdeti er -3 til 3.
R: brytningspunktene for resistens av bakterier mot antimikrobielle midler standardisert av CLSI.
f: MIC-frekvensfordelingen.
MERK: Den generelle Lar-indeksen er det aritmetiske gjennomsnittet av alle Lar-indeksene. Etter at Lar-indeksen er beregnet, runder du av den endelige verdien til to signifikante sifre etter desimaltegnet.
- Bestem Lar-indeksen nøyaktig med formelen: , hvor:
er 2 i, og områdeti er -3 til 3.2. Intelligent fagscreeningssystem med høy gjennomstrømning9
- Forbereder fagfrøblokken og dobbeltlags inkuberte plater som inneholder bakterier.
- Bruk dobbeltlags agarmetode10 eller væskekulturmetode11 for å lage forskjellige fager. Fortynn til en passende parallell konsentrasjon med en titer på 1 x 104-5 pfu / ml, og tilsett 200 μL av faginokulumet i 96-brønnfrøblokken.
- Lag dobbeltlagsplater med bakterier (10 ml bunnagarmedier [agar 12 g/L] og 6 ml øvre semi-agar media [6 g/L] med 100 μL bakterier [0,5 McFarland]) som skal testes.
- Lag en dobbeltlags inkubert plate for hver stamme som skal testes. La det være et gap under lokket på dobbeltlagsplaten og blås for å tørke agaroverflaten i biosikkerhetsskapet.
- Screening test
- Plasser den forberedte fagfrøblokken og dobbeltlagsplaten på mobilbæreren til 96-punkts matriseinokulatoren, og overfør all faginokula til halvagaroverflaten. Fortsett syklusene til alle testede stammer er fullført.
- La de inokulerte dobbeltlagsplatene forbli ved RT til fuktigheten i inokulumflekkene absorberes helt inn i semi-agar.
- Inverter platene og inkuber under passende forhold for de testede stammene i 4-6 timer for å sikre at klare lytiske flekker dannes.
- Analysere data
- Hent og lagre bildet av det eksperimentelle resultatet av hver dobbeltlagsplate ved hjelp av bildeinnsamlingsomformeren (trinn 1.5.4-1.5.6).
- Registrer antall og morfologier av de forskjellige formene av flekker i et regneark basert på de oppnådde bildene, og beregne de respektive proporsjonene av de forskjellige typer fager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter protokollen til det intelligente AST-systemet med høy gjennomstrømning ble applikasjonen illustrert av Salmonella fra fjærfe i Shandong, Kina, som et eksempel.
Veksten av Salmonella-stammer på agarplater med ampicillin (R på 32 μg / ml) i konsentrasjoner fra 2 til 256 μg / ml bestemt av bildeinnsamlingsomformeren er vist i figur 3. Den horisontale 1st brønn A1 var negativ kontroll og viste ingen kolonivekst; A2 og A3 var kvalitetskontrollstammene med MIC 4 μg/ml (som danner en koloni på agarplaten med 2 μg/ml ampicillin, men ikke på 4 μg/ml), innenfor kvalitetskontrollområdet standardisert med CLSI (2-8 μg/ml). MIC av Salmonella-stammen i A4 var 64 μg / ml, mens den for A5 var 16 μg / ml. MIC-fordeling av 93 Salmonella-stammer mot ampicillin ble beregnet automatisk av programvaren.
Figur 3: Morfologi av Salmonella på en serie dyrkningsplater med ampicillin. 8 horisontale: A-H, 12 vertikale: 1-12. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
AST med høy gjennomstrømning ble brukt for å bestemme AMR av Salmonella-stammer fra dyr i Shandong-provinsen. MIC-dataene ble lastet opp til databasen til Varms (http://www.varms.cn/)12. De statistiske resultatene er vist i tabell 1. Totalt 10 antimikrobielle midler ble testet mot 300-1,500 Salmonella-stammer , som viser fordelene med høy gjennomstrømning ved dette systemet.
I henhold til de resistente brytningspunktene i CLSI-standarden ble resistensraten (R%) beregnet som en prosentandel av stammer med MIC ≥ R blant de testede stammene (tabell 1). R%-verdiene for ampicillin, ciprofloxacin og amoksicillin-klavulansyre var høyere enn 50%, R%-verdiene for doksycyklin, florfenikol, cefotaksim og enrofloksacin var 30% -50%, og R% -verdiene for gentamicin, amikacin og meropenem var mindre enn 30%. Meropenem ble ikke brukt i industrielt hevede dyr og viste en R% på 7%.
