Summary
Hier stellen wir das Prinzip, den Aufbau und die Anleitung des intelligenten Hochdurchsatz-Antimikrobiell-Sensitivitätstest-/Phagen-Screening-Systems vor. Die Anwendung wird am Beispiel von Salmonellen , die aus Geflügel in Shandong, China, isoliert wurden, veranschaulicht. Der Lar-Index wird berechnet und seine Bedeutung für die Bewertung antimikrobieller Resistenzen wird umfassend diskutiert.
Abstract
Um die Effizienz von antimikrobiellen Empfindlichkeitstests (AST) und Phagen-Hochdurchsatz-Screenings auf resistente Bakterien zu verbessern und die Nachweiskosten zu senken, wurde ein intelligentes Hochdurchsatz-AST/Phagen-Screening-System entwickelt, das einen 96-Punkt-Matrix-Inokuultator, einen Bildaufnahmekonverter und eine entsprechende Software umfasst, die den AST-Kriterien und den vom Clinical & Laboratory Standards Institute (CLSI) formulierten Breakpoints of Resistance (R) entsprechen. AST und Statistiken über die Verteilung der minimalen Hemmkonzentration (MIC) (von R/8 bis 8R) von 1.500 Salmonellenstämmen , die aus Geflügel in Shandong, China, gegen 10 antimikrobielle Wirkstoffe isoliert wurden, wurden mit dem intelligenten Hochdurchsatz-AST/Phagen-Screening-System durchgeführt. Der Lar-Index, d.h. "weniger Antibiose, weniger Resistenz und Residuum bis wenig Antibiose", wurde durch die Berechnung des gewichteten Durchschnitts jedes MHK und die Division durch R ermittelt. Dieser Ansatz verbessert die Genauigkeit im Vergleich zur Verwendung der Prävalenz von Resistenzen zur Charakterisierung des Grades der antimikrobiellen Resistenz (AMR) von hochresistenten Stämmen. Für die Salmonellenstämme mit hoher AMR wurden lytische Phagen mit diesem System effizient aus der Phagenbibliothek gescreent und das Lysespektrum berechnet und analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass das intelligente Hochdurchsatz-AST/Phagen-Screening-System bedienbar, genau, hocheffizient, kostengünstig und einfach zu warten war. In Kombination mit dem veterinärmedizinischen antimikrobiellen Resistenzüberwachungssystem von Shandong war das System für die wissenschaftliche Forschung und den klinischen Nachweis im Zusammenhang mit AMR geeignet.
Introduction
Da antimikrobielle Wirkstoffe in großem Umfang zur Vorbeugung bakterieller Infektionskrankheiten eingesetzt werden, ist die antimikrobielle Resistenz (AMR) zu einem globalen Problem für die öffentliche Gesundheit geworden1. Die Bekämpfung antimikrobieller Resistenzen ist derzeit die Hauptaufgabe der Überwachung von Antibiotikaresistenzen epidemiologischer Krankheitserreger und der synergistischen Therapie empfindlicher antimikrobieller Wirkstoffe und lytischer Bakteriophagen2.
In-vitro-Tests auf antimikrobielle Empfindlichkeit (AST) sind die wichtigste Säule für die Überwachung der Therapie und den Nachweis des AMR-Niveaus. Es ist ein wichtiger Bestandteil der antimikrobiellen Pharmakologie und die entscheidende Grundlage für die klinische Medikation. Das Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) der Vereinigten Staaten und das Europäische Komitee für antimikrobielle Empfindlichkeitstests (EUCAST) haben internationale Kriterien für AST formuliert und überarbeitet und kontinuierlich modifiziert und ergänzt AST-Methoden und die Breakpoints zur Bestimmung der MHK einer bestimmten Kombination aus "Organismus und antimikrobiellem Wirkstoff" als sensitiv (S), resistent (R) oder intermediär (I)3, 4. Anmelden
Von den 1980er bis in die 1990er Jahre wurden schnell automatische Mikrobrühe-Verdünnungsgeräte entwickelt und in der klinischen Praxis eingesetzt, mit Beispielen wie Alfred 60AST, VITEK System, PHOENIXTM und Cobasbact 5,6,7. Diese Instrumente waren jedoch teuer, erforderten teure Verbrauchsmaterialien und ihre Detektionsbereiche waren für die klinische Patientenmedikation ausgelegt 5,6,7. Aus diesen Gründen eignen sie sich nicht für die veterinärklinische Untersuchung und den Nachweis großer Mengen hochresistenter Stämme. In dieser Studie wurde ein intelligentes Hochdurchsatz-AST/Phagen-Screening-System entwickelt, das einen 96-Punkt-Matrix-Inokulator (Abbildung 1), einen Bilderfassungskonverter (Abbildung 2) und die entsprechende Software8 umfasst, um AST für eine Charge von Bakterienstämmen gegen mehrere antimikrobielle Wirkstoffe gleichzeitig mit der Agar-Verdünnungsmethode durchzuführen. Darüber hinaus wurde das System auch verwendet, um die Lysemuster von Phagen gegen antimikrobiell resistente Bakterien zu detektieren und zu analysieren9, und lytische Phagen wurden effizient aus der Phagenbibliothek ausgewählt. Dieses System erwies sich als effizient, erschwinglich und einfach zu bedienen.
