Summary
Сложные генетические схемы требуют много времени для проектирования, тестирования и оптимизации. Чтобы облегчить этот процесс, клетки млекопитающих трансфицируются таким образом, чтобы можно было тестировать несколько стехиометрий компонентов схемы в одной лунке. В этом протоколе описаны этапы планирования экспериментов, трансфекции и анализа данных.
Abstract
Генетические схемы млекопитающих продемонстрировали потенциал для обнаружения и лечения широкого спектра болезненных состояний, но оптимизация уровней компонентов цепи остается сложной и трудоемкой. Чтобы ускорить этот процесс, наша лаборатория разработала политрансфекцию, высокопроизводительное расширение традиционной трансфекции млекопитающих. При политрансфекции каждая клетка в трансфицированной популяции по существу выполняет свой эксперимент, проверяя поведение схемы при разных числах копий ДНК и позволяя пользователям анализировать большое количество стехиометрий в реакции с одним горшком. До сих пор были продемонстрированы политрансфекции, которые оптимизируют соотношения трехкомпонентных цепей в одной яме ячеек; В принципе, тот же метод можно использовать для разработки еще более крупных схем. Результаты политрансфекции могут быть легко применены для поиска оптимальных соотношений ДНК и котрансфекта для переходных цепей или для выбора уровней экспрессии компонентов схемы для генерации стабильных клеточных линий.
Здесь мы демонстрируем использование политрансфекции для оптимизации трехкомпонентной схемы. Протокол начинается с принципов экспериментального дизайна и объясняет, как политрансфекция основывается на традиционных методах совместной трансфекции. Далее проводится политрансфекция клеток с последующей проточной цитометрией через несколько дней. Наконец, данные анализируются путем изучения срезов данных одноклеточной проточной цитометрии, которые соответствуют подмножествам клеток с определенными соотношениями компонентов. В лаборатории политрансфекция использовалась для оптимизации клеточных классификаторов, контроллеров обратной связи и прямой связи, бистабильных мотивов и многого другого. Этот простой, но мощный метод ускоряет циклы проектирования сложных генетических схем в клетках млекопитающих.
Introduction
Область синтетической биологии млекопитающих быстро прогрессировала: от разработки простых частей восприятия и ответа в культивируемых клеточных линиях до оптимизации сложных сетей генов для решения реальных проблем в диагностике и терапии1. Эти сложные схемы способны воспринимать биологические входы от профилей микроРНК до цитокинов и низкомолекулярных лекарств, а также реализовывать схемы логической обработки, включая транзисторы, полосовые фильтры, тумблеры и осцилляторы. Они также показали многообещающие результаты на животных моделях таких заболеваний, как рак, артрит, диабет и многих других 1,2,3,4,5. Однако по мере роста сложности схемы оптимизация уровней каждого из ее компонентов становится все более сложной задачей.
Одним из особенно полезных типов генетической схемы является классификатор клеток, который может быть запрограммирован на восприятие и реагирование на клеточные состояния. Селективная продукция белков или выходов РНК в определенных клеточных состояниях является мощным инструментом для направления и программирования дифференцировки клеток и органоидов, выявления и уничтожения больных клеток и/или нежелательных типов клеток, а также регулирования функции терапевтических клеток 1,2,3,4,5 . Однако создание схем в клетках млекопитающих, которые могут точно классифицировать клеточные состояния из нескольких клеточных видов РНК и / или белков, было очень сложной задачей.
Одним из наиболее трудоемких этапов разработки схемы классификации клеток является оптимизация относительных уровней экспрессии отдельных генов компонентов, таких как датчики и факторы обработки, в схеме. Чтобы ускорить оптимизацию схем и позволить строить более сложные схемы, в недавних работах использовалось математическое моделирование схем классификаторов ячеек и их компонентов для прогнозирования оптимальных составов и топологий 6,7. Несмотря на то, что до сих пор это показало мощные результаты, математический анализ ограничен необходимостью систематической характеристики поведения входа-вывода генов компонентов в схеме, что отнимает много времени. Кроме того, в сложных генетических схемах может возникнуть множество контекстно-зависимых проблем, в результате чего поведение полной схемы не поддается предсказаниям, основанным на характеристиках отдельных частей 8,9.
Для более быстрой разработки и тестирования сложных схем млекопитающих, таких как классификаторы состояния клеток, наша лаборатория разработала метод, называемый политрансфекцией10, эволюцию протоколов плазмидной котрансфекции. При совместной трансфекции несколько видов плазмидной ДНК комплексируются вместе с положительно заряженным липидным или полимерным реагентом, а затем доставляются в клетки коррелированным образом (рис. 1A). При политрансфекции плазмиды отдельно образуют комплекс с реагентом, так что ДНК из каждого трансфекционного комплекса доставляется в клетки декоррелированным образом (рис. 1B). Используя этот метод, клетки в трансфицированной популяции подвергаются воздействию многочисленных комбинаций соотношений двух или более полезных нагрузок ДНК, несущих различные компоненты схемы.
Для измерения соотношений компонентов цепи, доставляемых в каждую ячейку, каждый трансфекционный комплекс в политрансфекции содержит конститутивно экспрессируемый флуоресцентный репортер, который служит прокси для клеточного поглощения комплекса. ДНК-наполнитель, которая не содержит каких-либо элементов, активных в клетке млекопитающих, используется для настройки относительного количества флуоресцентного репортера и компонентов схемы, доставляемых в клетку в одном трансфекционном комплексе, и более подробно обсуждается в обсуждении. Примером ДНК-наполнителя, используемой в лаборатории Вайса, является плазмида, содержащая последовательность терминатора, но без промотора, кодирующей последовательности и т. д. Затем можно сравнить клетки с различными соотношениями компонентов цепи, чтобы найти оптимальные соотношения для функции генной цепи. Это, в свою очередь, дает полезные прогнозы для выбора промоторов и других элементов схемы для достижения оптимальных уровней экспрессии генов при объединении компонентов схемы в единый вектор для генетической интеграции (например, лентивирус, транспозон или посадочная площадка). Таким образом, вместо того, чтобы выбирать соотношения между компонентами схемы на основе интуиции или с помощью трудоемкого процесса проб и ошибок, политрансфекция оценивает широкий спектр стехиометрий между генетическими частями в реакции с одним горшком.
В нашей лаборатории политрансфекция позволила оптимизировать многие генетические схемы, включая классификаторы клеток, контроллеры обратной связи и прямой связи, а также бистабильные мотивы. Этот простой, но мощный метод значительно ускоряет циклы проектирования сложных генетических схем в клетках млекопитающих. С тех пор политрансфекция использовалась для характеристики нескольких генетических цепей, чтобы выявить их многомерные функции передачи ввода-вывода с высоким разрешением10, оптимизировать альтернативную топологию схемы для классификации состояния клетки 11 и ускорить различные опубликованные12,13 и текущие проекты.
Здесь мы описываем и изображаем рабочий процесс использования политрансфекции для быстрой оптимизации генетической цепи (рис. 2). Протокол показывает, как генерировать высококачественные данные политрансфекции и избежать нескольких распространенных ошибок в протоколе политрансфекции и анализе данных (рис. 3). Затем он демонстрирует, как использовать политрансфекцию для характеристики простых компонентов схемы и, в процессе, сравнивать результаты политрансфекции с совместной трансфекцией (рис. 4). Наконец, результаты политрансфекции показывают оптимизацию схемы классификатора рака (рис. 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Таблицы 1 и 2 служат важными ссылками для этого протокола. В таблице 1 показано масштабирование реагентов для реакций, а в таблице 2 показана арифметика соотношения ДНК для примера политрансфекции, описанной в протоколе (верхняя половина), и для возможного последующего эксперимента (нижняя половина).
