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Bioengineering

Poly-transfection을 이용한 세포 상태 식별 회로의 신속한 개발

Published: February 24, 2023 doi: 10.3791/64793
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 1,3
1Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2School of Biological Engineering, University of British Columbia, 3Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology

Summary

복잡한 유전 회로는 설계, 테스트 및 최적화에 시간이 많이 걸립니다. 이 과정을 촉진하기 위해 포유류 세포는 단일 웰에서 회로 구성 요소의 여러 화학량론을 테스트할 수 있는 방식으로 형질감염됩니다. 이 프로토콜은 실험 계획, transfection 및 데이터 분석을 위한 단계를 간략하게 설명합니다.

Abstract

포유류의 유전 회로는 광범위한 질병 상태를 감지하고 치료할 수 있는 잠재력을 입증했지만 회로 구성 요소 수준의 최적화는 여전히 어렵고 노동 집약적입니다. 이 과정을 가속화하기 위해 우리 연구실은 전통적인 포유류 형질감염의 고처리량 확장인 폴리 형질감염을 개발했습니다. 폴리형질감염에서 형질주입된 집단의 각 세포는 본질적으로 서로 다른 실험을 수행하여 서로 다른 DNA 복제 수에서 회로의 거동을 테스트하고 사용자가 단일 포트 반응에서 많은 수의 화학량론을 분석할 수 있도록 합니다. 지금까지, 세포의 단일 웰에서 3성분 회로의 비율을 최적화하는 폴리-형질감염이 입증되었다; 원칙적으로 더 큰 회로를 개발하는 데 동일한 방법을 사용할 수 있습니다. 폴리형질주입 결과는 일시적인 회로를 위한 동시 형질감염에 대한 DNA의 최적 비율을 찾거나 안정적인 세포주 생성을 위한 회로 성분에 대한 발현 수준을 선택하기 위해 쉽게 적용할 수 있습니다.

여기서는 3성분 회로를 최적화하기 위해 폴리 트랜스펙션을 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 실험 설계 원칙으로 시작하여 폴리 트랜스펙션이 전통적인 공동 트랜스펙션 방법을 기반으로 하는 방법을 설명합니다. 다음에, 세포의 폴리형질감염을 수행하고, 며칠 후에 유세포 분석을 수행한다. 마지막으로, 데이터는 특정 성분 비율을 가진 세포의 하위 집합에 해당하는 단일 세포 유세포 분석 데이터의 슬라이스를 검사하여 분석됩니다. 실험실에서 폴리-트랜스펙션은 세포 분류자, 피드백 및 피드포워드 컨트롤러, 쌍안정 모티프 등을 최적화하는 데 사용되었습니다. 이 간단하지만 강력한 방법은 포유류 세포의 복잡한 유전 회로에 대한 설계 주기를 단축합니다.

Introduction

포유류 합성 생물학 분야는 배양된 세포주에서 간단한 감지 및 반응 부분을 개발하는 것부터 진단 및 치료의 실제 문제를 해결하기 위한 복잡한 유전자 네트워크의 최적화에 이르기까지 빠르게 발전했습니다1. 이러한 정교한 회로는 microRNA 프로파일에서 사이토카인, 저분자 약물에 이르기까지 생물학적 입력을 감지하고 트랜지스터, 대역 통과 필터, 토글 스위치 및 발진기를 포함한 논리 처리 회로를 구현할 수 있습니다. 그들은 또한 암, 관절염, 당뇨병 등과 같은 질병의 동물 모델에서 유망한 결과를 보여주었습니다 1,2,3,4,5. 그러나 회로의 복잡성이 증가함에 따라 각 구성 요소의 레벨을 최적화하는 것이 점점 더 어려워지고 있습니다.

유전 회로의 특히 유용한 유형 중 하나는 세포 상태를 감지하고 반응하도록 프로그래밍할 수 있는 세포 분류기입니다. 특정 세포 상태에서 단백질 또는 RNA 산출물의 선택적 생산은 세포와 오가노이드의 분화를 유도 및 프로그래밍하고, 병든 세포 및/또는 바람직하지 않은 세포 유형을 식별 및 파괴하고, 치료 세포의 기능을 조절하는 강력한 도구입니다 1,2,3,4,5 . 그러나 여러 세포 RNA 및/또는 단백질 종에서 세포 상태를 정확하게 분류할 수 있는 포유류 세포에서 회로를 만드는 것은 매우 어려운 일이었습니다.

세포 분류 회로를 개발하는 데 가장 시간이 많이 소요되는 단계 중 하나는 회로 내에서 센서 및 처리 인자와 같은 개별 구성 요소 유전자의 상대적 발현 수준을 최적화하는 것입니다. 회로 최적화를 가속화하고 보다 정교한 회로의 구축을 허용하기 위해, 최근 연구에서는 최적의 조성 및 토폴로지를 예측하기 위해 셀 분류기 회로 및 그 구성 요소의 수학적 모델링을 사용했습니다(6,7). 이것은 지금까지 강력한 결과를 보여주었지만 수학적 분석은 회로에서 구성 요소 유전자의 입출력 거동을 체계적으로 특성화해야 하는 필요성으로 인해 시간이 많이 걸리기 때문에 제한적입니다. 또한, 복잡한 유전 회로에서 무수히 많은 문맥 의존적 문제가 나타날 수 있으며, 이로 인해 전체 회로의 동작이 개별 부분 특성화에 기초한 예측을 무시하게 됩니다(8,9).

세포 상태 분류기와 같은 복잡한 포유류 회로를 보다 신속하게 개발하고 테스트하기 위해 우리 연구실은 플라스미드 공동 형질주입 프로토콜의 진화인 폴리 형질감염10이라는 기술을 개발했습니다. 동시 형질감염에서 여러 플라스미드 DNA 종은 양전하를 띤 지질 또는 고분자 시약과 함께 복합체화된 다음 상관관계가 있는 방식으로 세포에 전달됩니다(그림 1A). 폴리형질감염에서, 플라스미드는 시약과 개별적으로 복합체화되어, 각각의 형질주입 복합체로부터의 DNA가 비상관된 방식으로 세포에 전달된다 (도 1B). 이 방법을 사용하여, 형질주입된 집단 내의 세포는 상이한 회로 성분을 운반하는 2개 이상의 DNA 페이로드 비율의 수많은 조합에 노출된다.

각각의 세포에 전달되는 회로 성분의 비율을 측정하기 위해, 폴리형질주입 내의 각각의 형질주입 복합체는 복합체의 세포 흡수에 대한 프록시로서 기능하는 구성적으로 발현된 형광 리포터를 함유한다. 포유동물 세포 내에서 활성인 어떠한 요소도 함유하지 않는 필러 DNA는 단일 형질감염 복합체에서 세포에 전달되는 형광 리포터 및 회로 성분의 상대적인 양을 조정하기 위해 사용되며, 논의에서 더 상세히 논의된다. Weiss 연구실에서 사용되는 필러 DNA의 예로는 터미네이터 서열을 포함하지만 프로모터, 코딩 서열 등을 포함하지 않는 플라스미드가 있습니다. 그런 다음 회로 구성 요소의 비율이 다른 세포를 비교하여 유전자 회로 기능에 대한 최적의 비율을 찾을 수 있습니다. 이는 차례로 유전자 통합을 위해 회로 구성 요소를 단일 벡터(예: 렌티바이러스, 트랜스포존 또는 랜딩 패드)로 결합할 때 최적의 유전자 발현 수준을 달성하기 위해 프로모터 및 기타 회로 요소를 선택하는 데 유용한 예측을 제공합니다. 따라서 직관에 따라 또는 시간이 많이 소요되는 시행착오 과정을 통해 회로 구성 요소 간의 비율을 선택하는 대신 poly-transfection은 단일 포트 반응에서 유전 부분 간의 광범위한 화학량론을 평가합니다.

우리 연구실에서 폴리 형질 감염은 세포 분류자, 피드백 및 피드 포워드 컨트롤러, 쌍안정 모티프를 포함한 많은 유전 회로의 최적화를 가능하게했습니다. 이 간단하지만 강력한 방법은 포유류 세포의 복잡한 유전 회로에 대한 설계 주기를 크게 단축합니다. 폴리-형질감염(Poly-transfection)은 이후 여러 유전 회로를 특성화하여 고분해능(high resolution)에서 다차원 입출력 전달 함수(input-output transfer function)를 밝히고(10), 세포 상태 분류(cell state classification)11를 위한 대체 회로 토폴로지(alternate circuit topology)를 최적화하며, 다양한 발표된12,13 및 진행 중인 프로젝트를 가속화하는 데 사용되었다.

