Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

التطور السريع لدوائر تحديد حالة الخلية باستخدام النقل المتعدد

Published: February 24, 2023 doi: 10.3791/64793
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 1,3
1Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2School of Biological Engineering, University of British Columbia, 3Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology

Summary

تستغرق الدوائر الجينية المعقدة وقتا طويلا لتصميمها واختبارها وتحسينها. لتسهيل هذه العملية ، يتم نقل خلايا الثدييات بطريقة تسمح باختبار قياسات متكافئة متعددة لمكونات الدائرة في بئر واحد. يحدد هذا البروتوكول خطوات التخطيط التجريبي والنقل وتحليل البيانات.

Abstract

أظهرت الدوائر الوراثية للثدييات القدرة على استشعار وعلاج مجموعة واسعة من الحالات المرضية ، لكن تحسين مستويات مكونات الدائرة لا يزال يمثل تحديا ويتطلب عمالة مكثفة. لتسريع هذه العملية ، طور مختبرنا النقل المتعدد ، وهو امتداد عالي الإنتاجية لنقل الثدييات التقليدي. في poly-transfection ، تقوم كل خلية في السكان المنقولين بشكل أساسي بإجراء تجربة مختلفة ، واختبار سلوك الدائرة بأرقام نسخ مختلفة من الحمض النووي والسماح للمستخدمين بتحليل عدد كبير من القياسات المتكافئة في تفاعل وعاء واحد. حتى الآن ، تم إثبات عمليات النقل المتعددة التي تعمل على تحسين نسب الدوائر المكونة من ثلاثة مكونات في بئر واحد من الخلايا. من حيث المبدأ ، يمكن استخدام نفس الطريقة لتطوير دوائر أكبر. يمكن تطبيق نتائج النقل المتعدد بسهولة للعثور على النسب المثلى من الحمض النووي إلى النقل المشترك للدوائر العابرة أو لاختيار مستويات التعبير لمكونات الدائرة لتوليد خطوط خلايا مستقرة.

هنا ، نوضح استخدام النقل المتعدد لتحسين دائرة مكونة من ثلاثة مكونات. يبدأ البروتوكول بمبادئ التصميم التجريبي ويشرح كيف يبني النقل المتعدد على طرق النقل المشترك التقليدية. بعد ذلك ، يتم إجراء نقل متعدد للخلايا ويتبعه قياس التدفق الخلوي بعد بضعة أيام. أخيرا ، يتم تحليل البيانات عن طريق فحص شرائح بيانات قياس التدفق الخلوي أحادي الخلية التي تتوافق مع مجموعات فرعية من الخلايا ذات نسب مكونات معينة. في المختبر ، تم استخدام poly-transfection لتحسين مصنفات الخلايا ، والتغذية المرتدة وأجهزة التحكم في التغذية الأمامية ، والزخارف ثنائية الاستقرار ، وغيرها الكثير. تعمل هذه الطريقة البسيطة والقوية على تسريع دورات التصميم للدوائر الجينية المعقدة في خلايا الثدييات.

Introduction

تقدم مجال البيولوجيا التركيبية للثدييات بسرعة ، من تطوير أجزاء بسيطة من الإحساس والاستجابة في خطوط الخلايا المستزرعة إلى تحسين الشبكات المعقدة من الجينات لمواجهة تحديات العالم الحقيقي في التشخيص والعلاج1. هذه الدوائر المتطورة قادرة على استشعار المدخلات البيولوجية من ملفات تعريف microRNA إلى السيتوكينات إلى أدوية الجزيئات الصغيرة ، وتنفيذ دوائر المعالجة المنطقية بما في ذلك الترانزستورات ومرشحات تمرير النطاق ومفاتيح التبديل والمذبذبات. كما أظهروا نتائج واعدة في النماذج الحيوانية لأمراض مثل السرطان والتهاب المفاصل والسكري وغيرها الكثير1،2،3،4،5. ومع ذلك ، مع نمو تعقيد الدائرة ، يصبح تحسين مستويات كل مكون من مكوناتها أمرا صعبا بشكل متزايد.

أحد الأنواع المفيدة بشكل خاص من الدوائر الوراثية هو مصنف الخلايا ، والذي يمكن برمجته لاستشعار الحالات الخلوية والاستجابة لها. يعد الإنتاج الانتقائي لمخرجات البروتين أو الحمض النووي الريبي في حالات خلوية محددة أداة قوية لتوجيه وبرمجة تمايز الخلايا والكائنات العضوية ، وتحديد وتدمير الخلايا المريضة و / أو أنواع الخلايا غير المرغوب فيها ، وتنظيم وظيفة الخلايا العلاجية1،2،3،4،5. ومع ذلك ، فإن إنشاء دوائر في خلايا الثدييات يمكنها تصنيف حالات الخلايا بدقة من أنواع متعددة من الحمض النووي الريبي الخلوي و / أو أنواع البروتين كان أمرا صعبا للغاية.

تتمثل إحدى الخطوات الأكثر استهلاكا للوقت في تطوير دائرة تصنيف الخلية في تحسين مستويات التعبير النسبية للجينات المكونة الفردية ، مثل أجهزة الاستشعار وعوامل المعالجة ، داخل الدائرة. لتسريع تحسين الدوائر والسماح ببناء دوائر أكثر تطورا ، استخدم العمل الأخير النمذجة الرياضية لدوائر تصنيف الخلايا ومكوناتها للتنبؤ بالتركيبات والطوبولوجيا المثلى 6,7. في حين أن هذا أظهر نتائج قوية حتى الآن ، فإن التحليل الرياضي محدود بسبب الحاجة إلى توصيف سلوك المدخلات والمخرجات للجينات المكونة في الدائرة بشكل منهجي ، وهو ما يستغرق وقتا طويلا. علاوة على ذلك ، يمكن أن يظهر عدد لا يحصى من المشكلات المعتمدة على السياق في الدوائر الجينية المعقدة ، مما يتسبب في سلوك دائرة كاملة لتحدي التنبؤات بناء على توصيفات الأجزاء الفردية 8,9.

لتطوير واختبار دوائر الثدييات المعقدة بسرعة أكبر مثل مصنفات حالة الخلية ، طور مختبرنا تقنية تسمى poly-transfection10 ، وهي تطور لبروتوكولات النقل المشترك للبلازميد. في النقل المشترك ، يتم تعقيد أنواع متعددة من الحمض النووي البلازميد مع كاشف دهني أو بوليمر موجب الشحنة ، ثم يتم تسليمه إلى الخلايا بطريقة مترابطة (الشكل 1 أ). في النقل المتعدد ، يتم تعقيد البلازميدات بشكل منفصل مع الكاشف ، بحيث يتم تسليم الحمض النووي من كل مركب نقل إلى الخلايا بطريقة غير مترابطة (الشكل 1 ب). باستخدام هذه الطريقة ، تتعرض الخلايا داخل السكان المنقولين لمجموعات عديدة من نسب حمولتين أو أكثر من الحمض النووي تحمل مكونات دائرة مختلفة.

لقياس نسب مكونات الدائرة التي يتم تسليمها إلى كل خلية ، يحتوي كل مركب نقل داخل متعدد النقل على مراسل فلوري معبر عنه بشكل أساسي يعمل كوكيل للامتصاص الخلوي للمجمع. يتم استخدام الحمض النووي للحشو الذي لا يحتوي على أي عناصر نشطة داخل خلية الثدييات لضبط الكمية النسبية لمراسل الفلورسنت ومكونات الدائرة التي يتم تسليمها إلى خلية في مجمع نقل واحد ويتم مناقشته بمزيد من التفصيل في المناقشة. مثال على الحمض النووي للحشو المستخدم في مختبر فايس هو البلازميد الذي يحتوي على تسلسل الفاصل ، ولكن لا يوجد مروج ، تسلسل ترميز ، إلخ. يمكن بعد ذلك مقارنة الخلايا ذات النسب المختلفة لمكونات الدائرة لإيجاد النسب المثلى لوظيفة الدائرة الجينية. وهذا بدوره يعطي تنبؤات مفيدة لاختيار المروجين وعناصر الدائرة الأخرى لتحقيق مستويات التعبير الجيني المثلى عند الجمع بين مكونات الدائرة في ناقل واحد للتكامل الجيني (على سبيل المثال ، فيروس lentivirus أو transposon أو منصة الهبوط). وبالتالي ، بدلا من اختيار النسب بين مكونات الدائرة بناء على الحدس أو عبر عملية التجربة والخطأ التي تستغرق وقتا طويلا ، يقوم النقل المتعدد بتقييم مجموعة واسعة من القياسات المتكافئة بين الأجزاء الجينية في تفاعل وعاء واحد.

في مختبرنا ، مكن النقل المتعدد من تحسين العديد من الدوائر الجينية ، بما في ذلك مصنفات الخلايا ، والتغذية المرتدة وأجهزة التحكم في التغذية الأمامية ، والزخارف ثنائية الاستقرار. هذه الطريقة البسيطة والقوية تسرع بشكل كبير دورات التصميم للدوائر الجينية المعقدة في خلايا الثدييات. ومنذ ذلك الحين ، تم استخدام النقل المتعدد لتوصيف العديد من الدوائر الجينية للكشف عن وظائف نقل المدخلات والمخرجات متعددة الأبعاد بدقةعالية 10 ، وتحسين طوبولوجيا الدائرة البديلة لتصنيف حالة الخلية11 ، وتسريع مختلف المشاريعالمنشورة 12،13 والمشاريع الجارية.