Abbildung 1: Strukturdiagramm des 96-Punkt-Matrix-Inokulators. 1: Inokulations-Pin-Platte; 2: Mobilfunkanbieter; 3: Saatblock; 4: Inkubierte Platte; 5: Basis; 6: Bedienungsgriff; 7: Pin begrenzen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Strukturdiagramm des Bildaufnahmekonverters. 1: Schale; 2: Bildschirm anzeigen; 3: Raum für die Bildaufnahme; 4: Basis der Detektionsplatine; 5: Erkennungstafel in und aus dem Lager; 6: Steuerplatine; 7: Bildaufnahme-Konvertierungsgerät; 8: Lichtquelle; 9: Bildscanner. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Die in dieser Studie verwendeten Salmonellenstämme wurden von Geflügel in Shandong, China, gesammelt, nachdem sie die Genehmigung des Ausschusses für biologische Sicherheit des Instituts für Tierwissenschaften und Veterinärmedizin der Shandong Academy of Agricultural Sciences, China, erhalten hatten.
1. Anwendung des intelligenten Hochdurchsatz-AST-Systems8
- Inokulum-Präparat
- Inkubieren Sie den Qualitätskontrollorganismus Escherichia coli und 93 Salmonellenstämme , die auf AST getestet werden sollen, auf Mueller-Hinton-Agarplatten (MHA) für 16-18 Stunden bei 37 °C3.
- Bereiten Sie das Inokulum jedes Stammes so vor, dass es dem McFarland-Trübungsstandard von 0,5 entspricht, basierend auf der im CLSI-Standard3angegebenen Methode, und verdünnen Sie es dann 10-fach.
- Geben Sie 200 μl sterile normale Kochsalzlösung als Negativkontrolle in die horizontale 1. Vertiefung (A1) der 96-Well-Platte, zwei Suspensionen des Qualitätskontrollorganismus in die horizontale 2. und 3. Vertiefung (A2 und A3) als Positivkontrolle bzw. Qualitätskontrolle. Geben Sie 200 μl der verdünnten Inokulumsuspensionen jedes getesteten Farbstoffs in die entsprechenden 93 Vertiefungen im 96-Well-Saatblock.
- Herstellung einer antimikrobiellen Agarplatte
- Stellen Sie die Konzentrationsbereiche der verschiedenen getesteten antibakteriellen Wirkstoffe gemäß dem Berechnungsbereich des Lar-Index (von 0,125 R bis 8 R) ein. Die Konzentrationen reichen vom Qualitätskontrollbereich oder 0,0625R (vorbehaltlich des unteren Bereichs) bis zu 8R.
HINWEIS: Wenn der Lar-Index nicht berechnet wird, kann der Bereich der Antibiotikakonzentrationen entsprechend den Anforderungen der AST eingestellt werden. - Führen Sie ein log2-Verdopplungsverdünnungsschema für Antibiotikalösung aus, beginnend mit einer geeigneten Stammkonzentration auf der Grundlage der im CLSI-Standard3 festgelegten Agar-Verdünnungsmethode.
- Sterilisieren Sie 50-ml-Glasflaschen mit 18 ml Mueller-Hinton-Agarmedien. 2 ml der entsprechenden Verdünnungen der antimikrobiellen Lösung in 18 ml geschmolzenes Medium geben, das auf 45-50 °C abgekühlt ist, gründlich mischen und in die Platten in der Biosicherheitswerkbank gießen.
- Lassen Sie den Agar bei Raumtemperatur (RT) erstarren, lassen Sie einen Spalt unter dem Deckel der inkubierten Platten und blasen Sie, um die Agaroberfläche vor der Inokulation zu trocknen.
- Beschriften Sie die Arten der antimikrobiellen Wirkstoffe und Konzentrationen auf der Rückseite der inkubierten Platten. Ordnen Sie die mehrfach inkubierten Platten jedes antimikrobiellen Wirkstoffs in einem Stapel in log2-verdoppelnder Verdünnungsreihenfolge an.
- Bereiten Sie zwei arzneimittelfreie Agarplatten als Kontrollen für jedes antimikrobielle Mittel vor.
- Stellen Sie die Konzentrationsbereiche der verschiedenen getesteten antibakteriellen Wirkstoffe gemäß dem Berechnungsbereich des Lar-Index (von 0,125 R bis 8 R) ein. Die Konzentrationen reichen vom Qualitätskontrollbereich oder 0,0625R (vorbehaltlich des unteren Bereichs) bis zu 8R.
- Inokulationsschritte für 96-Punkt-Matrix-Inokulator
- Montieren Sie die autoklavierte Impfstiftplatte auf dem Träger eines 96-Punkt-Matrix-Inokuultators in der Biosicherheitswerkbank.
- Legen Sie den vorbereiteten Saatgutblock mit den getesteten Stämmen und einer Agar-Inkubationsplatte auf den mobilen Träger, mit dem gleichen Positionierungswinkel für die beiden Platten.
- Schieben Sie den mobilen Träger so, dass sich der Saatblock direkt unter der Impfstiftplatte befindet.