여기서는 유전자 회로를 신속하게 최적화하기 위해 폴리 트랜스펙션을 사용하는 워크플로우를 설명하고 묘사합니다(그림 2). 이 프로토콜은 고품질 poly-transfection 데이터를 생성하고 poly-transfection 프로토콜 및 데이터 분석에서 몇 가지 일반적인 오류를 방지하는 방법을 보여줍니다(그림 3). 그런 다음 poly-transfection을 사용하여 간단한 회로 구성 요소를 특성화하고 그 과정에서 co-transfection에 대한 poly-transfection 결과를 벤치마킹하는 방법을 보여줍니다(그림 4). 마지막으로, 폴리형질감염의 결과는 암 분류자 회로의 최적화를 보여준다(도 5).

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Protocol

참고: 표 1 과 표 2 는 이 프로토콜에 대한 중요한 참조 역할을 합니다. 표 1 은 반응에 대한 시약 스케일링을 보여주고, 표 2 는 프로토콜에 기술된 폴리형질감염의 예(상반부) 및 가능한 후속 실험(하반부)에 대한 DNA 비율 산술을 나타낸다.

1. 형질주입을 위한 세포 준비

  1. 프로토콜을 시작하기 전에 인간 배아 신장(HEK293) 세포의 배양이 60%-80% 융합되는지 확인합니다. 이렇게 2일 전에 100 mm x 15 mm 조직 배양 페트리 디쉬에6 x 10 세포를 시딩하고, 5%CO2와 함께 37°C에서 배양한다.
    참고: 당사의 프로토콜은 HEK293 세포에 중점을 두고 있지만 다른 세포 유형으로 대체될 수 있습니다.
  2. 형질주입을 위한 배지 및 세포를 하기에 기재된 바와 같이 준비한다.
    1. 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 비필수 아미노산(NEAA; 재료 표 참조)을 갖는 Dulbecco's modified eagle medium(DMEM)의 용액을 최소 20 mL 37°C로 예열한다. 적어도 2.4 mL의 트립신 및 2.4 mL의 인산염 완충 식염수 (PBS)를 37°C로 예열한다. 예열은 혈청 배지를 ~16°C로 감소시켰습니다.
      알림: 모든 조직 배양 작업은 생물 안전 캐비닛에서 주의해서 수행해야 합니다.
  3. 아래에 설명된 대로 DMEM 용액에서 세포를 재현탁합니다.
    1. 현재 미디어를 흡인하고 폐기하십시오. HEK293 세포 배양액에 PBS 2mL를 분주하여 세포를 세척합니다. PBS를 흡인하고 폐기하십시오.
    2. HEK293 세포 배양액에 트립신 2mL를 분주합니다. 페트리 접시를 37°C의 인큐베이터에 3분 동안 또는 세포가 더 이상 접시에 부착되지 않을 때까지 놓습니다. 접시를 생물 안전 캐비닛으로 되돌리고 8mL의 DMEM 용액을 플레이트에 분배하여 세포 용액을 희석합니다.
    3. 부드럽게 위아래로 여러 번 피펫팅하여 용액을 혼합합니다. 모든 배지를 흡인하고 15mL 원뿔형 튜브에 넣습니다.
  4. 세포를 300 x g 에서 3분 동안 원심분리하여 펠릿화합니다. 배지를 흡인하고(세포를 흡인하지 않도록 주의) 폐기합니다. 5mL의 DMEM 용액에 세포를 재현탁하고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다.
  5. 자동화된 세포 계수기( 재료 표에 나열됨)를 사용하여 현재 세포 농도를 추정합니다. 1 x 105 세포(50,000 cells/cm2의 파종 밀도의 경우)가 있는 24웰 플레이트에 6개의 웰(이 예에서)을 시드합니다.
  6. DMEM 용액을 최대 500μL까지 추가하고(먼저 웰에 DMEM 용액 추가) 처리당 하나의 웰에 색상 제어 없음, mKO2 제어, TagBFP 제어, NeonGreen 제어, 모든 색상 제어 및 폴리-형질감염 1로 라벨을 붙입니다. TagBFP, mKO2 및 NeonGreen 대조군 웰은 폴리 트랜스펙션에 포함된 모든 형광 단백질에 대한 단색 대조군입니다.

2. 형질주입 수행

  1. 각 DNA 응집체에 대한 튜브를 준비하십시오. 1.5mL 미세 원심분리기 튜브를 따로 보관하고 튜브에 색상 제어 없음, mKO2 제어, TagBFP 제어, NeonGreen 제어, 모든 색상 제어, 폴리 트랜스펙션 믹스 1 및 폴리 트랜스펙션 믹스 2로 라벨을 붙입니다.
    1. 36μL의 환원된 혈청 배지를 무색 대조군, mKO2 대조군, TagBFP 대조군, NeonGreen 대조군 및 모든 색상 대조군 튜브에 추가합니다. 18 μL의 환원된 혈청 배지를 각각의 폴리형질주입 믹스 1 및 폴리형질주입 믹스 2 튜브에 첨가한다.
      참고: 플라스미드 농도는 150ng/μL로 가정합니다.
    2. 600ng의 필러 플라스미드를 무색 조절 튜브에 추가합니다. mKO2 색상 제어 튜브에 mKO2 300ng과 필러 플라스미드 300ng을 추가합니다. 300ng의 TagBFP와 300ng의 필러 플라스미드를 TagBFP 색상 제어 튜브에 추가합니다.
    3. 300ng의 구성적 NeonGreen 플라스미드와 300ng의 필러 플라스미드를 NeonGreen 색상 제어 튜브에 추가합니다. mKO2, TagBFP 및 구성 NeonGreen의 각각 100ng과 필러 플라스미드 300ng을 모든 색상 제어 튜브에 추가합니다.
    4. 150ng의 mKO2를 폴리형질주입 믹스 1 튜브에 추가합니다. 75ng의 리포터 NeonGreen 플라스미드와 75ng의 필러 플라스미드를 폴리-형질주입 믹스 1 튜브에 추가합니다.
    5. 150ng의 TagBFP를 폴리형질주입 믹스 2 튜브에 추가합니다. 75 ng의 L7ae 플라스미드 및 75 ng의 필러 플라스미드를 폴리-형질주입 믹스 2 튜브에 첨가한다.
  2. 216 μL의 환원된 혈청 배지와 9.48 μL의 형질주입 시약을 결합하여 1.5 mL 미세원심분리기 튜브에 형질주입 마스터 믹스를 만듭니다(시약 비율 및 반응 스케일링은 표 1 참조). 위아래로 피펫팅하여 잘 섞고 따로 보관합니다.
  3. 1.58μL의 인핸서 시약을 각각 색상 제어 없음, 단일 색상 제어 및 모든 색상 제어 튜브에 추가합니다. 79 μL의 인핸서 시약을 각각의 폴리-트랜스펙션 믹스 튜브에 첨가한다. 각 튜브를 피펫팅으로 개별적으로 혼합합니다.
  4. DNA가 들어 있는 각 튜브에 형질주입 마스터 믹스를 추가합니다.
    1. 37.58μL의 transfection 마스터 믹스를 각각 무색 제어, 단일 색상 제어 및 모든 색상 제어 튜브에 추가합니다. 각 튜브를 피펫팅으로 개별적으로 혼합합니다.
    2. 18.79 μL의 형질주입 마스터 혼합물을 각각의 폴리-형질주입 믹스 튜브에 첨가한다. 각 튜브를 피펫팅으로 개별적으로 혼합합니다.
  5. 형질주입 믹스를 웰 내로 분배한다.
    1. 65.97 μL의 각 형질주입 혼합을 무색, 단색 및 모든 색상 대조군을 상응하는 웰에 피펫팅합니다.
    2. 32.98 μL의 폴리형질주입 피펫을 폴리형질감염 웰 내로 혼합하고, 복합체를 효과적으로 분배하기 위해 평평한 표면을 따라 타이트한 8자형 패턴으로 플레이트를 신속하지만 부드럽게 소용돌이친다. 이어서, 32.98 μL의 폴리형질주입 혼합된 2를 동일한 폴리형질주입 웰 내로 피펫팅하고 동일한 방식으로 플레이트를 소용돌이친다.
  6. 플레이트를 37°C의 인큐베이터에 5%CO2 로 진탕하지 않고 48시간 동안 두었다.
    참고: 세포 생존율을 높이기 위해 형질주입 후 6시간마다 세포 배지를 교체할 수 있습니다(항상 필요한 것은 아니지만 HEK293 세포 및 그 유도체의 경우 배지를 교체할 때 플레이트에서 세포를 분리하지 않도록 주의해야 함).
시약 분량 스케일링
DNA 혼합물에 대한 혈청 배지 감소 대조군 튜브당 36 μL, 폴리-트랜스펙션 튜브당 18 μL 튜브당 혈청 배지/ng DNA 0.05μL 감소, 피펫팅을 설명하기 위해 10-20% 추가 부피
DNA (유전자) 튜브 당 300-600 ng
P3000 (영문) 대조군 튜브당 1.58 μL, 폴리 트랜스펙션 튜브당 0.79 μL 튜브당 0.0022 μL P3000/ng DNA, 10-20% 추가
Lipo 마스터 믹스를 위한 환원된 혈청 배지 대조군 튜브당 36 μL, 폴리-트랜스펙션 튜브당 18 μL 0.05 μL의 혈청 배지/ng 총 DNA 감소, 피펫팅을 설명하기 위해 10-20% 추가 부피
형질주입 및 인핸서 시약 대조군 튜브당 1.58 μL, 폴리 트랜스펙션 튜브당 0.79 μL 0.0022 μL 리포펙타민 3000/ng DNA, 10-20% 추가