هنا نصف ونصور سير العمل لاستخدام النقل المتعدد لتحسين الدائرة الجينية بسرعة (الشكل 2). يوضح البروتوكول كيفية إنشاء بيانات نقل متعدد عالية الجودة وتجنب العديد من الأخطاء الشائعة في بروتوكول النقل المتعدد وتحليل البيانات (الشكل 3). ثم يوضح كيفية استخدام النقل المتعدد لتوصيف مكونات الدائرة البسيطة ، وفي هذه العملية ، قياس نتائج النقل المتعدد مقابل النقل المشترك (الشكل 4). أخيرا ، تظهر نتائج النقل المتعدد تحسين دائرة مصنف السرطان (الشكل 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: يعمل الجدولان 1 و2 كمرجعين هامين لهذا البروتوكول. يوضح الجدول 1 مقياس الكاشف للتفاعلات ، ويبين الجدول 2 حساب نسبة الحمض النووي لمثال متعدد النقل الموصوف في البروتوكول (النصف العلوي) ولتجربة متابعة محتملة (النصف السفلي).

1. تحضير الخلايا للانتقال

  1. تأكد من أن مزرعة خلايا الكلى الجنينية البشرية (HEK293) متقاربة بنسبة 60٪ -80٪ قبل بدء البروتوكول. للقيام بذلك ، قم بزرع 1 × 106 خلايا في طبق بتري لزراعة الأنسجة 100 مم × 15 مم قبل يومين ، واحتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
    ملاحظة: على الرغم من أن بروتوكولنا يركز على خلايا HEK293 ، فقد يتم استبدال أنواع الخلايا الأخرى.
  2. قم بإعداد الوسائط والخلايا لعمليات النقل كما هو موضح أدناه.
    1. قم بتسخين ما لا يقل عن 20 مل من محلول وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco مع مصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) و 1٪ أحماض أمينية غير أساسية (NEAA ؛ انظر جدول المواد) إلى 37 درجة مئوية. قم بتسخين ما لا يقل عن 2.4 مل من التربسين و 2.4 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) إلى 37 درجة مئوية أيضا. قبل التسخين خفض المصل المتوسط إلى ~ 16 °C.
      ملاحظة: يجب إجراء جميع أعمال زراعة الأنسجة بعناية في خزانة السلامة البيولوجية.
  3. أعد تعليق الخلايا في محلول DMEM كما هو موضح أدناه.
    1. نضح والتخلص من وسائل الإعلام الحالية. قم بتوزيع 2 مل من برنامج تلفزيوني على مزرعة الخلايا HEK293 لغسل الخلايا. نضح والتخلص من برنامج تلفزيوني.
    2. وزع 2 مل من التربسين على مزرعة خلايا HEK293. ضع طبق بتري في حاضنة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق أو حتى تتوقف الخلايا عن الالتصاق بالطبق. أعد الطبق إلى خزانة السلامة الحيوية وقم بتخفيف محلول الخلية عن طريق توزيع 8 مل من محلول DMEM في الطبق.
    3. امزج المحلول عن طريق السحب برفق لأعلى ولأسفل عدة مرات. نضح جميع الوسائط ووضعها في أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
  4. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 × غرام لمدة 3 دقائق لتكويتها. نضح الوسائط (مع الحرص على عدم استنشاق الخلايا) والتخلص منها. أعد تعليق الخلايا في 5 مل من محلول DMEM ، واخلطها عن طريق السحب برفق لأعلى ولأسفل.
  5. قم بتقدير تركيز الخلية الحالي باستخدام عداد خلية آلي (مدرج في جدول المواد). بذر ستة آبار (في هذا المثال) في صفيحة 24 بئرا مع 1 × 105 خلايا (لكثافة بذر تبلغ 50000 خلية / سم2).
  6. أضف محلول DMEM حتى 500 ميكرولتر (أضف محلول DMEM إلى الآبار أولا) ، ثم قم بتسمية بئر واحد لكل معالجة على النحو التالي: لا يوجد تحكم في اللون ، وتحكم mKO2 ، وتحكم TagBFP ، وتحكم NeonGreen ، وكل التحكم في الألوان ، و poly-transfection 1. آبار التحكم TagBFP و mKO2 و NeonGreen هي عناصر تحكم أحادية اللون لجميع البروتينات الفلورية المدرجة في النقل المتعدد.

2. أداء نقل

  1. تحضير الأنابيب لكل مجموع الحمض النووي. ضع جانبا أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل وقم بتسمية الأنابيب على النحو التالي: لا يوجد تحكم في اللون ، والتحكم في mKO2 ، والتحكم في TagBFP ، والتحكم في NeonGreen ، والتحكم في جميع الألوان ، ومزيج النقل المتعدد 1 ، ومزيج النقل المتعدد 2.
    1. أضف 36 ميكرولتر من وسط المصل المخفض إلى التحكم في عدم التحكم في الألوان ، والتحكم mKO2 ، والتحكم في TagBFP ، والتحكم في NeonGreen ، وجميع أنابيب التحكم في الألوان. أضف 18 ميكرولتر من وسط المصل المختزل إلى كل من أنابيب مزيج البولي نقل 1 ومزيج البولي نقل 2.
      ملاحظة: يفترض أن تكون تركيزات البلازميد 150 نانوغرام / ميكرولتر.
    2. أضف 600 نانوغرام من بلازميد الحشو إلى أنبوب عدم التحكم في اللون. أضف 300 نانوغرام من mKO2 و 300 نانوغرام من بلازميد الحشو إلى أنبوب التحكم في الألوان mKO2. أضف 300 نانوغرام من TagBFP و 300 نانوغرام من بلازميد الحشو إلى أنبوب التحكم في الألوان TagBFP.
    3. أضف 300 نانوغرام من بلازميد NeonGreen التأسيسي و 300 نانوغرام من بلازميد الحشو إلى أنبوب التحكم في اللون NeonGreen. أضف 100 نانوغرام لكل من mKO2 و TagBFP و NeonGreen التأسيسي ، بالإضافة إلى 300 نانوغرام من بلازميد الحشو ، إلى أنبوب التحكم في الألوان بالكامل.
    4. أضف 150 نانوغرام من mKO2 إلى أنبوب مزيج 1 متعدد النقل. أضف 75 نانوغرام من البلازميد NeonGreen المراسل و 75 نانوغرام من بلازميد الحشو إلى أنبوب مزيج 1 متعدد النقل.
    5. أضف 150 نانوغرام من TagBFP إلى أنبوب مزيج 2 متعدد النقل. أضف 75 نانوغرام من بلازميد L7ae و 75 نانوغرام من بلازميد الحشو إلى أنبوب مزيج 2 متعدد النقل.
  2. قم بإنشاء المزيج الرئيسي للنقل في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل من خلال الجمع بين 216 ميكرولتر من وسط المصل المختزل مع 9.48 ميكرولتر من كاشف النقل (انظر الجدول 1 لنسب الكاشف ومقياس التفاعل). تخلط جيدا عن طريق سحب الماصة لأعلى ولأسفل ، وتوضع جانبا.
  3. أضف 1.58 ميكرولتر من كاشف المحسن إلى كل من عدم التحكم في الألوان والتحكم في اللون الفردي وجميع أنابيب التحكم في الألوان. أضف 79 ميكرولتر من كاشف المحسن إلى كل أنبوب من أنابيب مزيج النقل المتعدد. امزج كل أنبوب على حدة عن طريق سحب الإصبع بقوة.
  4. أضف المزيج الرئيسي للنقل إلى كل أنبوب يحتوي على الحمض النووي.
    1. أضف 37.58 ميكرولتر من المزيج الرئيسي للنقل إلى كل من أنابيب التحكم في اللون بدون والتحكم في اللون الفردي وجميع أنابيب التحكم في الألوان. امزج كل أنبوب على حدة عن طريق سحب الإصبع بقوة.
    2. أضف 18.79 ميكرولتر من المزيج الرئيسي للنقل إلى كل أنبوب من أنابيب مزيج النقل المتعدد. امزج كل أنبوب على حدة عن طريق سحب الإصبع بقوة.
  5. الاستغناء عن خلطات النقل في الآبار.
    1. ماصة 65.97 ميكرولتر من كل مزيج نقل لعدم وجود لون ، لون واحد ، وجميع عناصر التحكم في الألوان في الآبار المقابلة.
    2. ماصة 32.98 ميكرولتر من بولي نقل مزيج 1 في بئر بولي نقل وتدوير اللوحة بسرعة ولكن بلطف في نمط الشكل ثمانية ضيق على طول سطح مستو لتوزيع المجمعات بشكل فعال. بعد ذلك ، تخلط ماصة 32.98 ميكرولتر من poly-transfection 2 في نفس بئر النقل المتعدد وتدور اللوحة بنفس الطريقة.
  6. ضع اللوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، مع 5٪ CO2 وبدون اهتزاز ، لمدة 48 ساعة.
    ملاحظة: لزيادة صلاحية الخلية ، يمكن استبدال وسائط الخلية كل 6 ساعات بعد النقل (على الرغم من أن هذا ليس ضروريا دائما ، ومع خلايا HEK293 ومشتقاتها ، يجب على المرء أن يكون حريصا على عدم فصل الخلايا عن اللوحة عند تغيير الوسائط).
الكاشف مبلغ القياس
انخفاض وسط المصل لخليط الحمض النووي 36 ميكرولتر لكل أنبوب تحكم ، 18 ميكرولتر لكل أنبوب متعدد النقل 0.05 ميكرولتر انخفاض الحمض النووي المتوسط / نانوغرام في المصل لكل أنبوب ، مع حجم إضافي بنسبة 10-20٪ لحساب السحب
دنا 300-600 نانوغرام لكل أنبوب
ص 3000 1.58 ميكرولتر لكل أنبوب تحكم ، 0.79 ميكرولتر لكل أنبوب متعدد النقل 0.0022 ميكرولتر P3000 / نانوغرام DNA لكل أنبوب ، مع 10-20٪ إضافية
وسط مصل مخفض لمزيج ليبو ماستر 36 ميكرولتر لكل أنبوب تحكم ، 18 ميكرولتر لكل أنبوب متعدد النقل 0.05 ميكرولتر مخفض من الحمض النووي المتوسط / نانوغرام في المصل ، مع حجم إضافي بنسبة 10-20٪ لحساب السحب
كاشف النقل والمحسن 1.58 ميكرولتر لكل أنبوب تحكم ، 0.79 ميكرولتر لكل أنبوب متعدد النقل 0.0022 ميكرولتر ليبوفيكتامين 3000 / نانوغرام الحمض النووي ، مع 10-20٪ إضافية

الجدول 1: تحجيم الكاشف لعمليات النقل. يوضح الجدول النسبة الصحيحة للكاشف المطلوب تضمينها لكمية الحمض النووي (DNA) المضمنة في بئر واحدة. يمكن استخدام هذا لقياس التفاعلات بشكل فعال وتشكيل خلطات رئيسية. تم تحجيم كميات الكاشف لتشمل زيادة بنسبة 20٪.

