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Bioengineering

पॉली-अभिकर्मक के साथ सेल स्टेट आइडेंटिफिकेशन सर्किट का तेजी से विकास

Published: February 24, 2023 doi: 10.3791/64793
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 1,3
1Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2School of Biological Engineering, University of British Columbia, 3Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology

Summary

जटिल आनुवंशिक सर्किट डिजाइन, परीक्षण और अनुकूलन करने के लिए समय लेने वाले हैं। इस प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाने के लिए, स्तनधारी कोशिकाओं को एक तरह से स्थानांतरित किया जाता है जो एक ही कुएं में सर्किट घटकों के कई स्टोइकोमेट्री के परीक्षण की अनुमति देता है। यह प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक योजना, अभिकर्मक और डेटा विश्लेषण के लिए चरणों को रेखांकित करता है।

Abstract

स्तनधारी आनुवंशिक सर्किट ने रोग राज्यों की एक विस्तृत श्रृंखला को समझने और इलाज करने की क्षमता का प्रदर्शन किया है, लेकिन सर्किट घटकों के स्तर का अनुकूलन चुनौतीपूर्ण और श्रम-गहन बना हुआ है। इस प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए, हमारी प्रयोगशाला ने पॉली-अभिकर्मक विकसित किया, जो पारंपरिक स्तनधारी अभिकर्मक का एक उच्च-थ्रूपुट विस्तार है। पॉली-अभिकर्मक में, संक्रमित आबादी में प्रत्येक कोशिका अनिवार्य रूप से एक अलग प्रयोग करती है, विभिन्न डीएनए कॉपी संख्याओं पर सर्किट के व्यवहार का परीक्षण करती है और उपयोगकर्ताओं को एकल-पॉट प्रतिक्रिया में बड़ी संख्या में स्टोइकोमेट्री का विश्लेषण करने की अनुमति देती है। अब तक, पॉली-अभिकर्मक जो कोशिकाओं के एक ही कुएं में तीन-घटक सर्किट के अनुपात को अनुकूलित करते हैं, का प्रदर्शन किया गया है; सिद्धांत रूप में, एक ही विधि का उपयोग बड़े सर्किट के विकास के लिए भी किया जा सकता है। पॉली-अभिकर्मक परिणामों को क्षणिक सर्किट के लिए सह-संक्रमण के लिए डीएनए के इष्टतम अनुपात को खोजने या स्थिर सेल लाइनों की पीढ़ी के लिए सर्किट घटकों के लिए अभिव्यक्ति स्तर चुनने के लिए आसानी से लागू किया जा सकता है।

यहां, हम तीन-घटक सर्किट को अनुकूलित करने के लिए पॉली-अभिकर्मक के उपयोग का प्रदर्शन करते हैं। प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक डिजाइन सिद्धांतों से शुरू होता है और बताता है कि पॉली-अभिकर्मक पारंपरिक सह-अभिकर्मक विधियों पर कैसे बनता है। इसके बाद, कोशिकाओं का पॉली-अभिकर्मक किया जाता है और उसके बाद कुछ दिनों बाद फ्लो साइटोमेट्री की जाती है। अंत में, डेटा का विश्लेषण एकल-सेल फ्लो साइटोमेट्री डेटा के स्लाइस की जांच करके किया जाता है जो कुछ घटक अनुपात वाले कोशिकाओं के उप-समूहों के अनुरूप होते हैं। प्रयोगशाला में, पॉली-अभिकर्मक का उपयोग सेल क्लासिफायर, प्रतिक्रिया और फीडफॉरवर्ड नियंत्रकों, द्विस्थिर रूपांकनों और कई और अधिक को अनुकूलित करने के लिए किया गया है। यह सरल लेकिन शक्तिशाली विधि स्तनधारी कोशिकाओं में जटिल आनुवंशिक सर्किट के लिए डिजाइन चक्रों को गति देती है।

Introduction

स्तनधारी सिंथेटिक जीव विज्ञान के क्षेत्र ने तेजी से प्रगति की है, सुसंस्कृत सेल लाइनों में सरल अर्थ-और-प्रतिक्रिया भागों को विकसित करने से लेकर निदान और चिकित्सीय1 में वास्तविक दुनिया की चुनौतियों का समाधान करने के लिए जीन के जटिल नेटवर्क के अनुकूलन तक। ये परिष्कृत सर्किट माइक्रोआरएनए प्रोफाइल से साइटोकिन्स से छोटे अणु दवाओं तक जैविक इनपुट को महसूस करने और ट्रांजिस्टर, बैंड-पास फिल्टर, टॉगल स्विच और ऑसिलेटर सहित लॉजिक प्रोसेसिंग सर्किट को लागू करने में सक्षम हैं। उन्होंने कैंसर, गठिया, मधुमेह और कई अन्य 1,2,3,4,5 जैसी बीमारियों के पशु मॉडल में भी आशाजनक परिणाम दिखाए हैं। हालांकि, जैसे-जैसे सर्किट की जटिलता बढ़ती है, इसके प्रत्येक घटक के स्तर को अनुकूलित करना तेजी से चुनौतीपूर्ण हो जाता है।

आनुवंशिक सर्किट का एक विशेष रूप से उपयोगी प्रकार एक सेल क्लासिफायर है, जिसे सेलुलर राज्यों को समझने और प्रतिक्रिया देने के लिए प्रोग्राम किया जा सकता है। विशिष्ट सेलुलर राज्यों में प्रोटीन या आरएनए आउटपुट का चयनात्मक उत्पादन कोशिकाओं और ऑर्गेनोइड्स के भेदभाव को निर्देशित और प्रोग्राम करने, रोगग्रस्त कोशिकाओं और / या अवांछनीय सेल प्रकारों की पहचान करने और नष्ट करने औरचिकित्सीय कोशिकाओं के कार्य को विनियमित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।. हालांकि, स्तनधारी कोशिकाओं में सर्किट बनाना जो कई सेलुलर आरएनए और / या प्रोटीन प्रजातियों से सेल राज्यों को सटीक रूप से वर्गीकृत कर सकता है, अत्यधिक चुनौतीपूर्ण रहा है।

सेल वर्गीकरण सर्किट विकसित करने के सबसे अधिक समय लेने वाले चरणों में से एक सर्किट के भीतर व्यक्तिगत घटक जीन, जैसे सेंसर और प्रसंस्करण कारकों के सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तरों को अनुकूलित करना है। सर्किट अनुकूलन को गति देने और अधिक परिष्कृत सर्किट के निर्माण की अनुमति देने के लिए, हाल के काम ने इष्टतम रचनाओं और टोपोलॉजी 6,7 की भविष्यवाणी करने के लिए सेल क्लासिफायर सर्किट और उनके घटकों के गणितीय मॉडलिंग का उपयोग किया है। हालांकि इसने अब तक शक्तिशाली परिणाम दिखाए हैं, गणितीय विश्लेषण सर्किट में घटक जीन के इनपुट-आउटपुट व्यवहार को व्यवस्थित रूप से चिह्नित करने की आवश्यकता से सीमित है, जो समय लेने वाला है। इसके अलावा, जटिल आनुवंशिक सर्किट में संदर्भ-निर्भर समस्याओं के असंख्य उभर सकते हैं, जिससे एक पूर्ण सर्किट का व्यवहार व्यक्तिगत भाग लक्षण वर्णन 8,9 के आधार पर भविष्यवाणियों की अवहेलना करता है।

सेल स्टेट क्लासिफायर जैसे जटिल स्तनधारी सर्किट को अधिक तेजी से विकसित करने और परीक्षण करने के लिए, हमारी प्रयोगशाला ने पॉली-अभिकर्मक10 नामक एक तकनीक विकसित की, जो प्लास्मिड सह-अभिकर्मक प्रोटोकॉल का एक विकास है। सह-अभिकर्मक में, कई प्लास्मिड डीएनए प्रजातियों को सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए लिपिड या बहुलक अभिकर्मक के साथ मिलकर जटिल किया जाता है, फिर सहसंबद्ध तरीके से कोशिकाओं को दिया जाता है (चित्रा 1 ए)। पॉली-अभिकर्मक में, प्लास्मिड को अभिकर्मक के साथ अलग से जटिल किया जाता है, जैसे कि प्रत्येक अभिकर्मक परिसर से डीएनए को एक गैर-सहसंबद्ध तरीके से कोशिकाओं तक पहुंचाया जाता है (चित्रा 1 बी)। इस विधि का उपयोग करके, संक्रमित आबादी के भीतर कोशिकाओं को विभिन्न सर्किट घटकों को ले जाने वाले दो या दो से अधिक डीएनए पेलोड के अनुपात के कई संयोजनों के संपर्क में लाया जाता है।

प्रत्येक सेल को दिए गए सर्किट घटकों के अनुपात को मापने के लिए, पॉली-अभिकर्मक के भीतर प्रत्येक अभिकर्मक परिसर में एक संवैधानिक रूप से व्यक्त फ्लोरोसेंट रिपोर्टर होता है जो कॉम्प्लेक्स के सेलुलर उत्थान के लिए प्रॉक्सी के रूप में कार्य करता है। फिलर डीएनए जिसमें स्तनधारी कोशिका के भीतर सक्रिय कोई तत्व नहीं होता है, का उपयोग फ्लोरोसेंट रिपोर्टर और सर्किट घटकों की सापेक्ष मात्रा को एक एकल अभिकर्मक परिसर में एक सेल में वितरित करने के लिए किया जाता है और चर्चा में अधिक विस्तार से चर्चा की जाती है। वीस लैब में उपयोग किए जाने वाले फिलर डीएनए का एक उदाहरण एक प्लास्मिड है जिसमें टर्मिनेटर अनुक्रम होता है, लेकिन कोई प्रोमोटर, कोडिंग अनुक्रम आदि नहीं होता है। सर्किट घटकों के विभिन्न अनुपातों वाली कोशिकाओं की तुलना जीन सर्किट फ़ंक्शन के लिए इष्टतम अनुपात खोजने के लिए की जा सकती है। यह बदले में आनुवंशिक एकीकरण के लिए सर्किट घटकों को एकल वेक्टर में संयोजित करते समय इष्टतम जीन अभिव्यक्ति स्तर प्राप्त करने के लिए प्रमोटरों और अन्य सर्किट तत्वों को चुनने के लिए उपयोगी भविष्यवाणियां देता है (जैसे, एक लेंटिवायरस, ट्रांसपोसन, या लैंडिंग पैड)। इस प्रकार, अंतर्ज्ञान के आधार पर या समय लेने वाले परीक्षण और त्रुटि प्रक्रिया के माध्यम से सर्किट घटकों के बीच अनुपात चुनने के बजाय, पॉली-अभिकर्मक एकल-पॉट प्रतिक्रिया में आनुवंशिक भागों के बीच स्टोइकोमेट्री की एक विस्तृत श्रृंखला का मूल्यांकन करता है।

हमारी प्रयोगशाला में, पॉली-अभिकर्मक ने कई आनुवंशिक सर्किटों के अनुकूलन को सक्षम किया है, जिसमें सेल क्लासिफायर, फीडबैक और फीडफॉरवर्ड नियंत्रक और द्विस्थिर रूपांकन शामिल हैं। यह सरल लेकिन शक्तिशाली विधि स्तनधारी कोशिकाओं में जटिल आनुवंशिक सर्किट के लिए डिजाइन चक्रों को काफी गति देती है। पॉली-अभिकर्मक का उपयोग तब से कई आनुवंशिक सर्किटों को चिह्नित करने के लिए किया गया है ताकि उच्च रिज़ॉल्यूशन10 पर उनके बहु-आयामी इनपुट-आउटपुट ट्रांसफर फ़ंक्शंस को प्रकट किया जा सके, सेल स्टेट वर्गीकरण 11 के लिए एक वैकल्पिक सर्किट टोपोलॉजी का अनुकूलन किया जा सके, और विभिन्न प्रकाशित 12,13 और चल रही परियोजनाओं में तेजी लाई जा सके।

