Summary
Komplexe genetische Schaltkreise sind zeitaufwändig zu entwerfen, zu testen und zu optimieren. Um diesen Prozess zu erleichtern, werden Säugetierzellen so transfiziert, dass mehrere Stöchiometrien von Schaltungskomponenten in einem einzigen Well getestet werden können. Dieses Protokoll beschreibt die Schritte für die experimentelle Planung, Transfektion und Datenanalyse.
Abstract
Genetische Schaltkreise von Säugetieren haben gezeigt, dass sie das Potenzial haben, eine Vielzahl von Krankheitszuständen zu erkennen und zu behandeln, aber die Optimierung der Ebenen von Schaltkreiskomponenten bleibt herausfordernd und arbeitsintensiv. Um diesen Prozess zu beschleunigen, hat unser Labor die Poly-Transfektion entwickelt, eine Hochdurchsatz-Erweiterung der traditionellen Transfektion von Säugetieren. Bei der Polytransfektion führt jede Zelle in der transfizierten Population im Wesentlichen ein anderes Experiment durch, bei dem das Verhalten des Schaltkreises bei unterschiedlichen DNA-Kopienzahlen getestet wird und die Benutzer eine große Anzahl von Stöchiometrien in einer Eintopfreaktion analysieren können. Bisher wurden Poly-Transfektionen demonstriert, die das Verhältnis von Drei-Komponenten-Schaltkreisen in einem einzigen Zelltopf optimieren. Prinzipiell kann die gleiche Methode für die Entwicklung noch größerer Schaltungen verwendet werden. Die Ergebnisse der Polytransfektion können leicht angewendet werden, um optimale Verhältnisse von DNA zu Co-Transfektion für transiente Schaltkreise zu finden oder um Expressionsniveaus für Schaltkreiskomponenten für die Erzeugung stabiler Zelllinien zu wählen.
Hier demonstrieren wir den Einsatz von Poly-Transfektion zur Optimierung einer Drei-Komponenten-Schaltung. Das Protokoll beginnt mit experimentellen Designprinzipien und erklärt, wie die Poly-Transfektion auf traditionellen Co-Transfektionsmethoden aufbaut. Als nächstes wird die Polytransfektion der Zellen durchgeführt und einige Tage später eine Durchflusszytometrie durchgeführt. Schließlich werden die Daten analysiert, indem Schichten der Einzelzell-Durchflusszytometriedaten untersucht werden, die Teilmengen von Zellen mit bestimmten Komponentenverhältnissen entsprechen. Im Labor wurde die Polytransfektion zur Optimierung von Zellklassifikatoren, Rückkopplungs- und Feedforward-Controllern, bistabilen Motiven und vielem mehr eingesetzt. Diese einfache, aber wirkungsvolle Methode beschleunigt Designzyklen für komplexe genetische Schaltkreise in Säugetierzellen.
Introduction
Das Gebiet der synthetischen Biologie von Säugetieren hat sich rasant weiterentwickelt, von der Entwicklung einfacher Sense-and-Response-Teile in kultivierten Zelllinien bis hin zur Optimierung komplexer Netzwerke von Genen, um reale Herausforderungen in der Diagnostik und Therapie anzugehen1. Diese ausgeklügelten Schaltkreise sind in der Lage, biologische Eingaben von microRNA-Profilen über Zytokine bis hin zu niedermolekularen Medikamenten zu erfassen und logische Verarbeitungsschaltkreise wie Transistoren, Bandpassfilter, Kippschalter und Oszillatoren zu implementieren. Sie haben auch vielversprechende Ergebnisse in Tiermodellen für Krankheiten wie Krebs, Arthritis, Diabetes und viele mehr gezeigt 1,2,3,4,5. Mit zunehmender Komplexität einer Schaltung wird es jedoch immer schwieriger, die Pegel der einzelnen Komponenten zu optimieren.
Eine besonders nützliche Art von genetischem Schaltkreis ist ein Zellklassifikator, der so programmiert werden kann, dass er zelluläre Zustände erkennt und darauf reagiert. Die selektive Produktion von Protein- oder RNA-Outputs in bestimmten zellulären Zuständen ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Differenzierung von Zellen und Organoiden zu steuern und zu programmieren, kranke Zellen und/oder unerwünschte Zelltypen zu identifizieren und zu zerstören und die Funktion therapeutischer Zellen zu regulieren 1,2,3,4,5 . Die Schaffung von Schaltkreisen in Säugetierzellen, die Zellzustände aus mehreren zellulären RNA- und/oder Proteinspezies genau klassifizieren können, war jedoch eine große Herausforderung.
Einer der zeitaufwändigsten Schritte bei der Entwicklung eines Zellklassifizierungsschaltkreises besteht darin, die relativen Expressionsniveaus einzelner Komponentengene, wie z. B. Sensoren und Verarbeitungsfaktoren, innerhalb des Schaltkreises zu optimieren. Um die Schaltungsoptimierung zu beschleunigen und den Aufbau anspruchsvollerer Schaltkreise zu ermöglichen, wurde in neueren Arbeiten die mathematische Modellierung von Zellklassifikatorschaltungen und deren Komponenten verwendet, um optimale Zusammensetzungen und Topologien vorherzusagen 6,7. Während dies bisher starke Ergebnisse gezeigt hat, ist die mathematische Analyse durch die Notwendigkeit begrenzt, das Input-Output-Verhalten von Komponentengenen in der Schaltung systematisch zu charakterisieren, was zeitaufwändig ist. Darüber hinaus kann in komplexen genetischen Schaltkreisen eine Vielzahl von kontextabhängigen Problemen auftreten, die dazu führen, dass sich das Verhalten eines vollständigen Schaltkreises Vorhersagen widersetzt, die auf der Charakterisierung einzelner Teile basieren 8,9.
Um komplexe Säugetierschaltkreise wie Zellzustandsklassifikatoren schneller zu entwickeln und zu testen, entwickelte unser Labor eine Technik namens Poly-Transfection10, eine Weiterentwicklung von Plasmid-Co-Transfektionsprotokollen. Bei der Co-Transfektion werden mehrere Plasmid-DNA-Spezies mit einem positiv geladenen Lipid- oder Polymerreagenz komplexiert und dann korreliert an die Zellen abgegeben (Abbildung 1A). Bei der Polytransfektion werden die Plasmide separat mit dem Reagenz komplexiert, so dass die DNA aus jedem Transfektionskomplex dekorreliert an die Zellen abgegeben wird (Abbildung 1B). Bei dieser Methode werden Zellen innerhalb der transfizierten Population zahlreichen Kombinationen von Verhältnissen von zwei oder mehr DNA-Nutzlasten ausgesetzt, die unterschiedliche Schaltkreiskomponenten tragen.
Um die Verhältnisse der Schaltungskomponenten zu messen, die an jede Zelle abgegeben werden, enthält jeder Transfektionskomplex innerhalb einer Polytransfektion einen konstitutiv exprimierten Fluoreszenzreporter, der als Proxy für die zelluläre Aufnahme des Komplexes dient. Füllstoff-DNA, die keine Elemente enthält, die in einer Säugetierzelle aktiv sind, wird verwendet, um die relative Menge der fluoreszierenden Reporter- und Schaltkreiskomponenten einzustellen, die in einem einzigen Transfektionskomplex an eine Zelle abgegeben werden, und wird in der Diskussion ausführlicher diskutiert. Ein Beispiel für Füllstoff-DNA, die im Weiss-Labor verwendet wird, ist ein Plasmid, das eine Terminatorsequenz enthält, aber keinen Promotor, keine kodierende Sequenz usw. Zellen mit unterschiedlichen Verhältnissen der Schaltkreiskomponenten können dann verglichen werden, um optimale Verhältnisse für die Funktion der Genschaltkreise zu finden. Dies wiederum liefert nützliche Vorhersagen für die Auswahl von Promotoren und anderen Schaltkreiselementen, um optimale Genexpressionsniveaus zu erreichen, wenn Schaltkreiskomponenten zu einem einzigen Vektor für die genetische Integration kombiniert werden (z. B. ein Lentivirus, ein Transposon oder ein Landeplatz). Anstatt also die Verhältnisse zwischen den Schaltungskomponenten auf der Grundlage von Intuition oder über einen zeitaufwändigen Trial-and-Error-Prozess zu wählen, wertet die Polytransfektion eine Vielzahl von Stöchiometrien zwischen genetischen Teilen in einer Eintopfreaktion aus.
In unserem Labor hat die Polytransfektion die Optimierung vieler genetischer Schaltkreise ermöglicht, darunter Zellklassifikatoren, Feedback- und Feedforward-Controller sowie bistabile Motive. Diese einfache, aber wirkungsvolle Methode beschleunigt die Designzyklen komplexer genetischer Schaltkreise in Säugetierzellen erheblich. Seitdem wurde die Polytransfektion verwendet, um mehrere genetische Schaltkreise zu charakterisieren, um ihre mehrdimensionalen Input-Output-Übertragungsfunktionen mit hoher Auflösungaufzudecken 10, eine alternative Schaltkreistopologie für die Zellzustandsklassifizierung 11 zu optimieren und verschiedene veröffentlichte12,13 und laufende Projekte zu beschleunigen.