3. تحضير الخلايا لقياس التدفق الخلوي

  1. قم بتسخين 4.2 مل على الأقل من محلول DMEM مسبقا إلى 37 درجة مئوية. قم بتسخين 4.2 مل على الأقل من التربسين و 4.2 مل من PBS إلى 37 درجة مئوية. احتفظ بمحلول المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) عند 4 درجات مئوية حتى يصبح جاهزا للاستخدام.
  2. إعادة تعليق الخلايا في محلول المخزن المؤقت FACS (PBS مكمل ب 1٪ BSA ، 5 mM إيثيلين ديامينيترايتيك حمض [EDTA] ، و 0.1٪ أزيد الصوديوم [NaN3] ، لتقليل التكتل ؛ انظر جدول المواد) كما هو موضح أدناه.
    1. نضح والتخلص من الوسائط الحالية في كل بئر. قم بتوزيع 5 مل من برنامج تلفزيوني في كل بئر لغسل الخلايا. نضح والتخلص من برنامج تلفزيوني.
    2. قم بتوزيع 5 مل من التربسين في كل بئر. ضع الطبق في حاضنة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، أو حتى لا تلتصق الخلايا بالطبق. أعد اللوحة إلى خزانة السلامة الحيوية وقم بتخفيف محاليل الخلايا عن طريق توزيع 5 مل من محلول DMEM في كل بئر.
    3. لكل بئر ، امزج المحلول عن طريق سحب السحب برفق لأعلى ولأسفل عدة مرات. لكل بئر ، قم بشفط جميع الوسائط ووضعها في أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
  3. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 × غرام لمدة 3 دقائق لتكويتها. نضح وسائل الإعلام ، مع الحرص على عدم استنشاق الخلايا والتخلص منها. في كل أنبوب ، أعد تعليق الخلايا في 5 مل من محلول FACS العازلة ، واخلطها عن طريق السحب برفق لأعلى ولأسفل.
  4. مرر كل محلول معلق للخلية من خلال مصفاة (لإزالة الكتل) في أنابيب مخروطية منفصلة لقياس التدفق الخلوي. احتفظ بهذه الأنابيب على الجليد لمدة لا تزيد عن 1 ساعة ، وقم بإجراء قياس التدفق الخلوي في أسرع وقت ممكن.

4. إجراء قياس التدفق الخلوي

ملاحظة: يتطلب تشغيل مقياس التدفق الخلوي التدريب المناسب ومعرفة المهام الضرورية. نظرا لأن البرامج والمعدات قد تختلف ويجب تدريب المستخدمين بشكل عام ، يشير هذا القسم إلى عمليات محددة مفيدة للأداء.

  1. أولا ، افحص الخلايا المنقولة باستخدام التحكم في بلازميد الحشو (بدون تحكم في اللون) لتحديد خصائص الخلية وتجنب الحالات الشاذة (بما في ذلك الركام والحطام وما إلى ذلك). في حين أن هناك العديد من مجموعات المعلمات لتمييز الخلايا ، استخدم الخيارات العامة الثلاثة التالية كطريقة جيدة لتصور الميزات المميزة.
    1. انظر إلى منطقة التشتت الجانبية (log أو المقياس الخطي لكل تفضيل / نوع الخلية) مقابل منطقة التشتت الأمامية (مقياس خطي).
    2. انظر إلى ارتفاع التشتت الجانبي (مقياس اللوغاريتم) مقابل عرض التشتت الجانبي (المقياس الخطي).
    3. انظر إلى عرض التشتت الأمامي (المقياس الخطي) مقابل ارتفاع التشتت الأمامي (المقياس الخطي).
  2. بعد ذلك ، انظر إلى عناصر التحكم في اللون الفردي. استخدم التحكم في كل الألوان لضبط جهد الجهاز ، بحيث يتم تطبيع الإشارات من كل بروتين فلوري إلى وحدات عشوائية مكافئة (a.u.) من التألق. بعد ذلك ، قم بتشغيل عناصر التحكم أحادية اللون لكل بروتين فلوري ، والتي تستخدم لضبط مصفوفة التعويض ، مما يسمح بتصحيح النزيف.
    ملاحظة: من الناحية المثالية ، يجب أن يكون النطاق الديناميكي الكامل لقيم التألق مرئيا. يمكن إجراء مزيد من التطبيع لإشارات البروتين الفلوري عن طريق التحويل إلى وحدات موحدة (على سبيل المثال ، جزيئات الفلوريسئين المكافئ [MEFLs ؛ انظر Beal et al.15]). لتمكين تحويل MEFL أثناء التحليل ، قم بتشغيل حبات معايرة قوس قزح. هذه المعايرة مفيدة أيضا لتقليل تباين الإشارة من أداة إلى أخرى ومن يوم إلىيوم 16.
  3. قم بتشغيل أنبوب عينة النقل المتعدد.
    ملاحظة: حيثما أمكن ، يوصى بتشغيل خلايا 1,000 × 10 ^ (^ = يمزج) ، حيث يجب تقسيم عمليات النقل المتعددة عالية الأبعاد إلى المزيد من الصناديق أثناء التحليل ، ويحتاج كل صندوق إلى خلايا كافية (من الناحية المثالية >10) لإجراء مقارنات ذات دلالة إحصائية.

5. إجراء تحليل ما بعد التجربة

  1. في البداية ، استخدم البيانات من عناصر التحكم (وإذا أمكن ، الخرزات) لضمان نتائج دقيقة. استخدم إحدى أدوات البرامج المتاحة لأداء بوابات الخلايا الحية (باستخدام البوابات الموضحة أعلاه) ، والتعويض ، وتصحيح التألق الذاتي.
    ملاحظة: نستخدم عادة إما كود MATLAB المخصص (على سبيل المثال ، https://github.com/jonesr18/MATLAB_Flow_Analysis أو Cytoflow17) ، والذي يحتوي على واجهة مستخدم رسومية ومكتبة بيثون مناسبة لمرحلة المعالجة المسبقة ولتحليل النقل المتعدد.
أسلوب معقد نانوغرام علامة الفلورسنت نانوغرام L7ae (كسر) نانوغرام مراسل (كسر) نانوغرام حشو الحمض النووي (جزء) المجموع (نانوغرام)
بولي ترانسفيشن 1 600
→ 1 150 75 (½) 75 (½) 300
→ 2 150 75 (½) 75 (½) 300
بولي ترانسفيشن 2 600
→ 1 150 25 (1/6) 125 (5/6) 300
→ 2 150 125 (5/6) 25(1/6) 300

الجدول 2: كميات الحمض النووي للانتقال المتعدد الموضحة في البروتوكول ، ومثال على تجربة متابعة مع نسب البلازميد المضبوطة. يوضح النصف العلوي من الجدول تركيب البلازميدات المستخدمة في تجربة نقل متعدد. يظهر النصف السفلي تكوين تجربة محدثة تقوم بضبط نسب البلازميد لأخذ عينة فرعية أفضل من مساحة تركيز افتراضية ، حيث يكون معدل التعبير الجيني بنسبة 1: 5 مثالية بالنسبة لمراسله ، مما ينتج عنه المزيد من الخلايا المنقولة لأخذ عينات حول هذه النسبة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في الشكل 1 ، نقارن النقل المشترك بالنقل المتعدد. في النقل المشترك ، يتم تسليم جميع البلازميدات في نفس مزيج النقل ، مما يؤدي إلى ارتباط كبير بين كمية كل بلازميد تتلقاه أي خلية واحدة (الشكل 1 أ). في حين أن عدد البلازميدات الكلية التي يتم توصيلها إلى كل خلية يختلف اختلافا كبيرا ، فإن مضان البروتينين المراسلين في الخلايا الفردية عبر السكان مرتبط جيدا ، مما يشير إلى أن البلازميدات يتم توصيلهما بشكل مشترك بنسبة ثابتة إلى حد ما. قد تمتص الخلايا المنقولة عددا قليلا أو كثيرا من المجمعات ، ولكن نظرا لأن كل مركب يحتوي على كميات مترابطة من كل بلازميد ، فإن النقل المشترك يستكشف فقط منطقة قطرية صغيرة من مساحة التركيز بين البلازميدين. في المقابل ، في النقل المتعدد ، يتم تسليم البلازميدات في مجمعات نقل متعددة ، مما يؤدي إلى توصيل غير مترابط للبلازميدات في خلطات نقل مختلفة (الشكل 1 ب). تمتص الخلايا المنقولة مجموعات مختلفة من المعقدات، مما ينتج عنه خلايا تحتوي على جرعات متفاوتة من البلازميدات من أي من المعقدين أو أحدهما أو كليهما.

يوضح الشكل 2 سير عمل تمثيلي متعدد النقل. بشكل عام ، تتكون تجربة النقل المتعدد من الخطوات التالية: تحديد المشكلة ، وإنشاء خلطات النقل ، واحتضان الخلايا ، وقياس التدفق الخلوي ، والتحليل. هناك أيضا خطوة اختيارية لتكرار النقل المتعدد مع نسب الأجزاء المحسنة إذا كانت نتائج النقل المتعدد الأولية غير قادرة على تضييق نسب الأجزاء المثلى بدقة. هذه الخطوات موضحة في البروتوكول.