यहां हम आनुवंशिक सर्किट को तेजी से अनुकूलित करने के लिए पॉली-अभिकर्मक का उपयोग करने के लिए वर्कफ़्लो का वर्णन और चित्रण करते हैं (चित्रा 2)। प्रोटोकॉल दिखाता है कि उच्च गुणवत्ता वाले पॉली-अभिकर्मक डेटा कैसे उत्पन्न करें और पॉली-अभिकर्मक प्रोटोकॉल और डेटा विश्लेषण (चित्रा 3) में कई सामान्य त्रुटियों से बचें। यह तब दर्शाता है कि सरल सर्किट घटकों को चिह्नित करने के लिए पॉली-अभिकर्मक का उपयोग कैसे करें और इस प्रक्रिया में, सह-अभिकर्मक के खिलाफ बेंचमार्क पॉली-अभिकर्मक परिणाम (चित्रा 4)। अंत में, पॉली-अभिकर्मक के परिणाम कैंसर क्लासिफायर सर्किट (चित्रा 5) के अनुकूलन को दिखाते हैं।

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Protocol

नोट: तालिका 1 और तालिका 2 इस प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण संदर्भ के रूप में काम करते हैं। तालिका 1 प्रतिक्रियाओं के लिए अभिकर्मक स्केलिंग दिखाती है, और तालिका 2 प्रोटोकॉल (ऊपरी आधे) में वर्णित एक उदाहरण पॉली-अभिकर्मक के लिए और संभावित अनुवर्ती प्रयोग (निचला आधा) के लिए डीएनए अनुपात अंकगणित दिखाती है।

1. अभिकर्मक के लिए कोशिकाओं को तैयार करना

  1. प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले सुनिश्चित करें कि मानव भ्रूण गुर्दे (एचईके 293) कोशिकाओं की संस्कृति 60% -80% स्थिर है। ऐसा करने के लिए, 2 दिन पहले 100 मिमी x 15 मिमी ऊतक संस्कृति पेट्री डिश में 1 x 106 कोशिकाओं को बीज दें, और 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: यद्यपि हमारा प्रोटोकॉल HEK293 कोशिकाओं पर केंद्रित है, अन्य सेल प्रकारों को प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
  2. नीचे वर्णित के रूप में अभिकर्मकों के लिए मीडिया और कोशिकाओं को तैयार करें।
    1. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (एनईएए; सामग्री की तालिका देखें) के साथ डलबेकको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) के घोल के कम से कम 20 मिलीलीटर को 37 डिग्री सेल्सियस तक पूर्व-गर्म करें। कम से कम 2.4 मिलीलीटर ट्रिप्सिन और 2.4 मिलीलीटर फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। पूर्व-गर्म सीरम माध्यम ~ 16 डिग्री सेल्सियस तक कम हो जाता है।
      नोट: सभी ऊतक संवर्धन कार्य एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में देखभाल के साथ किया जाना चाहिए।
  3. नीचे वर्णित डीएमईएम समाधान में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
    1. वर्तमान मीडिया का विश्लेषण और निपटान करें। कोशिकाओं को धोने के लिए एचईके 293 सेल कल्चर पर पीबीएस के 2 एमएल वितरित करें। पीबीएस का एस्पिरेट और निपटान करें।
    2. एचईके 293 सेल कल्चर पर ट्रिप्सिन के 2 एमएल वितरित करें। पेट्री डिश को 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखें या जब तक कि कोशिकाएं डिश का पालन न करें। पकवान को जैव सुरक्षा कैबिनेट में वापस करें और प्लेट में डीएमईएम समाधान के 8 मिलीलीटर वितरित करके सेल समाधान को पतला करें।
    3. कई बार धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइप करके घोल को मिलाएं। सभी मीडिया को एस्पिरेट करें और इसे 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में रखें।
  4. कोशिकाओं को 300 x g पर 3 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें ताकि उन्हें पेलेट किया जा सके। मीडिया को एस्पिरेट करें (ध्यान रखें कि कोशिकाओं को एस्पिरेट न करें) और इसे छोड़ दें। डीएमईएम समाधान के 5 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, धीरे से ऊपर और नीचे पाइप करके मिश्रण करें।
  5. एक स्वचालित सेल काउंटर ( सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध) का उपयोग करके वर्तमान सेल एकाग्रता का अनुमान लगाएं। 1 x 105 कोशिकाओं के साथ 24-वेल प्लेट में छह कुओं (इस उदाहरण में) को बीज दें (50,000 कोशिकाओं / सेमी2 के सीडिंग घनत्व के लिए)।
  6. डीएमईएम समाधान को 500 μL तक जोड़ें (पहले कुओं में डीएमईएम समाधान जोड़ें), और फिर निम्न के रूप में प्रति उपचार एक अच्छी तरह से लेबल करें: कोई रंग नियंत्रण, mKO2 नियंत्रण, टैगबीएफपी नियंत्रण, नियॉनग्रीन नियंत्रण, सभी रंग नियंत्रण, और पॉली-अभिकर्मक 1। टैगबीएफपी, एमकेओ 2, और नियॉनग्रीन नियंत्रण कुएं पॉली-अभिकर्मक में शामिल सभी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए एकल रंग नियंत्रण हैं।

2. अभिकर्मक प्रदर्शन

  1. प्रत्येक डीएनए एग्रीगेट के लिए ट्यूब तैयार करें। 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को अलग रखें और ट्यूबों को लेबल करें: कोई रंग नियंत्रण, एमकेओ 2 नियंत्रण, टैगबीएफपी नियंत्रण, नियॉनग्रीन नियंत्रण, सभी रंग नियंत्रण, पॉली-अभिकर्मक मिश्रण 1, और पॉली-अभिकर्मक मिश्रण 2।
    1. बिना रंग नियंत्रण, एमकेओ 2 नियंत्रण, टैगबीएफपी नियंत्रण, नियॉनग्रीन नियंत्रण और सभी रंग नियंत्रण ट्यूबों में कम सीरम माध्यम के 36 μL जोड़ें। पॉली-अभिकर्मक मिश्रण 1 और पॉली-अभिकर्मक मिश्रण 2 ट्यूबों में से प्रत्येक में कम सीरम माध्यम के 18 μL जोड़ें।
      नोट: प्लास्मिड सांद्रता को 150 एनजी /
    2. बिना रंग नियंत्रण ट्यूब में 600 एनजी फिलर प्लास्मिड जोड़ें। एमकेओ 2 रंग नियंत्रण ट्यूब में 300 एनजी एमकेओ 2 और 300 एनजी फिलर प्लास्मिड जोड़ें। टैगबीएफपी रंग नियंत्रण ट्यूब में 300 एनजी टैगबीएफपी और 300 एनजी फिलर प्लास्मिड जोड़ें।
    3. नियॉनग्रीन रंग नियंत्रण ट्यूब में 300 एनजी संवैधानिक नियॉनग्रीन प्लास्मिड और 300 एनजी फिलर प्लास्मिड जोड़ें। सभी रंग नियंत्रण ट्यूब में एमकेओ 2, टैगबीएफपी और संवैधानिक नियॉनग्रीन के 100 एनजी के साथ-साथ भराव प्लास्मिड के 300 एनजी जोड़ें।
    4. पॉली-अभिकर्मक मिश्रण 1 ट्यूब में 150 एनजी एमकेओ 2 जोड़ें। पॉली-अभिकर्मक मिश्रण 1 ट्यूब में रिपोर्टर नियॉनग्रीन प्लास्मिड के 75 एनजी और फिलर प्लास्मिड के 75 एनजी जोड़ें।
    5. पॉली-अभिकर्मक मिश्रण 2 ट्यूब में टैगबीएफपी के 150 एनजी जोड़ें। पॉली-अभिकर्मक मिश्रण 2 ट्यूब में 75 एनजी एल 7 ए प्लास्मिड और 75 एनजी फिलर प्लास्मिड जोड़ें।
  2. अभिकर्मक अभिकर्मक के 9.48 μL के साथ 216 μL कम सीरम माध्यम को मिलाकर 1.5 mL माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में अभिकर्मक मास्टर मिश्रण बनाएं (अभिकर्मक अनुपात और प्रतिक्रिया स्केलिंग के लिए तालिका 1 देखें)। ऊपर और नीचे पाइप करके अच्छी तरह मिलाएं, और एक तरफ रख दें।
  3. बिना रंग नियंत्रण, एकल रंग नियंत्रण और सभी रंग नियंत्रण ट्यूबों में से प्रत्येक में एन्हांसर अभिकर्मक के 1.58 μL जोड़ें। पॉली-अभिकर्मक मिश्रण ट्यूबों में से प्रत्येक में एन्हांसर अभिकर्मक के 79 μL जोड़ें। प्रत्येक ट्यूब को सख्ती से पाइप करके अलग-अलग मिलाएं।
  4. डीएनए युक्त प्रत्येक ट्यूब में अभिकर्मक मास्टर मिश्रण जोड़ें।
    1. बिना रंग नियंत्रण, एकल रंग नियंत्रण और सभी रंग नियंत्रण ट्यूबों में से प्रत्येक में अभिकर्मक मास्टर मिश्रण के 37.58 μL जोड़ें। प्रत्येक ट्यूब को सख्ती से पाइप करके अलग-अलग मिलाएं।
    2. पॉली-अभिकर्मक मिश्रण ट्यूबों में से प्रत्येक में अभिकर्मक मास्टर मिश्रण के 18.79 μL जोड़ें। प्रत्येक ट्यूब को सख्ती से पाइप करके अलग-अलग मिलाएं।
  5. अभिकर्मक मिश्रण को कुओं में डालें।
    1. प्रत्येक अभिकर्मक मिश्रण के पिपेट 65.97 μL में कोई रंग, एकल रंग और संबंधित कुओं में सभी रंग नियंत्रण नहीं होते हैं।
    2. पॉली-अभिकर्मक के पिपेट 32.98 μL 1 को पॉली-अभिकर्मक अच्छी तरह से मिलाएं और कॉम्प्लेक्स को प्रभावी ढंग से वितरित करने के लिए एक सपाट सतह के साथ एक तंग आकृति-आठ पैटर्न में प्लेट को जल्दी से लेकिन धीरे से घुमाएं। फिर, पॉली-अभिकर्मक के पिपेट 32.98 μL 2 को उसी पॉली-अभिकर्मक कुएं में मिलाएं और प्लेट को उसी तरह घुमाएं।
  6. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखें, 5% सीओ2 के साथ और बिना हिलाए, 48 घंटे की अवधि के लिए।
    नोट: सेल व्यवहार्यता बढ़ाने के लिए, सेल मीडिया को अभिकर्मक के बाद हर 6 घंटे में प्रतिस्थापित किया जा सकता है (हालांकि यह हमेशा आवश्यक नहीं होता है, और एचईके 293 कोशिकाओं और इसके डेरिवेटिव के साथ, मीडिया को बदलते समय प्लेट से कोशिकाओं को अलग नहीं करने के लिए सावधान रहना चाहिए)।
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) राशि स्केलिंग
डीएनए मिश्रण के लिए कम सीरम माध्यम 36 μL प्रति नियंत्रण ट्यूब, 18 μL प्रति पॉली-अभिकर्मक ट्यूब 0.05 μL प्रति ट्यूब सीरम मध्यम / एनजी डीएनए को कम करता है, जिसमें पाइपिंग के लिए 10-20% अतिरिक्त मात्रा होती है।
डीएनए 300-600 एनजी प्रति ट्यूब
P3000 1.58 μL प्रति नियंत्रण ट्यूब, 0.79 μL प्रति पॉली-अभिकर्मक ट्यूब 0.0022 μL P3000/ng DNA प्रति ट्यूब, 10-20% अतिरिक्त के साथ
लिपो मास्टर मिश्रण के लिए कम सीरम माध्यम 36 μL प्रति नियंत्रण ट्यूब, 18 μL प्रति पॉली-अभिकर्मक ट्यूब 0.05 μL ने सीरम मध्यम /एनजी कुल डीएनए को कम कर दिया, जिसमें पाइपिंग के लिए 10-20% अतिरिक्त मात्रा थी।
अभिकर्मक और एन्हांसर अभिकर्मक 1.58 μL प्रति नियंत्रण ट्यूब, 0.79 μL प्रति पॉली-अभिकर्मक ट्यूब 0.0022 μL लिपोफेक्टामाइन 3000 / ng DNA, 10-20% अतिरिक्त के साथ