R% indikerte andelen av bakteriestammene med MIC høyere enn R, mens MIC-fordelinger viste antall stammer med hver MIC for å beskrive den totale AMR av Salmonella mer nøyaktig. For eksempel var R% av ampicillin 73%, og maksimalt antall prøver (916 stammer) ble konsentrert med MIC ≥ 256 μg / ml, noe som indikerer at resistensen av Salmonella til ampicillin var ganske alvorlig.
Tabell 1: MIC-fordelinger, R% og Lar indeksverdier av Salmonella fra dyr i Shandong-provinsen. MIC-er som tilsvarer fet skrift er R-verdiene for antimikrobielle midler. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
For ensartethet og sammenlignbarhet ble 3 gradienter utvidet fremover og bakover, sentrert på R for hvert legemiddel. I henhold til MIC-fordelingene av syv gradienter ble Lar-indeksen beregnet med formelen:
.
Som eksempel for ampicillin var R-verdien 32 μg/ml, antall prøver var 1,414, og Lar = (4/32) x (245/1414) + (8/32) × (16/1414) + (16/32) × (117/1414) + (32/32) × (27/1414) + (64/32) × (36/1414) + (128/32) × (57/1414) + (2566/32) /32) × (916/1414) = 2-3 × (245/1414) + 2-2 × (16/1414) + 2-1 × (117/1414) + 20 × (27/1414) + 21 × (36/1414) + 2 2 × (57/1414) + 2 3 × (916/1414) = 5,48. Med denne formelen ble Lar-indekser for andre antimikrobielle midler beregnet og er vist i tabell 1.
Betydningen av Lar-indeksen var å angi alvorlighetsgraden av AMR nøyaktig. Ved å ta ciprofloxacin og amoksicillin-klavulansyre som eksempler, var deres R%-verdier like, henholdsvis 68% og 65%, men deres Lar-indekser varierte signifikant, henholdsvis 4,57 og 1,76. Årsaken til dette ble tydelig illustrert ved fordelingen av de høye MIC-verdiene i tabell 1, der 71,3 % av ciprofloksacinresistente stammer var fordelt i 8R (32 μg/ml), mens MIC for amoksicillin-klavulansyreresistente stammer hovedsakelig var konsentrert om R og 2R, og andelen 8R var lav (8,69 %). Lar-indeksen for ciprofloksacin var derfor høyere enn for amoksicillin-klavulansyre, noe som indikerer at andelen høyt ciprofloksacinresistente stammer var høyere enn for amoksicillin-klavulansyreresistente stammer. Lar-indeksen var en mer nøyaktig indikator på graden av AMR enn resistensraten.
I henhold til formelen til Lar-indeksen, hvis MICene for alle stammer med hensyn til et bestemt stoff var R, ville Lar-indeksen være 1; hvis MICene til alle stammer var 2R, ville Lar-indeksen være 2. Lar-indeksen viste derfor flere sammenhenger mellom de omfattende mikrofonene og den tilsvarende R-verdien, bortsett fra kantkonsentrasjonene. Lar-indeksen ble brukt til å vurdere grad av AMR, og fordelen var større hvis AMR var høyere. For ensartethet og sammenlignbarhet var beregningsområdet for Lar-indeksen syv MICer med de fremre og bakre 3 gradientene sentrert på R-verdien, og det vektede gjennomsnittet ble oppnådd ved å integrere de forskjellige antimikrobielle midlene, antall stammer og MIC-fordelinger. Derfor var verdiområdet for Lar-indeksen 0,125-8. Jo nærmere Lar var 0,125, jo lavere AMR, og jo nærmere den var 8, jo høyere AMR. Det var imidlertid ingen proporsjonal sammenheng mellom Lar og R ved kantkonsentrasjonen. Når de antimikrobielle midlene og beregningsområdet for Lar-indeksen var bestemte, ble den generelle Lar normalisert til en intuitiv omfattende verdi som brukes til direkte å sammenligne og evaluere graden og endringstrenden til AMR under de forskjellige forholdene til forskjellige bakterier, brukere, år, regioner, etc.
Etter protokollen til det intelligente fagscreeningssystemet ble applikasjonen demonstrert ved å ta 96 fager av Salmonella for å lyse AMR Salmonella-stammer som et eksempel, og faglytisk mønster ble analysert.