- Drücken Sie auf den Bediengriff, bewegen Sie die Impfnadelplatte nach unten und richten Sie die 96 Stifte in 96 Vertiefungen des Saatblocks.
- Lassen Sie den Bediengriff mit Kontrolle los und stellen Sie dann die Impfstiftplatte unter Federwirkung wieder her.
- Drücken Sie 2-3 Mal auf den Bediengriff, um jedes Inokulum gut umzurühren und einzutauchen. Schieben und bewegen Sie die Trägerplatte so, dass sich die inkubierte Platte direkt unter der Inokulationsplatte befindet.
- Drücken Sie auf den Bediengriff, bewegen Sie die Impfstiftplatte nach unten und halten Sie sie für 1-2 s an, damit die Impfstifte die Oberfläche der inkubierten Platte vollständig berühren.
- Lassen Sie den Bediengriff los. Damit ist eine Inokulation abgeschlossen. Ersetzen Sie eine weitere inkubierte Platte und setzen Sie den Zyklus fort, bis eine Gruppe von antimikrobiellen Agarplatten aufgebraucht ist.
- Ersetzen Sie eine weitere Impfnadelplatte und einen anderen Saatblock und impfen Sie eine andere Gruppe getesteter Stämme. Zyklus, bis alle Impfungen abgeschlossen sind.
HINWEIS: Beimpfen Sie zuerst eine Kontrollagarplatte (kein antimikrobielles Mittel), dann die Platte in der Reihenfolge der Arzneimittelkonzentration von niedrig nach hoch und zuletzt eine zweite Kontrollagarplatte, um sicherzustellen, dass keine Kontamination oder Verschleppung antimikrobieller Wirkstoffe auftritt. Das Impfvolumen beruht auf dem Volumen der natürlichen Abscheidung jedes Stifts von ca. 2 μl.
- Inkubation der antimikrobiellen Agarplatten
- Inkubieren Sie die inokulierten antimikrobiellen Agarplatten bei RT, bis die Feuchtigkeit in den Inokulumflecken in den Agar absorbiert ist.
- Invertieren Sie die Platten und inkubieren Sie sie für 16-20 h bei 37 °C für die getesteten Stämme, um sicherzustellen, dass die ungehemmten Bakterien Kolonien bilden.
- Bildaufnahme und Datenstatistik
- Doppelklicken Sie auf das 96-Punkt-Matrix-AST-Bilderfassungssystem , um das Programm zu öffnen.
- Klicken Sie in der Taskleiste auf Testinformationen . Klicken Sie auf Neu , um eine neue Testaufgabe zu erstellen, und geben Sie die Informationen gemäß den Eingabeaufforderungen ein, einschließlich Code, Name, Quelle, Bakterien, Anzahl der Stämme, Antibiotika und Gradient.
- Klicken Sie auf Datenerfassung > Foto > Testelement , um die neu erstellte Aufgabe auszuwählen. Klicken Sie auf Antibiotika , um den Namen des Antibiotikums auszuwählen, und klicken Sie auf Gradient , um die Anfangskonzentration dieses Antibiotikums auszuwählen.
- Klicken Sie auf Verbinden , um eine Verbindung mit dem Bildaufnahmekonverter herzustellen.
- Legen Sie die entsprechenden inkubierten Platten mit dem fehlenden Winkel zur Orientierung vorne rechts auf die Detektionsplattenbasis und schieben Sie sie in den Bildaufnahmekonverter.
- Klicken Sie auf Sammlung , um die Bilder zu erhalten. Der antibiotische Gradient springt automatisch zum nächsten Gradienten. Platzieren Sie den nächsten Teller der Reihe nach und klicken Sie so lange auf Sammeln , bis die Platten für dieses Antibiotikum gesammelt wurden.
- Klicken Sie auf Antibiotika und wählen Sie den nächsten Satz inkubierter Platten aus. Klicken Sie auf Farbverlauf, um den Startverlauf auszuwählen und mit der nächsten Runde der Bildsammlung fortzufahren.
- Nachdem Sie alle Sammlungen abgeschlossen haben, klicken Sie auf Senden. Das Programm erkennt automatisch die Anzahl der weißen Pixel, die an jedem Impfpunkt in den Bildern formatiert sind, stellt fest, ob eine Koloniebildung vorliegt, und wandelt die Bilder in MIC-Werte um.
- Klicken Sie auf Abfrage , um alle MIC-Ergebnisse der Stämme gegen die getesteten Antibiotika zu erhalten.
HINWEIS: Das intelligente Hochdurchsatz-AST-System eignet sich für die Bestimmung von MHK großer Chargen von Bakterienstämmen. Der Testprozess, einschließlich Vorbereitung, Impfung, Inkubation und Ablesen der Ergebnisse, dauert 3 Tage. Die Arten von Antibiotika und MHK-Nachweisbereiche können entsprechend den jeweiligen Bedürfnissen eingestellt werden, und die wichtigsten Verbrauchsmaterialien können wiederverwendet werden.
- Berechnung des Lar-Index
- Bestimmen Sie den Lar-Index genau mit der Formel: , wobei:
MHKi: minimale Hemmkonzentration.