तालिका 1: अभिकर्मकों के लिए अभिकर्मक स्केलिंग। तालिका एक ही कुएं में शामिल डीएनए मात्रा के लिए अभिकर्मक के सही अनुपात को इंगित करती है। इसका उपयोग प्रतिक्रियाओं को प्रभावी ढंग से स्केल करने और मास्टर मिक्स बनाने के लिए किया जा सकता है। अभिकर्मक की मात्रा को 20% अतिरिक्त शामिल करने के लिए बढ़ाया गया है।

3. फ्लो साइटोमेट्री के लिए कोशिकाओं को तैयार करना

  1. डीएमईएम समाधान के कम से कम 4.2 एमएल को 37 डिग्री सेल्सियस तक प्री-वार्मिंग करें। ट्रिप्सिन के कम से कम 4.2 एमएल और पीबीएस के 4.2 एमएल को 37 डिग्री सेल्सियस तक प्री-वार्म करें। प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) बफर समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें जब तक कि उपयोग करने के लिए तैयार न हो।
  2. एफएसीएस बफर समाधान में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें (पीबीएस 1% बीएसए, 5 एमएम एथिलीनडायमाइनटेट्राएसिटिक एसिड [ईडीटीए], और 0.1% सोडियम एज़ाइड [एनएएन3] के साथ पूरक, क्लंपिंग को कम करने के लिए; सामग्री की तालिका देखें) जैसा कि नीचे वर्णित है।
    1. प्रत्येक कुएं में वर्तमान मीडिया का विश्लेषण और निपटान करें। कोशिकाओं को धोने के लिए प्रत्येक कुएं में 5 एमएल पीबीएस वितरित करें। पीबीएस का एस्पिरेट और निपटान करें।
    2. प्रत्येक कुएं में 5 मिलीलीटर ट्रिप्सिन डालें। प्लेट को 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखें, या जब तक कि कोशिकाएं अब डिश का पालन न करें। प्लेट को जैव सुरक्षा कैबिनेट में वापस करें और प्रत्येक कुएं में डीएमईएम समाधान के 5 मिलीलीटर वितरित करके सेल समाधान को पतला करें।
    3. प्रत्येक कुएं के लिए, कई बार धीरे से ऊपर और नीचे पाइप करके घोल को मिलाएं। प्रत्येक कुएं के लिए, सभी मीडिया को एस्पिरेट करें और इसे 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में रखें।
  3. कोशिकाओं को 300 x g पर 3 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें ताकि उन्हें पेलेट किया जा सके। मीडिया को एस्पिरेट करें, ध्यान रखें कि कोशिकाओं को एस्पिरेट न करें और इसे छोड़ दें। प्रत्येक ट्यूब में, एफएसीएस बफर समाधान के 5 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, धीरे से ऊपर और नीचे पाइप करके मिश्रण करें।
  4. प्रत्येक सेल निलंबन समाधान को एक छन्नी (क्लंप को हटाने के लिए) के माध्यम से अलग-अलग प्रवाह साइटोमेट्री शंक्वाकार ट्यूबों में पारित करें। इन ट्यूबों को बर्फ पर 1 घंटे से अधिक समय तक न रखें, और जितनी जल्दी हो सके फ्लो साइटोमेट्री करें।

4. फ्लो साइटोमेट्री का प्रदर्शन

नोट: फ्लो साइटोमीटर के संचालन के लिए उचित प्रशिक्षण और आवश्यक कार्यों के ज्ञान की आवश्यकता होती है। जैसा कि सॉफ्टवेयर और उपकरण भिन्न हो सकते हैं और उपयोगकर्ताओं को आम तौर पर प्रशिक्षित किया जाना चाहिए, यह खंड विशिष्ट कार्यों को संदर्भित करता है जो प्रदर्शन करने के लिए उपयोगी हैं।

  1. सबसे पहले, सेल विशेषताओं का चयन करने और विसंगतियों (समुच्चय, मलबे आदि सहित) से बचने के लिए भराव प्लास्मिड नियंत्रण (कोई रंग नियंत्रण नहीं) के साथ स्थानांतरित कोशिकाओं की जांच करें। जबकि कोशिकाओं को अलग करने के लिए मापदंडों के कई संयोजन हैं, विशिष्ट विशेषताओं की कल्पना करने के लिए एक अच्छे तरीके के रूप में निम्नलिखित तीन सामान्य विकल्पों का उपयोग करें।
    1. साइड स्कैटर क्षेत्र (लॉग या रैखिक पैमाने प्रति वरीयता / सेल प्रकार) बनाम फॉरवर्ड स्कैटर क्षेत्र (रैखिक पैमाने) को देखें।
    2. साइड स्कैटर ऊंचाई (लॉग स्केल) बनाम साइड स्कैटर चौड़ाई (रैखिक पैमाने) को देखें।
    3. आगे स्कैटर चौड़ाई (रैखिक पैमाने) बनाम आगे स्कैटर ऊंचाई (रैखिक पैमाने) को देखें।
  2. इसके बाद, एकल रंग नियंत्रण देखें। उपकरण वोल्टेज को ट्यून करने के लिए सभी रंग नियंत्रण का उपयोग करें, जैसे कि प्रत्येक फ्लोरोसेंट प्रोटीन से सिग्नल प्रतिदीप्ति की समकक्ष मनमानी इकाइयों (एयू) के लिए सामान्यीकृत होते हैं। इसके बाद, प्रत्येक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए एकल रंग नियंत्रण चलाएं, जिसका उपयोग मुआवजा मैट्रिक्स सेट करने के लिए किया जाता है, जिससे रक्तस्राव के माध्यम से सुधार की अनुमति मिलती है।
    नोट: आदर्श रूप से, प्रतिदीप्ति मूल्यों की पूर्ण गतिशील सीमा दिखाई देनी चाहिए। फ्लोरोसेंट प्रोटीन संकेतों का आगे सामान्यीकरण मानकीकृत इकाइयों में रूपांतरण के माध्यम से किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, समकक्ष फ्लोरेसिन के अणु [एमईएफएल; देखें बील एट अल .15])। विश्लेषण के दौरान एमईएफएल रूपांतरण को सक्षम करने के लिए, इंद्रधनुष अंशांकन मोती चलाएं। इस तरह के अंशांकन उपकरण-से-उपकरण और दिन-प्रतिदिन सिग्नल भिन्नताको कम करने के लिए भी उपयोगी है।
  3. पॉली-अभिकर्मक नमूना ट्यूब चलाएं।
    नोट: जहां संभव हो, 1,000 x 10 ^ (^ = मिश्रण) कोशिकाओं को चलाने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि विश्लेषण के दौरान उच्च-आयामी पॉली-अभिकर्मकों को अधिक डिब्बे में विभाजित करने की आवश्यकता होती है, और प्रत्येक बिन को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण तुलना करने के लिए पर्याप्त कोशिकाओं (आदर्श रूप से >10) की आवश्यकता होती है।

5. प्रयोग के बाद विश्लेषण करना

  1. प्रारंभ में, सटीक परिणाम सुनिश्चित करने के लिए नियंत्रण (और, यदि लागू हो, मोती) से डेटा का उपयोग करें। लाइव सेल गेटिंग (ऊपर उल्लिखित गेट्स का उपयोग करके), मुआवजा और ऑटोफ्लोरेसेंस सुधार करने के लिए उपलब्ध सॉफ़्टवेयर टूल में से एक का उपयोग करें।
    नोट: हम आम तौर पर कस्टम MATLAB कोड (जैसे, https://github.com/jonesr18/MATLAB_Flow_Analysis या साइटोफ़्लो17) का उपयोग करते हैं, जिसमें एक ग्राफिकल यूजर इंटरफेस और एक पायथन लाइब्रेरी दोनों होती है जो प्री-प्रोसेसिंग चरण और पॉली-अभिकर्मक विश्लेषण के लिए उपयुक्त होती है।
पद्धति जटिल एनजी फ्लोरोसेंट मार्कर। एनजी एल 7 ए (अंश) एनजी रिपोर्टर (अंश) एनजी फिलर डीएनए (अंश) कुल (ng)
पॉली-अभिकर्मक 1 600
→ 1 150 75 (½) 75 (½) 300
→ 2 150 75 (½) 75 (½) 300
पॉली-अभिकर्मक 2 600
→ 1 150 25 (1/6) 125 (5/6) 300
→ 2 150 125 (5/6) 25(1/6) 300

तालिका 2: प्रोटोकॉल में प्रदर्शित पॉली-अभिकर्मक के लिए डीएनए की मात्रा, और ट्यून किए गए प्लास्मिड अनुपात के साथ एक उदाहरण अनुवर्ती प्रयोग। तालिका का ऊपरी आधा हिस्सा एक साधारण पॉली-अभिकर्मक प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले प्लास्मिड की संरचना को दर्शाता है। निचला आधा एक अद्यतन प्रयोग की संरचना को दर्शाता है जो प्लास्मिड अनुपात को एक काल्पनिक एकाग्रता स्थान को बेहतर ढंग से समायोजित करने के लिए समायोजित करता है, जहां जीन अभिव्यक्ति मॉड्यूलेटर अपने रिपोर्टर के सापेक्ष अधिक इष्टतम 1: 5 अनुपात पर होता है, जिससे इस अनुपात के आसपास नमूना लेने के लिए अधिक संक्रमित कोशिकाएं उत्पन्न होती हैं।

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Representative Results

चित्रा 1 में, हम सह-अभिकर्मक की तुलना पॉली-अभिकर्मक से करते हैं। एक सह-अभिकर्मक में, सभी प्लास्मिड को एक ही अभिकर्मक मिश्रण में वितरित किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप प्रत्येक प्लास्मिड की मात्रा के बीच उच्च सहसंबंध होता है जो किसी भी एकल कोशिका को प्राप्त होता है (चित्रा 1 ए)। जबकि प्रत्येक कोशिका को दिए गए कुल प्लास्मिड की संख्या काफी भिन्न होती है, आबादी भर में अलग-अलग कोशिकाओं में दो रिपोर्टर प्रोटीन की प्रतिदीप्ति अच्छी तरह से सहसंबद्ध होती है, यह दर्शाता है कि दो प्लास्मिड काफी स्थिर अनुपात पर सह-वितरित किए जा रहे हैं। संक्रमित कोशिकाएं कुछ या कई परिसरों को उठा सकती हैं, लेकिन चूंकि प्रत्येक परिसर में प्रत्येक प्लास्मिड की सहसंबद्ध मात्रा होती है, इसलिए सह-अभिकर्मक केवल दो प्लास्मिड के बीच एकाग्रता स्थान के एक छोटे विकर्ण क्षेत्र की पड़ताल करता है। इसके विपरीत, एक पॉली-अभिकर्मक में, प्लास्मिड को कई अभिकर्मक परिसरों में वितरित किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप विभिन्न अभिकर्मक मिश्रणों में प्लास्मिड का गैर-सहसंबद्ध वितरण होता है (चित्रा 1 बी)। संक्रमित कोशिकाएं कॉम्प्लेक्स के विभिन्न संयोजनों को उठाती हैं, जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाएं होती हैं जिनमें न तो, एक या दोनों परिसरों से प्लास्मिड की अलग-अलग खुराक होती है।