1. Подготовка клеток к трансфекции
- Перед началом протокола убедитесь, что культура эмбриональных клеток почек человека (HEK293) сливается на 60-80%. Для этого за 2 дня до этого высевают 1 x 106 клеток в чашку Петри для культуры тканей размером 100 мм x 15 мм и инкубируют при 37 °C с 5%CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя наш протокол фокусируется на клетках HEK293, другие типы клеток могут быть заменены. - Подготовьте среду и клетки к трансфекции, как описано ниже.
- Предварительно подогрейте не менее 20 мл раствора модифицированной орлиной среды Дульбекко (DMEM) с 10% эмбриональной бычьей сывороткой (FBS) и 1% заменимыми аминокислотами (NEAA; см. Таблицу материалов) до 37 °C. Предварительно подогрейте не менее 2,4 мл трипсина и 2,4 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) до 37 ° C. Предварительно подогрейте среднюю сыворотку до ~16 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все работы по культивированию тканей должны выполняться с осторожностью в шкафу биобезопасности.
- Предварительно подогрейте не менее 20 мл раствора модифицированной орлиной среды Дульбекко (DMEM) с 10% эмбриональной бычьей сывороткой (FBS) и 1% заменимыми аминокислотами (NEAA; см. Таблицу материалов) до 37 °C. Предварительно подогрейте не менее 2,4 мл трипсина и 2,4 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) до 37 ° C. Предварительно подогрейте среднюю сыворотку до ~16 °C.
- Ресуспендируйте клетки в растворе DMEM, как описано ниже.
- Аспирировать и утилизировать текущие носители. Нанесите 2 мл PBS на культуру клеток HEK293 для промывки клеток. Аспирируйте и утилизируйте PBS.
- Распределите 2 мл трипсина на клеточную культуру HEK293. Поместите чашку Петри в инкубатор при температуре 37 °C на 3 минуты или до тех пор, пока клетки не перестанут прилипать к чашке. Верните блюдо в шкаф биобезопасности и разбавьте клеточный раствор, дозировав 8 мл раствора DMEM в тарелку.
- Смешайте раствор, аккуратно пипетируя вверх и вниз несколько раз. Аспирируйте все носители и поместите их в коническую пробирку объемом 15 мл.
- Центрифугируйте клетки при 300 x g в течение 3 мин, чтобы гранулировать их. Аспирируйте носитель (стараясь не аспирировать клетки) и выбросьте его. Ресуспендируют клетки в 5 мл раствора DMEM, перемешивая, осторожно пипетируя вверх и вниз.
- Оцените текущую концентрацию ячеек с помощью автоматизированного счетчика ячеек (приведенного в таблице материалов). Засейте шесть лунок (в этом примере) в 24-луночную тарелку с 1 x 105 ячейками (для плотности посева 50 000 ячеек/см2).
- Добавьте раствор DMEM до 500 мкл (сначала добавьте раствор DMEM в лунки), а затем пометьте одну лунку на каждую обработку следующим образом: без контроля цвета, контроль mKO2, контроль TagBFP, контроль NeonGreen, контроль цвета и политрансфекция 1. Контрольные лунки TagBFP, mKO2 и NeonGreen представляют собой одноцветные регуляторы для всех флуоресцентных белков, включенных в политрансфекцию.
2. Выполнение трансфекции
- Подготовьте пробирки для каждого агрегата ДНК. Отложите в сторону пробирки для микроцентрифуг объемом 1,5 мл и пометьте пробирки как: без контроля цвета, контроль mKO2, контроль TagBFP, контроль NeonGreen, контроль всего цвета, смесь политрансфекции 1 и смесь политрансфекции 2.
- Добавьте 36 мкл восстановленной сывороточной среды в контрольную камеру без цвета, контроль mKO2, контроль TagBFP, контроль NeonGreen и все пробирки для контроля цвета. Добавьте 18 мкл восстановленной сывороточной среды в каждую из пробирок для политрансфекционной смеси 1 и политрансфекционной смеси 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предполагается, что концентрация плазмиды составляет 150 нг/мкл. - Добавьте 600 нг плазмиды-наполнителя в пробирку без контроля цвета. Добавьте 300 нг мКО2 и 300 нг плазмиды-наполнителя в цветную контрольную трубку мКО2. Добавьте 300 нг TagBFP и 300 нг плазмиды-наполнителя в пробирку для контроля цвета TagBFP.
- Добавьте 300 нг конститутивной плазмиды NeonGreen и 300 нг плазмиды-наполнителя в цветную контрольную трубку NeonGreen. Добавьте по 100 нг mKO2, TagBFP и конститутивного NeonGreen, а также 300 нг плазмиды-наполнителя в контрольную трубку для всех цветов.
- Добавьте 150 нг мКО2 в 1 пробирку для политрансфекционной смеси. Добавьте 75 нг репортерной плазмиды NeonGreen и 75 нг плазмиды-наполнителя в пробирку политрансфекционной смеси 1.
- Добавьте 150 нг TagBFP в пробирку для политрансфекционной смеси 2. Добавьте 75 нг плазмиды L7ae и 75 нг плазмиды-наполнителя в пробирку с политрансфекционной смесью 2.
- Добавьте 36 мкл восстановленной сывороточной среды в контрольную камеру без цвета, контроль mKO2, контроль TagBFP, контроль NeonGreen и все пробирки для контроля цвета. Добавьте 18 мкл восстановленной сывороточной среды в каждую из пробирок для политрансфекционной смеси 1 и политрансфекционной смеси 2.
- Создайте мастер-смесь для трансфекции в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл, объединив 216 мкл восстановленной сывороточной среды с 9,48 мкл реагента для трансфекции (см. Таблицу 1 для соотношения реагентов и масштабирования реакции). Хорошо перемешайте, пипеткой вверх и вниз, и отложите в сторону.
- Добавьте 1,58 мкл реагента-усилителя в каждую из пробирок без контроля цвета, одного контроля цвета и всех пробирок для контроля цвета. Добавьте 79 мкл реагента-усилителя в каждую из пробирок с политрансфекционной смесью. Смешайте каждую трубку по отдельности, энергично пипетируя.
- Добавьте мастер-смесь трансфекции в каждую пробирку, содержащую ДНК.
- Добавьте 37,58 мкл мастер-смеси трансфекции в каждую из трубок без контроля цвета, контроля одного цвета и всех трубок контроля цвета. Смешайте каждую трубку по отдельности, энергично пипетируя.
- Добавьте 18,79 мкл смеси для трансфекции в каждую из пробирок смеси для политрансфекции. Смешайте каждую трубку по отдельности, энергично пипетируя.
- Распределите смеси для трансфекции в лунки.
- Пипетка 65,97 мкл каждой смеси для трансфекции для бесцветных, одноцветных и всех элементов управления цветом в соответствующие лунки.
- Пипеткой 32,98 мкл политрансфекции смешайте 1 в лунку для политрансфекции и быстро, но осторожно закрутите пластину плотной восьмеркой вдоль плоской поверхности для эффективного распределения комплексов. Затем пипетку 32,98 мкл политрансфекционной смеси 2 помещают в ту же лунку для политрансфекции и таким же образом перемешивают пластину.
- Поместите планшет в инкубатор при температуре 37 °C, с 5% CO2 и без встряхивания, на 48 часов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для повышения жизнеспособности клеток клеточную среду можно заменять каждые 6 ч после трансфекции (хотя это не всегда необходимо, а с клетками HEK293 и его производными нужно быть осторожным, чтобы не отсоединить клетки от пластины при смене среды).
| Реагент | Количество | Масштабирование | ||||
| Восстановленная сывороточная среда для смеси ДНК | 36 мкл на контрольную трубку, 18 мкл на политрансфекционную трубку | 0,05 мкл Снижение сывороточной среды/нг ДНК на пробирку с дополнительным объемом на 10-20% для учета пипетирования | ||||
| ДНК | 300-600 нг на тюбик | |||||
| П3000 | 1,58 мкл на контрольную трубку, 0,79 мкл на политрансфекционную трубку | 0,0022 мкл P3000/нг ДНК на пробирку, с 10-20% дополнительной | ||||
| Уменьшенная сыворотка для мастер-микса Lipo | 36 мкл на контрольную трубку, 18 мкл на политрансфекционную трубку | 0,05 мкл снижал общую ДНК сывороточной среды/нг с дополнительным объемом на 10-20% для учета пипетки | ||||
| Реагент для трансфекции и энхансера | 1,58 мкл на контрольную трубку, 0,79 мкл на политрансфекционную трубку | 0,0022 мкл ДНК липофектамина 3000 / нг, с 10-20% дополнительной | ||||
Таблица 1: Удаление накипи реагентами при трансфекциях. В таблице указано правильное соотношение реагента для включения количества ДНК, включенного в одну лунку. Это может быть использовано для эффективного масштабирования реакций и формирования мастер-смесей. Количество реагента было масштабировано, чтобы включить 20% избыток.