Der Bereich der MHK-Verteilungen von MHK-3 bis MHK3 stellt serielle zweifache Konzentrationen dar, die auf R zentriert sind: 0,125R, 0,25R, 0,5R, R, 2R, 4R und 8R.
ist 2 i, und der Bereich voni ist -3 bis 3.
R: die Bruchstellen der Resistenz von Bakterien gegen antimikrobielle Wirkstoffe, die durch CLSI standardisiert wurden.
f: die MIC-Häufigkeitsverteilung.
HINWEIS: Der allgemeine Lar-Index ist das arithmetische Mittel aller Lar-Indizes. Nachdem der Lar-Index berechnet wurde, runden Sie den Endwert auf zwei signifikante Stellen nach dem Dezimaltrennzeichen ab.
- Bestimmen Sie den Lar-Index genau mit der Formel: , wobei:
ist 2 i, und der Bereich voni ist -3 bis 3.2. Intelligentes Hochdurchsatz-Phagen-Screening-System9
- Vorbereitung des Phagen-Samenblocks und der doppellagigen inkubierten Platten, die Bakterien enthalten.
- Verwenden Sie die Doppelschicht-Agar-Methode10 oder die Flüssigkulturmethode11 zur Herstellung verschiedener Phagen. Man verdünnt auf eine geeignete parallele Konzentration mit einem Titer von 1 x 104-5 pfu/ml und fügt 200 μl des Phagen-Inokulums in den 96-Well-Samenblock hinzu.
- Stellen Sie doppellagige Platten mit Bakterien her (10 ml unteres Agarmedium [Agar 12 g/l] und 6 ml oberes Semi-Agar-Medium [6 g/l] mit 100 μl Bakterien [0,5 McFarland]), die getestet werden sollen.
- Stellen Sie für jeden zu testenden Stamm eine doppellagige Inkubationsplatte her. Lassen Sie eine Lücke unter dem Deckel der doppellagigen Platte und blasen Sie die Agaroberfläche in der Biosicherheitswerkbank zum Trocknen.
- Screening-Test
- Platzieren Sie den vorbereiteten Phagen-Seed-Block und die doppellagige Platte auf dem mobilen Träger des 96-Punkt-Matrix-Inokulators und übertragen Sie alle Phagen-Inokula auf die Semi-Agar-Oberfläche. Fahren Sie mit den Zyklen fort, bis alle getesteten Stämme abgeschlossen sind.
- Lassen Sie die inokulierten Doppelschichtplatten bei RT verbleiben, bis die Feuchtigkeit in den Inokulumflecken vollständig in den Halbagar aufgenommen ist.
- Invertieren Sie die Platten und inkubieren Sie unter geeigneten Bedingungen für die getesteten Stämme für 4-6 Stunden, um sicherzustellen, dass klare lytische Flecken gebildet werden.
- Analysieren von Daten
- Das Bild des experimentellen Ergebnisses jeder Doppelschichtplatte wird mit dem Bildaufnahmekonverter abgerufen und gespeichert (Schritte 1.5.4-1.5.6).
- Erfassen Sie die Anzahl und Morphologien der verschiedenen Formen von Flecken in einer Tabelle, die auf den erhaltenen Bildern basiert, und berechnen Sie die jeweiligen Proportionen der verschiedenen Arten von Phagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In Anlehnung an das Protokoll des intelligenten Hochdurchsatz-AST-Systems wurde dessen Anwendung am Beispiel von Salmonellen aus Geflügel in Shandong, China, veranschaulicht.
Das Wachstum von Salmonella-Stämmen auf Agarplatten mit Ampicillin (R von 32 μg/ml) bei Konzentrationen von 2 bis 256 μg/ml, bestimmt durch den Bildaufnahmekonverter, ist in Abbildung 3 dargestellt. Die horizontale 1. Vertiefung A1 war die Negativkontrolle und zeigte kein Koloniewachstum; A2 und A3 waren die Qualitätskontrollstämme mit MHK 4 μg/ml (die eine Kolonie auf der Agarplatte mit 2 μg/ml Ampicillin bildeten, aber nicht auf der von 4 μg/ml), innerhalb des durch CLSI standardisierten Qualitätskontrollbereichs (2-8 μg/ml). Die MHK des Salmonellenstamms in A4 betrug 64 μg/ml, während die von A5 16 μg/ml betrug. Die MIC-Verteilungen von 93 Salmonellenstämmen gegen Ampicillin wurden von der Software automatisch berechnet.
Abbildung 3: Morphologie von Salmonellen auf einer Reihe von Kulturplatten mit Ampicillin. 8 horizontal: A-H, 12 vertikal: 1-12. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Das Hochdurchsatz-AST-System wurde angewendet, um die AMR von Salmonellenstämmen von Tieren in der Provinz Shandong zu bestimmen. Die MIC-Daten wurden in die Datenbank von Varms (http://www.varms.cn/)12 hochgeladen. Die statistischen Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Insgesamt wurden 10 antimikrobielle Wirkstoffe gegen 300-1.500 Salmonellenstämme getestet, was die Vorteile dieses Systems bei hohem Durchsatz zeigt.