Nittiseks fager ble overført til dobbeltlags plater som inneholder Salmonella av en 96-punkts matriseinokulator. Morfologien til de dannede flekkene er vist i figur 4. Det var fire hovedtyper (men ikke begrenset til fire): klar rund flekk (●), samling av plakk (), uklar lytisk flekk () og ingen lytisk flekk (
○).
Figur 4: Morfologi av salmonellaflekker på dobbeltlags agarplater. 1 og 2: mønstrene produsert av 96 fager på forskjellige Salmonella-stammer. "●" rund klar flekk, "" samling av plaketter, "" uklar lytisk flekk, "○" ingen lytisk flekk) Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
På dobbeltlagsplatene var de lytiske flekkene av forskjellige fager på forskjellige vertsbakterier forskjellige i morfologi10. Det "runde klare lytiske stedet" skyldes en som pålitelig kunne drepe verten på tallerkenen, men som kanskje eller kanskje ikke lykkes med å replikere på vertens bekostning. I dette tilfellet var ytterligere fortynning nødvendig for endelig å bestemme typen. "Samlingen av plaketter" ble dannet av ekte plaketter. Hver enkelt lysisone ble tydelig produsert fra et enkelt smittsomt senter, som viste at fagen hadde replikert på bekostning av bakteriene på platen. Den "uklare lytiske flekken" skyldes en som ikke pålitelig drepte verten på tallerkenen, og som kanskje eller ikke kan lykkes med å replikere på vertens bekostning. I dette tilfellet var det mer enn én mulighet, og krevde dermed bekreftelse basert på videre forskningsinteresser. Den "ingen lytiske flekken" indikerte ikke-lytisk natur.
Videre kunne bruk av dette systemet for foreløpig testing i hovedsak avgjøre om stammene og bakteriofagene ble duplisert. Hvis forskjellige Salmonella-arter ble valgt og mønstrene til to bakteriofager var identiske, indikerte det at bakteriofagene kunne dupliseres. Hvis ikke-repeterende bakteriofager ble valgt for å infisere ukjente Salmonella-arter fra kliniske kilder, og fagmønsteret var det samme, indikerte det at Salmonella-stammer kan være den samme stammen. Videre hadde antall og andel duplikater referanseverdier for epidemiologisk undersøkelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Agarfortynningsmetoden er veletablert og mye brukt. Prinsippet for AST-systemet med høy gjennomstrømning var agarfortynningsmetoden. Et av de kritiske trinnene i protokollen var den nøyaktige overføringen av høy gjennomstrømning av 96 inokula på en gang, som ble utført flere ganger på rad. For å fullføre dette kritiske trinnet var pinnene til 96-punkts matriseinokulatoren ensartede og veldig glatte. Den naturlige avsetningen av hver pinne var et volum på ca. 2 μL, som samlet seg i små dråper på overflaten av agarmediet for raskt å bli absorbert i agar, ikke strømmende eller sprut for å forårsake krysskontaminering. Det andre kritiske trinnet var statistisk behandling av store AST-data. Med inokulering med høy gjennomstrømning måtte testdata bestemmes, og arbeidsbelastningen var enorm. Den intelligente analysen og statistiske resultatene produsert av den intelligente bildeinnsamlingsomformeren og støtteprogramvaren var en perfekt løsning på dette problemet. AST-resultatene ble automatisk lastet opp direkte til Varms database. Effektiviteten og nøyaktigheten av resultattolkningen ble forbedret, og feilene forårsaket av menneskelige faktorer ble redusert13.
Det tredje kritiske trinnet var å foreslå Lar-indeksen for AMR. For tiden er det få omfattende evalueringsindekser av AMR i verden. Ifølge litteraturen ble en stoffresistensindeks (DRI) beskrevet av Laxminarayan og Klugman for å måle endringer i antibiotikaeffektivitet14,15. Den kombinerte forekomsten av resistens og relative frekvenser av resept, men kunne ikke karakterisere graden av AMR og evaluere endringene i høye legemiddelresistensnivåer. Legemiddeleffektivitetsindeksen (DEI) 16, en annen indeks avledet fra DRI, har samme ulempe som DRI. Dermed ble Lar-indeksen foreslått, som besto av tre trinn: (1) MIC av bakteriestammer ble normalisert basert på den respektive R-verdien, og eliminerte forskjellene i antimikrobielle midler forårsaket av forskjellige R-verdier av AST-standarden; (2) I henhold til MIC-fordelingene ble de vektede gjennomsnittsverdiene beregnet for å gjenspeile graden av AMR mer nøyaktig enn resistensraten; (3) Det aritmetiske gjennomsnittet av Lar-indekser for flere antimikrobielle midler, det vil si den generelle Lar, kan gjenspeile den omfattende situasjonen for AMR, og gir bekvemmelighet for vurdering og sammenligning av AMR på forskjellige nivåer.