3. Подготовка клеток к проточной цитометрии
- Предварительно подогрейте не менее 4,2 мл раствора DMEM до 37 °C. Предварительно нагрейте не менее 4,2 мл трипсина и 4,2 мл PBS до 37 °C. Храните буферный раствор для сортировки клеток, активируемого флуоресценцией (FACS), при температуре 4 °C до готовности к использованию.
- Ресуспендируют клетки в буферном растворе FACS (PBS с добавлением 1% BSA, 5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты [ЭДТА] и 0,1% азида натрия [NaN3], чтобы уменьшить комкование; см. Таблицу материалов), как описано ниже.
- Аспирируйте и утилизируйте текущую среду в каждой скважине. Распределите по 5 мл PBS в каждую лунку, чтобы промыть клетки. Аспирируйте и утилизируйте PBS.
- Распределите по 5 мл трипсина в каждую лунку. Поместите тарелку в инкубатор при температуре 37 °C на 3 минуты или до тех пор, пока ячейки не перестанут прилипать к блюду. Верните пластину в шкаф биобезопасности и разбавьте клеточные растворы, дозировав 5 мл раствора DMEM в каждую лунку.
- Для каждой лунки перемешайте раствор, аккуратно пипетируя вверх и вниз несколько раз. Для каждой лунки аспирируйте всю среду и поместите ее в коническую пробирку объемом 15 мл.
- Центрифугируйте клетки при 300 x g в течение 3 мин, чтобы гранулировать их. Аспирируйте носитель, стараясь не аспирировать клетки и не выбрасывать их. В каждой пробирке ресуспендируют клетки в 5 мл буферного раствора FACS, перемешивая, осторожно пипетируя вверх и вниз.
- Пропустите каждый раствор клеточной суспензии через ситечко (для удаления комков) в отдельные конические пробирки для проточной цитометрии. Держите эти пробирки на льду не более 1 часа и как можно скорее проведите проточную цитометрию.
4. Выполнение проточной цитометрии
ПРИМЕЧАНИЕ: Работа с проточным цитометром требует надлежащей подготовки и знания необходимых задач. Поскольку программное обеспечение и оборудование могут различаться, а пользователи должны быть обучены в целом, этот раздел относится к конкретным операциям, которые полезно выполнять.
- Во-первых, исследуйте клетки, трансфицированные с помощью плазмиды-наполнителя (без контроля цвета), чтобы выбрать характеристики клеток и избежать аномалий (включая агрегаты, мусор и т. Д.). Несмотря на то, что существует множество комбинаций параметров для различения ячеек, используйте следующие три основных параметра в качестве хорошего способа визуализации отличительных признаков.
- Сравните область бокового рассеяния (логарифмическая или линейная шкала для предпочтения/типа ячейки) по сравнению с областью прямого рассеяния (линейная шкала).
- Сравните высоту бокового разброса (логарифмическая шкала) с шириной бокового разброса (линейная шкала).
- Сравните ширину прямого разброса (линейная шкала) с высотой прямого разброса (линейная шкала).
- Затем посмотрите на одноцветные элементы управления. Используйте регулятор всех цветов для настройки напряжений прибора таким образом, чтобы сигналы от каждого флуоресцентного белка нормализовались до эквивалентных произвольных единиц (а.е.) флуоресценции. Затем запустите элементы управления одним цветом для каждого флуоресцентного белка, которые используются для установки компенсационной матрицы, позволяющей корректировать просачивание.
ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале должен быть виден полный динамический диапазон значений флуоресценции. Дальнейшая нормализация сигналов флуоресцентных белков может быть осуществлена путем преобразования в стандартизированные единицы (например, молекулы эквивалентного флуоресцеина [MEFLs; см. Beal et al.15]). Чтобы включить преобразование MEFL во время анализа, запустите радужные калибровочные шарики. Такая калибровка также полезна для уменьшения колебаний сигнала от прибора к прибору и в повседневнойжизни16. - Запустите пробирку с образцом политрансфекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Там, где это возможно, рекомендуется запускать ячейки размером 1,000 x 10^ (^ = смеси), так как политрансфекции более высокой размерности должны быть разделены на большее количество ячеек во время анализа, и каждая ячейка нуждается в достаточном количестве ячеек (в идеале >10) для проведения статистически значимых сравнений.
5. Проведение анализа после эксперимента
- Первоначально используйте данные с элементов управления (и, если применимо, бусин), чтобы обеспечить точные результаты. Используйте один из доступных программных инструментов для выполнения стробирования живых клеток (с использованием ворот, описанных выше), компенсации и коррекции автофлуоресценции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно мы используем либо пользовательский код MATLAB (например, https://github.com/jonesr18/MATLAB_Flow_Analysis или Cytoflow17), который имеет как графический пользовательский интерфейс, так и библиотеку Python, подходящую как для фазы предварительной обработки, так и для анализа политрансфекции.
| Метод | Сложный | нг флуоресцентный маркер | нг L7ae (фракция) | нг Репортер (дробь) | ng ДНК наполнителя (фракция) | Всего (нг) |
| Политрансфекция 1 | 600 | |||||
| → | 1 | 150 | 75 (½) | 75 (½) | 300 | |
| → | 2 | 150 | 75 (½) | 75 (½) | 300 | |
| Политрансфекция 2 | 600 | |||||
| → | 1 | 150 | 25 (1/6) | 125 (5/6) | 300 | |
| → | 2 | 150 | 125 (5/6) | 25(1/6) | 300 |
Таблица 2: Количество ДНК для политрансфекции, продемонстрированное в протоколе, и пример последующего эксперимента с настроенными соотношениями плазмид. В верхней половине таблицы показан состав плазмид, используемых в простом эксперименте по политрансфекции. Нижняя половина показывает состав обновленного эксперимента, который регулирует соотношения плазмид для лучшей выборки гипотетического пространства концентрации, где модулятор экспрессии генов находится в более оптимальном соотношении 1:5 по отношению к его репортеру, что дает больше трансфицированных клеток для выборки вокруг этого соотношения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 мы сравниваем котрансфекцию с политрансфекцией. При совместной трансфекции все плазмиды доставляются в одну и ту же смесь для трансфекции, что приводит к высокой корреляции между количеством каждой плазмиды, получаемой любой отдельной клеткой (рис. 1A). В то время как количество общих плазмид, доставляемых в каждую клетку, значительно варьируется, флуоресценция двух репортерных белков в отдельных клетках по всей популяции хорошо коррелирует, что указывает на то, что две плазмиды совместно доставляются в довольно постоянном соотношении. Трансфицированные клетки могут поглощать несколько или много комплексов, но, поскольку каждый комплекс имеет коррелированные количества каждой плазмиды, котрансфекция исследует только небольшую диагональную область пространства концентрации между двумя плазмидами. Напротив, при политрансфекции плазмиды доставляются в нескольких трансфекционных комплексах, что приводит к декоррелированной доставке плазмид в различных трансфекционных смесях (рис. 1B). Трансфицированные клетки поглощают различные комбинации комплексов, в результате чего клетки содержат различные дозы плазмид ни из одного, ни из одного, ни из обоих комплексов.