표 1: transfection을 위한 시약 스케일링. 이 표는 단일 웰에 포함된 DNA 양에 대해 포함할 시약의 정확한 비율을 나타냅니다. 이것은 반응을 효과적으로 확장하고 마스터 믹스를 형성하는 데 사용할 수 있습니다. 시약의 양은 20% 초과분을 포함하도록 조정되었습니다.

3. 유세포 분석을 위한 세포 준비

  1. 적어도 4.2 mL의 DMEM 용액을 37°C로 예비-가온한다. 적어도 4.2 mL의 트립신 및 4.2 mL의 PBS를 37°C로 예열한다. 사용할 준비가 될 때까지 형광 활성화 세포 분류(FACS) 완충 용액을 4°C에서 보관하십시오.
  2. 응집을 줄이기 위해 FACS 완충액(1% BSA, 5mM 에틸렌디아민테트라아세트산[EDTA] 및 0.1% 아지드화나트륨[NaN3]으로 보충된 PBS; 재료 표 참조)에 세포를 재현탁합니다.
    1. 각 웰에서 현재 매체를 흡인하고 폐기하십시오. PBS 5mL를 각 웰에 분주하여 세포를 세척합니다. PBS를 흡인하고 폐기하십시오.
    2. 5mL의 트립신을 각 웰에 분배합니다. 플레이트를 37°C의 인큐베이터에 3분 동안 또는 세포가 더 이상 접시에 부착되지 않을 때까지 놓습니다. 플레이트를 생물안전 캐비닛으로 되돌리고 5mL의 DMEM 용액을 각 웰에 분배하여 세포 용액을 희석합니다.
    3. 각 웰에 대해 여러 번 부드럽게 피펫팅하여 용액을 혼합합니다. 각 웰에 대해 모든 배지를 흡인하고 15mL 원뿔형 튜브에 넣습니다.
  3. 세포를 300 x g 에서 3분 동안 원심분리하여 펠릿화합니다. 세포를 흡인하고 버리지 않도록 주의하면서 배지를 흡인합니다. 각 튜브에서 세포를 5mL의 FACS 완충 용액에 재현탁하고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다.
  4. 각 세포 현탁액 용액을 스트레이너(덩어리 제거용)를 통해 별도의 유세포 분석 원추형 튜브로 통과시킵니다. 이 튜브를 얼음 위에 1시간 이상 두지 말고 가능한 한 빨리 유세포 분석을 수행하십시오.

4. 유세포 분석 수행

참고: 유세포 분석기를 작동하려면 필요한 작업에 대한 적절한 교육과 지식이 필요합니다. 소프트웨어 및 장비가 다를 수 있고 사용자는 일반적으로 교육을 받아야 하므로 이 섹션에서는 수행하는 데 유용한 특정 작업을 참조합니다.

  1. 먼저, 필러 플라스미드 대조군(색상 대조군 없음)으로 형질감염된 세포를 검사하여 세포 특성을 선택하고 이상(응집체, 파편 등 포함)을 방지합니다. 셀을 구별하기 위한 다양한 매개변수 조합이 있지만, 구별되는 특징을 시각화하는 좋은 방법으로 다음 세 가지 일반 옵션을 사용하십시오.
    1. 측면 산란 영역(기본 설정/셀 유형별 로그 또는 선형 스케일)과 전방 산란 영역(선형 스케일)을 확인합니다.
    2. 측면 산란 높이(로그 스케일)와 측면 스캐터 폭(선형 스케일)을 확인합니다.
    3. 전방 산란 폭(선형 스케일)과 전방 스캐터 높이(선형 스케일)를 살펴봅니다.
  2. 다음으로 단색 컨트롤을 살펴봅니다. 모든 색상 제어를 사용하여 기기 전압을 조정하여 각 형광 단백질의 신호가 형광의 등가 임의 단위(a.u.)로 정규화되도록 합니다. 다음으로, 보상 매트릭스를 설정하는 데 사용되는 각 형광 단백질에 대해 단색 컨트롤을 실행하여 블리드스루 보정을 허용합니다.
    알림: 이상적으로는 형광 값의 전체 동적 범위가 표시되어야 합니다. 형광 단백질 신호의 추가 정규화는 표준화된 단위(예: 등가 플루오레세인 분자[MEFL]; Beal et al.15 참조)로의 변환을 통해 수행할 수 있습니다. 해석 중에 MEFL 변환을 활성화하려면 무지개 보정 비드를 실행합니다. 이러한 교정은 또한 기기 간 및 일상적인 신호 변동을 감소시키는데 유용하다(16).
  3. poly-transfection 샘플 튜브를 실행합니다.
    참고: 가능한 경우 1,000 x 10^(^ = 혼합) 세포를 실행하는 것이 좋으며, 분석 중에 고차원 폴리트랜스펙션을 더 많은 빈으로 세분화해야 하고 각 빈에는 통계적으로 유의미한 비교를 위해 충분한 세포(이상적으로는 >10)가 필요합니다.

5. 실험 후 분석 수행

  1. 처음에는 컨트롤(및 해당되는 경우 비드)의 데이터를 사용하여 정확한 결과를 보장합니다. 사용 가능한 소프트웨어 도구 중 하나를 사용하여 라이브 셀 게이팅(위에서 설명한 게이트 사용), 보정 및 자가형광 보정을 수행합니다.
    참고: 일반적으로 사용자 지정 MATLAB 코드(예: https://github.com/jonesr18/MATLAB_Flow_Analysis 또는 Cytoflow17)를 사용하며, 이 코드에는 그래픽 사용자 인터페이스와 전처리 단계 및 폴리 트랜스펙션 분석에 적합한 Python 라이브러리가 모두 있습니다.
메서드 콤플렉스 ng 형광 마커 ng L7ae (분획) ng 리포터 (분수) ng 필러 DNA(분획) 합계 (ng)
폴리-형질주입 1 600
→ 1 150 75 (½) 75 (½) 300
→ 2 150 75 (½) 75 (½) 300
폴리-형질주입 2 600
→ 1 150 25 (1/6) 125 (5/6) 300
→ 2 150 125 (5/6) 25(1/6) 300

표 2: 프로토콜에서 입증된 폴리형질감염을 위한 DNA 양, 및 조정된 플라스미드 비율을 사용한 후속 실험의 예. 표의 상반부는 간단한 폴리형질감염 실험에 사용된 플라스미드의 조성을 나타낸다. 하반부는 가상의 농도 공간을 더 잘 서브샘플링하기 위해 플라스미드 비율을 조정하는 업데이트된 실험의 구성을 보여주며, 여기서 유전자 발현 조절자는 리포터에 비해 더 최적의 1:5 비율에 있어 이 비율 주변의 샘플에 더 많은 형질주입된 세포를 생성합니다.