चित्रा 2 एक प्रतिनिधि पॉली-अभिकर्मक वर्कफ़्लो दिखाता है। सामान्य तौर पर, एक पॉली-अभिकर्मक प्रयोग में निम्नलिखित चरण होते हैं: समस्या को परिभाषित करें, अभिकर्मक मिश्रण बनाएं, कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, फ्लो साइटोमेट्री और विश्लेषण। अनुकूलित भाग अनुपात के साथ पॉली-अभिकर्मक को दोहराने के लिए एक वैकल्पिक कदम भी है यदि प्रारंभिक पॉली-अभिकर्मक परिणाम इष्टतम भाग अनुपात को ठीक से कम करने में सक्षम नहीं हैं। इन चरणों को प्रोटोकॉल में उल्लिखित किया गया है।

चित्रा 3 में, अच्छी तरह से प्रदर्शन किए गए सह-और पॉली-अभिकर्मकों और सामान्य त्रुटियों के कुछ उदाहरण प्रदान किए गए हैं। चित्रा 3 ए टैगबीएफपी और ईवाईएफपी-व्यक्त प्लास्मिड के बीच एक तंग सहसंबंध के साथ एक अच्छी तरह से प्रदर्शन किए गए सह-अभिकर्मक को दर्शाता है जो सह-वितरित किए गए थे। इसके विपरीत, चित्रा 3 बी में सह-अभिकर्मक इन दो प्लास्मिड के बीच खराब सहसंबंध दिखाता है। दिखाए गए आंकड़े में, खराब सहसंबंध प्लास्मिड को जोड़ने से पहले कम सीरम माध्यम में एन्हांसर अभिकर्मक जोड़ने के कारण है। प्रयोगों में इस तरह के खराब सहसंबंध फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति को चलाने वाले विभिन्न प्रमोटरों, अभिकर्मक मिश्रण निर्माण के दौरान खराब मिश्रण, या कॉम्प्लेक्स को बहुत कम या बहुत लंबे अंतराल के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति देने के कारण भी हो सकते हैं।

चित्रा 3 सी एक अच्छी तरह से प्रदर्शन किए गए पॉली-अभिकर्मक को दर्शाता है, जिसमें दो-आयामी स्थान का अच्छा कवरेज और फ्लोरोसेंट प्रोटीन के बीच किसी भी वर्णक्रमीय रक्तस्राव का अच्छा मुआवजा है। चित्रा 3 डी जीवित कोशिकाओं की कम संख्या के साथ पॉली-अभिकर्मक डेटा दिखाता है, जो विश्लेषण के लिए प्रत्येक बिन में पर्याप्त संख्या में कोशिकाओं के साथ पर्याप्त डिब्बे में उप-विभाजित करना मुश्किल है। इस मुद्दे को सुधारने के लिए, शुरुआती सेल आबादी अच्छे स्वास्थ्य में होनी चाहिए और अतिविकसित नहीं होनी चाहिए, और प्रयोगात्मक विषाक्तता को एक अलग अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग करके और / या कम कुल डीएनए के साथ स्थानांतरित करके कम किया जाना चाहिए। चित्रा 3 ई एक पॉली-अभिकर्मक दिखाता है जिसमें अभिकर्मक दक्षता खराब थी, जिसके परिणामस्वरूप फिर से विश्लेषण के लिए दो-आयामी स्थान का विरल कवरेज हुआ। इस मामले में, आकृति विज्ञान गेटिंग से गुजरने वाली कोशिकाओं की संख्या अधिक है, लेकिन कोशिकाएं फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त नहीं करती हैं। दक्षता में सुधार करने के लिए, अभिकर्मक अभिकर्मक विकल्प को अनुकूलित किया जाना चाहिए और निर्माता के प्रोटोकॉल का बारीकी से पालन किया जाना चाहिए। प्रत्येक अभिकर्मक मिश्रण में डीएनए द्रव्यमान की एक समान मात्रा होनी चाहिए, यह सुनिश्चित करते हुए कि कोशिकाओं को प्रत्येक प्रकार के कॉम्प्लेक्स को प्राप्त करने का लगभग समान मौका है, और प्रत्येक अभिकर्मक मिश्रण किट निर्देशों के अनुसार बनाया जाना चाहिए। विभिन्न सेल प्रकारों के लिए विभिन्न अभिकर्मक किट इष्टतम हैं; सेल प्रकार की रुचि में सबसे अच्छी दक्षता देने वाली किट का उपयोग किया जाना चाहिए। अंत में, उपयोग की जाने वाली किट की परवाह किए बिना, कुछ सेल प्रकारों को स्थानांतरित करना मुश्किल है। इन मामलों में, बड़ी संख्या में कोशिकाओं को स्थानांतरित किया जाना चाहिए, और विश्लेषण करने के लिए पर्याप्त संख्या में कोशिकाओं को सुनिश्चित करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री के दौरान जितना संभव हो उतना एकत्र किया जाना चाहिए। चित्रा 3 एफ पॉली-अभिकर्मक डेटा दिखाता है जहां फ्लोरोसेंट प्रोटीन मार्करों में से एक स्पष्ट रूप से स्पेक्ट्रल ब्लीड-थ्रू को दूसरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन में दिखा रहा है। एकल रंग नियंत्रण हमेशा सिस्टम में सभी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए चलाया जाना चाहिए और एक मुआवजा मैट्रिक्स उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जाना चाहिए जिसे विश्लेषण से पहले सभी पॉली-अभिकर्मकों पर लागू किया जाना चाहिए।

पहली बार पॉली-अभिकर्मक प्रयोगों का प्रदर्शन करते समय (समग्र रूप से या एक नई प्रयोगात्मक प्रणाली के लिए), किसी को मानक सह-अभिकर्मक के खिलाफ बेंचमार्किंग करनी चाहिए। एक दृष्टिकोण सह-अभिकर्मक (डीएनए खुराक ट्यूनिंग के माध्यम से) और पॉली-अभिकर्मक दोनों का उपयोग करके प्रमुख सिस्टम भागों के लिए इनपुट-आउटपुट ट्रांसफर फ़ंक्शन को व्यक्तिगत रूप से मापना है।

चित्रा 4 में, हम ट्रांसलेशनल रिप्रेसर एल 7 ए ई के बेंचमार्किंग का प्रदर्शन करते हैं, जिसे मूल पॉली-अभिकर्मक प्रकाशन10 से यहां अनुकूलित किया गया है। एल 7 ए ई एक आरएनए बाइंडिंग प्रोटीन है जो आरएनए किंक-टर्न (केटी) रूपांकनों20 को पहचानता है; जब दो केटी (2xKT) को एमआरएनए के 5 'अअनुवादित क्षेत्र (UTR) में रखा जाता है, तो डाउनस्ट्रीम ओपन रीडिंग फ्रेम (ORF) अनुवाद को L7Ae21 द्वारा प्रभावी ढंग से दबाया जा सकता है। एल 7 ए ई का उपयोग पहले आरएनए-आधारित सेल टाइप क्लासिफायर21 और अन्य आरएनए-आधारित सर्किट22 बनाने के लिए किया गया है। मानक सह-अभिकर्मक द्वारा एल 7 ए ई का परीक्षण करने के लिए, कोई भी विभिन्न अभिकर्मक मिश्रणों (चित्रा 4 ए और तालिका 3) के भीतर एल 7 ए ई और इसके लक्ष्य रिपोर्टर को एन्कोडिंग करने वाले प्लास्मिड के अनुपात को ट्यून कर सकता है। पॉली-अभिकर्मक के लिए, किसी को स्वतंत्र रूप से अलग-अलग अभिकर्मक मिश्रणों में संवैधानिक एल 7 ए और संबंधित 2 एक्सकेटी रिपोर्टर वितरित करना चाहिए, जैसे कि प्लास्मिड अनुपात की एक विस्तृत श्रृंखला कोशिकाओं को दी जाती है (चित्रा 4 बी)। अभिकर्मक और फ्लो साइटोमेट्री करने के बाद, डेटा विश्लेषण किया जा सकता है। डेटा को तुलनीय बनाने के लिए, कोई व्यक्तिगत सह-अभिकर्मक परिणामों को एक ही डेटासेट में जोड़ सकता है, फिर पॉली-अभिकर्मक डेटा (चित्रा 4 सी, डी) के समान बहु-आयामी बिनिंग कर सकता है। आउटपुट रिपोर्टर को दबाने वाले एल 7 ए ई की खुराक-प्रतिक्रिया वक्रों की तुलना करते हुए, यह देखा जा सकता है कि प्रति बिन औसत आउटपुट स्तर सह-अभिकर्मक और पॉली-अभिकर्मक डेटा (चित्रा 4 ई-जी) के बीच बहुत समान है।

सामान्य तौर पर, हमने देखा है कि पॉली-अभिकर्मक डेटा व्यापक डीएनए अनुपात में सह-अभिकर्मक डेटा के साथ अच्छी तरह से संबंधित है, अत्यधिक विषम डीएनए खुराक अनुपात पर कम परिशुद्धता के साथ (पॉली-अभिकर्मक प्रयोगों के लिए डिब्बे में कम सेल कवरेज के कारण, विशेष रूप से उन भागों के लिए जो कम प्लास्मिड खुराक पर बहुत दृढ़ता से सक्रिय हैं)। ऐसे संवेदनशील भागों के लिए माप सटीकता में सुधार करने के लिए, उनके अभिव्यक्ति स्तर को कमजोर प्रमोटर, अपस्ट्रीम ओपन रीडिंग फ्रेम18, या माइक्रोआरएनए साइलेंसिंग-मध्यस्थता फाइन-ट्यूनर (एमआईएसएफआईटी) 19 के साथ कम किया जा सकता है।