На рисунке 2 показан репрезентативный рабочий процесс политрансфекции. Как правило, эксперимент по политрансфекции состоит из следующих этапов: определение проблемы, создание смесей для трансфекции, инкубация клеток, проточная цитометрия и анализ. Существует также необязательный шаг для повторения политрансфекции с оптимизированным соотношением частей, если первоначальные результаты политрансфекции не могут точно сузить оптимальное соотношение частей. Эти шаги изложены в протоколе.
На рисунке 3 приведены некоторые примеры хорошо выполненных ко- и политрансфекций и распространенных ошибок. На рисунке 3A показана хорошо выполненная котрансфекция с тесной корреляцией между TagBFP и eYFP-экспрессирующими плазмидами, которые были совместно доставлены. Напротив, котрансфекция на рисунке 3B показывает плохую корреляцию между этими двумя плазмидами. На показанном рисунке плохая корреляция обусловлена добавлением реагента-энхансера в восстановленную сывороточную среду перед добавлением плазмид. Такая плохая корреляция в экспериментах также может быть связана с различными промоторами, управляющими экспрессией флуоресцентных белков, плохим перемешиванием во время создания смеси трансфекции или позволением комплексу инкубироваться в течение слишком короткого или слишком длительного интервала.
На рисунке 3C показана хорошо выполненная политрансфекция с хорошим покрытием двумерного пространства и хорошей компенсацией любого спектрального протечки между флуоресцентными белками. На рисунке 3D показаны данные политрансфекции с небольшим количеством живых клеток, которые трудно разделить на достаточное количество ячеек с достаточным количеством ячеек в каждой ячейке для анализа. Чтобы решить эту проблему, исходная клеточная популяция должна быть в добром здравии и не разрастаться, а экспериментальная токсичность должна быть снижена за счет использования другого реагента для трансфекции и/или трансфекции с меньшим количеством общей ДНК. На рисунке 3E показана политрансфекция, в которой эффективность трансфекции была низкой, что снова привело к редкому охвату двумерного пространства для анализа. В этом случае количество клеток, проходящих морфологическое стробирование, велико, но клетки не экспрессируют флуоресцентные белки. Для повышения эффективности необходимо оптимизировать выбор реагента для трансфекции и строго следовать протоколу производителя. Каждая смесь для трансфекции должна содержать эквивалентное количество массы ДНК, гарантируя, что клетки имеют примерно равные шансы получить каждый тип комплекса, и каждая смесь для трансфекции должна быть сделана в соответствии с инструкциями набора. Различные наборы для трансфекции оптимальны для разных типов клеток; Следует использовать набор, который дает наилучшую эффективность в интересующем типе клетки. Наконец, некоторые типы клеток трудно трансфицировать, независимо от используемого набора. В этих случаях следует трансфицировать большее количество клеток и собрать как можно больше во время проточной цитометрии, чтобы обеспечить достаточное количество клеток для анализа. На рисунке 3F показаны данные политрансфекции, где один из маркеров флуоресцентного белка ясно показывает спектральное просачивание в другой флуоресцентный белок. Одноцветные элементы управления всегда должны выполняться для всех флуоресцентных белков в системе и использоваться для создания компенсационной матрицы, которая должна быть применена ко всем политрансфекциям перед анализом.
При первом проведении экспериментов по политрансфекции (в целом или для новой экспериментальной системы) следует проводить сравнительный анализ со стандартной котрансфекцией. Один из подходов заключается в индивидуальном измерении передаточной функции ввода-вывода для ключевых частей системы с использованием как котрансфекции (путем настройки доз ДНК), так и политрансфекции.
На рисунке 4 мы демонстрируем сравнительный анализ трансляционного репрессора L7Ae, адаптированного здесь из оригинальной публикации10 по политрансфекции. L7Ae представляет собой РНК-связывающий белок, который распознает мотивыизлома РНК (KT) 20; когда два KT (2xKT) помещаются в 5'-нетранслируемую область (UTR) мРНК, нисходящая трансляция открытой рамки считывания (ORF) может быть эффективно подавлена L7Ae21. L7Ae ранее использовался для построения классификаторов21 типов клеток на основе РНК и других схем22 на основе РНК. Чтобы протестировать L7Ae с помощью стандартной совместной трансфекции, можно настроить соотношения плазмид, кодирующих L7Ae, и его целевого репортера в различных смесях трансфекции (рис. 4A и таблица 3). Для политрансфекции следует независимо доставлять конститутивный L7Ae и соответствующий репортер 2xKT в отдельных трансфекционных смесях, чтобы в клетки доставлялся широкий диапазон соотношений плазмид (рис. 4B). После проведения трансфекции и проточной цитометрии может быть выполнен анализ данных. Чтобы сделать данные сопоставимыми, можно сопоставить отдельные результаты совместной трансфекции в единый набор данных, а затем выполнить аналогичное многомерное биннирование с данными политрансфекции (рис. 4C, D). Сравнивая кривые доза-реакция L7Ae, подавляющего выходной репортер, можно увидеть, что медианный выходной уровень на ячейку очень похож между данными о котрансфекции и политрансфекции (рис. 4E-G).
В целом, мы видели, что данные политрансфекции хорошо коррелируют с данными о котрансфекции в широких соотношениях ДНК с меньшей точностью при сильно искаженных соотношениях дозировки ДНК (отчасти из-за более низкого покрытия клеток в бункерах для экспериментов по политрансфекции, особенно для частей, которые очень сильно активны при низких дозах плазмиды). Чтобы повысить точность измерений для таких чувствительных участков, уровень их экспрессии может быть снижен с помощью более слабого промотора, открытых кадровсчитывания 18 или опосредованных молчанием микроРНК тонких настроек (miSFIT)19.
На рисунке 5 показано успешное применение политрансфекции для оптимизации классификатора клеточного типа, опять же адаптированного из Gam et al10. Классификатор представляет собой относительно простую конструкцию, которая производит выход в ответ на экспрессию miR-21-5p, микроРНК, чрезмерно экспрессируемой во многих опухолевых клетках23. В отсутствие miR-21 выход классификатора подавляется бактериальным транскрипционным репрессором BM3R124, адаптация которого, как было показано ранее, работает в клетках25 млекопитающих. Когда miR-21 присутствует, он связывает четыре целевых сайта, размещенных как в 3', так и в 5' UTR BM3R1, сбивая его экспрессию и, таким образом, обеспечивая выходную транскрипцию (рис. 5A). Чтобы оптимизировать эту систему, три компонента схемы были доставлены в отдельных трансфекционных смесях: (1) BM3R1 (с мишенями miR-21), (2) выходной репортер (mKO2) и (3) Gal4-VP16, который активирует транскрипцию выходного сигнала (таблица 4). Обратите внимание, что промотор вывода работает по логике (Gal4-VP16), а не BM3R1, который подавляет вывод даже при наличии Gal4-VP1625. Каждая часть кодирует маркер трансфекции, TagBFP, mNeonGreen и iRFP720, соответственно, на одной и той же плазмиде, чтобы указать относительную дозировку ДНК каждого комплекса. В целом, повышенная экспрессия Gal4-VP16 должна увеличивать выход репортера mKO2, в то время как повышенная экспрессия BM3R1 должна приводить к снижению выхода mKO2. Поскольку BM3R1 сбивается miR-21-5p, выходная экспрессия должна быть выше в клетках HeLa, которые имеют более высокие уровни miR-21-5p и, следовательно, экспрессируют меньше BM3R1, чем в клетках HEK.