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Representative Results

그림 1에서 우리는 co-transfection과 poly-transfection을 비교합니다. 공동형질감염에서, 모든 플라스미드는 동일한 형질주입 혼합물로 전달되어, 임의의 단일 세포가 받는 각 플라스미드의 양 사이에 높은 상관관계를 초래한다(도 1A). 각 세포에 전달되는 총 플라스미드의 수는 크게 다르지만, 집단 전체에 걸쳐 개별 세포에 있는 두 리포터 단백질의 형광은 상관관계가 있으며, 이는 두 플라스미드가 상당히 일정한 비율로 동시 전달되고 있음을 나타냅니다. 형질주입된 세포는 거의 또는 다수의 복합체를 흡수할 수 있지만, 각각의 복합체는 각각의 플라스미드의 상관된 양을 갖기 때문에, 공동-형질감염은 단지 2개의 플라스미드 사이의 농도 공간의 작은 대각선 영역만을 탐색한다. 대조적으로, 폴리형질감염에서, 플라스미드는 다중 형질주입 복합체로 전달되고, 그 결과 상이한 형질주입 혼합물에서 플라스미드의 비상관관계 전달이 이루어진다(도 1B). 형질주입된 세포는 복합체의 상이한 조합을 흡수하여, 어느 하나, 하나 또는 둘 다의 플라스미드를 다양한 용량의 플라스미드를 포함하는 세포를 생성한다.

도 2는 대표적인 폴리형질주입 워크플로우를 나타낸다. 일반적으로, 폴리형질주입 실험은 다음의 단계로 구성된다: 문제를 정의하고, 형질주입 믹스를 생성하고, 세포를 인큐베이션하고, 유세포 분석, 및 분석. 초기 폴리형질주입 결과가 최적 부분 비율을 정확하게 좁힐 수 없는 경우 최적화된 부분 비율로 폴리형질주입을 반복하는 선택적 단계도 있습니다. 이러한 단계는 프로토콜에 설명되어 있습니다.

그림 3에는 잘 수행된 공동형질감염 및 폴리형질감염 및 일반적인 오류의 몇 가지 예가 나와 있습니다. 도 3A는 TagBFP와 공동-전달된 eYFP-발현 플라스미드 사이의 긴밀한 상관관계와 함께 잘 수행된 공동-형질감염을 보여준다. 대조적으로, 도 3B의 공동형질감염은 이들 2개의 플라스미드 사이의 불량한 상관관계를 보여준다. 표시된 그림에서 불량한 상관관계는 플라스미드가 추가되기 전에 환원된 혈청 배지에 인핸서 시약을 첨가했기 때문입니다. 실험에서 이러한 불량한 상관관계는 형광 단백질의 발현을 유도하는 상이한 프로모터, 형질주입 혼합물 생성 중 불량한 혼합 또는 복합체가 너무 짧거나 너무 긴 간격 동안 배양되도록 허용하기 때문일 수도 있습니다.

도 3C 는 2차원 공간의 양호한 커버리지와 형광 단백질 사이의 임의의 스펙트럼 블리드-스루의 양호한 보상과 함께, 잘 수행된 폴리-트랜스펙션을 보여준다. 도 3D 는 분석을 위해 각 빈에 충분한 수의 세포를 갖는 충분한 빈으로 세분하기 어려운 적은 수의 살아있는 세포를 갖는 폴리-형질주입 데이터를 보여준다. 이 문제를 개선하기 위해, 시작 세포 집단은 양호하고 과도하게 자라지 않아야 하며, 다른 형질주입 시약을 사용하거나 더 적은 총 DNA로 형질감염을 함으로써 실험 독성을 감소시켜야 합니다. 도 3E 는 형질주입 효율이 불량한 폴리형질주입을 보여주며, 분석을 위한 2차원 공간의 희박한 커버리지를 다시 초래한다. 이 경우, 모폴로지 게이팅을 통과하는 세포의 수는 많지만, 세포는 형광 단백질을 발현하지 않는다. 효율성을 향상시키려면 transfection 시약 선택을 최적화하고 제조업체의 프로토콜을 면밀히 따라야 합니다. 각 형질주입 혼합물은 동일한 양의 DNA 질량을 포함해야 하며, 세포가 각 유형의 복합체를 받을 확률이 거의 동일하도록 보장해야 하며, 각 형질주입 혼합물은 키트 지침에 따라 이루어져야 합니다. 상이한 형질주입 키트는 상이한 세포 유형에 최적이다; 관심 있는 세포 유형에서 최고의 효율을 제공하는 키트를 사용해야 합니다. 마지막으로, 일부 세포 유형은 사용된 키트에 관계없이 형질주입이 어렵습니다. 이러한 경우 더 많은 수의 세포를 transfection해야 하며, 분석할 충분한 수의 세포를 확보하기 위해 유세포 분석 중에 가능한 한 많은 세포를 수집해야 합니다. 도 3F 는 형광 단백질 마커 중 하나가 다른 형광 단백질로의 스펙트럼 블리드스루를 명확하게 보여주는 폴리-트랜스펙션 데이터를 보여준다. 단색 대조군은 시스템의 모든 형광 단백질에 대해 항상 실행되어야 하며 분석 전에 모든 폴리-트랜스펙션에 적용되어야 하는 보상 매트릭스를 생성하는 데 사용해야 합니다.

폴리-형질주입 실험을 처음으로 수행할 때(전체 또는 새로운 실험 시스템의 경우) 표준 공동-형질감염에 대한 벤치마킹을 수행해야 합니다. 한 가지 접근법은 공동 형질감염(DNA 투여량 조정을 통해 )과 폴리 형질감염을 모두 사용하여 주요 시스템 부품에 대한 입력-출력 전달 함수를 개별적으로 측정하는 것입니다.

그림 4에서, 우리는 원래의 폴리-형질감염 간행물10에서 여기에서 채택된 번역 억제인자 L7Ae의 벤치마킹을 보여줍니다. L7Ae는 RNA 꼬임-턴(KT) 모티프를 인식하는 RNA 결합 단백질이다20; 2개의 KT(2xKT)가 mRNA의 5' 비번역 영역(UTR)에 배치될 때, 다운스트림 오픈 리딩 프레임(ORF) 번역은 L7Ae(21)에 의해 효과적으로 억제될 수 있다. L7Ae는 이전에 RNA-기반 세포 유형 분류기(21) 및 다른 RNA-기반 회로(22)를 구축하기 위해 사용되어 왔다. 표준 동시 형질감염에 의해 L7Ae를 테스트하기 위해 서로 다른 형질감염 혼합물 내에서 L7Ae를 인코딩하는 플라스미드와 그 표적 리포터의 비율을 조정할 수 있습니다(그림 4A 및 표 3). 폴리형질감염의 경우, 광범위한 플라스미드 비율이 세포에 전달되도록 별도의 형질감염 혼합물에서 구성적 L7Ae 및 상응하는 2xKT 리포터를 독립적으로 전달해야 합니다(그림 4B). 형질감염 및 유세포 분석을 수행한 후 데이터 분석을 수행할 수 있습니다. 데이터를 비교할 수 있도록 개별 공동 형질감염 결과를 단일 데이터 세트로 대조한 다음 폴리형질감염 데이터와 유사한 다차원 비닝을 수행할 수 있습니다(그림 4C, D). 출력 리포터를 억제하는 L7Ae의 용량-반응 곡선을 비교하면, 빈당 중간 출력 레벨이 공동형질감염 및 폴리형질감염 데이터 간에 매우 유사하다는 것을 알 수 있습니다(그림 4E-G).

일반적으로, 본 발명자들은 폴리-형질주입 데이터가 매우 편향된 DNA 투여 비율에서 덜 정밀도로 광범위한 DNA 비율에 걸쳐 공동-형질주입 데이터와 잘 상관관계가 있음을 보았다(부분적으로는 폴리-형질주입 실험을 위한 빈에서의 더 낮은 세포 커버리지, 특히 낮은 플라스미드 투여량에서 매우 강하게 활성인 부분의 경우). 이러한 민감한 부분에 대한 측정 정확도를 향상시키기 위해 더 약한 프로모터, 업스트림 개방 판독 프레임(upstream open reading frame)18 또는 microRNA 침묵 매개 미세 조정기(miSFIT)19를 사용하여 발현 수준을 낮출 수 있습니다.