Entsprechend den Widerstandsbruchpunkten des CLSI-Standards wurde die Widerstandsrate (R%) als Prozentsatz der Stämme mit MHK ≥ R unter den getesteten Stämmen berechnet (Tabelle 1). Die R%-Werte von Ampicillin, Ciprofloxacin und Amoxicillin-Clavulansäure lagen über 50%, die R%-Werte von Doxycyclin, Florfenicol, Cefotaxim und Enrofloxacin lagen bei 30%-50% und die R%-Werte von Gentamicin, Amikacin und Meropenem lagen unter 30%. Meropenem wurde bei industriell gezüchteten Tieren nicht angewendet und wies einen R%-Wert von 7 % auf.
Das R% gab den Anteil der Bakterienstämme mit MHK an, die höher als R waren, während die MIC-Verteilung die Anzahl der Stämme mit jedem MHK zeigte, um die Gesamtantibiotikaresistenz von Salmonellen genauer zu beschreiben. Zum Beispiel betrug die R%-Konzentration von Ampicillin 73 %, und die maximale Anzahl von Proben (916 Stämme) wurde mit MHK ≥ 256 μg/ml konzentriert, was darauf hindeutet, dass die Resistenz von Salmonellen gegen Ampicillin ziemlich schwerwiegend war.
Tabelle 1: MIC-Verteilungen, R% und Lar-Index-Werte von Salmonellen von Tieren in der Provinz Shandong. MHK, die fett gedruckt sind, sind die R-Werte von antimikrobiellen Wirkstoffen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Aus Gründen der Einheitlichkeit und Vergleichbarkeit wurden 3 Gradienten vorwärts und rückwärts verlängert, zentriert auf das R jedes Arzneimittels. Nach den MIC-Verteilungen von sieben Gradienten wurde der Lar-Index nach folgender Formel berechnet:
.
Als Beispiel für Ampicillin betrug der R-Wert 32 μg/ml, die Anzahl der Proben betrug 1,414 und Lar = (4/32) x (245/1414) + (8/32) × (16/1414) + (16/32) × (117/1414) + (32/32) × (27/1414) + (64/32) × (36/1414) + (128/32) × (57/1414) + (2566) /32) × (916/1414) = 2-3 × (245/1414) + 2-2 × (16/1414) + 2-1 × (117/1414) + 20 × (27/1414) + 21 × (36/1414) + 2 2 × (57/1414) + 2 3 × (916/1414) = 5,48. Nach dieser Formel wurden die Lar-Indizes anderer antimikrobieller Wirkstoffe berechnet, die in Tabelle 1 dargestellt sind.
Die Signifikanz des Lar-Index bestand darin, den Schweregrad der AMR genau anzugeben. Am Beispiel von Ciprofloxacin und Amoxicillin-Clavulansäure waren ihre R%-Werte mit 68% bzw. 65% ähnlich, aber ihre Lar-Indizes unterschieden sich signifikant von 4,57 bzw. 1,76. Der Grund dafür wurde durch die Verteilung der hohen MHK-Werte in Tabelle 1 deutlich, in der 71,3 % der Ciprofloxacin-resistenten Stämme in 8R (32 μg/ml) verteilt waren, während die MHK der Amoxicillin-Clavulansäure-resistenten Stämme hauptsächlich auf R und 2R konzentriert waren und der Anteil von 8R gering war (8,69 %). Daher war der Lar-Index von Ciprofloxacin höher als der von Amoxicillin-Clavulansäure, was darauf hindeutet, dass der Anteil der hochgradig Ciprofloxacin-resistenten Stämme höher war als der der Amoxicillin-Clavulansäure-resistenten Stämme. Der Lar-Index war ein genauerer Indikator für den Grad der AMR als die Widerstandsrate.
Nach der Formel des Lar-Index wäre der Lar-Index 1, wenn die MHK aller Stämme in Bezug auf ein bestimmtes Medikament R wären; Wenn die MHK aller Stämme 2R wären, wäre der Lar-Index 2. Daher zeigte der Lar-Index mehrere Beziehungen zwischen den umfassenden MHK und dem entsprechenden R-Wert, mit Ausnahme der Kantenkonzentrationen. Der Lar-Index wurde verwendet, um den Grad der AMR zu bewerten, und der Vorteil war ausgeprägter, wenn die AMR höher war. Aus Gründen der Einheitlichkeit und Vergleichbarkeit betrug der Berechnungsbereich des Lar-Index sieben MHK, wobei die vorderen und hinteren 3 Gradienten auf den R-Wert zentriert waren, und der gewichtete Durchschnitt wurde durch Integration der verschiedenen antimikrobiellen Wirkstoffe, der Anzahl der Stämme und der MHK-Verteilung erhalten. Daher lag der Wertebereich des Lar-Index bei 0,125-8. Je näher der Lar-Wert an 0,125 lag, desto niedriger war der AMR, und je näher er an 8 lag, desto höher war der AMR. Es gab jedoch keine proportionale Beziehung zwischen Lar und R an der Randkonzentration. Wenn die antimikrobiellen Wirkstoffe und der Berechnungsbereich des Lar-Index eindeutig waren, wurde der allgemeine Lar-Index auf einen intuitiven, umfassenden Wert normalisiert, der verwendet wurde, um den Grad und den Veränderungstrend von AMR unter den verschiedenen Bedingungen verschiedener Bakterien, Benutzer, Jahre, Regionen usw. direkt zu vergleichen und zu bewerten.