После политрансфекции в клетки HEK293 и HeLa мы получили 3D-распределение различных соотношений плазмид (рис. 5B-HEK клетки). Gam et al.10 подвыборили это распределение в различных соотношениях, рассматривая клетки в пределах определенного евклидова расстояния от интересующего соотношения; Это расстояние должно быть достаточно широким, чтобы включать достаточное количество ячеек, чтобы обеспечить статистически значимые результаты анализа, но достаточно узким, чтобы избежать ненужного шума от включения слишком широкого набора соотношений компонентов трех частей. Затем Gam et al.10 использовали алгоритм оптимизации для определения соотношения частей, которое максимизировало точность классификации для совместной трансфекции (т. е. трансфицированные клетки HeLa положительны для выходной экспрессии, а трансфицированные клетки HEK - нет). Установлено, что оптимальное соотношение деталей составляет 10,9:1,5:1: Gal4-VP16:output:BM3R1; клетки, поддискретизированные вокруг оптимального соотношения во всем пространстве политрансфекции, показаны на рисунке 5C. Эта подвыборка предсказала, что при таком соотношении котрансфицированная цепь имеет 91% специфичность, 62% чувствительность и 77% точность при классификации HEK293 по сравнению с клетками HeLa (рис. 5D). Котрансфекция с соотношением плазмид, установленным на этот оптимум, дала еще лучшие результаты: 99% специфичности, 68% чувствительности и 84% точности10. Кроме того, соотношения определяли реализацию одноплазмидной версии схемы с относительной экспрессией, настроенной с использованием различных усеченных промоторов и восходящих ORF (uORF), что давало схему с 91% специфичностью, 90% чувствительностью и 90% точностью10. Таким образом, политрансфекция является мощным инструментом для более широкого проектирования клеточных классификаторов и генных схем.
Рисунок 1: Сравнение котрансфекции и политрансфекции. (А, Б) Обзор и сравнение доставки плазмиды с котрансфекцией двух плазмид и политрансфекцией двух плазмид. Для каждого метода трансфекции крайняя левая диаграмма показывает образование трансфекционных комплексов между отрицательно заряженной ДНК и положительно заряженными липидами. В этих примерах каждая цветная плазмида (синяя и красная) кодирует экспрессию другого флуоресцентного белка. На центральной диаграмме показаны примеры доставки плазмиды в клетки, а также схема ожидаемых распределений на гистограмме или диаграмме рассеяния. Интенсивность цвета на гистограмме соответствует флуоресценции от соответствующего цвета плазмиды. На крайней правой диаграмме показаны реальные данные из ячеек, трансфицированных с использованием каждого заданного метода. (A) При совместной трансфекции с двумя различными плазмидами обе плазмиды смешивают вместе перед добавлением реагента для трансфекции, что приводит к высокой корреляции упаковки двух видов плазмид. В фактических данных о котрансфекции клетки демонстрируют коррелированную доставку обеих плазмид (справа). (B) При политрансфекции каждый набор совместно доставленных плазмид, соответствующих части схемы и маркеру трансфекции, смешивается с трансфекционным реагентом отдельно, в результате чего образуются комплексы, содержащие только эти плазмиды (слева). В фактических данных о политрансфекции клетки исследуют широкий диапазон концентрационного пространства с одновременным исследованием множества различных плазмидных стехиометрий (справа). Эта цифра была изменена с10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Рабочий процесс политрансфекции. Шаг 1: Определите проблему. Начните с системы с несколькими компонентами, для которых идеальное соотношение между частями неизвестно, и выберите начальное соотношение между компонентами. Шаг 2: Создайте смеси для трансфекции. Каждая трансфекционная смесь содержит компонент схемы и флуоресцентный маркер трансфекции. Количество части цепи, доставленной в клетку, коррелирует с флуоресценцией маркера. Шаг 3: Инкубируйте клетки. В типичном рабочем процессе мы инкубируем клетки в течение 48 часов между трансфекцией и проточной цитометрией. Шаг 4: Проточная цитометрия. Запустите соответствующие элементы управления, как описано в протоколе, а затем запустите примеры. Шаг 5: Анализ.Используйте маркеры трансфекции для объединения клеток в ячейки в соответствии с количеством или соотношением частей, полученных клеткой. Используйте выходной белок(и) для измерения производительности схемы. Найдите ячейки/соотношения деталей, которые оптимизируют производительность схемы. Шаг 6: Повторите с оптимизированными соотношениями деталей (опционально). Если оптимальные ячейки/соотношения находятся в сильно перекошенных соотношениях, пилотная политрансфекция может не сузить оптимальные соотношения частей точно. Повторите политрансфекцию с настроенным соотношением частей, так что клетка, получившая равное количество каждой смеси трансфекции, теперь получает близкое к оптимальному соотношение частей, как определено предыдущим раундом. Эта цифра была изменена с10. Было использовано изображение инкубатора от Servier Medical Art и изображение цитометра от BioRender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативные положительные и отрицательные результаты политрансфекции . (A) Хорошо выполненная совместная трансфекция двух флуоресцентных репортеров, демонстрирующая тесную корреляцию. Всего 20 000 ячеек нанесены как здесь, так и в (B) для сравнения. Перед началом эксперимента по политрансфекции рекомендуется провести аналогичную небольшую пробную совместную трансфекцию двух флуоресцентных репортеров, чтобы убедиться, что плазмиды хорошо коррелируют в трансфекционных смесях. (B) Более шумная котрансфекция: плазмиды плохо коррелируют в каждой смеси трансфекции, что может привести к тому, что флуоресцентные маркеры в политрансфекции будут плохим маркером соотношения плазмид. (C) Хорошо выполненные результаты политрансфекции, показывающие хорошее количество клеток, эффективность трансфекции и компенсацию. (D) Низкое количество живых клеток, что не позволяет проводить подвыборку в контейнеры со статистически значимым числом клеток. (E) Низкая эффективность трансфекции, которая не позволяет проводить подотбор проб в бункеры со статистически значимым числом клеток. (F) Отсутствие соответствующей компенсации, что приводит к тому, что данные флуоресценции являются плохим показателем количества флуоресцентного белка в системе. Используйте одноцветные элементы управления, чтобы определить идеальную матрицу линейной компенсации и применить ее к данным перед дальнейшей обработкой. Все элементы управления цветом также рекомендуются в зависимости от выбора программного обеспечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Сравнительный анализ политрансфекции с котрансфекцией. (A) При совместной трансфекции в каждой экспериментальной скважине может быть проверено одно отношение трансляционного репрессора L7Ae к флуоресцентным репортерным плазмидам. (B) При политрансфекции многие соотношения L7Ae и репортеров могут быть проверены в одной и той же скважине. См. Таблицу 3 для получения подробной информации о политрансфекционных плазмидных смесях. (С,Д) Рабочий процесс биннинга для сравнения политрансфекции с несколькими совместными трансфекциями. В общей сложности для каждого измерения маркера трансфекции было назначено 10 биэкспоненциально разнесенных ячеек, которые аппроксимируют уровни каждой из двух плазмид. Здесь показаны ячейки, обозначающие разные уровни плазмиды #2. Биннинг был выполнен как на собранном наборе из 11 образцов котрансфекции, охватывающих различные соотношения плазмид (C), так и на данных одной политрансфекции, включающей около 500 000 клеток каждая (D). Цвета соответствуют наборам ячеек, определяемых уровнями гена 2 (TagBFP). (Э-Г) Сравнительный анализ политрансфекции и котрансфекции для репрезентативной схемы. Медиана выходной флуоресценции была оценена для клеток в каждом бункере и сравнена между методами репрезентативной системы, трансляционной репрессии L7Ae. (E) Конструкции для измерения активности L7Ae. Флуоресценция mKO2 служит оценкой доставки L7Ae (ген #1), в то время как флуоресценция TagBFP служит оценкой доставки регулируемого выхода mNeonGreen (ген #2). (F) Многомерные кривые титрования для L7Ae. Каждая строка представляет собой набор ячеек на одном уровне TagBFP, как обозначено в (C) и (D). Сплошные линии обозначают данные политрансфекции, а пунктирные линии обозначают данные котрансфекции. На каждом уровне репортерной плазмиды репортерный выход уменьшается по мере увеличения L7Ae. (G) Визуальное сравнение между котрансфекцией и политрансфекцией для системы L7Ae. Каждая точка представляет