Maskinvareutformingen av disse apparatene var rimelig og enkel å betjene, og alle deler gikk jevnt. Det var ikke noe fastkjøringsproblem eller feil. Utformingen av støtteprogramvaren samsvarte med de personlige kravene til AST og fagscreening og var enkel å betjene og bruke. Ett instrument var utstyrt med 4-5 bokser med inokulasjonspinner for flere aktuelle scenarier for batchbakteriell overføring. Kjernekomponentene i dette instrumentet var inokulasjonsstiftplaten og pinnene laget av rustfritt stål, som kunne tilpasses en rekke miljøer og kunne autoklaveres, demonteres og erstattes. Inokulasjonspinnene ble designet for å kombineres på noen måte.
Det var viktig å etablere et AMR-overvåkingssystem på grunn av forekomsten av resistente patogener forårsaket av misbruk av antibiotika. Siden 2008 har folkehelseteamet ved Institutt for dyrevitenskap og veterinærmedisin, Shandong Academy of Agricultural Sciences, utført AMR-overvåking av dyr suksessivt i Shandong-provinsen1 2,13,17. Det var nødvendig å effektivt oppdage MICs av patogener for å regulere bruken av antimikrobielle midler på grunn av det høye nivået av veterinærresistens og det store overvåkingsvolumet. Imidlertid er de relevante instrumentene for AST dyre, og kostnaden for drift og forbruksvarer er høy og ikke egnet for et bredt spekter av store gårder. Av denne grunn bidro utviklingen av det intelligente AST-systemet med høy gjennomstrømning og standardiseringen av dets anvendelse til å fremme etableringen av et lydsystem for AMR-overvåkingsteknologi. Ifølge tidligere forskning12,13 oppnådde det intelligente AST-systemet med høy gjennomstrømning god repeterbarhet og stabilitet for å matche standarden for CLSI og ble brukt på AST og analyse av kliniske patogene bakterier hos dyr. Hittil har omfattende AMR-data for mer enn 20 000 epidemiske stammer blitt akkumulert12. For de resistente bakteriene som finnes i overvåkingsprosessen, kan dette systemet også brukes til rask høy gjennomstrømningsscreening av lytiske fager for å samarbeide med antimikrobielle midler for å redusere AMR. Anvendelsen av 96-punkts matriseinokulator og bildeinnsamlingsomformer for faglysisscreening var en utvidet funksjon, og ingen andre instrumenter hadde tidligere blitt brukt på dette feltet.
Det intelligente høykapasitets ASAT / fagscreeningssystemet kombinerte AST med lytiske bakteriofager for å oppnå AMR-overvåking, kontroll og reduksjon. Samtidig ble Lar-indeksen mer intuitivt og konsist brukt til å evaluere bidragene fra ulike faktorer og nye antibakterielle teknologier til reduksjon av AMR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yuqing Liu et al. har arkivert kinesiske patenter for 96-punkts matriseinokulator og bildeoppkjøpsomformer og deres applikasjoner (patentnummer ZL 201610942866.3 og patentnummer ZL 201910968255.X).