Dem Protokoll des intelligenten Phagen-Screening-Systems folgend, wurde die Anwendung am Beispiel von 96 Salmonellen-Phagen zur Lyse von AMR-Salmonellenstämmen demonstriert und das lytische Muster der Phagen analysiert.
Sechsundneunzig Phagen wurden mit einem 96-Punkt-Matrix-Inokulator auf doppelschichtige Platten übertragen, die Salmonellen enthielten. Die Morphologie der gebildeten Flecken ist in Abbildung 4 dargestellt. Es gab vier Haupttypen (wenn auch nicht auf vier beschränkt): klarer runder Fleck (●), Ansammlung von Plaques (), trüber lytischer Fleck () und kein lytischer Fleck (
○).
Abbildung 4: Morphologie von Salmonellenflecken auf doppellagigen Agarplatten. 1 und 2: die Muster, die von 96 Phagen auf verschiedenen Salmonellenstämmen erzeugt werden. "●" runder klarer Fleck, "" Ansammlung von Tafeln, "" trüber lytischer Fleck, "○" kein lytischer Fleck) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Auf den doppellagigen Platten waren die lytischen Flecken verschiedener Phagen auf verschiedenen Wirtsbakterien in der Morphologie unterschiedlich10. Der "runde, klare lytische Fleck" resultierte aus einem Phagen, der den Wirt auf der Platte zuverlässig abtöten konnte, sich aber auf Kosten dieses Wirts erfolgreich replizieren kann oder auch nicht. In diesem Fall war eine weitere Verdünnung notwendig, um den Typ schlüssig zu bestimmen. Die "Sammlung von Plaques" wurde von echten Plaques gebildet. Jede einzelne Lysezone wurde eindeutig von einem einzigen infektiösen Zentrum aus produziert, was zeigte, dass sich der Phage auf Kosten der Bakterien auf der Platte vermehrt hatte. Der "trübe lytische Fleck" resultierte aus einem Phagen, der den Wirt auf der Platte nicht zuverlässig abtötete und der sich auf Kosten dieses Wirts erfolgreich replizieren kann oder auch nicht. In diesem Fall gab es mehr als eine Möglichkeit, so dass eine Bestätigung auf der Grundlage weiterer Forschungsinteressen erforderlich war. Der "kein lytischer Fleck" deutete auf nichtlytische Natur hin.
Darüber hinaus könnte die Verwendung dieses Systems für vorläufige Tests im Wesentlichen feststellen, ob die Stämme und Bakteriophagen dupliziert wurden. Wenn verschiedene Salmonella-Spezies ausgewählt wurden und die Muster zweier Bakteriophagen identisch waren, deutete dies darauf hin, dass die Bakteriophagen dupliziert sein könnten. Wenn nicht-repetitive Bakteriophagen ausgewählt wurden, um unbekannte Salmonella-Spezies aus klinischen Quellen zu infizieren, und das Phagenmuster das gleiche war, deutete dies darauf hin, dass es sich bei den Salmonellenstämmen um denselben Stamm handeln könnte. Darüber hinaus verfügten die Anzahl und der Anteil der Dubletten über Referenzwerte für epidemiologische Untersuchungen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die Agar-Verdünnungsmethode ist gut etabliert und weit verbreitet. Das Prinzip des Hochdurchsatz-AST-Systems war das der Agar-Verdünnungsmethode. Einer der kritischen Schritte innerhalb des Protokolls war der genaue Hochdurchsatztransfer von 96 Inokula auf einmal, der mehrmals hintereinander durchgeführt wurde. Um diesen kritischen Schritt abzuschließen, waren die Pins des 96-Punkt-Matrix-Inokulators gleichmäßig und sehr glatt. Die natürliche Abscheidung jedes Stifts hatte ein Volumen von ca. 2 μl, das sich zu kleinen Tröpfchen auf der Oberfläche des Agarmediums aggregierte, um schnell in das Agar aufgenommen zu werden, ohne zu fließen oder zu spritzen, um eine Kreuzkontamination zu verursachen. Der zweite kritische Schritt war die statistische Verarbeitung großer AST-Daten. Bei der Hochdurchsatz-Inokulation mussten Testdaten ermittelt werden, und der Arbeitsaufwand war enorm. Die intelligente Analyse und die statistischen Ergebnisse, die der intelligente Bilderfassungskonverter und die unterstützende Software lieferten, waren eine perfekte Lösung für dieses Problem. Die AST-Ergebnisse wurden automatisch direkt in die Varms-Datenbank hochgeladen. Die Effizienz und Genauigkeit der Ergebnisinterpretation wurde verbessert, und die durch menschliche Faktoren verursachten Fehler wurden reduziert13.