Hier beschreiben und beschreiben wir den Arbeitsablauf für den Einsatz der Polytransfektion zur schnellen Optimierung eines genetischen Schaltkreises (Abbildung 2). Das Protokoll zeigt, wie qualitativ hochwertige Poly-Transfektionsdaten generiert und mehrere häufige Fehler im Poly-Transfektionsprotokoll und in der Datenanalyse vermieden werden können (Abbildung 3). Anschließend wird demonstriert, wie die Polytransfektion zur Charakterisierung einfacher Schaltungskomponenten eingesetzt werden kann und dabei die Ergebnisse der Polytransfektion mit der Co-Transfektion verglichen werden können (Abbildung 4). Schließlich zeigen die Ergebnisse der Polytransfektion eine Optimierung des Krebsklassifikatorschaltkreises (Abbildung 5).
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Protocol
HINWEIS: Tabelle 1 und Tabelle 2 dienen als wichtige Referenzen für dieses Protokoll. Tabelle 1 zeigt die Skalierung der Reagenzien für Reaktionen und Tabelle 2 zeigt die Arithmetik des DNA-Verhältnisses für eine im Protokoll beschriebene Beispiel-Polytransfektion (obere Hälfte) und für ein mögliches Folgeexperiment (untere Hälfte).
1. Zellen für die Transfektion vorbereiten
- Stellen Sie sicher, dass die Kultur menschlicher embryonaler Nierenzellen (HEK293) zu 60 % bis 80 % konfluent ist, bevor Sie mit dem Protokoll beginnen. Dazu 1 x 106 Zellen 2 Tage vorher in einer 100 mm x 15 mm großen Gewebekultur-Petrischale aussäen und bei 37 °C mit 5% CO2 inkubieren.
HINWEIS: Obwohl sich unser Protokoll auf HEK293-Zellen konzentriert, können andere Zelltypen substituiert werden. - Bereiten Sie das Medium und die Zellen für die Transfektion vor, wie unten beschrieben.
- Mindestens 20 ml einer Lösung von Dulbeccos modifiziertem Adlermedium (DMEM) mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA; siehe Materialtabelle) auf 37 °C vorwärmen. Mindestens 2,4 ml Trypsin und 2,4 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) ebenfalls auf 37 °C vorwärmen. Serummedium auf ~16 °C vorwärmen.
HINWEIS: Alle Gewebekulturarbeiten sollten mit Sorgfalt in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden.
- Mindestens 20 ml einer Lösung von Dulbeccos modifiziertem Adlermedium (DMEM) mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA; siehe Materialtabelle) auf 37 °C vorwärmen. Mindestens 2,4 ml Trypsin und 2,4 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) ebenfalls auf 37 °C vorwärmen. Serummedium auf ~16 °C vorwärmen.
- Resuspendieren Sie die Zellen in der DMEM-Lösung wie unten beschrieben.
- Aspirieren und entsorgen Sie die aktuellen Medien. Geben Sie 2 ml PBS auf die HEK293-Zellkultur, um die Zellen zu waschen. Saugen Sie das PBS ab und entsorgen Sie es.
- Geben Sie 2 ml Trypsin auf die HEK293-Zellkultur. Stellen Sie die Petrischale für 3 min in einen Inkubator bei 37 °C oder bis die Zellen nicht mehr an der Schale haften. Stellen Sie die Schale wieder in die Biosicherheitswerkbank und verdünnen Sie die Zelllösung, indem Sie 8 ml DMEM-Lösung in die Platte geben.
- Mischen Sie die Lösung, indem Sie mehrmals vorsichtig auf und ab pipettieren. Saugen Sie das gesamte Medium ab und geben Sie es in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 3 Minuten, um sie zu pelletieren. Saugen Sie das Medium ab (achten Sie darauf, die Zellen nicht abzusaugen) und entsorgen Sie es. Resuspendieren Sie die Zellen in 5 ml DMEM-Lösung und mischen Sie sie durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren.
- Schätzen Sie die aktuelle Zellkonzentration mit einem automatisierten Zellzähler (aufgeführt in der Materialtabelle). Säen Sie sechs Vertiefungen (in diesem Beispiel) in einer 24-Well-Platte mit 1 x 105 Zellen (für eine Aussaatdichte von 50.000 Zellen/cm2).
- Fügen Sie die DMEM-Lösung bis zu 500 μl hinzu (fügen Sie zuerst die DMEM-Lösung in die Wells hinzu) und kennzeichnen Sie dann eine Well-Vertiefung pro Behandlung wie folgt: keine Farbkontrolle, mKO2-Kontrolle, TagBFP-Kontrolle, NeonGreen-Kontrolle, gesamte Farbkontrolle und Polytransfektion 1. TagBFP-, mKO2- und NeonGreen-Kontrollvertiefungen sind einfarbige Kontrollen für alle fluoreszierenden Proteine, die in der Polytransfektion enthalten sind.
2. Durchführung der Transfektion
- Bereiten Sie Röhrchen für jedes DNA-Aggregat vor. Legen Sie 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen beiseite und beschriften Sie die Röhrchen als: keine Farbkontrolle, mKO2-Steuerung, TagBFP-Steuerung, NeonGreen-Steuerung, alle Farbkontrolle, Poly-Transfektionsmischung 1 und Poly-Transfektionsmischung 2.
- Geben Sie 36 μl reduziertes Serummedium in die No-Color-Control-, mKO2-Control-, TagBFP-Control-, NeonGreen-Control- und alle Color-Control-Röhrchen. Geben Sie 18 μl reduziertes Serummedium in jedes der Röhrchen der Poly-Transfektionsmischung 1 und der Poly-Transfektionsmischung 2.
HINWEIS: Die Plasmidkonzentrationen werden mit 150 ng/μl angenommen. - Geben Sie 600 ng Füllstoffplasmid in das farblose Kontrollröhrchen. Geben Sie 300 ng mKO2 und 300 ng Füllstoffplasmid in das mKO2-Farbkontrollröhrchen. Geben Sie 300 ng TagBFP und 300 ng Füllstoffplasmid in das TagBFP-Farbkontrollröhrchen.
- Geben Sie 300 ng konstitutives NeonGreen-Plasmid und 300 ng Füllstoffplasmid in das NeonGreen-Farbkontrollröhrchen. Fügen Sie jeweils 100 ng mKO2, TagBFP und konstitutives NeonGreen sowie 300 ng Füllstoffplasmid in das Allfarbkontrollröhrchen hinzu.
- 150 ng mKO2 in das Röhrchen der Poly-Transfektionsmischung 1 geben. 75 ng Reporter-NeonGreen-Plasmid und 75 ng Füllstoff-Plasmid in das Röhrchen der Poly-Transfektionsmischung 1 geben.
- Geben Sie 150 ng TagBFP in das Röhrchen der Poly-Transfektionsmischung 2. 75 ng L7ae-Plasmid und 75 ng Füllstoffplasmid werden in das Poly-Transfektionsmischungs-2-Röhrchen gegeben.
- Geben Sie 36 μl reduziertes Serummedium in die No-Color-Control-, mKO2-Control-, TagBFP-Control-, NeonGreen-Control- und alle Color-Control-Röhrchen. Geben Sie 18 μl reduziertes Serummedium in jedes der Röhrchen der Poly-Transfektionsmischung 1 und der Poly-Transfektionsmischung 2.
- Stellen Sie den Transfektions-Mastermix in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen her, indem Sie 216 μl reduziertes Serummedium mit 9,48 μl Transfektionsreagenz kombinieren (siehe Tabelle 1 für Reagenzienverhältnisse und Reaktionsskalierung). Durch Auf- und Abpipettieren gut mischen und beiseite stellen.
- Geben Sie 1,58 μl Enhancer-Reagenz in jedes der Röhrchen ohne Farbkontrolle, Einzelfarbkontrolle und alle Farbkontrollröhrchen. Geben Sie 79 μl Enhancer-Reagenz in jedes der Poly-Transfektions-Mischröhrchen. Mischen Sie jedes Röhrchen einzeln, indem Sie kräftig pipettieren.
- Geben Sie den Transfektions-Mastermix in jedes Röhrchen, das DNA enthält.
- Fügen Sie 37,58 μl Transfektions-Mastermix zu jedem der Röhrchen ohne Farbkontrolle, Einzelfarbkontrolle und allen Farbkontrollröhrchen hinzu. Mischen Sie jedes Röhrchen einzeln, indem Sie kräftig pipettieren.
- Geben Sie 18,79 μl Transfektions-Mastermix in jedes der Poly-Transfektions-Mix-Röhrchen. Mischen Sie jedes Röhrchen einzeln, indem Sie kräftig pipettieren.
- Geben Sie die Transfektionsmischungen in die Vertiefungen.
- Pipettieren Sie 65,97 μl jeder Transfektionsmischung für die Farblosigkeit, die Einzelfarbe und alle Farbkontrollen in die entsprechenden Vertiefungen.
- Pipettieren Sie 32,98 μl des Poly-Transfektions-Mixes 1 in die Poly-Transfektionsvertiefung und schwenken Sie die Platte schnell, aber vorsichtig in einem engen Achtermuster entlang einer ebenen Oberfläche, um die Komplexe effektiv zu verteilen. Pipettieren Sie dann 32,98 μl der Poly-Transfektionsmischung 2 in dieselbe Poly-Transfektionsvertiefung und schwenken Sie die Platte auf die gleiche Weise.
- Legen Sie die Platte für einen Zeitraum von 48 h bei 37 °C mit 5 % CO2 und ohne Schütteln in einen Inkubator.