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Key Research and Development Project (2019YFA0904003); Moderne landbruksindustrisystem i Shandong-provinsen (SDAIT-011-09); Internasjonalt samarbeidsprosjekt for plattformoptimalisering (CXGC2023G15); Store innovasjonsoppgaver for landbruksvitenskap og teknologisk innovasjonsprosjekt ved Academy of Agricultural Sciences Shandong, Kina (CXGC2023G03).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well culture plate | Beijing lanjieke Technology Co., Ltd | 11510 | |
| 96-dot matrix AST image acquisition system | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| 96-dot matrix inoculator | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Agar | Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd | HB8274-1 | |
| Amikacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A857053 | |
| Amoxicillin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A822839 | |
| Ampicillin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A830931 | |
| Analytical balance | Sartorius | BSA224S | |
| Automated calculation software for Lar index of AMR | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Bacteria Salmonella strains | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Animal origin |
| Bacterial resistance Lar index certification management system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Ceftiofur | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C873619 | |
| Ciprofloxacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C824343 | |
| Clavulanic acid | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C824181 | |
| Clean worktable | Suzhou purification equipment Co., Ltd | SW-CJ-2D | |
| Colistin sulfate | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C805491 | |
| Culture plate | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Doxycycline | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | D832390 | |
| Enrofloxacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | E809130 | |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SLGP033RB | |
| Florfenicol | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | F809685 | |
| Gentamicin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | G810322 | |
| Glass bottle 50 mL | Xuzhou Qianxing Glass Technology Co., Ltd | QX-7 | |
| High-throughput resistance detection system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Image acquisition converter | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Meropenem | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | M861173 | |
| Mueller-Hinton agar | Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd | HB6232 | |
| Petri dish 60 mm x 15 mm | Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd | 16021-1 | |
| Petri dish 90 mm x 15 mm | Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd | 16001-1 | |
| Salmonella phages | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | |
| Shaker incubator | Shanghai Minquan Instrument Co., Ltd | MQD-S2R | |
| Turbidimeter | Shanghai XingBai Biotechnology Co., Ltd | F-TC2015 | |
| Varms base type library system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Vertical high-pressure steam sterilizer | Shanghai Shen'an medical instrument factory | LDZX-75L | |
| Veterinary pathogen resistance testing management system | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Veterinary resistance cloud monitoring and phage control platform V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright |
References
- Ramanan, L., et al. Antimicrobial resistance-the need for global solutions. The Lancet Infectious Diseases. 13 (12), 1057-1098 (2013).
- Xiaonan, Z., Qing, Z., Thomas, S. P., Yuqing, L., Martha, R. J. C. inPhocus: Perspectives of the application of bacteriophages in poultry and aquaculture industries based on Varms in China. PHAGE: Therapy, Applications, and Research. 2 (2), 69-74 (2021).
- CLSI. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. CLSI document M100. , M100 32nd edition, Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA . (2022).
- Yuqing, L., et al. Antimicrobial Sensitivity Testing Standard of EUCAST. , China Standards Press, Beijing. (2017).
- Barnini, S., et al. A new rapid method for direct antimicrobial susceptibility testing of bacteria from positive blood cultures. BMC Microbiology. 16 (1), 185-192 (2016).
- Höring, S., Massarani, A. S., Löffler, B., Rödel, J. Rapid antimicrobial susceptibility testing in blood culture diagnostics performed by direct inoculation using the VITEK®-2 and BD PhoenixTM platforms. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (3), 471-478 (2019).
- Dupuis, G. Evaluation of the Cobasbact automated antimicrobial susceptibility testing system. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 4 (2), 119-122 (1985).
- A system of bacterial antimicrobial resistance detection and its operation method. China Patent. Liu, Y., et al. , ZL 201610942866.3 (2019).
- A high throughput test plate for screening bacteriophage of zoonotic pathogens and its application. China Patent. Liu, Y. , ZL 201910968255.X (2022).
- Adams, M. H. Bacteriophages. , Interscience Publishers, New York. (1959).
- Nair, A., Ghugare, G. S., Khairnar, K. An appraisal of bacteriophage isolation techniques from environment. Microbial Ecology. 83 (3), 519-535 (2022).
- Shandong veterinary antibiotic resistance system. , http://www.varms.cn (2023).
- Ming, H., et al. Comparison of the results of 96-dot agar dilution method and broth microdilution method. Chinese Journal of Antibiotics. 43 (6), 729-733 (2018).
- Laxminarayan, R., Klugman, K. P. Communicating trends in resistance using a drug resistance index. BMJ Open. 1 (2), e000135 (2011).
- Chen, Y., et al. Assessing antibiotic therapy effectiveness against the major bacterial pathogens in a hospital using an integrated index. Future Microbiology. 12, 853-866 (2017).
- Ciccolini, M., Spoorenberg, V., Geerlings, S. E., Prins, J. M., Grundmann, H. Using an index-based approach to assess the population-level appropriateness of empirical antibiotic therapy. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (1), 286-293 (2015).
- Yanbo, L., et al. Preliminary application of inoculation system for high-throughput drug susceptibility test. China Poultry. 42 (6), 52-57 (2020).