Der dritte entscheidende Schritt bestand darin, den Lar-Index der AMR vorzuschlagen. Derzeit gibt es weltweit nur wenige umfassende Evaluierungsindizes für AMR. Laut Literatur wurde von Laxminarayan und Klugman ein Arzneimittelresistenzindex (DRI) beschrieben, um Veränderungen in der Wirksamkeit von Antibiotika zu messen14,15. Sie kombinierte die Prävalenz von Resistenzen und die relative Häufigkeit von Verschreibungen, konnte aber den Grad der AMR nicht charakterisieren und die Veränderungen bei hohen Arzneimittelresistenzen nicht bewerten. Der Drug Effectiveness Index (DEI)16, ein weiterer vom DRI abgeleiteter Index, hat den gleichen Nachteil wie der DRI. Daher wurde der Lar-Index vorgeschlagen, der aus drei Schritten bestand: (1) Die MHK der Bakterienstämme wurden auf der Grundlage des jeweiligen R-Wertes normalisiert, wodurch die Unterschiede in den antimikrobiellen Wirkstoffen, die durch unterschiedliche R-Werte des AST-Standards verursacht wurden, eliminiert wurden; (2) Entsprechend den MHK-Verteilungen wurden die gewichteten Durchschnittswerte so berechnet, dass sie den Grad der AMR genauer widerspiegeln als die Widerstandsrate. (3) Das arithmetische Mittel der Lar-Indizes mehrerer antimikrobieller Wirkstoffe, d. h. der allgemeine Lar-Index, könnte die umfassende Situation der antimikrobiellen Resistenzen widerspiegeln und die Bewertung und den Vergleich von Antibiotikaresistenzen auf verschiedenen Ebenen erleichtern.
Das Hardware-Design dieser Geräte war vernünftig und einfach zu bedienen, und alle Teile liefen reibungslos. Es gab kein Verklemmungsproblem oder -fehler. Das Design der unterstützenden Software entsprach den personalisierten Anforderungen des AST- und Phagen-Screenings und war einfach zu bedienen und zu verwenden. Ein Gerät wurde mit 4-5 Schachteln mit Impfstiften für mehrere Anwendungsszenarien des Batch-Bakterientransfers ausgestattet. Die Kernkomponenten dieses Instruments waren die Impfstiftplatte und Stifte aus Edelstahl, die an eine Vielzahl von Umgebungen anpassbar waren und autoklaviert, zerlegt und ausgetauscht werden konnten. Die Impfstifte wurden so konzipiert, dass sie beliebig kombiniert werden können.
Die Einrichtung eines AMR-Überwachungssystems war aufgrund der Prävalenz resistenter Erreger, die durch den Missbrauch von Antibiotika verursacht werden, unerlässlich. Seit 2008 führt das Team für öffentliche Gesundheit des Instituts für Tierwissenschaften und Veterinärmedizin der Shandong Academy of Agricultural Sciences inder Provinz Shandong 1 2,13,17 sukzessive AMR-Monitoring von Tieren durch. Aufgrund der hohen veterinärmedizinischen Resistenz und des großen Überwachungsvolumens war es notwendig, MHK von Krankheitserregern effizient nachzuweisen, um den Einsatz von antimikrobiellen Wirkstoffen zu regulieren. Die entsprechenden Instrumente für AST sind jedoch teuer, und die Kosten für den Betrieb und die Verbrauchsmaterialien sind hoch und nicht für eine Vielzahl von Großbetrieben geeignet. Aus diesem Grund waren die Entwicklung des intelligenten Hochdurchsatz-AST-Systems und die Standardisierung seiner Anwendung förderlich, um die Etablierung eines Soundsystems für die AMR-Überwachungstechnik voranzutreiben. Nach früheren Untersuchungen12,13 erreichte das intelligente Hochdurchsatz-AST-System eine gute Wiederholbarkeit und Stabilität, um dem CLSI-Standard zu entsprechen, und wurde für AST und die Analyse klinisch pathogener Bakterien bei Tieren eingesetzt. Bis heute wurden umfassende AMR-Daten für mehr als 20.000 epidemische Stämme gesammelt12. Für die resistenten Bakterien, die im Überwachungsprozess gefunden werden, könnte dieses System auch für ein schnelles Hochdurchsatz-Screening lytischer Phagen verwendet werden, um mit antimikrobiellen Wirkstoffen zusammenzuarbeiten, um AMR zu reduzieren. Die Anwendung des 96-Punkt-Matrix-Inokulators und des Bildaufnahmekonverters für das Phagenlyse-Screening war eine erweiterte Funktion, und bisher wurden in diesem Bereich keine anderen Instrumente eingesetzt.
Das intelligente Hochdurchsatz-AST/Phagen-Screening-System kombinierte AST mit lytischen Bakteriophagen, um die Überwachung, Kontrolle und Reduzierung von AMR zu erreichen. Gleichzeitig wurde der Lar-Index intuitiver und prägnanter verwendet, um die Beiträge verschiedener Faktoren und neuer antibakterieller Technologien zur Reduktion von AMR zu bewerten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yuqing Liu et al. haben chinesische Patente für den 96-Punkt-Matrix-Inokulator und den Bilderfassungskonverter und deren Anwendungen angemeldet (Patentnummer ZL 201610942866.3 und Patentnummer ZL 201910968255.X).