собой измеренный выходной сигнал в соответствующих ячейках для измерений политрансфекции и котрансфекции, где более эквивалентные значения находятся ближе к красной линии 1:1. В целом, различия, наблюдаемые между политрансфекцией и котрансфекцией, невелики, что обеспечивает уверенность в надежности метода политрансфекции. Эта цифра была изменена с10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Анализ данных для политрансфекции. При политрансфекции клетки могут быть сгруппированы в ячейки или срезы для анализа. На рисунке 4 показана форма анализа, при которой клетки объединяются в срезы, соответствующие уровням компонента системы, такие как уровень репортерной плазмиды, что может быть полезно для подгонки модели и понимания реакций дозировки. Другой полезной стратегией является анализ характеристик схемы при различных соотношениях компонентов схемы. (А) Схема схемы классификатора для оптимизации. Уровни TagBFP, NeonGreen и iRFP720 соответствуют уровням BM3R1, выходного mKO2 и Gal4-VP16 соответственно. См. Таблицу 4 для получения подробной информации о политрансфекционных плазмидных смесях. (B) Экспериментальная установка политрансфекционных смесей. (C) Данные проточной цитометрии, собранные в результате политрансфекции со схемой в (A). Уровни каждого из трех репортерных флуоресцентных белков в результате политрансфекции цепи в клетки HEK, демонстрирующие широкий диапазон соотношений компонентов схемы, присутствующих в данных. Аналогичные результаты были получены при трансфекции цепи как в клетках HEK, так и в клетках HeLa. (D) Политрансфекция субвыборки в определенном соотношении. Для анализа данных мы просканировали большое количество соотношений между компонентами схемы и определили производительность классификатора при каждом соотношении. В качестве примера мы покажем здесь одно конкретное соотношение, которое продемонстрировало хорошую производительность (Gal4-VP16 = 435 нг ДНК, репортер = 60 нг и BM3R1 = 40 нг). Синим цветом показано соответствующее соотношение флуоресцентных маркеров для трех различных компонентов схемы. Затем мы подвыборили данные, рассматривая только точки в пределах определенного евклидова расстояния от траектории флуоресценции. Мы взяли субвыборку клеток по одной и той же траектории из трансфекций HEK и HeLa. (E) Сравнение характеристик цепи на одной и той же траектории в ячейках HEK и HeLa. Сравнивая статистические данные, такие как чувствительность, специфичность и точность классификации по многим соотношениям, можно оптимизировать соотношения компонентов для создания идеальной генетической цепи. Эта цифра была изменена с10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Сложный | ng L7Ae плазмида | ng Репортерная плазмида | OptiMEM (мкл) | P3000 (мкл) | Lipo 3000 (мкл) |
| 1 | 250 | 75 | 1.5 | 1.5 | |
| 2 | 250 | 75 | 1.5 | 1.5 |
Таблица 3: Трансфекционные смеси, соответствующие рисунку 4. Клетки HEK293 были политрансфицированы этими смесями для трансфекции в одной лунке 24-луночного планшета.
| Сложный | ng BM3R1 плазмида | нг Плазмида Gal4-VP16 | ng Репортерная плазмида | OptiMEM (мкл) | P3000 (мкл) | Lipo 3000 (мкл) |
| 1 | 900 | 75 | 1.5 | 1.5 | ||
| 2 | 900 | 75 | 1.5 | 1.5 | ||
| 3 | 900 | 75 | 1.5 | 1.5 |
Таблица 4: Смеси для трансфекции, соответствующие рисунку 5. Клетки HEK293 и HeLa были политрансфицированы этими смесями для трансфекции в одной лунке на 6-луночной пластине.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Методы быстрого прототипирования, такие как автоматизированное проектирование (САПР), макетирование и 3D-печать, произвели революцию в механических, электрических и гражданских инженерных дисциплинах. Возможность быстрого поиска среди множества возможных решений данной проблемы значительно ускоряет прогресс в области. Мы считаем, что политрансфекция является аналогичной технологией биологической инженерии, позволяющей быстро создавать прототипы генетических цепей. Кроме того, другие технологии быстрого прототипирования требуют практической последовательной итерации нескольких возможных решений, тогда как политрансфекция способна исследовать множество решений одновременно. Политрансфекция позволяет тестировать большое количество комбинаций соотношений компонентов генетических цепей в одной лунке и используется для оптимизации нескольких опубликованных генетических схем10,11,13. Экспериментальный протокол представляет собой простое расширение стандартной совместной трансфекции, позволяющее легко принять его многими исследователями клеток млекопитающих. Как правило, очень тесное совпадение между результатами политрансфекции и котрансфекции видно10 (пример на рисунке 4). Таким образом, политрансфекция может быть использована в большинстве случаев, когда плазмидные соотношения титруются в смесях котрансфекции, а выходы измеряются на уровне отдельных клеток.
Сложность и масштаб политрансфекции увеличиваются с усложнением генетических схем для оптимизации. По мере увеличения числа анализируемых измерений комбинаторные соотношения различных частей и количество ячеек, необходимых для их анализа, увеличиваются экспоненциально. Например, для оптимизации классификатора на рисунке 5 клетки были трансфицированы в формат 6-луночного планшета, и были собраны данные по крайней мере о 1,5 миллионах живых клеток. Мы также оптимизировали классификатор с дополнительным компонентом схемы 10, что потребовало трансфекции в масштабе10 см и сбора миллионов ячеек. В таком масштабе и выше производство ДНК занимает много времени, а реагенты для трансфекции стоят дорого. Тем не менее, при политрансфекции используется на порядки меньше клеток, ДНК и реагентов для трансфекции, чем при тестировании сопоставимого количества комбинаций соотношений компонентов контура в отдельных лунках. Кроме того, значительное количество времени экономится за счет создания на порядки меньшего количества смесей для трансфекции.
Политрансфекция позволяет использовать передовые методы анализа данных проточной цитометрии. Двумя основными подходами являются (1) бинирование клеток в соответствии с экспрессией каждого маркера трансфекции и (2) извлечение клеток при определенных соотношениях маркеров трансфекции, тем самым имитируя котрансфекцию. Первый выбирает клетки с определенной комбинацией дозировки ДНК для каждого комплекса (и, следовательно, для каждой части), что дает функции передачи ввода-вывода. Последний отбирает клетки при определенном соотношении дозировок ДНК для каждой части, имитируя котрансфекцию при таком соотношении масс плазмидной ДНК. Построение графика уровня выражения репортера (ов) выходного сигнала схемы в выборках поддискретизации дает меру выходного сигнала при определенных уровнях или соотношениях входов. Для оптимизации схемы можно определить наиболее эффективные ячейки/соотношения, определяемые назначением схемы - в случае классификаторов ячеек это ячейки/соотношения, в которых схема включена в целевом типе ячейки и выключена в нецелевых типах ячеек. При выборе размера ячейки следует учитывать требуемый уровень точности, а также количество ячеек в ячейке. Меньшие бункеры более точно ориентированы на идеальную комбинацию компонентов схемы, но если в бункере слишком мало ячеек, это может привести к нежелательному шуму при измерениях.
Будущие усовершенствования в вычислительном анализе данных политрансфекции могут способствовать оптимизации даже при низком покрытии ячейкой на ячейку/соотношение. В настоящее время мы исключаем данные из ячеек с меньшим, чем установленный порог ячеек (например, 10), чтобы избежать чрезмерно шумных измерений. В сочетании с повторными измерениями это позволяет более точно и точно рассчитывать кривые доза-реакция, точность классификатора и другие показатели, определенные для каждого бункера. Тем не менее, каждую ячейку в политрансфекции можно рассматривать как независимый эксперимент, измеряющий с высоким разрешением выход (выходы) схемы на точном уровне входов. Имея это в виду, механистические и фенотипические модели дозовых реакций и оптимизации схем могут непосредственно соответствовать распределению экспрессии генов от каждого маркера и репортера, а не их сводной статистике10. Это позволяет проводить более надежные измерения и использовать множество отдельных точек данных, собранных в ходе эксперимента. Таким образом, такие подходы к моделированию могут привести к прогностической характеристике и оптимизации схем даже с редкой выборкой многомерных политрансфекций. Кроме того, методы машинного обучения, такие как методология поверхности отклика и случайная лесная регрессия, могут использоваться для анализа относительно разреженных многомерных данных10.