في الشكل 3 ، يتم تقديم بعض الأمثلة على عمليات النقل المشتركة والمتعددة جيدة الأداء والأخطاء الشائعة. يوضح الشكل 3 أ انتقالا مشتركا جيد الأداء مع وجود ارتباط وثيق بين TagBFP والبلازميدات المعبرة عن eYFP التي تم تسليمها بشكل مشترك. في المقابل ، يظهر النقل المشترك في الشكل 3B ارتباطا ضعيفا بين هذين البلازميدين. في الشكل الموضح ، يرجع الارتباط الضعيف إلى إضافة كاشف محسن إلى وسط المصل المختزل قبل إضافة البلازميدات. يمكن أن يكون هذا الارتباط الضعيف في التجارب أيضا بسبب المروجين المختلفين الذين يقودون التعبير عن البروتينات الفلورية ، أو الخلط السيئ أثناء إنشاء مزيج النقل ، أو السماح للمجمع بالحضانة لفترة قصيرة جدا أو طويلة جدا.

يوضح الشكل 3C تعدد نقل جيد الأداء ، مع تغطية جيدة للفضاء ثنائي الأبعاد وتعويض جيد لأي نزيف طيفي بين البروتينات الفلورية. يوضح الشكل 3D بيانات النقل المتعدد مع عدد قليل من الخلايا الحية ، والتي يصعب تقسيمها إلى صناديق كافية مع عدد كاف من الخلايا في كل حاوية للتحليل. لتحسين هذه المشكلة ، يجب أن يكون عدد الخلايا الأولية بصحة جيدة وليس متضخما ، وأن يتم تقليل السمية التجريبية باستخدام كاشف نقل مختلف و / أو نقل مع إجمالي أقل من الحمض النووي. يوضح الشكل 3E عملية نقل متعددة كانت فيها كفاءة النقل ضعيفة ، مما أدى مرة أخرى إلى تغطية متفرقة للفضاء ثنائي الأبعاد للتحليل. في هذه الحالة ، يكون عدد الخلايا التي تمر ببوابات مورفولوجيا مرتفعا ، لكن الخلايا لا تعبر عن بروتينات الفلورسنت. لتحسين الكفاءة ، يجب تحسين اختيار كاشف النقل واتباع بروتوكول الشركة المصنعة عن كثب. يجب أن يحتوي كل مزيج نقل على كمية مكافئة من كتلة الحمض النووي ، مما يضمن أن الخلايا لديها فرصة متساوية تقريبا لتلقي كل نوع من أنواع المعقد ، ويجب أن يتم كل مزيج نقل وفقا لتعليمات المجموعة. مجموعات النقل المختلفة هي الأمثل لأنواع الخلايا المختلفة. يجب استخدام المجموعة التي تعطي أفضل كفاءة في نوع الخلية ذات الاهتمام. أخيرا ، يصعب نقل بعض أنواع الخلايا ، بغض النظر عن المجموعة المستخدمة. في هذه الحالات ، يجب نقل عدد أكبر من الخلايا ، وجمع أكبر عدد ممكن أثناء قياس التدفق الخلوي لضمان وجود عدد كاف من الخلايا لتحليلها. يوضح الشكل 3F بيانات النقل المتعدد حيث تظهر إحدى علامات البروتين الفلورية بوضوح نزيفا طيفيا إلى بروتين فلوري آخر. يجب دائما تشغيل عناصر التحكم أحادية اللون لجميع البروتينات الفلورية في النظام واستخدامها لإنشاء مصفوفة تعويض يجب تطبيقها على جميع عمليات النقل المتعددة قبل التحليل.

عند إجراء تجارب النقل المتعدد لأول مرة (بشكل عام أو لنظام تجريبي جديد) ، يجب على المرء إجراء مقارنة معيارية مقابل النقل المشترك القياسي. يتمثل أحد الأساليب في قياس وظيفة نقل المدخلات والمخرجات بشكل فردي لأجزاء النظام الرئيسية باستخدام كل من النقل المشترك (عن طريق ضبط جرعات الحمض النووي) والنقل المتعدد.

في الشكل 4 ، نوضح قياس أداء الكابت الانتقالي L7Ae ، المقتبس هنا من المنشور الأصلي متعدد النقل10. L7Ae هو بروتين ملزم للحمض النووي الريبي يتعرف على زخارف دوران التواء الحمض النووي الريبي (KT)20 ؛ عندما يتم وضع اثنين من KTs (2xKT) في المنطقة غير المترجمة 5 '(UTR) من mRNA ، يمكن قمع ترجمة إطار القراءة المفتوحة (ORF) بشكل فعال بواسطة L7Ae21. تم استخدام L7Ae سابقا لبناء مصنفات نوع الخلية القائمة على الحمض النووي الريبي21 والدوائر الأخرى القائمة على الحمض النووي الريبي22. لاختبار L7Ae عن طريق النقل المشترك القياسي ، يمكن للمرء ضبط نسب البلازميدات التي تشفر L7Ae ومراسلها المستهدف ضمن خلطات نقل مختلفة (الشكل 4A والجدول 3). بالنسبة للنقل المتعدد ، يجب على المرء أن يقدم بشكل مستقل L7Ae التأسيسي ومراسل 2xKT المقابل في خلطات نقل منفصلة ، بحيث يتم تسليم مجموعة واسعة من نسب البلازميد إلى الخلايا (الشكل 4B). بعد إجراء القياس الخلوي للتدفق والتدفق ، يمكن إجراء تحليل البيانات. لجعل البيانات قابلة للمقارنة ، يمكن للمرء أن يجمع نتائج النقل المشترك الفردية في مجموعة بيانات واحدة ، ثم إجراء تجميع متعدد الأبعاد مماثل لبيانات النقل المتعدد (الشكل 4C ، D). بمقارنة منحنيات الاستجابة للجرعة ل L7Ae التي تقمع مراسل الإخراج ، يمكن ملاحظة أن متوسط مستوى الإخراج لكل حاوية مشابه جدا بين بيانات النقل المشترك وبيانات النقل المتعدد (الشكل 4E-G).

بشكل عام ، رأينا أن بيانات النقل المتعدد ترتبط ارتباطا جيدا ببيانات النقل المشترك عبر نسب الحمض النووي الواسعة ، مع دقة أقل عند نسب جرعة الحمض النووي شديدة الانحراف (ويرجع ذلك جزئيا إلى انخفاض تغطية الخلايا في الصناديق لتجارب النقل المتعدد ، خاصة بالنسبة للأجزاء النشطة بشدة عند جرعات البلازميد المنخفضة). لتحسين دقة القياس لمثل هذه الأجزاء الحساسة ، يمكن تقليل مستوى تعبيرها باستخدام مروج أضعف ، أو إطارات قراءة مفتوحة المنبع18 ، أو موالفات دقيقة بوساطة إسكات الحمض النووي الريبي الدقيق (miSFITs) 19.

يوضح الشكل 5 تطبيقا ناجحا للانتقال المتعدد لتحسين مصنف نوع الخلية ، مقتبس مرة أخرى من Gam etal 10. المصنف هو تصميم بسيط نسبيا ينتج مخرجات استجابة للتعبير عن miR-21-5p ، وهو miRNA يتم التعبير عنه بشكل مفرط في العديد من الخلايا السرطانية23. في غياب miR-21 ، يتم قمع إخراج المصنف بواسطة قامع نسخ مشتق بكتيريا ، BM3R124 ، والذي ثبت سابقا أن تكيفه يعمل في خلايا الثدييات25. عندما يكون miR-21 موجودا ، فإنه يربط أربعة مواقع مستهدفة موضوعة في كل من UTRs 3 'و 5' من BM3R1 ، مما يؤدي إلى خفض تعبيره وبالتالي السماح بنسخ الإخراج (الشكل 5A). لتحسين هذا النظام ، تم تسليم مكونات الدائرة الثلاثة في مزيج نقل منفصل: (1) BM3R1 (مع مواقع مستهدفة miR-21) ، (2) مراسل الإخراج (mKO2) ، و (3) Gal4-VP16 ، الذي ينشط نسخ الإخراج (الجدول 4). لاحظ أن مروج الإخراج يعمل على المنطق (Gal4-VP16) وليس BM3R1 ، الذي يمنع الإخراج حتى في وجود Gal4-VP1625. يقوم كل جزء بتشفير علامة نقل ، TagBFP ، mNeonGreen ، و iRFP720 ، على التوالي ، على نفس البلازميد للإشارة إلى جرعة الحمض النووي النسبية لكل مركب. بشكل عام ، يجب أن تؤدي زيادة تعبير Gal4-VP16 إلى زيادة إخراج mKO2 للمراسل ، بينما يجب أن تؤدي زيادة تعبير BM3R1 إلى انخفاض إخراج mKO2. نظرا لأن BM3R1 يتم إسقاطه بواسطة miR-21-5p ، يجب أن يكون تعبير الإخراج أعلى في خلايا HeLa ، التي تحتوي على مستويات أعلى من miR-21-5p وبالتالي تعبر عن BM3R1 أقل من خلايا HEK.