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch das National Key Research and Development Project (2019YFA0904003) unterstützt; Modernes landwirtschaftliches Industriesystem in der Provinz Shandong (SDAIT-011-09); Projekt zur Optimierung der internationalen Kooperationsplattform (CXGC2023G15); Wesentliche Innovationsaufgaben des agrarwissenschaftlichen und technologischen Innovationsprojekts der Akademie der Agrarwissenschaften Shandong, China (CXGC2023G03).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well culture plate | Beijing lanjieke Technology Co., Ltd | 11510 | |
| 96-dot matrix AST image acquisition system | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| 96-dot matrix inoculator | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Agar | Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd | HB8274-1 | |
| Amikacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A857053 | |
| Amoxicillin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A822839 | |
| Ampicillin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A830931 | |
| Analytical balance | Sartorius | BSA224S | |
| Automated calculation software for Lar index of AMR | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Bacteria Salmonella strains | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Animal origin |
| Bacterial resistance Lar index certification management system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Ceftiofur | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C873619 | |
| Ciprofloxacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C824343 | |
| Clavulanic acid | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C824181 | |
| Clean worktable | Suzhou purification equipment Co., Ltd | SW-CJ-2D | |
| Colistin sulfate | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C805491 | |
| Culture plate | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Doxycycline | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | D832390 | |
| Enrofloxacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | E809130 | |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SLGP033RB | |
| Florfenicol | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | F809685 | |
| Gentamicin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | G810322 | |
| Glass bottle 50 mL | Xuzhou Qianxing Glass Technology Co., Ltd | QX-7 | |
| High-throughput resistance detection system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Image acquisition converter | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Meropenem | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | M861173 | |
| Mueller-Hinton agar | Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd | HB6232 | |
| Petri dish 60 mm x 15 mm | Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd | 16021-1 | |
| Petri dish 90 mm x 15 mm | Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd | 16001-1 | |
| Salmonella phages | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | |
| Shaker incubator | Shanghai Minquan Instrument Co., Ltd | MQD-S2R | |
| Turbidimeter | Shanghai XingBai Biotechnology Co., Ltd | F-TC2015 | |
| Varms base type library system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Vertical high-pressure steam sterilizer | Shanghai Shen'an medical instrument factory | LDZX-75L | |
| Veterinary pathogen resistance testing management system | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Veterinary resistance cloud monitoring and phage control platform V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright |
References
- Ramanan, L., et al. Antimicrobial resistance-the need for global solutions. The Lancet Infectious Diseases. 13 (12), 1057-1098 (2013).
- Xiaonan, Z., Qing, Z., Thomas, S. P., Yuqing, L., Martha, R. J. C. inPhocus: Perspectives of the application of bacteriophages in poultry and aquaculture industries based on Varms in China. PHAGE: Therapy, Applications, and Research. 2 (2), 69-74 (2021).
- CLSI. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. CLSI document M100. , M100 32nd edition, Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA . (2022).
- Yuqing, L., et al. Antimicrobial Sensitivity Testing Standard of EUCAST. , China Standards Press, Beijing. (2017).
- Barnini, S., et al. A new rapid method for direct antimicrobial susceptibility testing of bacteria from positive blood cultures. BMC Microbiology. 16 (1), 185-192 (2016).
- Höring, S., Massarani, A. S., Löffler, B., Rödel, J. Rapid antimicrobial susceptibility testing in blood culture diagnostics performed by direct inoculation using the VITEK®-2 and BD PhoenixTM platforms. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (3), 471-478 (2019).
- Dupuis, G. Evaluation of the Cobasbact automated antimicrobial susceptibility testing system. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 4 (2), 119-122 (1985).
- A system of bacterial antimicrobial resistance detection and its operation method. China Patent. Liu, Y., et al. , ZL 201610942866.3 (2019).
- A high throughput test plate for screening bacteriophage of zoonotic pathogens and its application. China Patent. Liu, Y. , ZL 201910968255.X (2022).
- Adams, M. H. Bacteriophages. , Interscience Publishers, New York. (1959).
- Nair, A., Ghugare, G. S., Khairnar, K. An appraisal of bacteriophage isolation techniques from environment. Microbial Ecology. 83 (3), 519-535 (2022).
- Shandong veterinary antibiotic resistance system. , http://www.varms.cn (2023).
- Ming, H., et al. Comparison of the results of 96-dot agar dilution method and broth microdilution method. Chinese Journal of Antibiotics. 43 (6), 729-733 (2018).
- Laxminarayan, R., Klugman, K. P. Communicating trends in resistance using a drug resistance index. BMJ Open. 1 (2), e000135 (2011).
- Chen, Y., et al. Assessing antibiotic therapy effectiveness against the major bacterial pathogens in a hospital using an integrated index. Future Microbiology. 12, 853-866 (2017).
- Ciccolini, M., Spoorenberg, V., Geerlings, S. E., Prins, J. M., Grundmann, H. Using an index-based approach to assess the population-level appropriateness of empirical antibiotic therapy. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (1), 286-293 (2015).
- Yanbo, L., et al. Preliminary application of inoculation system for high-throughput drug susceptibility test. China Poultry. 42 (6), 52-57 (2020).