Альтернативный подход к все более крупным политрансфекциям заключается в последовательной оптимизации схем с использованием иерархий политрансфекций. В этом подходе, во-первых, политрансфекция используется для оптимизации модуля, содержащего подмножество генетических компонентов в более крупной схеме. Затем эти оптимизированные модули поставляются в виде отдельных политрансфекционных смесей, что позволяет найти оптимальное соотношение / дозировку каждого модуля схемы. В этом подходе используется значительно меньшее количество клеток, ДНК и реагентов для трансфекции. Однако группы компонентов не обязательно являются модульными по отношению к другим компонентам, и, таким образом, оптимальное соотношение составных частей в модуле, измеренном изолированно, может быть неоптимальным в более широком контекстесхемы 8.
Методы политрансфекции также ограничены конфигурацией лазера/фильтра проточного цитометра, используемого для сбора данных. В дополнение к измеренным флуоресцентным выходам каждая трансфекционная смесь содержит флуоресцентный белковый маркер. Таким образом, критически важно выбрать флуоресцентные белки, которые могут быть хорошо компенсированы на цитометре. Ранее мы систематически анализировали просачивание панели из 22 флуоресцентных белков на пятилазерном проточном цитометре (BD LSRFortessa) и обнаружили, что набор Sirius, TagBFP, mNeonGreen, mKO2 и iRFP720 можно использовать вместе и хорошо компенсировать без значительных проблем10. Однако для оптимизации более крупных схем могут потребоваться передовые методы цитометрии, такие как спектральная цитометрия для разделения флуоресцентных белков с более перекрывающимися спектрами, которые наша лаборатория в настоящее время оптимизирует с помощью до восьми флуоресцентных белков. Базы данных, такие как база данных флуоресцентных белков (https://www.fpbase.org), полезны для выбора флуоресцентных белков с определенным спектральным перекрытием. Однако этот процесс может быть осложнен различными факторами, некоторые из которых специфичны для конкретных цитометров. Например, использование некоторых красных белков, таких как tdTomato, может привести к нежелательному просачиванию в синие каналы только в определенных конфигурациях лазера/фильтра10. Кроме того, несколько дальних красных белков показали нелинейную зависимость между дозировкой ДНК и выходом флуоресценции10, что снижает их использование в качестве эффективных маркеров для дозировки ДНК.
Для согласованности экспериментов, которые выполняются с различным количеством комплексов (один, два, три и т. д.), полезно использовать одно и то же дробное количество плазмиды на трансфекционную смесь. Например, при тестировании системы из трех генов с каждым геном, закодированным в одной из трех плазмид (A, B и C), можно было бы совместно трансфицировать плазмиды схемы в соотношении 1:1:1 вместе с равным соотношением плазмиды, кодирующей маркер трансфекции. Это сделало бы каждую плазмиду одной четвертью от общей массы смеси и, следовательно, примерно одной четвертью массы каждого трансфекционного комплекса, который образуется. При политрансфекции А, В и С в отдельных комплексах с их собственными репортерами, вместо того, чтобы смешивать плазмиды 1:1 с репортерами или поддерживать их общую массу ДНК, более последовательно держать каждую плазмиду на уровне одной четверти массы каждого комплекса, при этом оставшуюся массу занимает ДНК-наполнитель (см. Таблицу 5 для примеров). Это связано с тем, что распределение экспрессии генов среди трансфицированных клеток зависит не столько от общей массы ДНК, доставляемой в комплексах, сколько от фракционного количества ДНК в каждом комплексе10. Если желательны соотношения, отличные от 1:1:1, рассчитайте соответствующие доли общей массы ДНК в смеси для трансфекции для каждой части. Например, в таблице 5 [внизу] показано соотношение 1:1:4.
| Метод | Сложный | нг А (дробь) | нг В (дробь) | нг С (фракция) | нг Репортер (дробь) | ng ДНК наполнителя (фракция) | Всего (нг) |
| Котрансфекция | 1 | 150 (¼) | 150 (¼) | 150 (¼) | 150 (¼) | 0 (0) | 600 |
| Политрансфекция | 600 | ||||||
| → | 1 | 50 (¼) | 50 (¼) | 100 (½) | 200 | ||
| → | 2 | 50 (¼) | 50 (¼) | 100 (½) | 200 | ||
| → | 3 | 50 (¼) | 50 (¼) | 100 (½) | 200 | ||
| Котрансфекция | 1 | 75 (⅛) | 75 (⅛) | 300 (½) | 150 (¼) | 0 (0) | 600 |
| Политрансфекция | 600 | ||||||
| → | 1 | 25 (⅛) | 50 (¼) | 125 (⅝) | 200 | ||
| → | 2 | 25 (⅛) | 50 (¼) | 125 (⅝) | 200 | ||
| → | 3 | 100 (½) | 50 (¼) | 50 (¼) | 200 |
Таблица 5: Примеры использования ДНК-филлеров для согласованности в экспериментах по ко- и политрансфекции. Здесь показаны два общих примера совместной трансфекции трех плазмид с одинаковым количеством ДНК-наполнителя. В верхнем примере все плазмиды имеют одинаковую массу. В нижнем примере одна плазмида доставляется с большей массой по сравнению с другими. Часть общей ДНК, которая будет использоваться в комплексе котрансфекции, трансмутируется в политрансфекционные комплексы, при этом оставшееся количество ДНК (до общего количества для каждого комплекса, которое является фиксированным и одинаковым для всех комплексов) состоит из ДНК-наполнителя.
Общая цель филлерной ДНК состоит в том, чтобы поддерживать одинаковые дозы плазмид на клетку, независимо от количества уникальных трансфекционных смесей. В качестве грубого приближения к этому принципу, разделение трех плазмид на три смеси при сохранении одинаковой массы ДНК каждой (и соответствующего соотношения трансфекционного реагента) снижает процент клеток, получающих данный комплекс, на одну треть по сравнению с одной смесью, содержащей все три плазмиды. Однако каждая трансфицированная клетка впоследствии получает ~ 3-кратно более высокую дозу гена. Таким образом, уменьшение относительного количества одних только плазмид без ДНК-наполнителя недостаточно для поддержания последовательных доз плазмид, поскольку это просто снижает эффективность трансфекции без изменения основного распределения экспрессии среди трансфицированных клеток10. С другой стороны, ДНК-филлер позволяет регулировать дозировку ДНК, не влияя на общую эффективность трансфекции (хотя обнаруживаемые трансфицируемые клетки могут уменьшаться из-за более низкого сигнала)10. Следуя грубому приближению, приведенному выше, уменьшение доли ДНК в политрансфекционных смесях до одной трети и добавление ДНК-наполнителя поддерживает относительные дозы генов по сравнению с исходной котрансфекцией. Таким образом, ДНК-наполнитель обеспечивает эффективное и точное формирование трансфекционного комплекса.
Чтобы изменить диапазон экспрессии интересующего гена, охватываемого его репортером, доля каждой тестовой плазмиды и/или промоторов, используемых для управления геном, может быть настроена относительно репортера. Если часть сильная/высокоактивная при низких дозах ДНК, использование более низкой фракции ДНК может помочь центрировать динамический диапазон детали в середине распределения флуоресценции репортера в трансфицированных клетках. Аналогичным образом, для частей, которые являются слабыми / активными только при высоких дозах ДНК, может быть полезно использовать более высокую фракцию. Однако с такой настройкой необходимо соблюдать осторожность, так как слишком сильное уменьшение фракций ДНК увеличивает стохастичность доставки в клетки по сравнению с репортером10, а высокие уровни экспрессии генов могут перегружать клеточный механизм экспрессии генов12,14. Чтобы избежать стохастичности, и в тех случаях, когда каждый ген доставляется в клетки с фиксированным соотношением (например, если цепь должна быть сгенерирована в виде одного вектора ленти, PiggyBac или Landing Pad), относительная экспрессия каждого гена может быть настроена с использованием более сильных/слабых промоторов, малыхuORF18 и/или miSFITs19.