도 5는 Gam 등으로부터 다시 적응된, 세포 유형 분류인자의 최적화를 위한 폴리형질감염의 성공적인 적용을 입증한다. 분류기는 많은 종양 세포에서 과발현된 miRNA인 miR-21-5p의 발현에 반응하여 출력을 생성하는 비교적 단순한 설계이다23. miR-21이 없는 경우, 분류자 출력은 박테리아 유래 전사 억제인자인 BM3R124에 의해 억제되며, 그의 적응은 이전에 포유류 세포에서 작용하는 것으로 나타났습니다25. miR-21이 존재할 때, 이는 BM3R1의 3' 및 5' UTR 둘 다에 배치된 4개의 표적 부위에 결합하여, 그의 발현을 녹다운시키고, 이에 의해 출력 전사를 허용한다 (도 5A). 이 시스템을 최적화하기 위해 (1) BM3R1(miR-21 표적 부위 포함), (2) 출력 리포터(mKO2) 및 (3) 출력의 전사를 활성화하는 Gal4-VP16(표 4)의 세 가지 회로 구성 요소를 별도의 형질주입 혼합물로 전달했습니다. 출력 프로모터는 BM3R1이 아닌 로직(Gal4-VP16)에서 작동하므로 Gal4-VP1625가 있는 경우에도 출력을 억제합니다. 각 부분은 동일한 플라스미드 상에서 각각 형질주입 마커인 TagBFP, mNeonGreen 및 iRFP720을 인코딩하여 각 복합체의 상대적 DNA 투여량을 나타냅니다. 일반적으로 Gal4-VP16 발현이 증가하면 리포터 mKO2 출력이 증가하는 반면, BM3R1 발현이 증가하면 mKO2 출력이 감소합니다. BM3R1은 miR-21-5p에 의해 녹다운되기 때문에 출력 발현은 HEK 세포보다 miR-21-5p 수준이 높아 BM3R1을 덜 발현하는 HeLa 세포에서 더 높아야 합니다.

HEK293 및 HeLa 세포 모두에 폴리형질감염 후, 상이한 플라스미드 비율의 3D 분포를 얻었다(도 5B-HEK 세포). Gam et al.10 은 관심 비율에서 특정 유클리드 거리 내의 세포를 고려하여 다양한 비율로 이 분포를 서브샘플링했습니다. 이 거리는 분석에서 통계적으로 유의미한 결과를 얻을 수 있을 만큼 충분한 셀을 포함할 수 있을 만큼 충분히 넓어야 하지만, 세 부분의 너무 넓은 성분비 집합을 포함하여 불필요한 노이즈를 피할 수 있을 만큼 충분히 좁아야 합니다. 그런 다음 Gam et al.10 은 최적화 알고리즘을 사용하여 공동 형질감염에 대한 분류 정확도를 최대화한 부분의 비율을 식별했습니다(즉, 형질주입된 HeLa 세포는 출력 발현에 대해 양성인 반면 형질주입된 HEK 세포는 그렇지 않음). 부품의 최적 비율은 10.9:1.5:1:Gal4-VP16:출력:BM3R1인 것으로 나타났습니다. 전체 폴리형질전환 공간 내에서 최적의 비율로 서브샘플링된 세포는 도 5C에 나타내었다. 이 서브샘플링은 이 비율에서 HEK293 대 HeLa 세포를 분류할 때 공동 형질감염된 회로가 91%의 특이성, 62%의 민감도 및 77%의 정확도를 가질 것으로 예측했습니다(그림 5D). 플라스미드 비율을 이 최적으로 설정한 병용형질감염은 99%의 특이도, 68%의 민감도, 84%의 정확도로 훨씬 더 나은 결과를 산출했다10. 또한, 이 비율은 서로 다른 절단된 프로모터와 업스트림 ORF(uORF)를 사용하여 상대적 발현을 조정하여 단일 플라스미드 버전의 회로를 구현하도록 안내하여 91%의 특이성, 90%의 민감도 및 90%의 정확도를 가진 회로를 생성했습니다10. 따라서, 폴리-형질감염은 세포 분류인자 및 유전자 회로의 설계를 보다 광범위하게 안내하는 강력한 도구이다.

Figure 1
그림 1: co-transfection과 poly-transfection 의 비교. (A,B) 두 플라스미드의 공동 형질감염 및 두 플라스미드의 폴리 형질감염과 플라스미드 전달의 개요 및 비교. 각각의 형질감염 방법에 대해, 가장 좌측 도표는 음전하를 띤 DNA와 양전하를 띤 지질 사이의 형질주입 복합체의 형성을 보여준다. 이들 예에서, 각각의 착색된 플라스미드(청색 및 적색)는 상이한 형광 단백질의 발현을 인코딩한다. 중앙 다이어그램은 세포에 플라스미드 전달의 예를 보여주고 히스토그램 또는 산점도에서 예상 분포에 대한 개략도를 보여줍니다. 히스토그램 상의 색 강도는 상응하는 플라스미드 색으로부터의 형광에 상응한다. 가장 오른쪽 다이어그램은 주어진 각 방법을 사용하여 형질주입된 세포의 실제 데이터를 보여줍니다. (A) 2개의 상이한 플라스미드와의 공동-형질감염에서, 형질주입 시약을 첨가하기 전에 두 플라스미드를 함께 혼합하여, 2개의 플라스미드 종의 고도로 상관관계가 있는 패키징을 생성한다. 실제 공동형질감염 데이터에서, 세포는 두 플라스미드의 상관된 전달을 나타낸다(오른쪽). (B) 폴리형질감염에서, 회로 부분 및 형질주입 마커에 상응하는 공동-전달 플라스미드의 각 세트는 형질주입 시약과 개별적으로 혼합되어, 이들 플라스미드만을 함유하는 복합체를 생성한다 (좌측). 실제 폴리-형질주입 데이터에서 세포는 다양한 플라스미드 화학량론을 동시에 탐색하여 광범위한 농도 공간을 탐색합니다(오른쪽). 이 수치는10에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: Poly-transfection 워크플로우. 1단계: 문제를 정의합니다. 부품 간의 이상적인 비율을 알 수 없는 여러 구성 요소가 있는 시스템에서 시작하고 구성 요소 간의 시작 비율을 선택합니다. 2단계: 트랜스펙션 믹스를 만듭니다. 각각의 형질주입 혼합물은 회로 성분 및 형광 형질주입 마커를 함유한다. 세포에 전달되는 회로 부분의 양은 마커의 형광과 상관 관계가 있습니다. 3단계: 세포를 배양합니다. 일반적인 워크플로우에서는 transfection과 유세포 분석 사이에 48시간 동안 세포를 배양합니다. 4단계: 유세포 분석. 프로토콜에 설명된 대로 적절한 컨트롤을 실행한 다음, 샘플을 실행합니다. 5단계: 분석. 형질주입 마커를 사용하여 세포가 받은 부분의 양 또는 비율에 따라 세포를 비닝합니다. 출력 단백질을 사용하여 회로 성능을 측정합니다. 회로 성능을 최적화하는 부품의 빈/비율을 찾습니다. 6단계: 최적화된 부품 비율로 반복합니다(선택 사항). 최적 빈/비율이 매우 치우친 비율인 경우, 파일럿 폴리-트랜스펙션은 최적 부품 비율을 정확하게 좁히지 못할 수 있습니다. 조정된 부분 비율로 폴리형질주입을 반복하여, 동일한 양의 각 형질주입 혼합물을 받은 세포가 이제 이전 라운드에 의해 결정된 바와 같이 최적에 가까운 비율의 부분을 받도록 합니다. 이 수치는10에서 수정되었습니다. 인큐베이터의 이미지는 Servier Medical Art의 이미지와 BioRender의 세포분석기 이미지를 사용했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 대표적인 양성 및 음성 폴리형질감염 결과 . (A) 밀접한 상관관계를 보여주는 2개의 형광 리포터의 잘 수행된 공동 형질감염. 비교를 위해 여기와 (B)에 총 20,000개의 셀이 그려져 있습니다. 폴리-형질주입 실험을 시작하기 전에 두 개의 형광 리포터에 대해 유사한 소규모 시험 공동 형질감염을 수행하여 플라스미드가 형질주입 혼합물 내에서 잘 상관되도록 하는 것이 좋습니다. (B) 잡음이 더 많은 공동-형질감염: 플라스미드는 각 형질주입 혼합물 내에서 잘 상관되지 않으며, 이로 인해 폴리형질주입의 형광 마커가 플라스미드 비율의 불량한 마커가 될 수 있습니다. (C) 양호한 세포 수, 형질주입 효율 및 보상을 보여주는 잘 수행된 폴리형질주입 결과. (D) 통계적으로 유의미한 수의 세포가 있는 빈으로의 하위 샘플링을 허용하지 않는 낮은 라이브 셀 수. (E) 통계적으로 유의한 수의 세포가 있는 빈으로의 서브샘플링을 허용하지 않는 형질주입 효율이 좋지 않습니다. (F) 적절한 보상의 부족으로 인해 형광 데이터가 시스템 내 형광 단백질의 양에 대한 불량한 프록시가 됩니다. 단색 컨트롤을 사용하여 이상적인 선형 보정 행렬을 결정하고 추가 처리 전에 데이터에 적용합니다. 모든 색상 컨트롤도 소프트웨어 선택에 따라 권장됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: co-transfection에 대한 poly-transfection의 벤치마킹. (A) 동시 형질감염에서, 형광 리포터 플라스미드에 대한 번역 억제인자 L7Ae의 한 비율을 각 실험 웰에서 테스트할 수 있습니다. (B) 폴리-트랜스펙션에서, 리포터에 대한 L7Ae의 많은 비율이 동일한 웰에서 시험될 수 있다. 폴리형질주입 플라스미드 혼합물에 대한 상세한 내용은 표 3을 참조한다. (씨, 디) 여러 co-transfection에 대한 poly-transfection을 벤치마킹하기 위한 비닝 워크플로우. 각 형질감염 마커 차원에 대해 총 10개의 이중지수-간격 빈이 할당되었으며, 이는 2개의 플라스미드 각각의 수준을 근사화합니다. 여기서, 상이한 수준의 플라스미드 #2를 나타내는 빈이 도시된다. 비닝은 다양한 플라스미드 비율(C)에 걸쳐 있는 11개의 공동 형질감염 샘플의 대조된 세트와 각각 약 500,000개의 세포(D)를 포함하는 단일 폴리형질감염의 데이터 모두에 대해 수행되었습니다. 색상은 유전자 2(TagBFP) 수준으로 정의된 빈 세트에 해당합니다. (예) 대표 회로에 대한 co-transfection에 대한 poly-transfection 벤치마킹. 각 빈의 세포에 대해 중간 출력 형광을 평가하고 대표적인 시스템인 L7Ae 번역 억제에 대한 방법 간에 비교했습니다. (E) L7Ae 활성을 측정하기 위한 구조체. mKO2 형광은 L7Ae(유전자 #1)의 전달에 대한 추정치로 사용되는 반면, TagBFP 형광은 조절된 mNeonGreen 출력(유전자 #2)의 전달에 대한 추정치로 사용됩니다. (F) L7Ae에 대한 다차원 적정 곡선. 각 줄은 (C) 및 (D)에 표시된 대로 TagBFP의 한 수준에 있는 그룹 집합을 나타냅니다. 실선은 poly-transfection data를 나타내고, 점선은 co-transfection data를 나타낸다. 리포터 플라스미드의 각 빈(binned) 레벨에서, 리포터 출력은 L7Ae가 증가함에 따라 감소한다. (G) L7Ae 시스템에 대한 공동형질감염과 폴리형질주입 사이의 시각적 비교. 각 포인트는 poly-transfection 및 co-transfection 측정을 위한 해당 빈에서 측정된 출력을 나타내며, 여기서 더 많은 등가 값이 빨간색 1:1 선에 더 가깝습니다. 전반적으로, 폴리-형질감염- 및 공동-형질감염 유래 사이에서 관찰된 차이는 낮으며, 이는 폴리-형질감염 방법의 신뢰성에 대한 신뢰도를 제공한다. 이 수치는10에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 폴리 트랜스펙션에 대한 데이터 분석. 폴리 트랜스펙션에서 세포는 분석을 위해 빈 또는 슬라이스로 그룹화할 수 있습니다. 그림 4 는 모델을 피팅하고 투여량 반응을 이해하는 데 유용할 수 있는 리포터 플라스미드 수준과 같은 시스템 구성 요소의 수준에 해당하는 조각으로 세포를 비닝하는 분석 형태를 보여줍니다. 또 다른 유용한 전략은 회로 구성 요소의 다양한 비율에서 회로 성능을 분석하는 것입니다. (A) 최적화를 위한 분류기 회로의 다이어그램. TagBFP, NeonGreen 및 iRFP720의 레벨은 각각 BM3R1, 출력 mKO2 및 Gal4-VP16의 레벨에 해당합니다. 폴리형질주입 플라스미드 혼합물에 대한 상세한 내용은 표 4 를 참조한다. (B) 폴리-형질주입 혼합물의 실험적 설정. (C) (A)의 폴리회로를 이용한 형질감염으로부터 수집된 유세포 분석 데이터. HEK 세포로의 회로 폴리형질감염의 결과로서 3개의 리포터 형광 단백질 각각의 수준은, 데이터에 존재하는 광범위한 회로 성분 비율을 보여준다. HEK 및 HeLa 세포 모두에서 회로 형질감염으로부터 유사한 결과가 얻어졌다. (D) 특정 비율로 폴리형질감염을 서브샘플링한다. 데이터를 분석하기 위해 회로 구성 요소 간의 많은 비율을 스캔하고 각 비율에서 분류기 성능을 결정했습니다. 예를 들어, 여기에서 우수한 성능을 입증한 특정 비율을 보여줍니다(Gal4-VP16 = DNA 435ng, 리포터 = 60ng 및 BM3R1 = 40ng). 파란색으로 표시된 것은 세 가지 다른 회로 구성 요소에 대한 형광 마커의 해당 비율입니다. 다음으로, 형광 궤적에서 특정 유클리드 거리 내의 점만 고려하여 데이터를 서브샘플링했습니다. 우리는 HEK와 HeLa 형질감염 모두에서 동일한 궤적에서 세포를 서브샘플링했습니다. (E) HEK 및 HeLa 셀의 동일한 궤적에서 회로 성능 비교. 민감도, 특이도, 분류 정확도 등의 통계를 여러 비율에 걸쳐 비교함으로써 성분 비율을 최적화하여 이상적인 유전 회로를 생성할 수 있습니다. 이 수치는10에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