بعد النقل المتعدد إلى كل من خلايا HEK293 و HeLa ، حصلنا على توزيع ثلاثي الأبعاد لنسب البلازميد المختلفة (الشكل 5B-HEK الخلايا). قام Gam et al.10 بأخذ عينات فرعية من هذا التوزيع بنسب مختلفة من خلال النظر في الخلايا داخل مسافة إقليدية معينة من نسبة الاهتمام. يجب أن تكون هذه المسافة واسعة بما يكفي لتشمل خلايا كافية للسماح بنتائج ذات دلالة إحصائية من التحليل ، ولكنها ضيقة بما يكفي لتجنب الضوضاء غير الضرورية من تضمين مجموعة واسعة جدا من نسب المكونات للأجزاء الثلاثة. ثم استخدم Gam et al.10 خوارزمية التحسين لتحديد نسبة الأجزاء التي زادت من دقة التصنيف للنقل المشترك (على سبيل المثال ، خلايا HeLa المنقولة موجبة لتعبير الإخراج بينما خلايا HEK المنقولة ليست كذلك). تم العثور على النسبة المثلى للأجزاء لتكون 10.9: 1.5: 1: Gal4-VP16: الإخراج: BM3R1 ؛ يتم عرض الخلايا الفرعية حول النسبة المثلى داخل مساحة النقل المتعدد بالكامل في الشكل 5C. تنبأت هذه العينة الفرعية أنه عند هذه النسبة ، تتمتع الدائرة المنقولة المشتركة بخصوصية 91٪ وحساسية 62٪ ودقة 77٪ عند تصنيف خلايا HEK293 مقابل خلايا HeLa (الشكل 5D). أسفر النقل المشترك مع ضبط نسب البلازميد على هذا المستوى الأمثل عن نتائج أفضل: خصوصية 99٪ ، حساسية 68٪ ، دقة84٪ 10. علاوة على ذلك ، وجهت النسب تنفيذ نسخة أحادية البلازميد من الدائرة ، مع ضبط التعبير النسبي باستخدام محفزات مبتورة مختلفة و ORFs المنبع (uORFs) ، مما ينتج عنه دائرة ذات خصوصية 91٪ وحساسية 90٪ ودقة 90٪10. وبالتالي ، فإن النقل المتعدد هو أداة قوية لتوجيه تصميم مصنفات الخلايا ودوائر الجينات على نطاق أوسع.

Figure 1
الشكل 1: مقارنة النقل المشترك والنقل المتعدد. (أ ، ب) نظرة عامة ومقارنة توصيل البلازميد مع النقل المشترك لاثنين من البلازميدات والنقل المتعدد لاثنين من البلازميدات. لكل طريقة من طرق النقل، يوضح الشكل الموجود في أقصى اليسار تكوين معقدات الانتقال بين الحمض النووي (DNA) السالب الشحنة والليبيدات الموجبة الشحنة. في هذه الأمثلة ، يشفر كل بلازميد ملون (أزرق وأحمر) تعبيرا عن بروتين فلوري مختلف. يوضح الرسم البياني المركزي أمثلة على توصيل البلازميد إلى الخلايا وأيضا تخطيطا للتوزيعات المتوقعة في الرسم البياني أو مخطط التشتت. تتوافق كثافة اللون على الرسم البياني مع التألق من لون البلازميد المقابل. يوضح الرسم البياني الموجود في أقصى اليمين بيانات حقيقية من الخلايا المنقولة باستخدام كل طريقة معينة. (أ) في النقل المشترك مع بلازميدين مختلفين ، يتم خلط كلا البلازميدات معا قبل إضافة كاشف النقل ، مما ينتج عنه تغليف شديد الترابط لنوعي البلازميد. في بيانات النقل المشترك الفعلية ، تظهر الخلايا توصيلا مترابطا لكل من البلازميدات (يمين). (ب) في النقل المتعدد ، يتم خلط كل مجموعة من البلازميدات المشتركة التوصيل المقابلة لجزء من الدائرة وعلامة النقل مع كاشف النقل بشكل منفصل ، مما ينتج عنه معقدات تحتوي على تلك البلازميدات فقط (يسار). في بيانات النقل المتعدد الفعلية ، تستكشف الخلايا نطاقا واسعا من مساحة التركيز مع العديد من القياسات المتكافئة المختلفة للبلازميد التي تم استكشافها في وقت واحد (يمين). تم تعديل هذا الرقم من10. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: سير عمل النقل المتعدد. الخطوة 1: حدد المشكلة. ابدأ بنظام يحتوي على أجزاء مكونة متعددة تكون النسبة المثالية بين الأجزاء غير معروفة ، واختر نسبة البداية بين الأجزاء المكونة. الخطوة 2: قم بإنشاء خلطات النقل. يحتوي كل مزيج نقل على مكون دائرة وعلامة نقل الفلورسنت. ترتبط كمية جزء الدائرة الذي يتم توصيله إلى الخلية بمضان العلامة. الخطوة 3: احتضان الخلايا. في سير عمل نموذجي ، نقوم باحتضان الخلايا لمدة 48 ساعة بين النقل وقياس التدفق الخلوي. الخطوة 4: قياس التدفق الخلوي. قم بتشغيل عناصر التحكم المناسبة، كما هو موضح في البروتوكول، ثم قم بتشغيل العينات. الخطوة 5: التحليل.استخدم علامات النقل لتجميع الخلايا وفقا لكمية أو نسب الأجزاء التي تلقتها الخلية. استخدم بروتين (بروتينات) الإخراج لقياس أداء الدائرة. ابحث عن صناديق / نسب الأجزاء التي تعمل على تحسين أداء الدائرة. الخطوة 6: كرر مع نسب الأجزاء المحسنة (اختياري). إذا كانت الصناديق / النسب المثلى بنسب منحرفة للغاية ، فقد لا يضيق النقل المتعدد التجريبي نسب الأجزاء المثلى بدقة. كرر النقل المتعدد بنسب أجزاء مضبوطة ، بحيث تتلقى الخلية التي تلقت كمية متساوية من كل مزيج نقل الآن نسبة قريبة من الأمثل من الأجزاء ، على النحو الذي تحدده الجولة السابقة. تم تعديل هذا الرقم من10. تم استخدام صورة الحاضنة من Servier Medical Art وصورة مقياس الخلايا من BioRender. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: نتائج تمثيلية إيجابية وسالبة متعددة النقل. (أ) النقل المشترك الجيد الأداء لاثنين من مراسلي الفلورسنت ، مما يدل على وجود ارتباط وثيق. تم رسم ما مجموعه 20000 خلية هنا وفي (ب) للمقارنة. إنها لفكرة جيدة إجراء نقل مشترك تجريبي صغير مماثل لاثنين من مراسلي الفلورسنت قبل البدء في تجربة النقل المتعدد ، للتأكد من أن البلازميدات مرتبطة جيدا داخل خلطات النقل. (ب) النقل المشترك الأكثر ضوضاء: لا ترتبط البلازميدات ارتباطا جيدا داخل كل مزيج نقل ، مما قد يتسبب في أن تكون علامات الفلورسنت في النقل المتعدد علامة ضعيفة لنسب البلازميد. (ج) نتائج نقل متعدد جيدة الأداء تظهر عددا جيدا للخلايا وكفاءة النقل والتعويض. د: انخفاض عدد الخلايا الحية، وهو ما لا يسمح بأخذ عينات فرعية في صناديق بها أعداد ذات دلالة إحصائية من الخلايا. (ه) ضعف كفاءة النقل، وهو ما لا يسمح بأخذ عينات فرعية في صناديق ذات أعداد ذات دلالة إحصائية من الخلايا. (F) عدم وجود تعويض مناسب ، مما يجعل بيانات التألق وكيلا ضعيفا لكمية البروتين الفلوري في النظام. استخدم عناصر تحكم أحادية اللون لتحديد مصفوفة تعويض خطية مثالية ، وقم بتطبيقها على البيانات قبل المعالجة الإضافية. يوصى أيضا باستخدام جميع عناصر التحكم في الألوان اعتمادا على اختيار البرنامج. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: قياس النقل المتعدد مقابل النقل المشترك. (أ) في النقل المشترك ، يمكن اختبار نسبة واحدة من الكابت الانتقالي L7Ae إلى بلازميدات المراسل الفلوري في كل بئر تجريبي. (ب) في النقل المتعدد ، يمكن اختبار العديد من نسب L7Ae إلى المراسلين في نفس البئر. انظر الجدول 3 للحصول على تفاصيل عن خلطات البلازميد متعددة النقل. (ج، د) سير عمل Binning لقياس النقل المتعدد مقابل عمليات النقل المشتركة المتعددة. تم تخصيص ما مجموعه 10 صناديق متباعدة بشكل كبير لكل بعد علامة نقل ، والتي تقارب مستويات كل من البلازميدات. هنا ، يتم عرض الصناديق التي تشير إلى مستويات مختلفة من البلازميد # 2. تم إجراء Binning على كل من مجموعة مجمعة من 11 عينة نقل مشترك تغطي نسب البلازميد المختلفة (C) وبيانات من نقل متعدد واحد ، يضم حوالي 500000 خلية لكل منها (D). تتوافق الألوان مع مجموعات الصناديق المحددة بواسطة مستويات الجين 2 (TagBFP). (E-G) قياس النقل المتعدد مقابل النقل المشترك لدائرة تمثيلية. تم تقييم متوسط مضان المخرجات للخلايا في كل حاوية ومقارنتها بين طرق النظام التمثيلي ، L7Ae قمع متعدية. (ه) تركيبات لقياس نشاط L7AE. يعمل مضان mKO2 كتقدير لتسليم L7Ae (الجين #1) ، بينما يعمل مضان TagBFP كتقدير لتسليم ناتج mNeonGreen المنظم (الجين #2). (F) منحنيات المعايرة بالتحليل الحجمي متعددة الأبعاد ل L7AE. يمثل كل سطر مجموعة الصناديق عند مستوى واحد من TagBFP ، كما هو موضح في (C) و (D). تشير الخطوط الصلبة إلى بيانات النقل المتعدد ، بينما تشير الخطوط المتقطعة إلى بيانات النقل المشترك. في كل مستوى مثبت من بلازميد المراسل ، ينخفض إنتاج المراسل مع زيادة L7AE. (ز) مقارنة بصرية بين النقل المشترك والنقل المتعدد لنظام L7AE. تمثل كل نقطة الناتج المقاس في الصناديق المقابلة لقياسات النقل المتعدد والنقل المشترك ، حيث تكون القيم المكافئة أكثر أقرب إلى الخط الأحمر 1: 1. بشكل عام ، الاختلافات التي لوحظت بين المشتقة من النقل المتعدد والنقل المشترك منخفضة ، مما يوفر الثقة في موثوقية طريقة النقل المتعدد. تم تعديل هذا الرقم من10. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تحليل البيانات للانتقال المتعدد. في النقل المتعدد ، يمكن تجميع الخلايا في صناديق أو شرائح للتحليل. يوضح الشكل 4 شكلا من أشكال التحليل حيث يتم ربط الخلايا في شرائح تتوافق مع مستويات مكون النظام ، مثل مستوى البلازميد المراسل ، والذي يمكن أن يكون مفيدا لتركيب النموذج وفهم استجابات الجرعة. استراتيجية أخرى مفيدة هي تحليل أداء الدائرة بنسب مختلفة من مكونات الدائرة. (أ) رسم تخطيطي لدائرة مصنف للتحسين. تتوافق مستويات TagBFP و NeonGreen و iRFP720 مع مستويات BM3R1 وإخراج mKO2 و Gal4-VP16 على التوالي. انظر الجدول 4 للحصول على تفاصيل عن خلطات البلازميد متعددة النقل. (ب) الإعداد التجريبي لخلطات النقل المتعدد. (ج) بيانات قياس التدفق الخلوي التي تم جمعها من النقل المتعدد مع الدائرة في (أ). مستويات كل من البروتينات الفلورية الثلاثة المراسل نتيجة للنقل المتعدد للدائرة إلى خلايا HEK ، مما يعرض النطاق الواسع لنسب مكونات الدائرة الموجودة في البيانات. تم الحصول على نتائج مماثلة من نقل الدائرة في كل من خلايا HEK و HeLa. (د) أخذ عينات فرعية من النقل المتعدد بنسبة معينة. لتحليل البيانات ، قمنا بمسح عدد كبير من النسب بين مكونات الدائرة وتحديد أداء المصنف عند كل نسبة. على سبيل المثال ، نعرض هنا نسبة معينة أظهرت أداء جيدا (Gal4-VP16 = 435 نانوغرام من الحمض النووي ، المراسل = 60 نانوغرام ، و BM3R1 = 40 نانوغرام). الرسم باللون الأزرق هو النسبة المقابلة لعلامات الفلورسنت لمكونات الدائرة الثلاثة المختلفة. بعد ذلك ، قمنا بأخذ عينات فرعية من البيانات من خلال النظر فقط في النقاط داخل مسافة إقليدية معينة من مسار التألق. قمنا بأخذ عينات فرعية من الخلايا في نفس المسار من كل من عمليات نقل HEK و HeLa. ه: مقارنة أداء الدائرة الكهربية في نفس المسار في خلايا HEK وخلايا HeLa. من خلال مقارنة الإحصائيات مثل الحساسية والنوعية ودقة التصنيف عبر العديد من النسب ، يمكن تحسين نسب المكونات لتوليد دائرة وراثية مثالية. تم تعديل هذا الرقم من10. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