Хотя в протоколе описан метод обратной трансфекции, политрансфекция также возможна при прямой трансфекции. При обратной трансфекции клетки одновременно засеваются и трансфицируются; При прямой трансфекции клетки трансфицируются ~ 24 ч после первого покрытия примерно с половиной плотности, которая использовалась бы при обратной трансфекции (чтобы обеспечить деление клеток к моменту трансфекции). В целом, обратная трансфекция более эффективна, но и более токсична, и мы заметили некоторые различия в форме распределения трансфекции в зависимости от реагента, времени трансфекции и клеточной линии. Таким образом, выбранный метод трансфекции должен быть оптимизирован для каждой клеточной линии, чтобы максимизировать количество трансфицируемых клеток и охват многомерного пространства концентрации доз плазмиды на клетку.
В целом, политрансфекция позволяет быстро оптимизировать генетические схемы млекопитающих. Многие возможные ратиометрические комбинации компонентов схемы могут быть легко испытаны в одной скважине. Кроме того, поскольку политрансфекция содержит больше информации об уровнях каждой части системы, чем обычная трансфекция, было обнаружено, что она очень ценна для характеристики поведения различных генетических частей10,11,12,13. Ожидается, что внедрение политрансфекции ускорит темпы разработки новых и улучшенных генных схем для использования в клетках млекопитающих.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
R.W. является соучредителем Strand Therapeutics и Replay Bio; R.W. и R.J. подали предварительный патент, относящийся к классификатору типов клеток.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить бывших сотрудников Weiss Lab, которые руководили или внесли свой вклад в разработку метода политрансфекции и его применение к клеточным классификаторам: Джереми Гама, Бре ДиАндрета и Джин Ху; другие члены лаборатории Weiss, которые внесли свой вклад в дальнейшую разработку/оптимизацию метода: Вэньлун Сюй, Лэй Ван и Кристиан Куба-Саманьего; Профессор Джош Леонард и члены группы, в том числе Патрик Донахью и Хейли Эдельштейн, за тестирование политрансфекции и предоставление обратной связи; и профессору Нике Шакибе за приглашение этой рукописи и предоставление отзывов. Мы также хотели бы поблагодарить Национальные институты здравоохранения [R01CA173712, R01CA207029, P50GM098792]; Национальный научный фонд [1745645]; Грант поддержки онкологического центра (основной) [P30CCA14051, частично] от NCI и Национальных институтов здравоохранения [P50GM098792] для финансирования этой работы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15mL Corning Falcon conical tubes | ThermoFisher Scientific | 14-959-53A | |
| 24-well petri dish | Any company of choice | (Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free) | |
| Bovine serum albumin | NEB | B9000S | |
| Centrifuge | Any company of choice | Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX2000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | |
| Cytoflow | Non-commercial software package | https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/# | |
| DMEM | VWR | 10-013-CV | Use the correct media for your cell type |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 03690-100ML | |
| Fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F4135 | |
| HEK cells | ATCC | CRL-1573 | Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently. |
| HeLa cells | ATCC | CRL-12401 | Use the relevant cell type for your experiments. |
| Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer | ThermoFisher Scientific | L3000001 | Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent |
| LSRFortessa flow cytometer | BD Biosciences | N/A | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
| Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | Any company of choice | ||
| Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985070 | reduced serum medium |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Rainbow calibration beads | Spherotech | URCP-100-2H | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Trypsin | VWR | 25-053-CI |
References
- Prochazka, L., Benenson, Y., Zandstra, P. W. Synthetic gene circuits and cellular decision-making in human pluripotent stem cells. Current Opinion in Systems Biology. 5, 93-103 (2017).
- Sayeg, M. K., et al. Rationally designed microRNA-based genetic classifiers target specific neurons in the brain. ACS Synthetic Biology. 4 (7), 788-795 (2015).
- Zhen, X., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. Multi-Input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells. Science. 333 (6047), 1307-1311 (2011).
- Nissim, L., et al. Synthetic RNA-based immunomodulatory gene circuits for cancer immunotherapy. Cell. 171 (5), 1138-1150 (2017).
- Nissim, L., Bar-Ziv, R. H. A tunable dual-promoter integrator for targeting of cancer cells. Molecular Systems Biology. 6, 444 (2010).
- Mohammadi, P., Castel, S. E., Brown, A. A., Lappalainen, T. Quantifying the regulatory effect size of cis-acting genetic variation using allelic fold change. Genome Research. 27 (11), 1872-1884 (2017).
- Prochazka, L., et al. Discrete-to-analog signal pluripotent stem cells conversion in human. BioRxiv. , (2021).
- Del Vecchio, D. Modularity, context-dependence, and insulation in engineered biological circuits. Trends in Biotechnology. 33 (2), 111-119 (2015).
- Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell. Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).
- Gam, J. J., DiAndreth, B., Jones, R. D., Huh, J., Weiss, R. A 'poly-transfection' method for rapid, one-pot characterization and optimization of genetic systems. Nucleic Acids Research. 47 (18), 106 (2019).
- Jones, R. D., et al. Robust and tunable signal processing in mammalian cells via engineered covalent modification cycles. Nature Communications. 13 (1), 1720 (2022).
- Jones, R. D., et al. An endoribonuclease-based feedforward controller for decoupling resource-limited genetic modules in mammalian cells. Nature Communications. 11 (1), 5690 (2020).
- DiAndreth, B., Wauford, N., Hu, E., Palacios, S., Weiss, R. PERSIST platform provides programmable RNA regulation using CRISPR endoRNases. Nature Communications. 13 (1), 2582 (2022).
- Frei, T., et al. Characterization and mitigation of gene expression burden in mammalian cells. Nature Communications. 11 (1), 4641 (2020).
- Beal, J., Weiss, R., Yaman, F., Adler, A., Davidsohn, N. A method for fast, high-precision characterization of synthetic biology devices. Computer Science and Artificial Intelligence Laboratory Technical Report. Massachusetts institute of technology. , Cambridge. MIT-CSAIL-TR-2012-008 (2012).
- Beal, J., et al. Meeting measurement precision requirements for effective engineering of genetic regulatory networks. ACS Synthetic Biology. 11 (3), 1196-1207 (2022).
- Teague, B. Cytoflow: A Python toolbox for flow cytometry. bioRxiv. , (2022).
- Ferreira, J. P., Overton, K. W., Wang, C. L. Tuning gene expression with synthetic upstream open reading frames). Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11284-11289 (2013).
- Michaels, Y. S., et al. Precise tuning of gene expression levels in mammalian cells. Nature Communications. 10 (1), 818 (2019).
- Saito, H., et al. Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch. Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).
- Wroblewska, L., et al. Mammalian synthetic circuits with RNA binding proteins for RNA-only delivery. Nature Biotechnology. 33 (8), 839-841 (2015).
- Wagner, T. E., et al. Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells. Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043-1050 (2018).
- Sekuklu, S. D., Donoghue, M. T. A., Spillane, C. miR-21 as a key regulator of oncogenic processes. Biochemical Society Transactions. 37, 918-925 (2009).
- Stanton, B. C., et al. Genomic mining of prokaryotic repressors for orthogonal logic gates. Nature Chemical Biology. 10 (2), 99-105 (2014).
- Stanton, B. C., et al. Systematic transfer of prokaryotic sensors and circuits to mammalian cells. ACS Synthetic Biology. 3 (12), 880-891 (2014).