콤플렉스 ng L7Ae 플라스미드 ng 리포터 플라스미드 옵티멤 (μL) P3000 (마이크로리터) 리포 3000 (μL)
1 250 75 1.5 1.5
2 250 75 1.5 1.5

표 3: 그림 4에 해당하는 형질주입 믹스. HEK293 세포를 24-웰 플레이트의 하나의 웰에서 이들 형질주입 믹스로 폴리형질감염시켰다.

콤플렉스 ng BM3R1 플라스미드 ng Gal4-VP16 플라스미드 ng 리포터 플라스미드 옵티멤 (μL) P3000 (마이크로리터) 리포 3000 (μL)
1 900 75 1.5 1.5
2 900 75 1.5 1.5
3 900 75 1.5 1.5

표 4: 그림 5에 해당하는 형질주입 믹스. HEK293 및 HeLa 세포를 각각 6-웰 플레이트의 1 웰에서 이들 형질주입 믹스로 각각 폴리형질감염시켰다.

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Discussion

CAD(Computer-Aided Design), 브레드보드 및 3D 프린팅과 같은 신속한 프로토타이핑 방법은 기계, 전기 및 토목 공학 분야에 혁명을 일으켰습니다. 주어진 과제에 대한 가능한 많은 솔루션을 신속하게 검색할 수 있는 능력은 해당 분야의 발전을 크게 가속화합니다. 우리는 폴리 트랜스펙션이 생물 공학과 유사한 기술로, 유전자 회로의 신속한 프로토타이핑을 가능하게 한다고 믿습니다. 또한 다른 래피드 프로토타이핑 기술은 가능한 여러 솔루션을 순차적으로 직접 반복해야 하는 반면, 폴리 트랜스펙션은 많은 솔루션을 동시에 탐색할 수 있습니다. 폴리형질감염은 유전자 회로 성분 비율의 많은 조합이 단일 웰에서 시험될 수 있게 하고, 몇몇 공개된 유전자 회로를 최적화하기 위해 사용되어 왔다10,11,13. 실험 프로토콜은 표준 공동 형질감염의 간단한 확장으로, 많은 포유류 세포 연구자들이 직접 채택할 수 있습니다. 일반적으로, 폴리형질감염과 공동형질감염 결과 사이의 매우 밀접한 일치가 보인다10(예는 도 4). 따라서, 폴리형질주입은 플라스미드 비율이 공동-형질주입 혼합물 내에서 적정되고 출력이 단일-세포 수준에서 측정되는 대부분의 경우에 사용될 수 있다.

폴리형질감염의 복잡성 및 규모는 최적화할 유전자 회로의 복잡성에 따라 증가한다. 분석할 차원의 수가 증가함에 따라 서로 다른 부분의 조합 비율과 분석에 필요한 셀 수가 기하급수적으로 증가합니다. 예를 들어, 도 5에서 분류자를 최적화하기 위해, 세포를 6-웰 플레이트 포맷으로 형질감염시키고, 적어도 150만 개의 살아있는 세포에 대한 데이터를 수집하였다. 우리는 또한 추가 회로 구성 요소10으로 분류기를 최적화하여 10cm 플레이트 스케일에서 형질감염과 수백만 개의 세포 수집을 필요로 합니다. 이 규모 이상에서는 DNA 생산에 시간이 많이 걸리고 형질주입 시약은 비용이 많이 듭니다. 즉, 폴리-형질주입은 개별 웰에서 비슷한 수의 회로 성분 비율 조합을 테스트하는 것보다 훨씬 적은 수의 세포, DNA 및 형질주입 시약을 사용합니다. 또한, 형질주입 혼합물을 훨씬 더 적게 만들어 상당한 시간을 절약할 수 있습니다.