चित्रा 5 एक सेल प्रकार क्लासिफायर के अनुकूलन के लिए पॉली-अभिकर्मक के एक सफल अनुप्रयोग को दर्शाता है, जिसे फिर से गम एट अल10 से अनुकूलित किया गया है। क्लासिफायर एक अपेक्षाकृत सरल डिजाइन है जो एमआईआर -21-5 पी की अभिव्यक्ति के जवाब में एक आउटपुट पैदा करता है, एक एमआरएनए कई ट्यूमर कोशिकाओं23 में अधिक व्यक्त किया जाता है। एमआईआर -21 की अनुपस्थिति में, क्लासिफायर आउटपुट को बैक्टीरिया से व्युत्पन्न ट्रांसक्रिप्शनल रिप्रेसर, बीएम 3 आर 124 द्वारा दमित किया जाता है, जिसका अनुकूलन पहले स्तनधारी कोशिकाओं25 में काम करने के लिए दिखाया गया था। जब MIR-21 मौजूद होता है, तो यह BM3R1 के 3 ' और 5' UTR दोनों में रखे गए चार लक्ष्य साइटों को बांधता है, इसकी अभिव्यक्ति को खटखटाता है और इस तरह आउटपुट ट्रांसक्रिप्शन (चित्रा 5 ए) की अनुमति देता है। इस प्रणाली को अनुकूलित करने के लिए, तीन सर्किट घटकों को अलग-अलग अभिकर्मक मिश्रणों में वितरित किया गया था: (1) बीएम 3 आर 1 (एमआईआर -21 लक्ष्य साइटों के साथ), (2) आउटपुट रिपोर्टर (एमकेओ 2), और (3) गैल 4-वीपी 16, जो आउटपुट के प्रतिलेखन को सक्रिय करता है (तालिका 4)। ध्यान दें कि आउटपुट प्रमोटर तर्क (Gal4-VP16) पर काम करता है, न कि BM3R1, जो Gal4-VP1625 की उपस्थिति में भी आउटपुट को दबा देता है। प्रत्येक भाग प्रत्येक कॉम्प्लेक्स के सापेक्ष डीएनए खुराक को इंगित करने के लिए एक ही प्लास्मिड पर क्रमशः एक अभिकर्मक मार्कर, टैगबीएफपी, एमनियॉनग्रीन और आईआरएफपी 720 को एन्कोड करता है। सामान्य तौर पर, गैल 4-वीपी 16 अभिव्यक्ति में वृद्धि से रिपोर्टर एमकेओ 2 आउटपुट में वृद्धि होनी चाहिए, जबकि बीएम 3 आर 1 अभिव्यक्ति में वृद्धि के परिणामस्वरूप कम एमकेओ 2 आउटपुट होना चाहिए। चूंकि BM3R1 को MIR-21-5p द्वारा नीचे गिराया जाता है, इसलिए HeLa कोशिकाओं में आउटपुट अभिव्यक्ति अधिक होनी चाहिए, जिसमें MIR-21-5p का उच्च स्तर होता है और इस प्रकार HEK कोशिकाओं की तुलना में कम BM3R1 व्यक्त करता है।

एचईके 293 और हेला कोशिकाओं दोनों में पॉली-अभिकर्मक के बाद, हमने विभिन्न प्लास्मिड अनुपात (चित्रा 5 बी-एचईके कोशिकाओं) का 3 डी वितरण प्राप्त किया। गैम एट अल.10 ने ब्याज के अनुपात से एक विशेष यूक्लिडियन दूरी के भीतर कोशिकाओं पर विचार करके विभिन्न अनुपातों में इस वितरण की गणना की; यह दूरी विश्लेषण से सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण परिणामों की अनुमति देने के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को शामिल करने के लिए पर्याप्त चौड़ी होनी चाहिए, लेकिन तीन भागों के घटक अनुपात के बहुत व्यापक सेट को शामिल करने से अनावश्यक शोर से बचने के लिए पर्याप्त संकीर्ण होना चाहिए। गैम एट अल.10 ने तब सह-अभिकर्मक के लिए वर्गीकरण सटीकता को अधिकतम करने वाले भागों के अनुपात की पहचान करने के लिए एक अनुकूलन एल्गोरिथ्म का उपयोग किया (यानी, ट्रांसक्रिप्टेड हेला कोशिकाएं आउटपुट अभिव्यक्ति के लिए सकारात्मक हैं जबकि ट्रांसक्रिप्टेड एचईके कोशिकाएं नहीं हैं)। भागों का इष्टतम अनुपात 10.9: 1.5: 1: Gal4-VP16: आउटपुट: BM3R1 पाया गया; पूरे पॉली-अभिकर्मक स्थान के भीतर इष्टतम अनुपात के आसपास स्थित कोशिकाओं को चित्रा 5 सी में दिखाया गया है। इस उप-नमूनाकरण ने भविष्यवाणी की कि, इस अनुपात में, एचईके 293 बनाम हेला कोशिकाओं को वर्गीकृत करते समय सह-संक्रमित सर्किट में 91% विशिष्टता, 62% संवेदनशीलता और 77% सटीकता होती है (चित्रा 5 डी)। इस इष्टतम पर सेट प्लास्मिड अनुपात के साथ सह-अभिकर्मक ने और भी बेहतर परिणाम दिए: 99% विशिष्टता, 68% संवेदनशीलता, और 84% सटीकता10। इसके अलावा, अनुपातों ने सर्किट के एकल-प्लास्मिड संस्करण के कार्यान्वयन को निर्देशित किया, जिसमें अलग-अलग कटे हुए प्रमोटरों और अपस्ट्रीम ओआरएफ (यूओआरएफ) का उपयोग करके सापेक्ष अभिव्यक्ति के साथ 91% विशिष्टता, 90% संवेदनशीलता और 90% सटीकता10 के साथ एक सर्किट उत्पन्न हुआ। इस प्रकार, पॉली-अभिकर्मक सेल क्लासिफायर और जीन सर्किट के डिजाइन को अधिक व्यापक रूप से निर्देशित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।