معقد نانوغرام L7Ae البلازميد نانوغرام مراسل البلازميد OptiMEM (ميكرولتر) P3000 (ميكرولتر) ليبو 3000 (ميكرولتر)
1 250 75 1.5 1.5
2 250 75 1.5 1.5

الجدول 3: خلطات النقل المقابلة للشكل 4. تم نقل خلايا HEK293 متعددة مع خلطات النقل هذه في بئر واحد من صفيحة 24 بئرا.

معقد نانوغرام BM3R1 البلازميد نانوغرام Gal4-VP16 البلازميد نانوغرام مراسل البلازميد OptiMEM (ميكرولتر) P3000 (ميكرولتر) ليبو 3000 (ميكرولتر)
1 900 75 1.5 1.5
2 900 75 1.5 1.5
3 900 75 1.5 1.5

الجدول 4: خلطات النقل المقابلة للشكل 5. تم نقل كل من خلايا HEK293 و HeLa مع خلطات النقل هذه في بئر واحدة لكل منها لوحة من 6 آبار.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

أحدثت طرق النماذج الأولية السريعة مثل التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD) وألواح التجارب والطباعة ثلاثية الأبعاد 3D ثورة في تخصصات الهندسة الميكانيكية والكهربائية والمدنية. إن القدرة على البحث بسرعة من خلال العديد من الحلول الممكنة لتحد معين تسرع بشكل كبير من التقدم في مجال ما. نعتقد أن النقل المتعدد هو تقنية مماثلة للهندسة البيولوجية ، مما يتيح النماذج الأولية السريعة للدوائر الوراثية. بالإضافة إلى ذلك ، تتطلب تقنيات النماذج الأولية السريعة الأخرى تكرارا تسلسليا عمليا لحلول متعددة ممكنة ، في حين أن النقل المتعدد قادر على استكشاف العديد من الحلول في وقت واحد. يتيح النقل المتعدد اختبار عدد كبير من مجموعات نسب مكونات الدائرة الجينية في بئر واحد وقد تم استخدامه لتحسين العديد من الدوائر الجينية المنشورة10،11،13. البروتوكول التجريبي هو امتداد بسيط للنقل المشترك القياسي ، مما يسمح بالتبني المباشر من قبل العديد من الباحثين في خلايا الثدييات. بشكل عام ، يظهر اتفاق وثيق جدا بين نتائج النقل المتعدد والنقل المشترك10 (مثال على ذلك هو الشكل 4). وبالتالي ، يمكن استخدام poly-transfection في معظم الحالات التي يتم فيها معايرة نسب البلازميد داخل خلطات النقل المشترك ويتم قياس المخرجات على مستوى الخلية الواحدة.

يزداد تعقيد وحجم النقل المتعدد مع تعقيد الدوائر الجينية لتحسينها. مع زيادة عدد الأبعاد المراد تحليلها ، تزداد النسب التوافقية للأجزاء المختلفة وعدد الخلايا اللازمة لتحليلها بشكل كبير. على سبيل المثال ، لتحسين المصنف في الشكل 5 ، تم نقل الخلايا في شكل لوحة 6 آبار ، وتم جمع البيانات على ما لا يقل عن 1.5 مليون خلية حية. لقد قمنا أيضا بتحسين مصنف بمكون دائرة إضافي 10 ، مما يستلزم النقل بمقياس لوحة10 سم وجمع ملايين الخلايا. على هذا النطاق وما فوقه ، يستغرق إنتاج الحمض النووي وقتا طويلا ، وتكون كواشف النقل باهظة الثمن. ومع ذلك ، يستخدم النقل المتعدد أوامر أقل من الخلايا والحمض النووي وكواشف النقل من اختبار عدد مماثل من مجموعات نسبة مكونات الدائرة في الآبار الفردية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير قدر كبير من الوقت عن طريق إصدار أوامر من حيث الحجم أقل من مزيج النقل.

يتيح النقل المتعدد طرق تحليل متقدمة لبيانات قياس التدفق الخلوي. النهجان الرئيسيان هما (1) تجميع الخلايا وفقا لتعبير كل علامة نقل و (2) استخراج الخلايا بنسب محددة من علامات النقل ، وبالتالي محاكاة النقل المشترك. يختار الأول الخلايا التي تحتوي على مجموعة محددة من جرعة الحمض النووي لكل مركب (وبالتالي كل جزء) ، مما ينتج عنه وظائف نقل المدخلات والمخرجات. هذا الأخير يختار الخلايا في نسبة محددة من جرعات الحمض النووي لكل جزء ، ومحاكاة النقل المشترك في مثل هذه النسبة من كتل الحمض النووي البلازميد. يعطي رسم مستوى التعبير لمراسل (مراسلي) خرج الدائرة في التحديدات الفرعية مقياسا للمخرجات عند المستويات أو النسب المحددة للمدخلات. لتحسين الدائرة ، يمكن للمرء تحديد أفضل الصناديق / النسب أداء كما هو محدد من خلال الغرض من الدائرة - في حالة مصنفات الخلايا ، هذه هي الصناديق / النسب حيث تكون الدائرة قيد التشغيل في نوع الخلية المستهدفة وإيقاف التشغيل في أنواع الخلايا غير المستهدفة. عند اختيار حجم الحاوية ، ينبغي للمرء أن يأخذ في الاعتبار مستوى الدقة المطلوبة ، وكذلك عدد الخلايا لكل حاوية. تركز الصناديق الأصغر على المزيج المثالي من مكونات الدائرة بشكل أكثر دقة ، ولكن إذا كانت الحاوية تحتوي على عدد قليل جدا من الخلايا ، فيمكنها إدخال ضوضاء غير مرغوب فيها إلى القياسات.

قد تسهل التحسينات المستقبلية في التحليل الحسابي لبيانات النقل المتعدد التحسين حتى مع انخفاض تغطية الخلايا لكل حاوية / نسبة. في الوقت الحالي ، نستبعد البيانات من الصناديق التي تحتوي على أقل من عتبة محددة من الخلايا (على سبيل المثال ، 10) لتجنب القياسات الصاخبة بشكل مفرط. بالاقتران مع القياسات المتكررة ، يتيح ذلك إجراء حسابات أكثر دقة ودقة لمنحنيات استجابة الجرعة ، ودقة المصنف ، والمقاييس الأخرى المحددة على أساس كل حاوية. ومع ذلك ، يمكن اعتبار كل خلية في poly-transfection تجربة مستقلة ، تقيس بدقة دقيقة مخرجات (مخرجات) الدائرة على مستوى دقيق من المدخلات. مع وضع ذلك في الاعتبار ، يمكن أن تتناسب النماذج الميكانيكية والنمط الظاهري لاستجابات الجرعة وتحسين الدوائر بشكل مباشر مع توزيع التعبير الجيني من كل علامة ومراسل ، بدلا من إحصاءاتها الموجزة10. يتيح ذلك قياسات أكثر قوة ويستفيد من العديد من نقاط البيانات الفردية التي تم جمعها لكل تجربة. وبالتالي يمكن أن تسفر نهج النمذجة هذه عن توصيف الدوائر التنبؤية وتحسينها حتى مع أخذ عينات قليلة من عمليات النقل المتعددة عالية الأبعاد. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام طرق التعلم الآلي مثل منهجية سطح الاستجابة والانحدار العشوائي للغابات لتحليل البيانات المتفرقة نسبيا وعالية الأبعاد10.