Poly-transfection은 유세포 분석 데이터에 대한 고급 분석 방법을 가능하게 합니다. 두 가지 주요 접근법은 (1) 각 형질주입 마커의 발현에 따라 세포를 비닝하는 것 및 (2) 형질주입 마커의 정의된 비율로 세포를 추출하여 공동형질감염을 시뮬레이션하는 것입니다. 전자는 각 복합체(및 각 부분)에 대한 DNA 투여량의 특정 조합을 가진 세포를 선택하여 입출력 전달 기능을 생성합니다. 후자는 각 부분에 대한 DNA 투여량의 특정 비율로 세포를 선택하여 플라스미드 DNA 질량의 이러한 비율에서 공동 형질감염을 시뮬레이션합니다. 서브샘플링된 선택에서 회로 출력 리포터의 표현 레벨을 플로팅하면 정의된 입력 수준 또는 비율에서 출력을 측정할 수 있습니다. 회로 최적화를 위해, 회로의 목적에 의해 정의된 바와 같이 가장 성능이 좋은 빈/비율을 식별할 수 있다 - 셀 분류기의 경우, 이들은 회로가 타겟 셀 타입에서 ON이고 비-타겟 셀 타입에서 OFF인 빈/비율이다. 빈 크기를 선택할 때 필요한 정밀도 수준과 빈당 셀 수를 고려해야 합니다. 더 작은 빈은 회로 구성 요소의 이상적인 조합에 더 정확하게 초점을 맞추지만, 빈에 셀이 너무 적으면 측정에 바람직하지 않은 노이즈가 발생할 수 있습니다.

폴리-형질감염 데이터의 전산 분석의 향후 개선은 빈/비율당 낮은 세포 커버리지에서도 최적화를 용이하게 할 수 있습니다. 현재, 우리는 지나치게 시끄러운 측정을 피하기 위해 셀의 설정된 임계값(예: 10)보다 적은 빈에서 데이터를 제외합니다. 반복 측정과 함께 용량-반응 곡선, 분류기 정확도 및 빈당 기준으로 정의된 기타 메트릭을 보다 정확하고 정밀하게 계산할 수 있습니다. 그러나 poly-transfection의 각 셀은 정확한 입력 수준에서 회로 출력을 미세한 해상도로 측정하는 독립적인 실험으로 간주될 수 있습니다. 이를 염두에 두고, 용량 반응 및 회로 최적화의 기계론적 및 표현형 모델은 빈화된 요약 통계가 아닌 각 마커 및 리포터의 유전자 발현 분포에 직접 적합할 수 있다10. 이를 통해 보다 강력한 측정이 가능하며 실험당 수집된 많은 개별 데이터 포인트를 활용할 수 있습니다. 이러한 모델링 접근법은 드물게 샘플링 된 고차원 폴리 트랜스 펙션을 사용하더라도 예측 회로 특성화 및 최적화를 산출 할 수 있습니다. 또한, 반응 표면 방법론 및 랜덤 포레스트 회귀와 같은 기계 학습 방법은 상대적으로 희박한 고차원 데이터(10)를 분석하는 데 사용될 수 있다.

점점 더 커지는 폴리-트랜스펙션에 대한 대안적인 접근법은 폴리-트랜스펙션의 계층을 사용하여 회로를 순차적으로 최적화하는 것이다. 이러한 접근법에서, 먼저, 폴리형질감염은 더 큰 회로 내에서 유전적 성분의 하위세트를 포함하는 모듈을 최적화하기 위해 사용된다. 그런 다음 이러한 최적화된 모듈은 별도의 폴리 트랜스펙션 혼합물로 전달되어 각 회로 모듈의 최적 비율/투여량을 찾을 수 있습니다. 이 접근법은 현저히 적은 수의 세포, DNA 및 형질주입 시약을 사용합니다. 그러나, 컴포넌트들의 그룹들은 다른 컴포넌트들에 대해 반드시 모듈러일 필요는 없으며, 따라서 고립되어 측정된 모듈 내의 컴포넌트 파트들의 최적 비율은 더 큰 회로 콘텍스트(8) 내에서 차선책일 수 있다.

폴리-형질주입 방법은 또한 데이터 수집에 사용되는 유세포 분석기의 레이저/필터 구성에 의해 제한됩니다. 측정된 형광 출력 외에도, 각 형질주입 혼합물에는 형광 단백질 마커가 포함되어 있습니다. 따라서 세포분석기에서 잘 보정할 수 있는 형광 단백질을 선택하는 것이 중요합니다. 우리는 이전에 5개의 레이저 유세포 분석기(BD LSRFortessa)에서 22개의 형광 단백질 패널의 블리드스루를 체계적으로 분석한 결과, Sirius, TagBFP, mNeonGreen, mKO2 및 iRFP720 세트가 함께 사용될 수 있고 큰 문제 없이 잘 보상될 수 있음을 발견했습니다10. 그러나 더 큰 회로를 최적화하려면 스펙트럼이 더 많은 형광 단백질을 분리하기 위한 스펙트럼 세포분석과 같은 고급 세포분석 방법이 필요할 수 있으며, 현재 연구실에서 최대 8개의 형광 단백질로 최적화하고 있습니다. 형광 단백질 데이터베이스(https://www.fpbase.org)와 같은 데이터베이스는 특정 스펙트럼 중첩을 갖는 형광 단백질을 선택하는데 유용하다. 그러나 이 과정은 다양한 요인에 의해 복잡해질 수 있으며, 그 중 일부는 특정 세포계에 특이적입니다. 예를 들어, tdTomato와 같은 특정 적색 단백질을 사용하면 특정 레이저/필터 구성에서만 청색 채널로 바람직하지 않은 블리드스루(bleed-through)가 발생할 수 있다10. 추가적으로, 몇몇 원적외선 단백질은 DNA 투여량과 형광 출력10 사이에 비선형 관계를 나타내어 DNA 투여량에 대한 효과적인 마커로서의 사용을 감소시켰다.

다양한 수의 복합체(1개, 2개, 3개 등)로 수행되는 실험에서 일관성을 유지하기 위해 형질주입 혼합물당 동일한 분량의 플라스미드를 사용하는 것이 유용합니다. 예를 들어, 3개의 플라스미드(A, B 및 C) 중 하나에 암호화된 각 유전자를 사용하여 3개의 유전자 시스템을 테스트하는 경우, 형질주입 마커를 코딩하는 플라스미드의 동일한 비율과 함께 회로 플라스미드를 1:1:1 비율로 공동 형질주입할 수 있습니다. 이것은 각 플라스미드를 혼합물의 총 질량의 1/4로 만들고, 따라서 형성되는 각 형질주입 복합체 질량의 약 1/4을 만들 것입니다. 플라스미드를 리포터와 1:1로 혼합하거나 총 DNA 질량을 유지하는 대신, A, B 및 C를 자체 리포터와 별도의 복합체로 폴리트랜스펙션하는 경우, 각 플라스미드를 각 복합체 질량의 1/4로 유지하고 필러 DNA가 나머지 질량을 차지하는 것이 더 일관됩니다(예를 들어 표 5 참조). 이는 형질감염된 세포 사이의 유전자 발현 분포가 복합체에서 전달된 DNA의 총 질량에 덜 의존하고, 각 복합체 내의 DNA의 분획량에 더 많이 의존하기 때문이다10. 1:1:1 이외의 비율이 필요한 경우 각 부분에 대한 형질주입 혼합물에서 총 DNA 질량의 해당 분율을 계산합니다. 예를 들어, 표 5[아래] 는 1:1:4 비율을 나타낸다.