Figure 1
चित्रा 1: सह-अभिकर्मक और पॉली-अभिकर्मक की तुलना। (ए, बी) दो प्लास्मिड के सह-अभिकर्मक और दो प्लास्मिड के पॉली-अभिकर्मक के साथ प्लास्मिड वितरण का अवलोकन और तुलना। प्रत्येक अभिकर्मक विधि के लिए, सबसे बाएं आरेख नकारात्मक चार्ज डीएनए और सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए लिपिड के बीच अभिकर्मक परिसरों के गठन को दर्शाता है। इन उदाहरणों में, प्रत्येक रंगीन प्लास्मिड (नीला और लाल) एक अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति को एन्कोड करता है। केंद्र आरेख कोशिकाओं को प्लास्मिड वितरण के उदाहरण दिखाता है और हिस्टोग्राम या स्कैटर प्लॉट में अपेक्षित वितरण के लिए एक योजनाबद्ध भी है। हिस्टोग्राम पर रंग तीव्रता संबंधित प्लास्मिड रंग से प्रतिदीप्ति से मेल खाती है। सबसे दाहिना आरेख प्रत्येक दी गई विधि का उपयोग करके स्थानांतरित कोशिकाओं से वास्तविक डेटा दिखाता है। (ए) दो अलग-अलग प्लास्मिड के साथ सह-अभिकर्मक में, अभिकर्मक अभिकर्मक को जोड़ने से पहले दोनों प्लास्मिड को एक साथ मिलाया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप दो प्लास्मिड प्रजातियों की अत्यधिक सहसंबद्ध पैकेजिंग होती है। वास्तविक सह-अभिकर्मक डेटा में, कोशिकाएं प्लास्मिड (दाएं) दोनों के सहसंबद्ध वितरण का प्रदर्शन करती हैं। (बी) एक पॉली-अभिकर्मक में, एक सर्किट भाग और एक अभिकर्मक मार्कर के अनुरूप सह-वितरित प्लास्मिड के प्रत्येक सेट को अभिकर्मक अभिकर्मक के साथ अलग से मिलाया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप कॉम्प्लेक्स होते हैं जिनमें केवल वे प्लास्मिड (बाएं) होते हैं। वास्तविक पॉली-अभिकर्मक डेटा में, कोशिकाएं एक साथ कई अलग-अलग प्लास्मिड स्टोइकोमेट्री के साथ एकाग्रता स्थान की एक विस्तृत श्रृंखला का पता लगाती हैं (दाएं)। इस आंकड़े को10 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: पॉली-अभिकर्मक वर्कफ़्लो। चरण 1: समस्या को परिभाषित करें। कई घटक भागों के साथ एक प्रणाली से शुरू करें जिसके लिए भागों के बीच आदर्श अनुपात अज्ञात है, और घटक भागों के बीच एक प्रारंभिक अनुपात चुनें। चरण 2: अभिकर्मक मिश्रण बनाएं। प्रत्येक अभिकर्मक मिश्रण में एक सर्किट घटक और एक फ्लोरोसेंट अभिकर्मक मार्कर होता है। एक सेल को दिए गए सर्किट भाग की मात्रा मार्कर की प्रतिदीप्ति के साथ संबंधित है। चरण 3: कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। एक विशिष्ट वर्कफ़्लो में, हम अभिकर्मक और प्रवाह साइटोमेट्री के बीच 48 घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करते हैं। चरण 4: फ्लो साइटोमेट्री। प्रोटोकॉल में चर्चा के अनुसार उपयुक्त नियंत्रण चलाएँ, और उसके बाद नमूने चलाएँ। सेल को प्राप्त भागों की मात्रा या अनुपात के अनुसार कोशिकाओं को बिन करने के लिए अभिकर्मक मार्करों का उपयोग करें। सर्किट प्रदर्शन को मापने के लिए आउटपुट प्रोटीन (ओं) का उपयोग करें। परिपथ निष्पादन को अनुकूलित करने वाले भागों के डिब्बे/अनुपात ज्ञात कीजिए। चरण 6: अनुकूलित भाग अनुपात (वैकल्पिक) के साथ दोहराएं। यदि इष्टतम डिब्बे / अनुपात अत्यधिक विषम अनुपात पर हैं, तो पायलट पॉली-अभिकर्मक इष्टतम भाग अनुपात को ठीक से कम नहीं कर सकता है। ट्यून किए गए भाग अनुपात के साथ पॉली-अभिकर्मक को दोहराएं, जैसे कि एक सेल जिसे प्रत्येक अभिकर्मक मिश्रण की समान मात्रा प्राप्त होती है, अब पूर्व दौर द्वारा निर्धारित भागों का करीबी-से-इष्टतम अनुपात प्राप्त होता है। इस आंकड़े को10 से संशोधित किया गया है। एक इनक्यूबेटर की छवि का उपयोग सर्वियर मेडिकल आर्ट से और बायोरेंडर से एक साइटोमीटर की छवि से किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिनिधि सकारात्मक और नकारात्मक पॉली-अभिकर्मक परिणाम । (ए) दो फ्लोरोसेंट संवाददाताओं का अच्छी तरह से प्रदर्शन किया गया सह-अभिकर्मक, एक तंग सहसंबंध दिखाता है। तुलना के लिए यहां और (बी) दोनों में कुल 20,000 कोशिकाओं को प्लॉट किया गया है। पॉली-अभिकर्मक प्रयोग शुरू करने से पहले दो फ्लोरोसेंट संवाददाताओं के समान छोटे परीक्षण सह-अभिकर्मक करना एक अच्छा विचार है, यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्लास्मिड अभिकर्मक मिश्रण ों के भीतर अच्छी तरह से सहसंबद्ध हैं। (बी) शोर सह-अभिकर्मक: प्लास्मिड प्रत्येक अभिकर्मक मिश्रण के भीतर अच्छी तरह से सहसंबद्ध नहीं होते हैं, जो पॉली-अभिकर्मक में फ्लोरोसेंट मार्करों को प्लास्मिड अनुपात का खराब मार्कर होने का कारण बन सकता है। (सी) अच्छी तरह से प्रदर्शन किए गए पॉली-अभिकर्मक परिणाम अच्छे सेल काउंट, अभिकर्मक दक्षता और मुआवजे दिखाते हैं। (डी) कम लाइव सेल गिनती, जो सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण संख्या में कोशिकाओं के साथ डिब्बे में उप-नमूनाकरण की अनुमति नहीं देता है। (ई) खराब अभिकर्मक दक्षता, जो कोशिकाओं की सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण संख्या के साथ डिब्बे में उप-नमूने की अनुमति नहीं देती है। (एफ) उचित मुआवजे की कमी, जो प्रतिदीप्ति डेटा को सिस्टम में फ्लोरोसेंट प्रोटीन की मात्रा के लिए एक खराब प्रॉक्सी का कारण बनता है। एक आदर्श रैखिक मुआवजा मैट्रिक्स निर्धारित करने के लिए एकल रंग नियंत्रण का उपयोग करें, और आगे की प्रक्रिया से पहले इसे डेटा पर लागू करें। सॉफ्टवेयर की पसंद के आधार पर सभी रंग नियंत्रण ों की भी सिफारिश की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: सह-अभिकर्मक के खिलाफ पॉली-अभिकर्मक को बेंचमार्क करना। (ए) एक सह-अभिकर्मक में, ट्रांसलेशनल रिप्रेसर एल 7 ए ई से फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्लास्मिड के एक अनुपात का परीक्षण प्रत्येक प्रयोगात्मक कुएं में किया जा सकता है। (बी) पॉली-अभिकर्मक में, संवाददाताओं के लिए एल 7 ए ई के कई अनुपातों का परीक्षण एक ही कुएं में किया जा सकता है। पॉली-अभिकर्मक प्लास्मिड मिश्रणों के विवरण के लिए तालिका 3 देखें। (C, D) कई सह-अभिकर्मकों के खिलाफ पॉली-अभिकर्मक को बेंचमार्क करने के लिए बिनिंग वर्कफ़्लो। प्रत्येक अभिकर्मक मार्कर आयाम के लिए कुल 10 द्विघाती-स्पेस्ड डिब्बे सौंपे गए थे, जो दो प्लास्मिड में से प्रत्येक के स्तर का अनुमान लगाते हैं। यहां, प्लास्मिड # 2 के विभिन्न स्तरों को दर्शाने वाले डिब्बे दिखाए गए हैं। बिनिंग विभिन्न प्लास्मिड अनुपात (सी) और एकल पॉली-अभिकर्मक से डेटा तक फैले 11 सह-अभिकर्मक नमूनों के एक एकत्रित सेट पर किया गया था, जिसमें प्रत्येक (डी) में लगभग 500,000 कोशिकाएं शामिल थीं। रंग जीन 2 (टैगबीएफपी) स्तरों द्वारा परिभाषित डिब्बे के सेट के अनुरूप हैं। (E-G) एक प्रतिनिधि सर्किट के लिए सह-अभिकर्मक के खिलाफ पॉली-अभिकर्मक को बेंचमार्क करना। प्रत्येक बिन में कोशिकाओं के लिए औसत आउटपुट प्रतिदीप्ति का मूल्यांकन किया गया था और प्रतिनिधि प्रणाली, एल 7 ए ई ट्रांसलेशनल दमन के तरीकों के बीच तुलना की गई थी। (ई) एल 7 ए ई गतिविधि को मापने के लिए निर्माण। एमकेओ 2 प्रतिदीप्ति एल 7 ए (जीन # 1) के वितरण के लिए एक अनुमान के रूप में कार्य करता है, जबकि टैगबीएफपी प्रतिदीप्ति विनियमित एमनियोनग्रीन आउटपुट (जीन # 2) के वितरण के लिए एक अनुमान के रूप में कार्य करता है। (एफ) एल 7 एई के लिए बहु-आयामी अनुमापन वक्र। प्रत्येक पंक्ति टैगबीएफपी के एक स्तर पर डिब्बे के सेट का प्रतिनिधित्व करती है, जैसा कि (सी) और (डी) में दर्शाया गया है। ठोस रेखाएं पॉली-अभिकर्मक डेटा को दर्शाती हैं, जबकि धराशायी रेखाएं सह-अभिकर्मक डेटा को दर्शाती हैं। रिपोर्टर प्लास्मिड के प्रत्येक बिन्ड स्तर पर, एल 7 ए ई बढ़ने पर रिपोर्टर आउटपुट कम हो जाता है। (जी) एल 7 ए ई प्रणाली के लिए सह-अभिकर्मक और पॉली-अभिकर्मक के बीच दृश्य तुलना। प्रत्येक बिंदु पॉली-अभिकर्मक और सह-अभिकर्मक माप के लिए संबंधित डिब्बे में मापा आउटपुट का प्रतिनिधित्व करता है, जहां अधिक समकक्ष मान लाल 1: 1 रेखा के करीब होते हैं। कुल मिलाकर, पॉली-अभिकर्मक- और सह-अभिकर्मक-व्युत्पन्न के बीच देखे गए अंतर कम हैं, जो पॉली-अभिकर्मक विधि की विश्वसनीयता में विश्वास प्रदान करते हैं। इस आंकड़े को10 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: पॉली-अभिकर्मक के लिए डेटा विश्लेषण। पॉली-अभिकर्मक में, कोशिकाओं को विश्लेषण के लिए डिब्बे या स्लाइस में वर्गीकृत किया जा सकता है। चित्रा 4 विश्लेषण का एक रूप दिखाता है जहां कोशिकाओं को स्लाइस में विभाजित किया जाता है जो एक सिस्टम घटक के स्तर के अनुरूप होते हैं, जैसे कि रिपोर्टर प्लास्मिड स्तर, जो मॉडल फिटिंग और खुराक प्रतिक्रियाओं को समझने के लिए उपयोगी हो सकता है। एक और उपयोगी रणनीति सर्किट घटकों के विभिन्न अनुपातों पर सर्किट प्रदर्शन का विश्लेषण करना है। (ए) अनुकूलन के लिए एक क्लासिफायर सर्किट का आरेख। टैगबीएफपी, नियॉनग्रीन और आईआरएफपी 720 के स्तर क्रमशः बीएम 3 आर 1, आउटपुट एमकेओ 2 और गैल 4-वीपी 16 के स्तर के अनुरूप हैं। पॉली-अभिकर्मक प्लास्मिड मिश्रणों के विवरण के लिए तालिका 4 देखें। (बी) पॉली-अभिकर्मक मिश्रणों का प्रयोगात्मक सेटअप। (सी) (ए) में सर्किट के साथ पॉली-अभिकर्मक से एकत्र किए गए फ्लो साइटोमेट्री डेटा। एचईके कोशिकाओं में सर्किट पॉली-अभिकर्मक के परिणामस्वरूप तीन रिपोर्टर फ्लोरोसेंट प्रोटीन में से प्रत्येक का स्तर, डेटा में मौजूद सर्किट घटक अनुपात की विस्तृत श्रृंखला को दर्शाता है। इसी तरह के परिणाम एचईके और हेला कोशिकाओं दोनों में सर्किट अभिकर्मक से प्राप्त किए गए थे। (डी) एक विशेष अनुपात में पॉली-अभिकर्मक का उप-नमूनाकरण। डेटा का विश्लेषण करने के लिए, हमने सर्किट घटकों के बीच बड़ी संख्या में अनुपात ों को स्कैन किया और प्रत्येक अनुपात में क्लासिफायर प्रदर्शन निर्धारित किया। एक उदाहरण के रूप में, हम यहां एक विशेष अनुपात दिखाते हैं जिसने अच्छे प्रदर्शन का प्रदर्शन किया (गैल 4-वीपी 16 = डीएनए का 435 एनजी, रिपोर्टर = 60 एनजी, और बीएम 3 आर 1 = 40 एनजी)। नीले रंग में प्लॉट किया गया तीन अलग-अलग सर्किट घटकों के लिए फ्लोरोसेंट मार्करों का संबंधित अनुपात है। इसके बाद, हमने प्रतिदीप्ति प्रक्षेपवक्र से एक विशेष यूक्लिडियन दूरी के भीतर बिंदुओं पर विचार करके डेटा का विश्लेषण किया। हमने एचईके और हेला अभिकर्मकों दोनों से एक ही प्रक्षेपवक्र पर कोशिकाओं को अलग किया। (ई) एचईके और हेला कोशिकाओं में एक ही प्रक्षेपवक्र पर सर्किट प्रदर्शन की तुलना। कई अनुपातों में संवेदनशीलता, विशिष्टता और वर्गीकरण की सटीकता जैसे आंकड़ों की तुलना करके, घटक अनुपात को एक आदर्श आनुवंशिक सर्किट उत्पन्न करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इस आंकड़े को10 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

जटिल एनजी एल 7 ए ई प्लास्मिड। एनजी रिपोर्टर प्लास्मिड ऑप्टिएमईएम (μL) P3000 (μL) लिपो 3000 (μL)
1 250 75 1.5 1.5
2 250 75 1.5 1.5

तालिका 3: अभिकर्मक चित्र 4 के अनुरूप मिश्रण करता है। एचईके 293 कोशिकाओं को 24-वेल प्लेट के एक कुएं में इन अभिकर्मक मिश्रणों के साथ पॉली-ट्रांसक्रिप्टेड किया गया था।

जटिल एनजी बीएम 3 आर 1 प्लास्मिड; एनजी गैल 4-वीपी 16 प्लास्मिड; एनजी रिपोर्टर प्लास्मिड ऑप्टिएमईएम (μL) P3000 (μL) लिपो 3000 (μL)
1 900 75 1.5 1.5
2 900 75 1.5 1.5
3 900 75 1.5 1.5

तालिका 4: अभिकर्मक मिश्रण चित्रा 5 के अनुरूप है। एचईके 293 और हेला कोशिकाओं को 6-वेल प्लेट के एक कुएं में इन अभिकर्मक मिश्रणों के साथ प्रत्येक पॉली-ट्रांसक्रिप्टेड किया गया था।

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Discussion

कंप्यूटर-एडेड डिज़ाइन (सीएडी), ब्रेडबोर्डिंग और 3 डी प्रिंटिंग जैसे रैपिड प्रोटोटाइप विधियों ने मैकेनिकल, इलेक्ट्रिकल और सिविल इंजीनियरिंग विषयों में क्रांति ला दी है। किसी दिए गए चुनौती के कई संभावित समाधानों के माध्यम से जल्दी से खोज करने की क्षमता एक क्षेत्र में प्रगति को बहुत तेज करती है। हमारा मानना है कि पॉली-अभिकर्मक जैविक इंजीनियरिंग के लिए एक अनुरूप तकनीक है, जो आनुवंशिक सर्किट के तेजी से प्रोटोटाइप को सक्षम करता है। इसके अतिरिक्त, अन्य रैपिड प्रोटोटाइप तकनीकों को कई संभावित समाधानों के अनुक्रमिक पुनरावृत्ति की आवश्यकता होती है, जबकि पॉली-अभिकर्मक एक साथ कई समाधानों का पता लगाने में सक्षम है। पॉली-अभिकर्मक आनुवंशिक सर्किट घटक अनुपात के संयोजनों की एक बड़ी संख्या को एक ही कुएं में परीक्षण करने में सक्षम बनाता है और इसका उपयोग कई प्रकाशित आनुवंशिक सर्किट10,11,13 को अनुकूलित करने के लिए किया गया है। प्रायोगिक प्रोटोकॉल मानक सह-अभिकर्मक का एक सरल विस्तार है, जो कई स्तनधारी सेल शोधकर्ताओं द्वारा सीधे अपनाने की अनुमति देता है। आम तौर पर, पॉली-अभिकर्मक और सह-अभिकर्मक परिणामों के बीच एक बहुत करीबी समझौता10 देखा जाता है (एक उदाहरण चित्रा 4 है)। इस प्रकार, पॉली-अभिकर्मक का उपयोग ज्यादातर मामलों में किया जा सकता है जहां प्लास्मिड अनुपात को सह-अभिकर्मक मिश्रण के भीतर टाइट किया जाता है और आउटपुट को एकल-सेल स्तर पर मापा जाता है।