HINWEIS: Um die Zellviabilität zu erhöhen, kann das Zellmedium nach der Transfektion alle 6 Stunden ausgetauscht werden (obwohl dies nicht immer notwendig ist, und bei HEK293-Zellen und seinen Derivaten muss man darauf achten, die Zellen beim Medienwechsel nicht von der Platte zu lösen).
| Reagenz | Menge | Skalierung | ||||
| Reduziertes Serummedium für DNA-Gemisch | 36 μL pro Kontrollröhrchen, 18 μL pro Polytransfektionsröhrchen | 0,05 μl reduziertes Serummedium/ng DNA pro Röhrchen, mit 10-20 % zusätzlichem Volumen für das Pipettieren | ||||
| DNS | 300-600 ng pro Tube | |||||
| P3000 | 1,58 μl pro Kontrollröhrchen, 0,79 μl pro Polytransfektionsröhrchen | 0,0022 μL P3000/ng DNA pro Röhrchen, mit 10-20% extra | ||||
| Reduziertes Serummedium für Lipo Mastermix | 36 μL pro Kontrollröhrchen, 18 μL pro Polytransfektionsröhrchen | 0,05 μl reduzierte Serummedium/ng Gesamt-DNA mit 10-20 % zusätzlichem Volumen für das Pipettieren | ||||
| Transfektions- und Enhancer-Reagenz | 1,58 μl pro Kontrollröhrchen, 0,79 μl pro Polytransfektionsröhrchen | 0,0022 μL Lipofectamin 3000/ng DNA, mit 10-20% extra | ||||
Tabelle 1: Reagenzienskalierung für Transfektionen. Die Tabelle zeigt das richtige Verhältnis des einzuschließenden Reagenzes für die DNA-Menge, die in einer einzelnen Vertiefung enthalten ist. Dies kann verwendet werden, um Reaktionen effektiv zu skalieren und Mastermixe zu bilden. Die Reagenzmengen wurden so skaliert, dass sie einen Überschuss von 20 % enthalten.
3. Vorbereiten der Zellen für die Durchflusszytometrie
- Mindestens 4,2 ml der DMEM-Lösung auf 37 °C vorwärmen. Mindestens 4,2 ml Trypsin und 4,2 ml PBS auf 37 °C vorwärmen. Halten Sie die fluoreszenzaktivierte Zellsortierlösung (FACS) bis zur Verwendung bei 4 °C.
- Resuspendieren Sie die Zellen in der FACS-Pufferlösung (PBS ergänzt mit 1 % BSA, 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure [EDTA] und 0,1 % Natriumazid [NaN 3], um die Verklumpung zu reduzieren; siehe Materialtabelle) wie unten beschrieben.
- Saugen Sie die aktuellen Medien ab und entsorgen Sie sie in jedem Brunnen. Geben Sie 5 ml PBS in jede Vertiefung, um die Zellen zu waschen. Saugen Sie das PBS ab und entsorgen Sie es.
- Geben Sie 5 ml Trypsin in jede Vertiefung. Stellen Sie den Teller für 3 Minuten in einen Inkubator bei 37 °C oder bis die Zellen nicht mehr an der Schale haften. Legen Sie die Platte wieder in die Biosicherheitswerkbank zurück und verdünnen Sie die Zelllösungen, indem Sie 5 ml DMEM-Lösung in jede Vertiefung geben.
- Mischen Sie die Lösung für jede Vertiefung, indem Sie sie mehrmals vorsichtig auf und ab pipettieren. Saugen Sie für jede Vertiefung alle Medien ab und geben Sie sie in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 3 Minuten, um sie zu pelletieren. Saugen Sie die Medien ab und achten Sie darauf, die Zellen nicht abzusaugen und zu verwerfen. In jedem Röhrchen werden die Zellen in 5 ml FACS-Pufferlösung resuspendiert und durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren gemischt.
- Jede Zellsuspensionslösung wird durch ein Sieb (um Klumpen zu entfernen) in separate konische Röhrchen für die Durchflusszytometrie gegeben. Lassen Sie diese Röhrchen nicht länger als 1 Stunde auf Eis und führen Sie so schnell wie möglich eine Durchflusszytometrie durch.
4. Durchführung der Durchflusszytometrie
HINWEIS: Die Bedienung eines Durchflusszytometers erfordert eine angemessene Schulung und Kenntnis der erforderlichen Aufgaben. Da Software und Ausrüstung variieren können und Benutzer allgemein geschult werden sollten, bezieht sich dieser Abschnitt auf bestimmte Vorgänge, die sinnvoll ausgeführt werden können.
- Untersuchen Sie zunächst die Zellen, die mit der Füllstoffplasmidkontrolle (keine Farbkontrolle) transfiziert wurden, um Zellmerkmale auszuwählen und Anomalien (einschließlich Aggregate, Trümmer usw.) zu vermeiden. Es gibt zwar viele Kombinationen von Parametern zur Unterscheidung von Zellen, aber verwenden Sie die folgenden drei allgemeinen Optionen als gute Möglichkeit, Unterscheidungsmerkmale zu visualisieren.
- Betrachten Sie den seitlichen Streubereich (logarithmische oder lineare Skala je nach Präferenz/Zellentyp) im Vergleich zum vorderen Streubereich (lineare Skala).
- Betrachten Sie die Höhe der seitlichen Streuung (logarithmische Skala) im Vergleich zur Breite der seitlichen Streuung (lineare Skala).
- Betrachten Sie die Breite der Vorwärtsstreuung (lineare Skalierung) im Vergleich zur Vorwärtsstreuungshöhe (lineare Skalierung).
- Sehen Sie sich als Nächstes die einzelnen Farbsteuerelemente an. Verwenden Sie den All-Color-Regler, um die Gerätespannungen so abzustimmen, dass die Signale von jedem fluoreszierenden Protein auf äquivalente beliebige Einheiten (a.u.) der Fluoreszenz normalisiert werden. Führen Sie als Nächstes die einzelnen Farbsteuerelemente für jedes fluoreszierende Protein aus, die zum Festlegen der Kompensationsmatrix verwendet werden, um eine Durchblutungskorrektur zu ermöglichen.
HINWEIS: Idealerweise sollte der volle Dynamikbereich der Fluoreszenzwerte sichtbar sein. Eine weitere Normalisierung fluoreszierender Proteinsignale kann durch Umrechnung in standardisierte Einheiten (z. B. Moleküle mit äquivalentem Fluorescein [MEFLs; siehe Beal et al.15]) erfolgen. Um die MEFL-Konvertierung während der Analyse zu aktivieren, führen Sie Regenbogen-Kalibrierungsperlen aus. Eine solche Kalibrierung ist auch nützlich, um die Signalschwankungen von Gerät zu Gerät und von Tag zu Tag zu reduzieren16. - Führen Sie das Poly-Transfektions-Probenröhrchen aus.
HINWEIS: Wenn möglich, wird empfohlen, Zellen mit 1.000 x 10^ (^ = Mischungen) auszuführen, da höherdimensionale Polytransfektionen während der Analyse in mehrere Abschnitte unterteilt werden müssen und jeder Abschnitt genügend Zellen (idealerweise >10) benötigt, um statistisch signifikante Vergleiche anzustellen.
5. Durchführen einer Analyse nach dem Experiment
- Verwenden Sie zunächst Daten aus den Kontrollen (und ggf. den Perlen), um genaue Ergebnisse zu erzielen. Verwenden Sie eines der verfügbaren Software-Tools, um Live-Cell-Gating (unter Verwendung der oben beschriebenen Gates), Kompensation und Autofluoreszenzkorrektur durchzuführen.
HINWEIS: Wir verwenden in der Regel entweder benutzerdefinierten MATLAB-Code (z. B. https://github.com/jonesr18/MATLAB_Flow_Analysis oder Cytoflow17), der sowohl über eine grafische Benutzeroberfläche als auch über eine Python-Bibliothek verfügt, die für die Vorverarbeitungsphase und für die Polytransfektionsanalyse geeignet ist.
| Methode | Komplex | ng Fluoreszierender Marker | ng L7ae (Bruch) | ng Reporter (Bruch) | ng Füllstoff-DNA (Fraktion) | Gesamt (ng) |
| Poly-Transfektion 1 | 600 | |||||
| → | 1 | 150 | 75 (½) | 75 (½) | 300 | |
| → | 2 | 150 | 75 (½) | 75 (½) | 300 | |
| Poly-Transfektion 2 | 600 | |||||
| → | 1 | 150 | 25 (1/6) | 125 (5/6) | 300 | |
| → | 2 | 150 | 125 (5/6) | 25(1/6) | 300 |
Tabelle 2: DNA-Mengen für die Polytransfektion, die im Protokoll demonstriert werden, und ein Beispiel für ein Folgeexperiment mit abgestimmten Plasmidverhältnissen. Die obere Hälfte der Tabelle zeigt die Zusammensetzung der Plasmide, die in einem einfachen Polytransfektionsexperiment verwendet werden. Die untere Hälfte zeigt die Zusammensetzung eines aktualisierten Experiments, das die Plasmidverhältnisse anpasst, um einen hypothetischen Konzentrationsraum besser abzutasten, in dem sich der Genexpressionsmodulator in einem optimaleren Verhältnis von 1:5 im Verhältnis zu seinem Reporter befindet, was mehr transfizierte Zellen ergibt, die um dieses Verhältnis herum beprobt werden können.
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Representative Results
In Abbildung 1 vergleichen wir die Co-Transfektion mit der Poly-Transfektion. Bei einer Co-Transfektion werden alle Plasmide in der gleichen Transfektionsmischung abgegeben, was zu einer hohen Korrelation zwischen der Menge jedes einzelnen Plasmids führt, die eine einzelne Zelle erhält (Abbildung 1A). Während die Anzahl der gesamten Plasmide, die an jede Zelle abgegeben werden, erheblich variiert, ist die Fluoreszenz der beiden Reporterproteine in den einzelnen Zellen der Population gut korreliert, was darauf hindeutet, dass die beiden Plasmide in einem ziemlich konstanten Verhältnis abgegeben werden. Transfizierte Zellen können wenige oder viele Komplexe aufnehmen, aber da jeder Komplex korrelierte Mengen jedes Plasmids aufweist, erkundet die Co-Transfektion nur einen kleinen diagonalen Bereich des Konzentrationsraums zwischen den beiden Plasmiden. Im Gegensatz dazu werden bei einer Poly-Transfektion Plasmide in mehreren Transfektionskomplexen abgegeben, was zu einer dekorrelierten Abgabe von Plasmiden in verschiedenen Transfektionsmischungen führt (Abbildung 1B). Transfizierte Zellen nehmen verschiedene Kombinationen der Komplexe auf, was zu Zellen führt, die unterschiedliche Dosierungen von Plasmiden aus keinem, einem oder beiden Komplexen enthalten.
Abbildung 2 zeigt einen repräsentativen Polytransfektions-Workflow. Im Allgemeinen besteht ein Poly-Transfektionsexperiment aus den folgenden Schritten: Definition des Problems, Erstellung der Transfektionsmischungen, Inkubation der Zellen, Durchflusszytometrie und Analyse. Es gibt auch einen optionalen Schritt, um die Polytransfektion mit optimierten Teileverhältnissen zu wiederholen, wenn die anfänglichen Polytransfektionsergebnisse nicht in der Lage sind, die optimalen Teileverhältnisse genau einzugrenzen. Diese Schritte sind im Protokoll beschrieben.
In Abbildung 3 sind einige Beispiele für gut durchgeführte Ko- und Polytransfektionen und häufige Fehler aufgeführt. Abbildung 3A zeigt eine gut durchgeführte Co-Transfektion mit einer engen Korrelation zwischen TagBFP und eYFP-exprimierenden Plasmiden, die gemeinsam abgegeben wurden. Im Gegensatz dazu zeigt die Co-Transfektion in Abbildung 3B eine schlechte Korrelation zwischen diesen beiden Plasmiden. In der gezeigten Abbildung ist die schlechte Korrelation auf die Zugabe von Enhancer-Reagenz zum reduzierten Serummedium zurückzuführen, bevor die Plasmide zugegeben wurden. Diese schlechte Korrelation in den Experimenten könnte auch darauf zurückzuführen sein, dass verschiedene Promotoren die Expression der fluoreszierenden Proteine steuern, dass die Mischung während der Transfektionsmischung schlecht ist oder dass der Komplex für ein zu kurzes oder zu langes Intervall inkubiert werden kann.
Abbildung 3C zeigt eine gut durchgeführte Polytransfektion mit guter Abdeckung des zweidimensionalen Raums und guter Kompensation von spektralem Durchscheinen zwischen fluoreszierenden Proteinen. Abbildung 3D zeigt Polytransfektionsdaten mit einer geringen Anzahl lebender Zellen, die sich nur schwer in genügend Bins mit einer ausreichenden Anzahl von Zellen in jedem Bins für die Analyse unterteilen lassen. Um dieses Problem zu verbessern, sollte die Ausgangszellpopulation bei guter Gesundheit und nicht überwuchert sein und die experimentelle Toxizität durch die Verwendung eines anderen Transfektionsreagenzes und/oder die Transfektion mit weniger Gesamt-DNA reduziert werden. Abbildung 3E zeigt eine Polytransfektion, bei der die Transfektionseffizienz schlecht war, was wiederum zu einer spärlichen Abdeckung des zweidimensionalen Raums für die Analyse führte. In diesem Fall ist die Anzahl der Zellen, die das Morphologie-Gating passieren, hoch, aber die Zellen exprimieren keine fluoreszierenden Proteine. Um die Effizienz zu verbessern, sollte die Auswahl der Transfektionsreagenzien optimiert und das Protokoll des Herstellers genau befolgt werden. Jede Transfektionsmischung muss eine entsprechende Menge an DNA-Masse enthalten, um sicherzustellen, dass die Zellen eine ungefähr gleiche Chance haben, jede Art von Komplex zu erhalten, und jede Transfektionsmischung sollte in Übereinstimmung mit den Anweisungen des Kits hergestellt werden. Unterschiedliche Transfektionskits sind optimal für unterschiedliche Zelltypen; Es sollte das Kit verwendet werden, das den besten Wirkungsgrad für den interessierenden Zelltyp bietet. Schließlich sind einige Zelltypen schwer zu transfizieren, unabhängig vom verwendeten Kit. In diesen Fällen sollte eine größere Anzahl von Zellen transfiziert und so viele wie möglich während der Durchflusszytometrie gesammelt werden, um eine ausreichende Anzahl von Zellen für die Analyse zu gewährleisten. Abbildung 3F zeigt Polytransfektionsdaten, bei denen einer der fluoreszierenden Proteinmarker deutlich ein spektrales Durchscheinen in ein anderes fluoreszierendes Protein zeigt. Einfarbige Kontrollen sollten immer für alle fluoreszierenden Proteine im System durchgeführt und verwendet werden, um eine Kompensationsmatrix zu generieren, die vor der Analyse auf alle Polytransfektionen angewendet werden sollte.
Bei der erstmaligen Durchführung von Poly-Transfektionsexperimenten (insgesamt oder für ein neues experimentelles System) sollte ein Benchmarking mit der Standard-Co-Transfektion durchgeführt werden. Ein Ansatz besteht darin, die Input-Output-Transferfunktion für wichtige Systemteile sowohl mit Co-Transfektion (über Tuning-DNA-Dosierungen) als auch mit Poly-Transfektion einzeln zu messen.
In Abbildung 4 zeigen wir ein Benchmarking des translationalen Repressors L7Ae, der hier aus der ursprünglichen Poly-Transfektionspublikation10 übernommen wurde. L7Ae ist ein RNA-bindendes Protein, das RNA-Kink-Turn-Motive (KT) erkennt20; Wenn zwei KTs (2xKT) in der untranslatierten 5'-Region (UTR) einer mRNA platziert werden, kann die nachgeschaltete ORF-Translation (Open Reading Frame) durch L7Ae21 effektiv unterdrückt werden. L7Ae wurde zuvor verwendet, um RNA-basierte Zelltypklassifikatoren21 und andere RNA-basierte Schaltkreise22 zu bauen. Um L7Ae durch Standard-Co-Transfektion zu testen, kann man die Verhältnisse der Plasmide, die für L7Ae kodieren, und seines Zielreporters innerhalb verschiedener Transfektionsmischungen einstellen (Abbildung 4A und Tabelle 3). Für die Polytransfektion sollte man konstitutives L7Ae und den entsprechenden 2xKT-Reporter unabhängig voneinander in separaten Transfektionsmischungen abgeben, so dass ein breites Spektrum an Plasmidverhältnissen an die Zellen abgegeben wird (Abbildung 4B). Nach der Durchführung von Transfektion und Durchflusszytometrie kann eine Datenanalyse durchgeführt werden. Um die Daten vergleichbar zu machen, kann man die einzelnen Co-Transfektionsergebnisse in einem einzigen Datensatz zusammenfassen und dann ein ähnliches mehrdimensionales Binning wie die Poly-Transfektionsdaten durchführen (Abbildung 4C, D). Vergleicht man die Dosis-Wirkungs-Kurven von L7Ae, die den Output-Reporter unterdrücken, so ist ersichtlich, dass der mediane Output-Pegel pro Bin zwischen den Co-Transfektions- und Poly-Transfektionsdaten sehr ähnlich ist (Abbildung 4E-G).
Im Allgemeinen haben wir gesehen, dass Poly-Transfektionsdaten gut mit Co-Transfektionsdaten über breite DNA-Verhältnisse korrelieren, mit geringerer Präzision bei stark verzerrten DNA-Dosisverhältnissen (zum Teil aufgrund der geringeren Zellabdeckung in Bins für Poly-Transfektionsexperimente, insbesondere für Teile, die bei niedrigen Plasmiddosen sehr stark aktiv sind). Um die Messgenauigkeit für solche empfindlichen Teile zu verbessern, kann ihr Expressionsniveau mit einem schwächeren Promotor, vorgeschalteten offenen Leserastern18 oder microRNA-Silencing-vermittelten Feintunern (miSFITs)19 reduziert werden.
Abbildung 5 zeigt eine erfolgreiche Anwendung der Polytransfektion zur Optimierung eines Zelltypklassifikators, wiederum adaptiert von Gam et al.10. Der Klassifikator ist ein relativ einfaches Design, das als Reaktion auf die Expression von miR-21-5p, einer miRNA, die in vielen Tumorzellen überexprimiert wird, einen Output erzeugt23. In Abwesenheit von miR-21 wird die Klassifikatorproduktion durch einen bakteriell abgeleiteten transkriptionellen Repressor, BM3R124, unterdrückt, dessen Anpassung zuvor in Säugetierzellenfunktioniert 25. Wenn miR-21 vorhanden ist, bindet es vier Zielstellen, die sowohl in den 3'- als auch in den 5'-UTRs von BM3R1 platziert sind, wodurch seine Expression unterdrückt wird und dadurch die Output-Transkription ermöglicht wird (Abbildung 5A). Um dieses System zu optimieren, wurden die drei Schaltungskomponenten in separaten Transfektionsmischungen geliefert: (1) BM3R1 (mit miR-21-Zielstellen), (2) Output-Reporter (mKO2) und (3) Gal4-VP16, der die Transkription des Outputs aktiviert (Tabelle 4). Beachten Sie, dass der Ausgangs-Promoter mit der Logik (Gal4-VP16) und nicht mit BM3R1 arbeitet, wodurch der Ausgang auch bei Vorhandensein von Gal4-VP1625 unterdrückt wird. Jeder Teil kodiert für einen Transfektionsmarker, TagBFP, mNeonGreen bzw. iRFP720, auf demselben Plasmid, um die relative DNA-Dosis jedes Komplexes anzuzeigen. Im Allgemeinen sollte eine erhöhte Gal4-VP16-Expression den Reporter-mKO2-Output erhöhen, während eine erhöhte BM3R1-Expression zu einem niedrigeren mKO2-Output führen sollte. Da BM3R1 durch miR-21-5p ausgeschaltet wird, sollte die Output-Expression in HeLa-Zellen höher sein, die höhere miR-21-5p-Spiegel aufweisen und daher weniger BM3R1 exprimieren als in HEK-Zellen.
Nach Polytransfektion sowohl in HEK293- als auch in HeLa-Zellen erhielten wir eine 3D-Verteilung verschiedener Plasmidverhältnisse (Abbildung 5B-HEK-Zellen). Gam et al.10 untersuchten diese Verteilung in verschiedenen Verhältnissen, indem sie Zellen innerhalb eines bestimmten euklidischen Abstands von einem interessierenden Verhältnis betrachteten. Dieser Abstand sollte breit genug sein, um genügend Zellen einzuschließen, um statistisch signifikante Ergebnisse aus der Analyse zu ermöglichen, aber schmal genug, um unnötiges Rauschen zu vermeiden, wenn ein zu breiter Satz von Komponentenverhältnissen der drei Teile enthalten ist. Gam et al.10 verwendeten dann einen Optimierungsalgorithmus, um das Verhältnis der Teile zu identifizieren, die die Klassifizierungsgenauigkeit für die Co-Transfektion maximierten (d.h. transfizierte HeLa-Zellen sind positiv für die Ausgabeexpression, transfizierte HEK-Zellen jedoch nicht). Das optimale Verhältnis der Teile wurde als 10,9:1,5:1 ermittelt: Gal4-VP16:Ausgang:BM3R1; Zellen, die um das optimale Verhältnis innerhalb des gesamten Polytransfektionsraums herum abgetastet wurden, sind in Abbildung 5C dargestellt. Diese Teilprobenahme prognostizierte, dass der co-transfizierte Schaltkreis bei diesem Verhältnis eine Spezifität von 91 %, eine Sensitivität von 62 % und eine Genauigkeit von 77 % bei der Klassifizierung von HEK293 im Vergleich zu HeLa-Zellen aufweist (Abbildung 5D). Die Co-Transfektion mit Plasmidverhältnissen, die auf dieses Optimum eingestellt waren, lieferte noch bessere Ergebnisse: 99 % Spezifität, 68 % Sensitivität und 84 % Genauigkeit10. Darüber hinaus leiteten die Verhältnisse die Implementierung einer Einzelplasmid-Version des Schaltkreises, wobei die relative Expression durch die Verwendung verschiedener verkürzter Promotoren und Upstream-ORFs (uORFs) abgestimmt wurde, was einen Schaltkreis mit 91 % Spezifität, 90 % Sensitivität und 90 % Genauigkeit ergab10. Daher ist die Polytransfektion ein leistungsfähiges Werkzeug, um das Design von Zellklassifikatoren und Genschaltkreisen im weiteren Sinne zu steuern.
Abbildung 1: Vergleich von Co-Transfektion und Poly-Transfektion. (A,B) Übersicht und Vergleich der Plasmidabgabe mit der Co-Transfektion von zwei Plasmiden und der Poly-Transfektion von zwei Plasmiden. Das Diagramm ganz links zeigt für jede Transfektionsmethode die Bildung von Transfektionskomplexen zwischen negativ geladener DNA und positiv geladenen Lipiden. In diesen Beispielen kodiert jedes farbige Plasmid (blau und rot) für die Expression eines anderen fluoreszierenden Proteins. Das mittlere Diagramm zeigt Beispiele für die Plasmidabgabe an Zellen sowie ein Schema für die erwarteten Verteilungen in einem Histogramm oder Streudiagramm. Die Farbintensität im Histogramm entspricht der Fluoreszenz der entsprechenden Plasmidfarbe. Das Diagramm ganz rechts zeigt reale Daten von Zellen, die mit jeder gegebenen Methode transfiziert wurden. (A) Bei einer Co-Transfektion mit zwei verschiedenen Plasmiden werden beide Plasmide vor Zugabe von Transfektionsreagenz miteinander vermischt, was zu einer stark korrelierten Verpackung der beiden Plasmidspezies führt. In den aktuellen Co-Transfektionsdaten zeigen die Zellen eine korrelierte Abgabe beider Plasmide (rechts). (B) Bei einer Polytransfektion wird jeder Satz von gemeinsam zugeführten Plasmiden, die einem Schaltungsteil und einem Transfektionsmarker entsprechen, separat mit dem Transfektionsreagenz gemischt, was zu Komplexen führt, die nur diese Plasmide enthalten (links). In tatsächlichen Polytransfektionsdaten untersuchen Zellen einen weiten Bereich des Konzentrationsraums mit vielen verschiedenen Plasmid-Stöchiometrien, die gleichzeitig untersucht werden (rechts). Diese Zahl wurde von10 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Polytransfektions-Workflow. Schritt 1: Definieren Sie das Problem. Beginnen Sie mit einem System mit mehreren Komponenten, für die das ideale Verhältnis zwischen den Teilen unbekannt ist, und wählen Sie ein Startverhältnis zwischen den Komponenten. Schritt 2: Erstellen Sie die Transfektionsmischungen. Jede Transfektionsmischung enthält eine Schaltungskomponente und einen fluoreszierenden Transfektionsmarker. Die Menge des Schaltkreisteils, der an eine Zelle abgegeben wird, korreliert mit der Fluoreszenz des Markers. Schritt 3: Inkubieren Sie die Zellen. In einem typischen Arbeitsablauf inkubieren wir Zellen für 48 Stunden zwischen Transfektion und Durchflusszytometrie. Schritt 4: Durchflusszytometrie. Führen Sie die entsprechenden Steuerelemente aus, wie im Protokoll beschrieben, und führen Sie dann die Beispiele aus. Schritt 5: Analyse.Verwenden Sie die Transfektionsmarker, um die Zellen nach der Anzahl oder dem Verhältnis der Teile, die die Zelle erhalten hat, zu sortieren. Verwenden Sie das/die Ausgangsprotein(e), um die Leistung der Schaltung zu messen. Ermitteln Sie die Abschnitte/Verhältnisse von Teilen, die die Schaltungsleistung optimieren. Schritt 6: Wiederholen Sie den Vorgang mit optimierten Teileverhältnissen (optional). Wenn die optimalen Abschnitte/Verhältnisse stark verzerrt sind, kann es sein, dass die Pilot-Polytransfektion die optimalen Teileverhältnisse nicht genau eingrenzt. Wiederholen Sie die Poly-Transfektion mit abgestimmten Teileverhältnissen, sodass eine Zelle, die von jeder Transfektionsmischung die gleiche Menge erhalten hat, nun ein nahezu optimales Verhältnis von Teilen erhält, wie in der vorherigen Runde ermittelt. Diese Zahl wurde von10 geändert. Das Bild eines Inkubators wurde von Servier Medical Art und das Bild eines Zytometers von BioRender verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Repräsentative positive und negative Polytransfektionsergebnisse . (A) Gut durchgeführte Co-Transfektion zweier fluoreszierender Reporter, die eine enge Korrelation zeigt. Insgesamt 20.000 Zellen werden sowohl hier als auch in (B) zum Vergleich aufgetragen. Es ist eine gute Idee, eine ähnliche kleine Versuchs-Co-Transfektion von zwei fluoreszierenden Reportern durchzuführen, bevor ein Poly-Transfektionsexperiment gestartet wird, um sicherzustellen, dass die Plasmide innerhalb der Transfektionsmischungen gut korreliert sind. (B) Verrautere Co-Transfektion: Plasmide sind in jeder Transfektionsmischung nicht gut korreliert, was dazu führen kann, dass Fluoreszenzmarker in einer Polytransfektion ein schlechter Marker für Plasmidverhältnisse sind. (C) Gut durchgeführte Polytransfektionsergebnisse, die eine gute Zellzahl, Transfektionseffizienz und Kompensation zeigen. (D) Niedrige Anzahl lebender Zellen, die keine Teilprobenahme in Behältern mit statistisch signifikanter Anzahl von Zellen zulässt. (E) Schlechte Transfektionseffizienz, die keine Teilprobenahme in Bins mit statistisch signifikanter Anzahl von Zellen zulässt. (F) Fehlen einer angemessenen Kompensation, was dazu führt, dass Fluoreszenzdaten ein schlechter Indikator für die Menge an fluoreszierendem Protein im System sind. Verwenden Sie einfarbige Steuerelemente, um eine ideale lineare Kompensationsmatrix zu bestimmen, und wenden Sie sie vor der weiteren Verarbeitung auf die Daten an. Alle Farbsteuerungen werden je nach Wahl der Software ebenfalls empfohlen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Vergleich von Poly-Transfektion und Co-Transfektion. (A) Bei einer Co-Transfektion kann in jedem Versuchstopf ein Verhältnis von Translationsrepressor L7Ae zu fluoreszierenden Reporterplasmiden getestet werden. (B) Bei der Polytransfektion können viele Verhältnisse von L7Ae zu Reportern in derselben Vertiefung getestet werden. Siehe Tabelle 3 für Details zu den Poly-Transfektions-Plasmid-Mischungen. (C,D) Binning-Workflow für das Benchmarking von Poly-Transfektion mit mehreren Co-Transfektionen. Für jede Transfektionsmarkerdimension wurden insgesamt 10 Bins mit biexponentiellem Abstand zugewiesen, die die Konzentrationen jedes der beiden Plasmide annähern. Hier werden Bins gezeigt, die unterschiedliche Plasmid-#2-Niveaus bezeichnen. Das Binning wurde sowohl an einem zusammengestellten Satz von 11 Co-Transfektionsproben durchgeführt, die verschiedene Plasmidverhältnisse (C) umfassten, als auch an Daten aus einer einzelnen Polytransfektion, die jeweils etwa 500.000 Zellen umfasste (D). Die Farben entsprechen den Sätzen von Abschnitten, die durch Gen-2-Stufen (TagBFP) definiert sind. (E-G) Benchmarking von Poly-Transfektion und Co-Transfektion für eine repräsentative Schaltung. Die mediane Ausgangsfluoreszenz wurde für die Zellen in jedem Bin evaluiert und zwischen den Methoden für das repräsentative System, die L7Ae-Translationsrepression, verglichen. (E) Konstrukte zur Messung der L7Ae-Aktivität. Die mKO2-Fluoreszenz dient als Schätzung für die Abgabe von L7Ae (Gen #1), während die TagBFP-Fluoreszenz als Schätzung für die Abgabe des regulierten mNeonGreen-Outputs (Gen #2) dient. (F) Mehrdimensionale Titrationskurven für L7Ae. Jede Zeile stellt den Satz von Abschnitten auf einer Ebene von TagBFP dar, wie in (C) und (D) angegeben. Durchgezogene Linien kennzeichnen Polytransfektionsdaten, während gestrichelte Linien Co-Transfektionsdaten kennzeichnen. Mit jedem Binned-Level des Reporterplasmids nimmt die Reporterleistung mit zunehmendem L7Ae ab. (G) Visueller Vergleich zwischen Co-Transfektion und Poly-Transfektion für das L7Ae-System. Jeder Punkt stellt die gemessene Ausgabe in den entsprechenden Abschnitten für Poly-Transfektions- und Co-Transfektionsmessungen dar, wobei mehr äquivalente Werte näher an der roten 1:1-Linie liegen. Insgesamt sind die beobachteten Unterschiede zwischen Poly-Transfektions- und Co-Transfektions-abgeleiteten gering, was Vertrauen in die Zuverlässigkeit der Poly-Transfektionsmethode schafft. Diese Zahl wurde von10 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Datenanalyse für die Polytransfektion. Bei der Polytransfektion können Zellen zur Analyse in Bins oder Scheiben gruppiert werden. Abbildung 4 zeigt eine Form der Analyse, bei der die Zellen in Schichten unterteilt werden, die den Niveaus einer Systemkomponente entsprechen, z. B. dem Reporterplasmid-Niveau, was für die Modellanpassung und das Verständnis von Dosisreaktionen nützlich sein kann. Eine weitere nützliche Strategie besteht darin, die Schaltungsleistung bei unterschiedlichen Verhältnissen von Schaltungskomponenten zu analysieren. (A) Diagramm einer Klassifikatorschaltung zur Optimierung. Die Pegel von TagBFP, NeonGreen und iRFP720 entsprechen den Pegeln von BM3R1, Ausgang mKO2 bzw. Gal4-VP16. Siehe Tabelle 4 für Details zu den Poly-Transfektions-Plasmid-Mischungen. (B) Versuchsaufbau von Polytransfektionsmischungen. (C) Durchflusszytometrische Daten, die bei der Polytransfektion mit dem Kreislauf in (A) gesammelt wurden. Die Konzentrationen jedes der drei Reporterfluoreszenzproteine als Ergebnis der Polytransfektion des Schaltkreises in HEK-Zellen, was die große Bandbreite der in den Daten vorhandenen Verhältnisse der Schaltkreiskomponenten zeigt. Ähnliche Ergebnisse wurden bei der Transfektion von Schaltkreisen sowohl in HEK- als auch in HeLa-Zellen erzielt. (D) Subsampling-Polytransfektion in einem bestimmten Verhältnis. Um die Daten zu analysieren, haben wir eine große Anzahl von Verhältnissen zwischen Schaltungskomponenten gescannt und die Leistung des Klassifikators bei jedem Verhältnis bestimmt. Als Beispiel zeigen wir hier ein bestimmtes Verhältnis, das eine gute Leistung zeigte (Gal4-VP16 = 435 ng DNA, Reporter = 60 ng und BM3R1 = 40 ng). Blau dargestellt ist das entsprechende Verhältnis der Fluoreszenzmarker für die drei verschiedenen Schaltungskomponenten. Als nächstes haben wir die Daten abgetastet, indem wir nur Punkte innerhalb eines bestimmten euklidischen Abstands von der Fluoreszenzbahn berücksichtigt haben. Wir untersuchten Zellen mit der gleichen Trajektorie sowohl aus HEK- als auch aus HeLa-Transfektionen. (E) Vergleich der Schaltungsleistung bei gleicher Trajektorie in HEK- und HeLa-Zellen. Durch den Vergleich von Statistiken wie Sensitivität, Spezifität und Genauigkeit der Klassifizierung über viele Verhältnisse hinweg können die Komponentenverhältnisse optimiert werden, um einen idealen genetischen Schaltkreis zu erzeugen. Diese Zahl wurde von10 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Komplex | ng L7Ae Plasmid | ng Reporter-Plasmid | OptiMEM (μL) | P3000 (μL) | Lipo 3000 (μL) |
| 1 | 250 | 75 | 1.5 | 1.5 | |
| 2 | 250 | 75 | 1.5 | 1.5 |
Tabelle 3: Transfektionsmischungen entsprechend Abbildung 4. HEK293-Zellen wurden mit diesen Transfektionsmischungen in einer Vertiefung einer 24-Well-Platte poly-transfiziert.
| Komplex | ng BM3R1 Plasmid | ng Gal4-VP16 Plasmid | ng Reporter-Plasmid | OptiMEM (μL) | P3000 (μL) | Lipo 3000 (μL) |
| 1 | 900 | 75 | 1.5 | 1.5 | ||
| 2 | 900 | 75 | 1.5 | 1.5 | ||
| 3 | 900 | 75 | 1.5 | 1.5 |
Tabelle 4: Transfektionsmischungen entsprechend Abbildung 5. HEK293 und HeLa-Zellen wurden jeweils mit diesen Transfektionsmischungen in je einem Well einer 6-Well-Platte poly-transfiziert.
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Discussion
Rapid-Prototyping-Methoden wie Computer-Aided Design (CAD), Breadboarding und 3D-Druck haben die Disziplinen des Maschinenbaus, der Elektrotechnik und des Bauingenieurwesens revolutioniert. Die Fähigkeit, schnell nach vielen möglichen Lösungen für eine bestimmte Herausforderung zu suchen, beschleunigt den Fortschritt in einem Bereich erheblich. Wir glauben, dass die Polytransfektion eine analoge Technologie für die Biotechnik ist, die ein schnelles Prototyping genetischer Schaltkreise ermöglicht. Darüber hinaus erfordern andere Rapid-Prototyping-Technologien die manuelle sequenzielle Iteration mehrerer möglicher Lösungen, während die Polytransfektion in der Lage ist, viele Lösungen gleichzeitig zu untersuchen. Die Polytransfektion ermöglicht es, eine große Anzahl von Kombinationen von Komponenten genetischer Schaltkreise in einem einzigen Well zu testen, und wurde zur Optimierung mehrerer veröffentlichter genetischer Schaltkreise verwendet10,11,13. Das experimentelle Protokoll ist eine einfache Erweiterung der Standard-Co-Transfektion, die von vielen Säugetierzellforschern problemlos übernommen werden kann. Im Allgemeinen ist eine sehr enge Übereinstimmung zwischen Polytransfektions- und Co-Transfektionsergebnissen zu sehen10 (ein Beispiel ist Abbildung 4). Daher kann die Polytransfektion in den meisten Fällen verwendet werden, in denen Plasmidverhältnisse innerhalb von Co-Transfektionsmischungen titriert und die Ergebnisse auf Einzelzellebene gemessen werden.
Die Komplexität und das Ausmaß der Polytransfektion nehmen mit der Komplexität der zu optimierenden genetischen Schaltkreise zu. Mit zunehmender Anzahl der zu analysierenden Dimensionen nehmen die kombinatorischen Verhältnisse verschiedener Teile und die Anzahl der für ihre Analyse benötigten Zellen exponentiell zu. Um beispielsweise den Klassifikator in Abbildung 5 zu optimieren, wurden Zellen in einem 6-Well-Plattenformat transfiziert und Daten von mindestens 1,5 Millionen lebenden Zellen gesammelt. Wir haben auch einen Sichter mit einer zusätzlichen Schaltungskomponente 10 optimiert, was eine Transfektion im 10-cm-Plattenmaßstab und die Sammlung von Millionen von Zellen erfordert. In dieser Größenordnung und darüber hinaus ist die DNA-Produktion zeitaufwändig, und Transfektionsreagenzien sind teuer. Allerdings werden bei der Polytransfektion um Größenordnungen weniger Zellen, DNA und Transfektionsreagenzien verwendet als beim Testen einer vergleichbaren Anzahl von Kombinationen aus dem Verhältnis von Schaltkreiskomponenten in einzelnen Wells. Darüber hinaus wird eine beträchtliche Zeitersparnis erzielt, da die Transfektionsmischungen um Größenordnungen reduziert werden.
Die Polytransfektion ermöglicht fortschrittliche Analysemethoden für durchflusszytometrische Daten. Die beiden Hauptansätze sind (1) das Binning von Zellen entsprechend der Expression jedes Transfektionsmarkers und (2) das Extrahieren von Zellen in definierten Verhältnissen von Transfektionsmarkern, wodurch die Co-Transfektion simuliert wird. Ersteres wählt Zellen mit einer spezifischen Kombination von DNA-Dosierungen für jeden Komplex (und damit für jeden Teil) aus, was Input-Output-Transferfunktionen ergibt. Letzteres selektiert Zellen in einem bestimmten Verhältnis der DNA-Dosierungen für jeden Teil und simuliert so die Co-Transfektion bei einem solchen Verhältnis der Plasmid-DNA-Massen. Das Zeichnen des Expressionspegels von Schaltungsausgangsreportern in den Subsample-Auswahlen ergibt ein Maß für die Ausgabe bei den definierten Pegeln oder Verhältnissen der Eingaben. Für die Schaltungsoptimierung kann man die leistungsstärksten Bins/Verhältnisse identifizieren, wie sie durch den Zweck der Schaltung definiert sind - im Falle von Zellklassifikatoren sind dies die Bins/Verhältnisse, bei denen die Schaltung im Zielzellentyp EIN und in Nicht-Zielzelltypen AUS ist. Bei der Auswahl einer Behältergröße sollten Sie die erforderliche Präzision sowie die Anzahl der Zellen pro Behälter berücksichtigen. Kleinere Bins konzentrieren sich genauer auf die ideale Kombination von Schaltungskomponenten, aber wenn ein Bin zu wenige Zellen hat, kann dies zu unerwünschtem Rauschen bei den Messungen führen.
Zukünftige Verbesserungen in der computergestützten Analyse von Polytransfektionsdaten könnten die Optimierung auch bei geringer Zellabdeckung pro Bin/Verhältnis erleichtern. Derzeit schließen wir Daten aus Abschnitten mit weniger als einem festgelegten Schwellenwert von Zellen (z. B. 10) aus, um übermäßig verrauschte Messungen zu vermeiden. In Kombination mit wiederholten Messungen ermöglicht dies genauere und präzisere Berechnungen von Dosis-Wirkungs-Kurven, Klassifikatorgenauigkeiten und anderen Metriken, die pro Behälter definiert werden. Jede Zelle in der Polytransfektion kann jedoch als unabhängiges Experiment betrachtet werden, das mit einer feinen Auflösung die Schaltungsausgänge auf einem präzisen Eingangsniveau misst. Vor diesem Hintergrund können mechanistische und phänotypische Modelle von Dosis-Wirkungs-Beziehungen und Schaltkreisoptimierungen direkt an die Verteilung der Genexpression von jedem Marker und Reporter angepasst werden, anstatt an ihre zusammenfassende Statistik10. Dies ermöglicht robustere Messungen und nutzt die vielen einzelnen Datenpunkte, die pro Experiment gesammelt werden. Solche Modellierungsansätze könnten dabei eine prädiktive Charakterisierung und Optimierung von Schaltkreisen auch bei dünn abgetasteten hochdimensionalen Polytransfektionen ermöglichen. Darüber hinaus können Methoden des maschinellen Lernens, wie z. B. die Response-Surface-Methodik und die Random-Forest-Regression, verwendet werden, um relativ spärliche, hochdimensionale Daten zu analysieren10.
Ein alternativer Ansatz für immer größere Poly-Transfektionen ist die sequentielle Optimierung von Schaltkreisen unter Verwendung von Hierarchien von Poly-Transfektionen. Bei diesem Ansatz wird zunächst die Polytransfektion verwendet, um ein Modul zu optimieren, das eine Teilmenge genetischer Komponenten innerhalb eines größeren Schaltkreises umfasst. Anschließend werden diese optimierten Module als separate Poly-Transfektionsmischungen geliefert, so dass das optimale Verhältnis/die optimale Dosierung jedes Schaltungsmoduls gefunden werden kann. Bei diesem Ansatz wird eine deutlich geringere Anzahl von Zellen, DNA und Transfektionsreagenzien verwendet. Gruppen von Komponenten sind jedoch nicht notwendigerweise modular in Bezug auf andere Komponenten, und daher könnte ein optimales Verhältnis von Komponententeilen in einem Modul, isoliert gemessen, innerhalb des größeren Schaltungskontexts suboptimal sein8.
Poly-Transfektionsmethoden sind auch durch die Laser-/Filterkonfiguration des Durchflusszytometers begrenzt, das zur Datenerfassung verwendet wird. Zusätzlich zu den gemessenen Fluoreszenzausgängen enthält jede Transfektionsmischung einen fluoreszierenden Proteinmarker. Daher ist es wichtig, fluoreszierende Proteine auszuwählen, die auf dem Zytometer gut kompensiert werden können. Wir haben zuvor systematisch das Durchbluten eines Panels von 22 fluoreszierenden Proteinen auf einem Fünf-Laser-Durchflusszytometer (dem BD LSRFortessa) analysiert und festgestellt, dass der Satz von Sirius, TagBFP, mNeonGreen, mKO2 und iRFP720 zusammen verwendet werden kann und ohne nennenswerte Probleme gut kompensiert werden kann10. Die Optimierung größerer Schaltkreise kann jedoch fortschrittliche zytometrische Methoden erfordern, wie z. B. die spektrale Zytometrie zur Trennung fluoreszierender Proteine mit überlappenden Spektren, die unser Labor derzeit mit bis zu acht fluoreszierenden Proteinen optimiert. Datenbanken wie die Fluoreszenzproteindatenbank (https://www.fpbase.org) sind nützlich, um fluoreszierende Proteine mit besonderer spektraler Überlappung auszuwählen. Dieser Prozess kann jedoch durch verschiedene Faktoren erschwert werden, von denen einige spezifisch für bestimmte Zytometer sind. Beispielsweise kann die Verwendung bestimmter roter Proteine wie tdTomato nur in bestimmten Laser-/Filterkonfigurationen zu einem unerwünschten Durchscheinen in blaue Kanäle führen10. Darüber hinaus haben mehrere dunkelrote Proteine nichtlineare Beziehungen zwischen DNA-Dosierung und Fluoreszenzausbeute10 gezeigt, was ihre Verwendung als effektive Marker für die DNA-Dosierung reduziert.
Um die Konsistenz zwischen Experimenten zu gewährleisten, die mit einer unterschiedlichen Anzahl von Komplexen (eins, zwei, drei usw.) durchgeführt werden, ist es sinnvoll, die gleiche fraktionierte Menge an Plasmid pro Transfektionsmischung zu verwenden. Wenn man beispielsweise ein Drei-Gen-System testet, bei dem jedes Gen in einem von drei Plasmiden (A, B und C) kodiert ist, könnte man die Schaltkreisplasmide in einem Verhältnis von 1:1:1 zusammen mit einem gleichen Verhältnis eines Plasmids, das für einen Transfektionsmarker kodiert, co-transfizieren. Damit würde jedes Plasmid ein Viertel der Gesamtmasse des Mixes und damit etwa ein Viertel der Masse jedes gebildeten Transfektionskomplexes ausmachen. Bei der Polytransfektion von A, B und C in separaten Komplexen mit ihren eigenen Reportern ist es konsistenter, jedes Plasmid bei einem Viertel der Masse jedes Komplexes zu belassen, wobei die Füllstoff-DNA die verbleibende Masse einnimmt, anstatt die Plasmide 1:1 mit Reportern zu mischen oder ihre Gesamt-DNA-Masse beizubehalten (siehe Tabelle 5 für Beispiele). Dies liegt daran, dass die Verteilung der Genexpression zwischen den transfizierten Zellen weniger von der Gesamtmasse der in den Komplexen gelieferten DNA abhängt, sondern mehr von der fraktionierten Menge an DNA in jedem Komplex10. Wenn andere Verhältnisse als 1:1:1 gewünscht werden, berechnen Sie für jeden Teil die entsprechenden Anteile der gesamten DNA-Masse in der Transfektionsmischung. Tabelle 5 [unten] zeigt z. B. ein Verhältnis von 1:1:4.
| Methode | Komplex | ng A (Bruch) | ng B (Bruch) | ng C (Bruch) | ng Reporter (Bruch) | ng Füllstoff-DNA (Fraktion) | Gesamt (ng) |
| Co-Transfektion | 1 | 150 (¼) | 150 (¼) | 150 (¼) | 150 (¼) | 0 (0) | 600 |
| Poly-Transfektion | 600 | ||||||
| → | 1 | 50 (¼) | 50 (¼) | 100 (½) | 200 | ||
| → | 2 | 50 (¼) | 50 (¼) | 100 (½) | 200 | ||
| → | 3 | 50 (¼) | 50 (¼) | 100 (½) | 200 | ||
| Co-Transfektion | 1 | 75 (⅛) | 75 (⅛) | 300 (½) | 150 (¼) | 0 (0) | 600 |
| Poly-Transfektion | 600 | ||||||
| → | 1 | 25 (⅛) | 50 (¼) | 125 (⅝) | 200 | ||
| → | 2 | 25 (⅛) | 50 (¼) | 125 (⅝) | 200 | ||
| → | 3 | 100 (½) | 50 (¼) | 50 (¼) | 200 |
Tabelle 5: Beispiele für die Verwendung von Füllstoff-DNA für die Konsistenz in Co- und Poly-Transfektionsexperimenten. Hier werden zwei generische Beispiele für die Co-Transfizierung von drei Plasmiden mit der gleichen Menge an Füllstoff-DNA gezeigt. Im oberen Beispiel haben die Plasmide alle die gleiche Masse. Im unteren Beispiel wird ein Plasmid im Vergleich zu den anderen mit einer höheren Masse abgegeben. Der Anteil der Gesamt-DNA, der in einem Co-Transfektionskomplex verwendet würde, wird in Poly-Transfektionskomplexe umgewandelt, wobei die verbleibende DNA-Menge (bis zur Gesamtmenge für jeden Komplex, die in allen Komplexen fest und gleich ist) aus Füllstoff-DNA besteht.
Das übergeordnete Ziel der Füllstoff-DNA ist es, ähnliche Dosierungen von Plasmiden pro Zelle aufrechtzuerhalten, unabhängig von der Anzahl der einzigartigen Transfektionsmischungen. Als grobe Annäherung an dieses Prinzip reduziert die Trennung von drei Plasmiden in drei Mischungen bei gleicher DNA-Masse (und dem entsprechenden Verhältnis von Transfektionsreagenzien) den Prozentsatz der Zellen, die einen bestimmten Komplex erhalten, um ein Drittel im Vergleich zu einer einzigen Mischung, die alle drei Plasmide enthält. Allerdings erhält jede transfizierte Zelle anschließend eine ~3x höhere Gendosis. Eine alleinige Verringerung der relativen Menge der Plasmide ohne Füllstoff-DNA reicht daher nicht aus, um konsistente Plasmiddosen aufrechtzuerhalten, da dies einfach die Transfektionseffizienz verringert, ohne die zugrunde liegende Expressionsverteilung zwischen den transfizierten Zellen zu verändern10. Auf der anderen Seite ermöglicht Filler-DNA die Anpassung der DNA-Dosis, ohne die Gesamteffizienz der Transfektion zu beeinträchtigen (obwohl nachweisbare transfizierte Zellen aufgrund eines geringeren Signals abnehmen können)10. Nach der obigen groben Näherung werden durch die Reduzierung des DNA-Anteils in den Poly-Transfektionsmischungen auf ein Drittel und die Zugabe von Füller-DNA die relativen Gendosen im Vergleich zur ursprünglichen Co-Transfektion beibehalten. Füllstoff-DNA sorgt somit für eine effiziente und genaue Bildung von Transfektionskomplexen.
Um den Expressionsbereich eines Gens von Interesse, das von seinem Reporter abgedeckt wird, zu verändern, kann der Anteil jedes Testplasmids und/oder der Promotoren, die verwendet werden, um das Gen dorthin zu steuern, relativ zum Reporter eingestellt werden. Wenn ein Teil bei niedrigen DNA-Dosierungen stark/hochaktiv ist, kann die Verwendung einer niedrigeren DNA-Fraktion dazu beitragen, den Dynamikbereich des Teils in der Mitte der Fluoreszenzverteilung des Reporters in transfizierten Zellen zu zentrieren. Ebenso kann für Teile, die schwach/nur bei hohen DNA-Dosierungen aktiv sind, die Verwendung einer höheren Fraktion sinnvoll sein. Bei einer solchen Abstimmung ist jedoch Vorsicht geboten, da eine zu starke Reduzierung der DNA-Fraktionen die Stochastizität der Abgabe an die Zellen im Vergleich zum Reporter10 erhöht und hohe Genexpressionsniveaus die zelluläre Genexpressionsmaschinerie überlasten können12,14. Um Stochastizität zu vermeiden, und in Fällen, in denen jedes Gen in einem festen Verhältnis an die Zellen geliefert wird (z. B. wenn der Schaltkreis als einzelner Lenti-, PiggyBac- oder Landepad-Vektor erzeugt werden soll), kann die relative Expression jedes Gens mit stärkeren/schwächeren Promotoren, kleinen uORFs18 und/oder miSFITs19 eingestellt werden.
Obwohl das Protokoll eine umgekehrte Transfektionstechnik beschreibt, ist die Polytransfektion auch mit der Vorwärtstransfektion möglich. Bei der umgekehrten Transfektion werden die Zellen gleichzeitig ausgesät und transfiziert; Bei der Vorwärtstransfektion werden die Zellen ~24 Stunden nach der ersten Beschichtung mit etwa der Hälfte der Dichte transfiziert, die bei der Rückwärtstransfektion verwendet würde (um die Zellteilung zum Zeitpunkt der Transfektion zu ermöglichen). Im Allgemeinen ist die umgekehrte Transfektion effizienter, aber auch toxischer, und wir haben einige Unterschiede in der Form der Transfektionsverteilung basierend auf dem Reagenz, der Transfektionszeit und der Zelllinie festgestellt. Daher sollte die Transfektionsmethode der Wahl für jede Zelllinie optimiert werden, um die Anzahl der transfizierten Zellen und die Abdeckung des mehrdimensionalen Konzentrationsraums der Plasmiddosen pro Zelle zu maximieren.
Insgesamt ermöglicht die Polytransfektion die schnelle Optimierung der genetischen Schaltkreise von Säugetieren. Viele mögliche ratiometrische Kombinationen von Schaltungskomponenten können problemlos in einem einzigen Well getestet werden. Da die Polytransfektion mehr Informationen über die Niveaus jedes Teils in einem System enthält als eine konventionelle Transfektion, hat sie sich außerdem als sehr wertvoll für die Charakterisierung des Verhaltens verschiedener genetischer Teile erwiesen10,11,12,13. Es wird erwartet, dass die Einführung der Polytransfektion das Tempo der Entwicklung neuer und verbesserter Genschaltkreise für den Einsatz in Säugetierzellen beschleunigen wird.
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Disclosures
R.W. ist Mitbegründer von Strand Therapeutics und Replay Bio; R.W. und R.J. reichten ein vorläufiges Patent im Zusammenhang mit einem Zelltypklassifikator ein.
Acknowledgments
Wir möchten uns bei ehemaligen Mitgliedern des Weiss Labs bedanken, die die Poly-Transfektionsmethode und ihre Anwendung auf Zellklassifikatoren geleitet oder dazu beigetragen haben: Jeremy Gam, Bre DiAndreth und Jin Huh; weitere Weiss-Labormitglieder, die zur weiteren Methodenentwicklung/-optimierung beigetragen haben: Wenlong Xu, Lei Wang und Christian Cuba-Samaniego; Prof. Josh Leonard und Gruppenmitglieder, darunter Patrick Donahue und Hailey Edelstein, für die Prüfung der Polytransfektion und die Bereitstellung von Feedback; und Prof. Nika Shakiba für die Einladung zu diesem Manuskript und das Feedback. Wir möchten uns auch bei den National Institutes of Health [R01CA173712, R01CA207029, P50GM098792] bedanken; Nationale Wissenschaftsstiftung [1745645]; Cancer Center Support (core) Grant [P30CCA14051, teilweise] vom NCI und den National Institutes of Health [P50GM098792] zur Finanzierung dieser Arbeit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15mL Corning Falcon conical tubes | ThermoFisher Scientific | 14-959-53A | |
| 24-well petri dish | Any company of choice | (Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free) | |
| Bovine serum albumin | NEB | B9000S | |
| Centrifuge | Any company of choice | Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX2000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | |
| Cytoflow | Non-commercial software package | https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/# | |
| DMEM | VWR | 10-013-CV | Use the correct media for your cell type |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 03690-100ML | |
| Fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F4135 | |
| HEK cells | ATCC | CRL-1573 | Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently. |
| HeLa cells | ATCC | CRL-12401 | Use the relevant cell type for your experiments. |
| Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer | ThermoFisher Scientific | L3000001 | Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent |
| LSRFortessa flow cytometer | BD Biosciences | N/A | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
| Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | Any company of choice | ||
| Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985070 | reduced serum medium |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Rainbow calibration beads | Spherotech | URCP-100-2H | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Trypsin | VWR | 25-053-CI |
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