نهج بديل لعمليات النقل المتعددة الكبيرة بشكل متزايد هو تحسين الدوائر بالتتابع باستخدام التسلسلات الهرمية لعمليات النقل المتعددة. في هذا النهج ، أولا ، يتم استخدام النقل المتعدد لتحسين وحدة تضم مجموعة فرعية من المكونات الجينية داخل دائرة أكبر. بعد ذلك ، يتم تسليم هذه الوحدات المحسنة كمزيج منفصل متعدد النقل ، مما يتيح للمرء العثور على النسبة / الجرعة المثلى لكل وحدة دائرة. يستخدم هذا النهج عددا أقل بكثير من الخلايا والحمض النووي وكواشف النقل. ومع ذلك ، فإن مجموعات المكونات ليست بالضرورة معيارية فيما يتعلق بالمكونات الأخرى ، وبالتالي فإن النسبة المثلى للأجزاء المكونة في وحدة مقاسة بمعزل عن بعضها البعض يمكن أن تكون دون المستوى الأمثل في سياق الدائرةالأكبر 8.

طرق النقل المتعدد محدودة أيضا بتكوين الليزر / المرشح لمقياس التدفق الخلوي المستخدم لجمع البيانات. بالإضافة إلى مخرجات الفلورسنت المقاسة ، يحتوي كل مزيج نقل على علامة بروتين فلورية. وبالتالي ، من الأهمية بمكان اختيار البروتينات الفلورية التي يمكن تعويضها بشكل جيد على مقياس الخلايا. لقد قمنا سابقا بتحليل منهجي لنزيف لوحة من 22 بروتينا فلوريا على مقياس تدفق خلوي بخمسة ليزر (BD LSRFortessa) ، ووجدنا أن مجموعة Sirius و TagBFP و mNeonGreen و mKO2 و iRFP720 يمكن استخدامها معا وتعويضها جيدا دون مشاكل كبيرة10. ومع ذلك ، قد يتطلب تحسين الدوائر الأكبر طرقا متقدمة لقياس الخلايا ، مثل القياس الخلوي الطيفي لفصل البروتينات الفلورية ذات الأطياف الأكثر تداخلا ، والتي يقوم مختبرنا حاليا بتحسينها باستخدام ما يصل إلى ثمانية بروتينات فلورية. قواعد البيانات مثل قاعدة بيانات البروتين الفلوري (https://www.fpbase.org) مفيدة لاختيار البروتينات الفلورية ذات التداخل الطيفي الخاص. ومع ذلك ، يمكن أن تكون هذه العملية معقدة بسبب عوامل مختلفة ، بعضها خاص بمقاييس خلوية معينة. على سبيل المثال ، قد يؤدي استخدام بعض البروتينات الحمراء مثل tdTomato إلى نزيف غير مرغوب فيه في القنوات الزرقاء فقط في تكوينات ليزر / مرشحمعينة 10. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت العديد من البروتينات الحمراء البعيدة علاقات غير خطية بين جرعة الحمض النووي وإخراج مضان10 ، مما يقلل من استخدامها كعلامات فعالة لجرعة الحمض النووي.

من أجل الاتساق عبر التجارب التي يتم إجراؤها بأعداد متفاوتة من المجمعات (واحد ، اثنان ، ثلاثة ، إلخ) ، من المفيد استخدام نفس الكمية الكسرية من البلازميد لكل مزيج نقل. على سبيل المثال ، إذا اختبر نظاما ثلاثي الجينات مع كل جين مشفر في واحد من ثلاثة بلازميدات (A و B و C) ، يمكن للمرء أن يشارك في نقل بلازميدات الدائرة بنسبة 1: 1: 1 جنبا إلى جنب مع نسبة متساوية من البلازميد الذي يشفر علامة النقل. هذا من شأنه أن يجعل كل بلازميد ربع الكتلة الكلية للمزيج ، وبالتالي ما يقرب من ربع كتلة كل مركب نقل يتم تشكيله. عند النقل المتعدد A و B و C في مجمعات منفصلة مع مراسليهم ، بدلا من خلط البلازميدات 1: 1 مع المراسلين أو الحفاظ على كتلة الحمض النووي الإجمالية ، يكون من الأكثر اتساقا الحفاظ على كل بلازميد عند ربع كتلة كل مركب ، مع أخذ الحمض النووي للحشو الكتلة المتبقية (انظر الجدول 5 للحصول على أمثلة). وذلك لأن توزيع التعبير الجيني بين الخلايا المنقولة يعتمد بشكل أقل على الكتلة الكلية للحمض النووي الذي يتم تسليمه في المعقدات، وأكثر على الكمية الكسرية للحمض النووي في كل مركب10. إذا كانت النسب الأخرى غير 1: 1: 1 مطلوبة ، احسب الكسور المقابلة من إجمالي كتلة الحمض النووي في مزيج النقل لكل جزء. على سبيل المثال، يوضح الجدول 5 [أسفل] نسبة 1:1:4.

أسلوب معقد نانوغرام أ (كسر) نانوغرام ب (كسر) نانوغرام ج (كسر) نانوغرام مراسل (كسر) نانوغرام حشو الحمض النووي (جزء) المجموع (نانوغرام)
النقل المشترك 1 150 (¼) 150 (¼) 150 (¼) 150 (¼) 0 (0) 600
بولي ترانسفيشن 600
→ 1 50 (¼) 50 (¼) 100 (½) 200
→ 2 50 (¼) 50 (¼) 100 (½) 200
→ 3 50 (¼) 50 (¼) 100 (½) 200
النقل المشترك 1 75 (⅛) 75 (⅛) 300 (½) 150 (¼) 0 (0) 600
بولي ترانسفيشن 600
→ 1 25 (⅛) 50 (¼) 125 (⅝) 200
→ 2 25 (⅛) 50 (¼) 125 (⅝) 200
→ 3 100 (½) 50 (¼) 50 (¼) 200

الجدول 5: أمثلة على استخدام الحمض النووي للحشو من أجل الاتساق عبر تجارب النقل المشترك والمتعدد. ويوضح هنا مثالان عامان على النقل المشترك لثلاثة بلازميدات بنفس الكمية من الحمض النووي للحشو. في المثال العلوي، جميع البلازميدات متساوية الكتلة. في المثال السفلي ، يتم تسليم بلازميد واحد بكتلة أعلى مقارنة بالآخرين. يتم تحويل جزء الحمض النووي الكلي الذي سيتم استخدامه في مجمع النقل المشترك إلى معقدات متعددة النقل ، مع الكمية المتبقية من الحمض النووي (حتى الكمية الإجمالية لكل مركب ، والتي تكون ثابتة ومتساوية عبر المجمعات) تتكون من الحمض النووي للحشو.

الهدف العام من الحمض النووي للحشو هو الحفاظ على جرعات مماثلة من البلازميدات لكل خلية ، بغض النظر عن عدد خلطات النقل الفريدة. كتقريب خام لهذا المبدأ ، فإن فصل ثلاثة بلازميدات إلى ثلاثة خلطات مع الحفاظ على نفس كتلة الحمض النووي لكل منها (والنسبة المناسبة لكاشف النقل) يقلل من النسبة المئوية للخلايا التي تتلقى معقدا معينا بمقدار الثلث مقارنة بمزيج واحد يحتوي على جميع البلازميدات الثلاثة. ومع ذلك ، تتلقى كل خلية منقولة لاحقا جرعة جينية أعلى ~ 3x. وبالتالي ، فإن تقليل الكمية النسبية للبلازميدات وحدها بدون حشو الحمض النووي غير كاف للحفاظ على جرعات البلازميد المتسقة ، لأن هذا يقلل ببساطة من كفاءة النقل دون تغيير التوزيع الأساسي للتعبير بين الخلايا المنقولة10. من ناحية أخرى ، يسمح الحمض النووي للحشو بضبط جرعة الحمض النووي دون التأثير على كفاءة النقل الإجمالية (على الرغم من أن الخلايا المنقولة التي يمكن اكتشافها قد تنخفض بسبب انخفاض الإشارة)10. باتباع التقريب الخام أعلاه ، فإن تقليل جزء الحمض النووي في مزيج النقل المتعدد إلى الثلث وإضافة الحمض النووي للحشو يحافظ على جرعات الجينات النسبية مقارنة بالنقل المشترك الأصلي. وبالتالي ، يضمن حشو الحمض النووي تكوين مجمع نقل فعال ودقيق.