पॉली-अभिकर्मक की जटिलता और पैमाने को अनुकूलित करने के लिए आनुवंशिक सर्किट की जटिलता के साथ वृद्धि होती है। जैसे-जैसे विश्लेषण करने के लिए आयामों की संख्या बढ़ती है, विभिन्न भागों के मिश्रित अनुपात और उनके विश्लेषण के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या तेजी से बढ़ती है। उदाहरण के लिए, चित्रा 5 में क्लासिफायर को अनुकूलित करने के लिए, कोशिकाओं को 6-वेल प्लेट प्रारूप में स्थानांतरित किया गया था, और कम से कम 1.5 मिलियन जीवित कोशिकाओं पर डेटा एकत्र किया गया था। हमने एक अतिरिक्त सर्किट घटक 10 के साथ एक क्लासिफायर को भी अनुकूलित किया है, जिससे10 सेमी प्लेट स्केल पर अभिकर्मक और लाखों कोशिकाओं के संग्रह की आवश्यकता होती है। उस पैमाने पर और उससे ऊपर, डीएनए उत्पादन समय लेने वाला है, और अभिकर्मक अभिकर्मक महंगे हैं। उस ने कहा, पॉली-अभिकर्मक व्यक्तिगत कुओं में सर्किट घटक अनुपात संयोजनों की तुलनीय संख्या का परीक्षण करने की तुलना में कम कोशिकाओं, डीएनए और अभिकर्मक अभिकर्मकों के आदेशों का उपयोग करता है। इसके अतिरिक्त, कम अभिकर्मक मिश्रण के आदेश देकर काफी समय बचाया जाता है।

पॉली-अभिकर्मक प्रवाह साइटोमेट्री डेटा के लिए उन्नत विश्लेषण विधियों को सक्षम बनाता है। दो मुख्य दृष्टिकोण हैं (1) प्रत्येक अभिकर्मक मार्कर की अभिव्यक्ति के अनुसार कोशिकाओं को बिनिंग करना और (2) अभिकर्मक मार्करों के परिभाषित अनुपात पर कोशिकाओं को निकालना, जिससे सह-अभिकर्मक का अनुकरण होता है। पूर्व प्रत्येक कॉम्प्लेक्स (और इस प्रकार प्रत्येक भाग) के लिए डीएनए खुराक के एक विशिष्ट संयोजन के साथ कोशिकाओं का चयन करता है, जिससे इनपुट-आउटपुट ट्रांसफर फ़ंक्शन प्राप्त होते हैं। उत्तरार्द्ध प्रत्येक भाग के लिए डीएनए खुराक के एक विशिष्ट अनुपात पर कोशिकाओं का चयन करता है, प्लास्मिड डीएनए द्रव्यमान के ऐसे अनुपात में सह-अभिकर्मक का अनुकरण करता है। चयनित चयनों में सर्किट आउटपुट रिपोर्टर (ओं) के अभिव्यक्ति स्तर को प्लॉट करने से इनपुट के परिभाषित स्तरों या अनुपात पर आउटपुट का माप मिलता है। सर्किट अनुकूलन के लिए, कोई सर्किट के उद्देश्य से परिभाषित सर्वोत्तम प्रदर्शन करने वाले डिब्बे / अनुपात की पहचान कर सकता है - सेल क्लासिफायर के मामले में, ये डिब्बे / अनुपात हैं जहां सर्किट लक्ष्य सेल प्रकार में चालू है और गैर-लक्ष्य सेल प्रकारों में बंद है। बिन आकार चुनते समय, किसी को आवश्यक परिशुद्धता के स्तर को ध्यान में रखना चाहिए, साथ ही प्रति बिन कोशिकाओं की संख्या भी। छोटे डिब्बे सर्किट घटकों के आदर्श संयोजन पर अधिक सटीक रूप से ध्यान केंद्रित करते हैं, लेकिन यदि किसी बिन में बहुत कम कोशिकाएं हैं, तो यह माप के लिए अवांछनीय शोर पेश कर सकता है।

पॉली-अभिकर्मक डेटा के कम्प्यूटेशनल विश्लेषण में भविष्य के सुधार प्रति बिन / अनुपात में कम सेल कवरेज के साथ भी अनुकूलन की सुविधा प्रदान कर सकते हैं। वर्तमान में, हम अत्यधिक शोर माप से बचने के लिए कोशिकाओं की एक निर्धारित सीमा (जैसे, 10) से कम वाले डिब्बे से डेटा को बाहर करते हैं। बार-बार माप के साथ संयोजन में, यह खुराक-प्रतिक्रिया वक्रों, क्लासिफायर अशुद्धियों और प्रति-बिन आधार पर परिभाषित अन्य मैट्रिक्स की अधिक सटीक और सटीक गणना को सक्षम बनाता है। हालांकि, पॉली-अभिकर्मक में प्रत्येक कोशिका को एक स्वतंत्र प्रयोग माना जा सकता है, जो इनपुट के सटीक स्तर पर सर्किट आउटपुट (ओं) को ठीक रिज़ॉल्यूशन पर मापता है। इसे ध्यान में रखते हुए, खुराक प्रतिक्रियाओं और सर्किट अनुकूलन के यांत्रिक और फेनोटाइपिक मॉडल सीधे प्रत्येक मार्कर और रिपोर्टर से जीन अभिव्यक्ति के वितरण के लिए फिट हो सकते हैं, बजाय उनके बिन्ड सारांश आंकड़े10। यह अधिक मजबूत माप को सक्षम करता है और प्रति प्रयोग एकत्र किए गए कई व्यक्तिगत डेटा बिंदुओं का लाभ उठाता है। इस तरह के मॉडलिंग दृष्टिकोण इस प्रकार पूर्वानुमानित सर्किट लक्षण वर्णन और अनुकूलन उत्पन्न कर सकते हैं, यहां तक कि विरल रूप से नमूना उच्च-आयामी पॉली-अभिकर्मकों के साथ भी। इसके अलावा, मशीन सीखने के तरीकों जैसे प्रतिक्रिया सतह पद्धति और यादृच्छिक वन प्रतिगमन का उपयोग अपेक्षाकृत विरल, उच्च-आयामी डेटा10 का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है।

तेजी से बड़े पॉली-अभिकर्मकों के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण पॉली-अभिकर्मकों के पदानुक्रम का उपयोग करके क्रमिक रूप से सर्किट को अनुकूलित करना है। इस दृष्टिकोण में, सबसे पहले, पॉली-अभिकर्मक का उपयोग एक मॉड्यूल को अनुकूलित करने के लिए किया जाता है जिसमें एक बड़े सर्किट के भीतर आनुवंशिक घटकों का एक उप-समूह शामिल होता है। फिर, इन अनुकूलित मॉड्यूल को अलग-अलग पॉली-अभिकर्मक मिश्रण के रूप में वितरित किया जाता है, जिससे प्रत्येक सर्किट मॉड्यूल के इष्टतम अनुपात / खुराक को खोजने में मदद मिलती है। यह दृष्टिकोण कोशिकाओं, डीएनए और अभिकर्मक अभिकर्मकों की काफी कम संख्या का उपयोग करता है। हालांकि, घटकों के समूह अन्य घटकों के संबंध में आवश्यक रूप से मॉड्यूलर नहीं हैं, और इस प्रकार अलगाव में मापा गया मॉड्यूल में घटक भागों का एक इष्टतम अनुपात बड़े सर्किट संदर्भ8 के भीतर उप-मानक हो सकता है।

पॉली-अभिकर्मक विधियां डेटा एकत्र करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रवाह साइटोमीटर के लेजर / फिल्टर कॉन्फ़िगरेशन द्वारा भी सीमित हैं। मापा फ्लोरोसेंट आउटपुट के अलावा, प्रत्येक अभिकर्मक मिश्रण में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन मार्कर होता है। इस प्रकार, फ्लोरोसेंट प्रोटीन का चयन करना महत्वपूर्ण है जिसे साइटोमीटर पर अच्छी तरह से मुआवजा दिया जा सकता है। हमने पहले पांच-लेजर फ्लो साइटोमीटर (बीडी एलएसआरफोर्टेसा) पर 22 फ्लोरोसेंट प्रोटीन के एक पैनल के रक्तस्राव का व्यवस्थित रूप से विश्लेषण किया था, और पाया कि सिरियस, टैगबीएफपी, एमनियोनग्रीन, एमकेओ 2 और आईआरएफपी 720 के सेट का उपयोग एक साथ किया जा सकता है औरमहत्वपूर्ण मुद्दों के बिना अच्छी तरह से मुआवजा दिया जा सकता है। हालांकि, बड़े सर्किट के अनुकूलन के लिए उन्नत साइटोमेट्री विधियों की आवश्यकता हो सकती है, जैसे कि अधिक अतिव्यापी स्पेक्ट्रा के साथ फ्लोरोसेंट प्रोटीन को अलग करने के लिए वर्णक्रमीय साइटोमेट्री, जिसे हमारी प्रयोगशाला वर्तमान में आठ फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ अनुकूलित कर रही है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन डेटाबेस (https://www.fpbase.org) जैसे डेटाबेस विशेष वर्णक्रमीय ओवरलैप के साथ फ्लोरोसेंट प्रोटीन का चयन करने के लिए उपयोगी हैं। हालांकि, यह प्रक्रिया विभिन्न कारकों द्वारा जटिल हो सकती है, जिनमें से कुछ विशेष साइटोमीटर के लिए विशिष्ट हैं। उदाहरण के लिए, टीडीटमाटर जैसे कुछ लाल प्रोटीन के उपयोग से केवल कुछ लेजर / फिल्टर कॉन्फ़िगरेशन10 में नीले चैनलों में अवांछनीय रक्तस्राव हो सकता है। इसके अतिरिक्त, कई दूर-लाल प्रोटीन ने डीएनए खुराक और प्रतिदीप्ति आउटपुट10 के बीच गैर-रैखिक संबंध दिखाए हैं, जिससे डीएनए खुराक के लिए प्रभावी मार्कर के रूप में उनका उपयोग कम हो जाता है।

प्रयोगों में स्थिरता के लिए जो अलग-अलग संख्या में कॉम्प्लेक्स (एक, दो, तीन, आदि) के साथ किए जाते हैं, प्रति अभिकर्मक मिश्रण प्लास्मिड की समान आंशिक मात्रा का उपयोग करना उपयोगी होता है। उदाहरण के लिए, यदि तीन प्लास्मिड (ए, बी, और सी) में से एक में एन्कोड किए गए प्रत्येक जीन के साथ तीन-जीन प्रणाली का परीक्षण किया जाता है, तो कोई 1: 1: 1 अनुपात में सर्किट प्लास्मिड को सह-स्थानांतरित कर सकता है, साथ ही एक अभिकर्मक मार्कर को एन्कोडिंग करने वाले प्लास्मिड के बराबर अनुपात के साथ। यह प्रत्येक प्लास्मिड को मिश्रण के कुल द्रव्यमान का एक-चौथाई बना देगा, और इस प्रकार प्रत्येक अभिकर्मक परिसर के द्रव्यमान का लगभग एक-चौथाई हिस्सा होगा। जब ए, बी और सी को अपने स्वयं के संवाददाताओं के साथ अलग-अलग परिसरों में पॉली-ट्रांसिंग करते हैं, तो प्लास्मिड 1: 1 को संवाददाताओं के साथ मिलाने या उनके कुल डीएनए द्रव्यमान को बनाए रखने के बजाय, प्रत्येक प्लास्मिड को प्रत्येक कॉम्प्लेक्स के द्रव्यमान के एक-चौथाई पर रखना अधिक सुसंगत होता है, जिसमें भराव डीएनए शेष द्रव्यमान लेता है (उदाहरण के लिए तालिका 5 देखें)। ऐसा इसलिए है क्योंकि संक्रमित कोशिकाओं के बीच जीन अभिव्यक्ति का वितरण परिसरों में वितरित डीएनए के कुल द्रव्यमान पर कम निर्भर करता है, और प्रत्येक जटिल10 में डीएनए की आंशिक मात्रा पर अधिक निर्भर करता है। यदि 1: 1: 1 के अलावा अन्य अनुपात वांछित हैं, तो प्रत्येक भाग के लिए अभिकर्मक मिश्रण में कुल डीएनए द्रव्यमान के संबंधित अंशों की गणना करें। उदाहरण के लिए, तालिका 5 [नीचे] 1: 1: 4 अनुपात दिखाती है।

पद्धति जटिल एनजी ए (अंश)। एनजी बी (अंश) एनजी सी (अंश) एनजी रिपोर्टर (अंश) एनजी फिलर डीएनए (अंश) कुल (ng)
सह-अभिकर्मक 1 150 (¼) 150 (¼) 150 (¼) 150 (¼) 0 (0) 600
पॉली-अभिकर्मक। 600
→ 1 50 (¼) 50 (¼) 100 (½) 200
→ 2 50 (¼) 50 (¼) 100 (½) 200
→ 3 50 (¼) 50 (¼) 100 (½) 200
सह-अभिकर्मक 1 75 (⅛) 75 (⅛) 300 (½) 150 (¼) 0 (0) 600
पॉली-अभिकर्मक। 600
→ 1 25 (⅛) 50 (¼) 125 (⅝) 200
→ 2 25 (⅛) 50 (¼) 125 (⅝) 200
→ 3 100 (½) 50 (¼) 50 (¼) 200

तालिका 5: सह-और पॉली-अभिकर्मक प्रयोगों में स्थिरता के लिए भराव डीएनए का उपयोग करने के उदाहरण। यहां, भराव डीएनए की समान मात्रा के साथ तीन प्लास्मिड को सह-संक्रमित करने के दो सामान्य उदाहरण दिखाए गए हैं। शीर्ष उदाहरण में, प्लास्मिड सभी समान द्रव्यमान पर हैं। नीचे के उदाहरण में, एक प्लास्मिड दूसरों की तुलना में उच्च द्रव्यमान पर वितरित किया जाता है। सह-अभिकर्मक परिसर में उपयोग किए जाने वाले कुल डीएनए के अंश को पॉली-अभिकर्मक परिसरों में स्थानांतरित किया जाता है, जिसमें डीएनए की शेष मात्रा (प्रत्येक परिसर के लिए कुल राशि तक, जो निश्चित और परिसरों में बराबर होती है) भराव डीएनए के साथ गठित होती है।

भराव डीएनए का समग्र उद्देश्य अद्वितीय अभिकर्मक मिश्रणों की संख्या की परवाह किए बिना, प्रति सेल प्लास्मिड की समान खुराक बनाए रखना है। इस सिद्धांत के कच्चे अनुमान के रूप में, प्रत्येक के समान डीएनए द्रव्यमान (और अभिकर्मक अभिकर्मक के उचित अनुपात) को बनाए रखते हुए तीन प्लास्मिड को तीन मिश्रणों में अलग करने से सभी तीन प्लास्मिड युक्त एकल मिश्रण की तुलना में किसी दिए गए कॉम्प्लेक्स को प्राप्त करने वाली कोशिकाओं का प्रतिशत एक तिहाई कम हो जाता है। हालांकि, प्रत्येक संक्रमित कोशिका को बाद में ~ 3 x उच्च जीन खुराक प्राप्त होती है। भराव डीएनए के बिना अकेले प्लास्मिड की सापेक्ष मात्रा को कम करना इस प्रकार लगातार प्लास्मिड खुराक को बनाए रखने के लिए अपर्याप्त है, क्योंकि यह ट्रांसक्रिप्टेडकोशिकाओं के बीच अभिव्यक्ति के अंतर्निहित वितरण को बदलने के बिना अभिकर्मक दक्षता को कम करता है। दूसरी ओर, भराव डीएनए समग्र अभिकर्मक दक्षता को प्रभावित किए बिना डीएनए खुराक को समायोजित करने की अनुमति देता है (हालांकि कम संकेत के कारण पता लगाने योग्य संक्रमित कोशिकाएं कम हो सकती हैं)10। ऊपर कच्चे अनुमान के बाद, पॉली-अभिकर्मक मिश्रण में डीएनए के अंश को एक तिहाई तक कम करना और भराव डीएनए जोड़ना मूल सह-अभिकर्मक की तुलना में सापेक्ष जीन खुराक को बनाए रखता है। इसलिए भराव डीएनए कुशल और सटीक अभिकर्मक जटिल गठन सुनिश्चित करता है।

अपने रिपोर्टर द्वारा कवर किए गए रुचि के जीन की अभिव्यक्ति की सीमा को बदलने के लिए, जीन को चलाने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक परीक्षण प्लास्मिड और / या प्रमोटरों के अंश को रिपोर्टर के सापेक्ष ट्यून किया जा सकता है। यदि कोई हिस्सा कम डीएनए खुराक पर मजबूत / अत्यधिक सक्रिय है, तो कम डीएनए अंश का उपयोग करने से ट्रांसक्रिप्टेड कोशिकाओं में रिपोर्टर के प्रतिदीप्ति वितरण के बीच में भाग की गतिशील सीमा को केंद्र में रखने में मदद मिल सकती है। इसी तरह, उन हिस्सों के लिए जो कमजोर / केवल उच्च डीएनए खुराक पर सक्रिय हैं, उच्च अंश का उपयोग करना उपयोगी हो सकता है। हालांकि, इस तरह की ट्यूनिंग के साथ देखभाल की जानी चाहिए, क्योंकि डीएनए अंशों को बहुत कम करने से रिपोर्टर10 की तुलना में कोशिकाओं को वितरण की स्टोकेस्टिकिटी बढ़ जाती है, और उच्च जीन अभिव्यक्ति स्तर सेलुलर जीन अभिव्यक्ति मशीनरी12,14 को अधिभारित कर सकते हैं। स्टोकेस्टिकिटी से बचने के लिए, और ऐसे मामलों में जहां प्रत्येक जीन को एक निश्चित अनुपात में कोशिकाओं में पहुंचाया जाता है (उदाहरण के लिए, यदि सर्किट को एकल लेंटी, पिग्गीबैक या लैंडिंग पैड वेक्टर के रूप में उत्पन्न किया जाना है), तो प्रत्येक जीन की सापेक्ष अभिव्यक्ति को मजबूत / कमजोर प्रमोटरों, छोटे यूओआरएफ18, और / या एमआईएसएफआईटी19 का उपयोग करके ट्यून किया जा सकता है।

हालांकि प्रोटोकॉल एक रिवर्स अभिकर्मक तकनीक का वर्णन करता है, पॉली-अभिकर्मक आगे के अभिकर्मक के साथ भी संभव है। रिवर्स अभिकर्मक में, कोशिकाओं को एक साथ बीज और स्थानांतरित किया जाता है; आगे के अभिकर्मक में, कोशिकाओं को पहली बार लगभग आधे घनत्व पर चढ़ाना के बाद ~ 24 घंटे स्थानांतरित किया जाता है जिसका उपयोग रिवर्स अभिकर्मक में किया जाएगा (अभिकर्मक के समय तक कोशिका विभाजन की अनुमति देने के लिए)। सामान्य तौर पर, रिवर्स अभिकर्मक अधिक कुशल होता है लेकिन अधिक विषाक्त भी होता है, और हमने अभिकर्मक, अभिकर्मक समय और सेल लाइन के आधार पर अभिकर्मक वितरण के आकार में कुछ अंतर देखे हैं। इस प्रकार, पसंद की अभिकर्मक विधि को प्रत्येक सेल लाइन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए ताकि ट्रांसक्रिप्टेड कोशिकाओं की संख्या और प्रति सेल प्लास्मिड खुराक के बहु-आयामी एकाग्रता स्थान के कवरेज को अधिकतम किया जा सके।

कुल मिलाकर, पॉली-अभिकर्मक स्तनधारी आनुवंशिक सर्किट के तेजी से अनुकूलन को सक्षम बनाता है। सर्किट घटकों के कई संभावित अनुपातमीट्रिक संयोजनों को आसानी से एक ही कुएं में परीक्षण किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, चूंकि पॉली-अभिकर्मक में पारंपरिक अभिकर्मक की तुलना में एक प्रणाली में प्रत्येक भाग के स्तर के बारे में अधिक जानकारी होती है, इसलिए यह विभिन्न आनुवंशिक भागों10,11,12,13 के व्यवहार को चिह्नित करने के लिए अत्यधिक मूल्यवान पाया गया है। पॉली-अभिकर्मक को अपनाने से स्तनधारी कोशिकाओं में उपयोग के लिए नए और बेहतर जीन सर्किट विकसित करने की गति में तेजी आने की उम्मीद है।

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Disclosures

आर.डब्ल्यू. स्ट्रैंड थेरेप्यूटिक्स और रीप्ले बायो के सह-संस्थापक हैं; आर.डब्ल्यू. और आर.जे. ने सेल प्रकार क्लासिफायर से संबंधित एक अनंतिम पेटेंट दायर किया।

Acknowledgments

हम पूर्व वीस लैब सदस्यों को धन्यवाद देना चाहते हैं जिन्होंने पॉली-अभिकर्मक विधि विकसित करने और सेल क्लासिफायर्स के लिए इसके आवेदन का नेतृत्व या योगदान दिया: जेरेमी गैम, ब्रे डिएंड्रेथ, और जिन हुह; अन्य वीस प्रयोगशाला सदस्य जिन्होंने आगे विधि विकास / अनुकूलन में योगदान दिया है: वेनलोंग जू, लेई वांग, और क्रिश्चियन क्यूबा-समानिगो; जोश लियोनार्ड और पैट्रिक डोनह्यू और हैली एडेलस्टीन सहित समूह के सदस्य, पॉली-अभिकर्मक का परीक्षण करने और प्रतिक्रिया प्रदान करने के लिए; और इस पांडुलिपि को आमंत्रित करने और प्रतिक्रिया प्रदान करने के लिए प्रोफेसर निका शाकिबा। हम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान [R01CA173712, R01CA207029, P50GM098792] को भी धन्यवाद देना चाहते हैं; राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन [1745645]; इस काम के वित्तपोषण के लिए एनसीआई और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ [पी 50जीएम 098792] से कैंसर सेंटर सपोर्ट (कोर) अनुदान [पी 30 सीसीए 14051, भाग में]।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15mL Corning Falcon conical tubes ThermoFisher Scientific 14-959-53A
24-well petri dish Any company of choice (Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free)
Bovine serum albumin NEB B9000S
Centrifuge Any company of choice Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf
Countess 3 Automated Cell Counter ThermoFisher Scientific AMQAX2000
Countess Cell Counting Chamber Slides ThermoFisher Scientific C10228
Cytoflow Non-commercial software package https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/# 
DMEM VWR 10-013-CV Use the correct media for your cell type
EDTA  ThermoFisher Scientific 03690-100ML
Fetal bovine serum Sigma Aldrich F4135
HEK cells ATCC CRL-1573 Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently.
HeLa cells ATCC CRL-12401 Use the relevant cell type for your experiments.
Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer ThermoFisher Scientific L3000001 Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent
LSRFortessa flow cytometer BD Biosciences N/A
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Gibco 11140050
Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL Any company of choice
Opti-MEM ThermoFisher Scientific 31985070 reduced serum medium
Phosphate buffered saline ThermoFisher Scientific 70011044
Rainbow calibration beads Spherotech URCP-100-2H
Sodium azide Sigma Aldrich S2002
Trypsin VWR 25-053-CI

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References

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Wauford, N., Jones, R., Van De Mark, C., Weiss, R. Rapid Development of Cell State Identification Circuits with Poly-Transfection. J. Vis. Exp. (192), e64793, doi:10.3791/64793 (2023).

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