메서드 콤플렉스 ng A (분수) ng B (분수) ng C (분수) ng 리포터 (분수) ng 필러 DNA(분획) 합계 (ng)
공동 형질주입 1 150 (¼) 150 (¼) 150 (¼) 150 (¼) 0 (0) 600
폴리 형질 주입 600
→ 1 50 (¼) 50 (¼) 100 (½) 200
→ 2 50 (¼) 50 (¼) 100 (½) 200
→ 3 50 (¼) 50 (¼) 100 (½) 200
공동 형질주입 1 75 (⅛) 75 (⅛) 300 (½) 150 (¼) 0 (0) 600
폴리 형질 주입 600
→ 1 25 (⅛) 50 (¼) 125 (⅝) 200
→ 2 25 (⅛) 50 (¼) 125 (⅝) 200
→ 3 100 (½) 50 (¼) 50 (¼) 200

표 5: 공동형질주입 및 폴리형질주입 실험에서 일관성을 위해 필러 DNA를 사용하는 예. 여기서, 동일한 양의 필러 DNA로 3개의 플라스미드를 공동형질감염시키는 2가지 일반적인 예가 제시되어 있다. 위의 예에서 플라스미드는 모두 동일한 질량입니다. 하단 예에서, 하나의 플라스미드는 다른 플라스미드에 비해 더 높은 질량으로 전달된다. 공동형질감염 복합체에 사용되는 총 DNA의 분율은 폴리형질감염 복합체로 형질전환되고, 나머지 DNA의 양(각 복합체에 대한 총량까지, 복합체에 걸쳐 고정되고 동일함)은 필러 DNA로 구성됩니다.

필러 DNA의 전반적인 목표는 고유한 형질주입 혼합물의 수에 관계없이 세포당 유사한 용량의 플라스미드를 유지하는 것입니다. 이 원리의 대략적인 근사치로서, 각각의 동일한 DNA 질량(및 형질주입 시약의 적절한 비율)을 유지하면서 3개의 플라스미드를 3개의 혼합물로 분리하면 3개의 플라스미드를 모두 포함하는 단일 혼합물에 비해 주어진 복합체를 받는 세포의 비율이 1/3로 감소합니다. 그러나 형질감염된 각 세포는 이후에 ~3배 더 높은 유전자 용량을 받습니다. 따라서 필러 DNA 없이 단독으로 플라스미드의 상대적인 양을 감소시키는 것은 일관된 플라스미드 투여량을 유지하기에 불충분한데, 이는 형질주입된 세포10 사이의 발현의 기본 분포를 변경하지 않으면서 단순히 형질주입 효율을 감소시키기 때문이다. 반면에, 필러 DNA는 전체 형질주입 효율에 영향을 미치지 않으면서 DNA 투여량을 조절할 수 있게 한다(검출 가능한 형질주입된 세포는 낮은 신호로 인해 감소할 수 있음)10. 위의 조잡한 근사치에 따라, 폴리형질주입 혼합물에서 DNA의 분율을 1/3로 감소시키고 필러 DNA를 첨가하면 원래의 공동형질감염과 비교하여 상대적인 유전자 투여량이 유지됩니다. 따라서 필러 DNA는 효율적이고 정확한 형질주입 복합체 형성을 보장합니다.

리포터에 의해 커버되는 관심 유전자의 발현 범위를 변경하기 위해, 유전자를 구동하는 데 사용되는 각 테스트 플라스미드 및/또는 프로모터의 분획을 리포터에 비해 조정할 수 있습니다. 낮은 DNA 투여량에서 부분이 강하고 활성이 높은 경우 더 낮은 DNA 분획을 사용하면 형질주입된 세포에서 리포터의 형광 분포 중간에 부분의 동적 범위를 중앙에 배치하는 데 도움이 될 수 있습니다. 마찬가지로, 높은 DNA 투여량에서만 약한/활성인 부분의 경우, 더 높은 분획을 사용하는 것이 유용할 수 있다. 그러나, DNA 분획을 너무 많이 줄이면 리포터(10)에 비해 세포로의 전달의 확률성이 증가하고, 높은 유전자 발현 수준은 세포 유전자 발현 기계(12,14)에 과부하가 걸릴 수 있기 때문에 이러한 튜닝에 주의해야 한다. 확률성을 피하기 위해, 그리고 각 유전자가 고정된 비율로 세포에 전달되는 경우(예를 들어, 회로가 단일 렌티, PiggyBac, 또는 랜딩 패드 벡터로서 생성되어야 하는 경우), 각 유전자의 상대적 발현은 더 강한/약한 프로모터, 작은 uORFs(18) 및/또는 miSFITs(19)를 사용하여 조정될 수 있다.

프로토콜은 역형질감염 기술을 설명하지만, 폴리형질감염은 순방향 형질감염으로도 가능합니다. 역형질감염에서, 세포는 동시에 시딩되고 형질감염되고; 정방향 형질감염에서, 세포는 역형질감염에 사용되는 밀도의 약 1/2로 첫 번째 도금 후 ~24시간 후에 형질감염됩니다(형질감염 시점까지 세포 분열을 허용하기 위해). 일반적으로 역형질주입은 더 효율적이지만 독성도 더 강하며, 시약, 형질주입 시간 및 세포주에 따라 형질주입 분포의 형태에 약간의 차이가 있음을 발견했습니다. 따라서, 선택의 형질주입 방법은 형질주입된 세포의 수 및 세포당 플라스미드 투여량의 다차원 농도 공간의 커버리지를 최대화하기 위해 각 세포주에 대해 최적화되어야 한다.

전반적으로, 폴리-형질감염은 포유동물 유전 회로의 신속한 최적화를 가능하게 한다. 회로 구성 요소의 가능한 많은 비율계량 조합을 단일 웰에서 쉽게 테스트할 수 있습니다. 추가로, 폴리-형질감염은 종래의 형질감염보다 시스템 내의 각 부분의 수준에 대한 더 많은 정보를 함유하기 때문에, 다양한 유전 부분의 거동을 특성화하는데 매우 가치 있는 것으로 밝혀졌다10,11,12,13. 폴리-형질감염의 채택은 포유류 세포에 사용하기 위한 새롭고 개선된 유전자 회로의 개발 속도를 가속화할 것으로 예상됩니다.

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Disclosures

RW는 Strand Therapeutics와 Replay Bio의 공동 설립자입니다. R.W.와 R.J.는 세포 유형 분류기와 관련된 임시 특허를 출원했습니다.

Acknowledgments

우리는 폴리 형질 주입 방법 및 세포 분류제에 대한 적용을 주도하거나 기여한 전 Weiss Lab 구성원 인 Jeremy Gam, Bre DiAndreth 및 Jin Huh에게 감사드립니다. 추가 분석법 개발/최적화에 기여한 다른 Weiss 연구소 구성원: Wenlong Xu, Lei Wang 및 Christian Cuba-Samaniego; Josh Leonard 교수와 Patrick Donahue 및 Hailey Edelstein을 포함한 그룹 구성원은 poly-transfection을 테스트하고 피드백을 제공했습니다. 그리고 이 원고를 초대하고 피드백을 제공한 Nika Shakiba 교수. 또한 국립 보건원 [R01CA173712, R01CA207029, P50GM098792]에도 감사드립니다. 국립 과학 재단 [1745645]; 이 작업에 자금을 지원하기 위해 NCI 및 국립 보건원 [P30GM14051]의 암 센터 지원 (핵심) 보조금 [P50CCA14051, 부분적으로].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15mL Corning Falcon conical tubes ThermoFisher Scientific 14-959-53A
24-well petri dish Any company of choice (Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free)
Bovine serum albumin NEB B9000S
Centrifuge Any company of choice Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf
Countess 3 Automated Cell Counter ThermoFisher Scientific AMQAX2000
Countess Cell Counting Chamber Slides ThermoFisher Scientific C10228
Cytoflow Non-commercial software package https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/# 
DMEM VWR 10-013-CV Use the correct media for your cell type
EDTA  ThermoFisher Scientific 03690-100ML
Fetal bovine serum Sigma Aldrich F4135
HEK cells ATCC CRL-1573 Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently.
HeLa cells ATCC CRL-12401 Use the relevant cell type for your experiments.
Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer ThermoFisher Scientific L3000001 Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent
LSRFortessa flow cytometer BD Biosciences N/A
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Gibco 11140050
Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL Any company of choice
Opti-MEM ThermoFisher Scientific 31985070 reduced serum medium
Phosphate buffered saline ThermoFisher Scientific 70011044
Rainbow calibration beads Spherotech URCP-100-2H
Sodium azide Sigma Aldrich S2002
Trypsin VWR 25-053-CI

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References

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생명공학 합성생물학 유전회로 세포분류기 고처리량 최적화 유전자회로 신속프로토타이핑 형질감염 유세포 분석
Poly-transfection을 이용한 세포 상태 식별 회로의 신속한 개발
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Wauford, N., Jones, R., Van De Mark, … More

Wauford, N., Jones, R., Van De Mark, C., Weiss, R. Rapid Development of Cell State Identification Circuits with Poly-Transfection. J. Vis. Exp. (192), e64793, doi:10.3791/64793 (2023).

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