لتغيير نطاق التعبير عن الجين محل الاهتمام الذي يغطيه مراسله ، يمكن ضبط جزء كل اختبار بلازميد و / أو مروجين يستخدم لدفع الجين هناك بالنسبة إلى المراسل. إذا كان الجزء قويا / نشطا للغاية عند جرعات منخفضة من الحمض النووي ، فإن استخدام جزء أقل من الحمض النووي يمكن أن يساعد في توسيط النطاق الديناميكي للجزء في منتصف التوزيع الفلوري للمراسل في الخلايا المنقولة. وبالمثل ، بالنسبة للأجزاء الضعيفة / النشطة فقط عند جرعات عالية من الحمض النووي ، يمكن أن يكون استخدام جزء أعلى مفيدا. ومع ذلك ، يجب توخي الحذر مع مثل هذا الضبط ، لأن تقليل كسور الحمض النووي أكثر من اللازم يزيد من عشوائية التسليم إلى الخلايا مقارنة بالمراسل10 ، ويمكن أن تؤدي مستويات التعبير الجيني العالية إلى زيادة التحميل على آلية التعبير الجيني الخلوي12,14. لتجنب الاستوكاسات، وفي الحالات التي يتم فيها تسليم كل جين إلى الخلايا بنسبة ثابتة (على سبيل المثال، إذا كان سيتم إنشاء الدائرة كناقل واحد للعدس أو PiggyBac أو Landing Pad)، يمكن ضبط التعبير النسبي لكل جين باستخدام محفزات أقوى/أضعف، و uORFs18 الصغيرة، و / أو miSFITs19.

على الرغم من أن البروتوكول يصف تقنية النقل العكسي ، إلا أن النقل المتعدد ممكن أيضا مع النقل الأمامي. في النقل العكسي ، يتم زرع الخلايا ونقلها في وقت واحد. في النقل الأمامي ، يتم نقل الخلايا ~ 24 ساعة بعد الطلاء الأول بحوالي نصف الكثافة التي سيتم استخدامها في النقل العكسي (للسماح بانقسام الخلايا بحلول وقت النقل). بشكل عام ، يكون النقل العكسي أكثر كفاءة ولكنه أيضا أكثر سمية ، وقد لاحظنا بعض الاختلافات في شكل توزيعات النقل بناء على الكاشف ووقت النقل وخط الخلية. وبالتالي ، يجب تحسين طريقة النقل المفضلة لكل خط خلية لزيادة عدد الخلايا المنقولة وتغطية مساحة التركيز متعددة الأبعاد لجرعات البلازميد لكل خلية.

بشكل عام ، يتيح النقل المتعدد التحسين السريع للدوائر الوراثية للثدييات. يمكن اختبار العديد من مجموعات القياس النسبي الممكنة لمكونات الدائرة بسهولة في بئر واحدة. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن النقل المتعدد يحتوي على مزيد من المعلومات حول مستويات كل جزء في النظام أكثر من النقل التقليدي ، فقد وجد أنه ذو قيمة عالية لتوصيف سلوك الأجزاء الجينية المختلفة10،11،12،13. ومن المتوقع أن يؤدي اعتماد النقل المتعدد إلى تسريع وتيرة تطوير دوائر جينية جديدة ومحسنة لاستخدامها في خلايا الثدييات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

RW هو أحد مؤسسي Strand Therapeutics و Replay Bio. قدم RW و RJ براءة اختراع مؤقتة تتعلق بمصنف نوع الخلية.

Acknowledgments

نود أن نشكر أعضاء مختبر فايس السابقين الذين قادوا أو ساهموا في تطوير طريقة النقل المتعدد وتطبيقها على مصنفات الخلايا: جيريمي جام وبري دي أندريث وجين هوه. أعضاء مختبر فايس الآخرين الذين ساهموا في مزيد من تطوير / تحسين الطريقة: Wenlong Xu و Lei Wang و Christian Cuba-Samaniego ؛ البروفيسور جوش ليونارد وأعضاء المجموعة ، بما في ذلك باتريك دوناهو وهيلي إدلشتاين ، لاختبار النقل المتعدد وتقديم الملاحظات ؛ والبروفيسور نيكا شكيبا لدعوته هذه المخطوطة وتقديم ملاحظاته. نود أيضا أن نشكر المعاهد الوطنية للصحة [R01CA173712 ، R01CA207029 ، P50GM098792] ؛ المؤسسة الوطنية للعلوم [1745645]؛ منحة دعم مركز السرطان (الأساسية) [P30CCA14051 ، جزئيا] من المعهد الوطني للسرطان والمعاهد الوطنية للصحة [P50GM098792] لتمويل هذا العمل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15mL Corning Falcon conical tubes ThermoFisher Scientific 14-959-53A
24-well petri dish Any company of choice (Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free)
Bovine serum albumin NEB B9000S
Centrifuge Any company of choice Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf
Countess 3 Automated Cell Counter ThermoFisher Scientific AMQAX2000
Countess Cell Counting Chamber Slides ThermoFisher Scientific C10228
Cytoflow Non-commercial software package https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/# 
DMEM VWR 10-013-CV Use the correct media for your cell type
EDTA  ThermoFisher Scientific 03690-100ML
Fetal bovine serum Sigma Aldrich F4135
HEK cells ATCC CRL-1573 Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently.
HeLa cells ATCC CRL-12401 Use the relevant cell type for your experiments.
Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer ThermoFisher Scientific L3000001 Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent
LSRFortessa flow cytometer BD Biosciences N/A
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Gibco 11140050
Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL Any company of choice
Opti-MEM ThermoFisher Scientific 31985070 reduced serum medium
Phosphate buffered saline ThermoFisher Scientific 70011044
Rainbow calibration beads Spherotech URCP-100-2H
Sodium azide Sigma Aldrich S2002
Trypsin VWR 25-053-CI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prochazka, L., Benenson, Y., Zandstra, P. W. Synthetic gene circuits and cellular decision-making in human pluripotent stem cells. Current Opinion in Systems Biology. 5, 93-103 (2017).
  2. Sayeg, M. K., et al. Rationally designed microRNA-based genetic classifiers target specific neurons in the brain. ACS Synthetic Biology. 4 (7), 788-795 (2015).
  3. Zhen, X., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. Multi-Input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells. Science. 333 (6047), 1307-1311 (2011).
  4. Nissim, L., et al. Synthetic RNA-based immunomodulatory gene circuits for cancer immunotherapy. Cell. 171 (5), 1138-1150 (2017).
  5. Nissim, L., Bar-Ziv, R. H. A tunable dual-promoter integrator for targeting of cancer cells. Molecular Systems Biology. 6, 444 (2010).
  6. Mohammadi, P., Castel, S. E., Brown, A. A., Lappalainen, T. Quantifying the regulatory effect size of cis-acting genetic variation using allelic fold change. Genome Research. 27 (11), 1872-1884 (2017).
  7. Prochazka, L., et al. Discrete-to-analog signal pluripotent stem cells conversion in human. BioRxiv. , (2021).
  8. Del Vecchio, D. Modularity, context-dependence, and insulation in engineered biological circuits. Trends in Biotechnology. 33 (2), 111-119 (2015).
  9. Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell. Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).
  10. Gam, J. J., DiAndreth, B., Jones, R. D., Huh, J., Weiss, R. A 'poly-transfection' method for rapid, one-pot characterization and optimization of genetic systems. Nucleic Acids Research. 47 (18), 106 (2019).
  11. Jones, R. D., et al. Robust and tunable signal processing in mammalian cells via engineered covalent modification cycles. Nature Communications. 13 (1), 1720 (2022).
  12. Jones, R. D., et al. An endoribonuclease-based feedforward controller for decoupling resource-limited genetic modules in mammalian cells. Nature Communications. 11 (1), 5690 (2020).
  13. DiAndreth, B., Wauford, N., Hu, E., Palacios, S., Weiss, R. PERSIST platform provides programmable RNA regulation using CRISPR endoRNases. Nature Communications. 13 (1), 2582 (2022).
  14. Frei, T., et al. Characterization and mitigation of gene expression burden in mammalian cells. Nature Communications. 11 (1), 4641 (2020).
  15. Beal, J., Weiss, R., Yaman, F., Adler, A., Davidsohn, N. A method for fast, high-precision characterization of synthetic biology devices. Computer Science and Artificial Intelligence Laboratory Technical Report. Massachusetts institute of technology. , Cambridge. MIT-CSAIL-TR-2012-008 (2012).
  16. Beal, J., et al. Meeting measurement precision requirements for effective engineering of genetic regulatory networks. ACS Synthetic Biology. 11 (3), 1196-1207 (2022).
  17. Teague, B. Cytoflow: A Python toolbox for flow cytometry. bioRxiv. , (2022).
  18. Ferreira, J. P., Overton, K. W., Wang, C. L. Tuning gene expression with synthetic upstream open reading frames). Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11284-11289 (2013).
  19. Michaels, Y. S., et al. Precise tuning of gene expression levels in mammalian cells. Nature Communications. 10 (1), 818 (2019).
  20. Saito, H., et al. Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch. Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).
  21. Wroblewska, L., et al. Mammalian synthetic circuits with RNA binding proteins for RNA-only delivery. Nature Biotechnology. 33 (8), 839-841 (2015).
  22. Wagner, T. E., et al. Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells. Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043-1050 (2018).
  23. Sekuklu, S. D., Donoghue, M. T. A., Spillane, C. miR-21 as a key regulator of oncogenic processes. Biochemical Society Transactions. 37, 918-925 (2009).
  24. Stanton, B. C., et al. Genomic mining of prokaryotic repressors for orthogonal logic gates. Nature Chemical Biology. 10 (2), 99-105 (2014).
  25. Stanton, B. C., et al. Systematic transfer of prokaryotic sensors and circuits to mammalian cells. ACS Synthetic Biology. 3 (12), 880-891 (2014).

Tags

الهندسة الحيوية ، العدد 192 ، البيولوجيا التركيبية ، الدوائر الجينية ، مصنف الخلايا ، تحسين الإنتاجية العالية ، النماذج الأولية السريعة للدوائر الجينية ، النقل ، تحليل قياس التدفق الخلوي
التطور السريع لدوائر تحديد حالة الخلية باستخدام النقل المتعدد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wauford, N., Jones, R., Van De Mark, … More

Wauford, N., Jones, R., Van De Mark, C., Weiss, R. Rapid Development of Cell State Identification Circuits with Poly-Transfection. J. Vis. Exp. (192), e64793, doi:10.3791/64793 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter