Summary
Komplekse genetiske kredsløb er tidskrævende at designe, teste og optimere. For at lette denne proces transfekteres pattedyrceller på en måde, der tillader test af flere støkiometrier af kredsløbskomponenter i en enkelt brønd. Denne protokol skitserer trinene til eksperimentel planlægning, transfektion og dataanalyse.
Abstract
Pattedyrs genetiske kredsløb har vist potentialet til at mærke og behandle en bred vifte af sygdomstilstande, men optimering af niveauerne af kredsløbskomponenter forbliver udfordrende og arbejdskrævende. For at fremskynde denne proces udviklede vores laboratorium polytransfektion, en udvidelse med høj kapacitet af traditionel pattedyrtransfektion. I polytransfektion udfører hver celle i den transfekterede population i det væsentlige et andet eksperiment, tester kredsløbets opførsel ved forskellige DNA-kopinumre og giver brugerne mulighed for at analysere et stort antal støkiometrier i en enkeltpottereaktion. Indtil videre er polytransfektioner, der optimerer forholdet mellem trekomponentkredsløb i en enkelt brønd af celler, blevet demonstreret; I princippet kan den samme metode bruges til udvikling af endnu større kredsløb. Polytransfektionsresultater kan let anvendes til at finde optimale forhold mellem DNA og co-transfekt for forbigående kredsløb eller til at vælge ekspressionsniveauer for kredsløbskomponenter til generering af stabile cellelinjer.
Her demonstrerer vi brugen af polytransfektion til at optimere et trekomponentkredsløb. Protokollen begynder med eksperimentelle designprincipper og forklarer, hvordan polytransfektion bygger på traditionelle co-transfektionsmetoder. Derefter udføres polytransfektion af celler og efterfølges af flowcytometri et par dage senere. Endelig analyseres dataene ved at undersøge skiver af enkeltcelleflowcytometridataene, der svarer til delmængder af celler med visse komponentforhold. I laboratoriet er polytransfektion blevet brugt til at optimere celleklassifikatorer, feedback- og feedforward-controllere, bistabile motiver og mange flere. Denne enkle, men kraftfulde metode fremskynder designcyklusser for komplekse genetiske kredsløb i pattedyrceller.
Introduction
Området pattedyrs syntetiske biologi har udviklet sig hurtigt, fra at udvikle enkle sans-og-respons-dele i dyrkede cellelinjer til optimering af komplekse netværk af gener til at løse virkelige udfordringer inden for diagnostik og terapi1. Disse sofistikerede kredsløb er i stand til at registrere biologiske input fra mikroRNA-profiler til cytokiner til små molekylelægemidler og implementere logiske behandlingskredsløb, herunder transistorer, båndpasfiltre, vippekontakter og oscillatorer. De har også vist lovende resultater i dyremodeller af sygdomme som kræft, gigt, diabetes og mange flere 1,2,3,4,5. Men efterhånden som kompleksiteten af et kredsløb vokser, bliver optimering af niveauerne for hver af dets komponenter stadig mere udfordrende.
En særlig nyttig type genetisk kredsløb er en celleklassifikator, som kan programmeres til at mærke og reagere på cellulære tilstande. Selektiv produktion af protein- eller RNA-output i specifikke cellulære tilstande er et kraftfuldt værktøj til at guide og programmere differentiering af celler og organoider, identificere og ødelægge syge celler og / eller uønskede celletyper og regulere funktionen af terapeutiske celler 1,2,3,4,5 . Imidlertid har det været meget udfordrende at skabe kredsløb i pattedyrceller, der nøjagtigt kan klassificere celletilstande fra flere cellulære RNA- og / eller proteinarter.
Et af de mest tidskrævende trin i udviklingen af et celleklassificeringskredsløb er at optimere de relative ekspressionsniveauer for individuelle komponentgener, såsom sensorer og behandlingsfaktorer, inden for kredsløbet. For at fremskynde kredsløbsoptimering og muliggøre konstruktion af mere sofistikerede kredsløb har nyere arbejde brugt matematisk modellering af celleklassificeringskredsløb og deres komponenter til at forudsige optimale kompositioner og topologier 6,7. Selvom dette hidtil har vist stærke resultater, er matematisk analyse begrænset af behovet for systematisk at karakterisere input-output-adfærden af komponentgener i kredsløbet, hvilket er tidskrævende. Yderligere kan et utal af kontekstafhængige problemer opstå i komplekse genetiske kredsløb, hvilket får opførelsen af et fuldt kredsløb til at trodse forudsigelser baseret på individuelle delkarakteriseringer 8,9.
For hurtigere at udvikle og teste komplekse pattedyrkredsløb såsom celletilstandsklassifikatorer udviklede vores laboratorium en teknik kaldet polytransfektion10, en udvikling af plasmid-co-transfektionsprotokoller. Ved co-transfektion kompleksiseres flere plasmid-DNA-arter sammen med et positivt ladet lipid- eller polymerreagens og leveres derefter til celler på en korreleret måde (figur 1A). Ved polytransfektion kompleksiseres plasmider separat med reagenset, således at DNA'et fra hvert transfektionskompleks leveres til celler på en dekorreleret måde (figur 1B). Ved hjælp af denne metode udsættes celler inden for den transfekterede population for adskillige kombinationer af forhold mellem to eller flere DNA-nyttelaster, der bærer forskellige kredsløbskomponenter.
For at måle forholdet mellem kredsløbskomponenter, der leveres til hver celle, indeholder hvert transfektionskompleks inden for en polytransfektion en konstitutivt udtrykt fluorescerende reporter, der tjener som en proxy for cellulær optagelse af komplekset. Filler-DNA, der ikke indeholder nogen elementer, der er aktive i en pattedyrcelle, bruges til at indstille den relative mængde fluorescerende reporter og kredsløbskomponenter, der leveres til en celle i et enkelt transfektionskompleks og diskuteres mere detaljeret i diskussionen. Et eksempel på fyldstof-DNA, der anvendes i Weiss-laboratoriet, er et plasmid, der indeholder en terminatorsekvens, men ingen promotor, kodende sekvens osv. Celler med forskellige forhold mellem kredsløbskomponenter kan derefter sammenlignes for at finde optimale forhold for genkredsløbsfunktion. Dette giver igen nyttige forudsigelser for valg af promotorer og andre kredsløbselementer for at opnå optimale genekspressionsniveauer, når man kombinerer kredsløbskomponenter i en enkelt vektor til genetisk integration (f.eks. En lentivirus, transposon eller landingsplade). I stedet for at vælge forhold mellem kredsløbskomponenter baseret på intuition eller via en tidskrævende forsøgs- og fejlproces, evaluerer polytransfektion således en bred vifte af støkiometrier mellem genetiske dele i en enkeltpotreaktion.
I vores laboratorium har polytransfektion muliggjort optimering af mange genetiske kredsløb, herunder celleklassifikatorer, feedback- og feedforward-controllere og bistabile motiver. Denne enkle, men kraftfulde metode fremskynder designcyklusser for komplekse genetiske kredsløb i pattedyrceller betydeligt. Polytransfektion er siden blevet brugt til at karakterisere flere genetiske kredsløb for at afsløre deres multidimensionelle input-output overførselsfunktioner ved høj opløsning 10, optimere en alternativ kredsløbstopologi til celletilstandsklassificering11 og fremskynde forskellige offentliggjorte12,13 og igangværende projekter.
Her beskriver og skildrer vi arbejdsgangen for brug af polytransfektion til hurtigt at optimere et genetisk kredsløb (figur 2). Protokollen viser, hvordan man genererer polytransfektionsdata af høj kvalitet og undgår flere almindelige fejl i polytransfektionsprotokollen og dataanalysen (figur 3). Det demonstrerer derefter, hvordan man bruger polytransfektion til at karakterisere enkle kredsløbskomponenter og i processen benchmarke polytransfektionsresultater mod co-transfektion (figur 4). Endelig viser resultaterne af polytransfektion optimering af kræftklassificeringskredsløbet (figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Tabel 1 og tabel 2 tjener som vigtige referencer for denne protokol. Tabel 1 viser reagensskalering for reaktioner, og tabel 2 viser DNA-forholdsaritmetik for et eksempel polytransfektion beskrevet i protokollen (øverste halvdel) og for et muligt opfølgningseksperiment (nederste halvdel).
1. Forberedelse af celler til transfektion
- Sørg for, at kulturen af humane embryonale nyreceller (HEK293) er 60% -80% sammenflydende, før protokollen påbegyndes. For at gøre dette skal du frø 1 x 106 celler i en 100 mm x 15 mm vævskultur petriskål 2 dage før og inkubere ved 37 ° C med 5% CO2.
BEMÆRK: Selvom vores protokol fokuserer på HEK293-celler, kan andre celletyper erstattes. - Forbered medierne og cellerne til transfektioner som beskrevet nedenfor.
- Forvarm mindst 20 ml af en opløsning af Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% ikke-essentielle aminosyrer (NEAA; se materialetabel) til 37 °C. Forvarm mindst 2,4 ml trypsin og 2,4 ml fosfatbufret saltvand (PBS) til 37 °C. Forvarm reduceret serummedium til ~16 °C.
BEMÆRK: Alt vævskulturarbejde skal udføres med omhu i et biosikkerhedsskab.
- Forvarm mindst 20 ml af en opløsning af Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% ikke-essentielle aminosyrer (NEAA; se materialetabel) til 37 °C. Forvarm mindst 2,4 ml trypsin og 2,4 ml fosfatbufret saltvand (PBS) til 37 °C. Forvarm reduceret serummedium til ~16 °C.
- Resuspender cellerne i DMEM-opløsningen som beskrevet nedenfor.
- Opsug og bortskaf de aktuelle medier. Dispenser 2 ml PBS på HEK293-cellekulturen for at vaske cellerne. Opsug og bortskaf PBS.
- Dispenser 2 ml trypsin på HEK293-cellekulturen. Anbring petriskålen i en inkubator ved 37 °C i 3 min, eller indtil cellerne ikke længere klæber til skålen. Sæt skålen tilbage i biosikkerhedsskabet, og fortynd celleopløsningen ved at dispensere 8 ml DMEM-opløsning i pladen.
- Bland opløsningen ved forsigtigt at pipettere op og ned flere gange. Opsug alle medier og læg det i et 15 ml konisk rør.
- Centrifuger cellerne ved 300 x g i 3 minutter for at pelletere dem. Aspirer medierne (pas på ikke at aspirere cellerne) og kassér det. Resuspender cellerne i 5 ml DMEM-opløsning, bland ved forsigtigt pipettering op og ned.
- Anslå den aktuelle cellekoncentration ved hjælp af en automatiseret celletæller (angivet i materialetabellen). Frø seks brønde (i dette eksempel) i en plade med 24 brønde med 1 x 105 celler (for en såtæthed på 50.000 celler / cm2).
- Tilføj DMEM-opløsningen op til 500 μL (tilsæt DMEM-opløsning til hullerne først), og mærk derefter en brønd pr. behandling som følgende: ingen farvekontrol, mKO2-kontrol, TagBFP-kontrol, NeonGreen-kontrol, al farvekontrol og polytransfektion 1. TagBFP-, mKO2- og NeonGreen-kontrolbrønde er enkeltfarvekontroller for alle fluorescerende proteiner, der er inkluderet i polytransfektionen.
2. Udførelse af transfektion
- Forbered rør til hvert DNA-aggregat. Afsæt 1,5 ml mikrocentrifugerør, og mærk rørene som: ingen farvekontrol, mKO2-kontrol, TagBFP-kontrol, NeonGreen-kontrol, al farvekontrol, polytransfektionsblanding 1 og polytransfektionsblanding 2.
- Tilføj 36 μL reduceret serummedium til ingen farvekontrol, mKO2-kontrol, TagBFP-kontrol, NeonGreen-kontrol og alle farvekontrolrør. Der tilsættes 18 μL reduceret serummedium til hvert af polytransfektionsblandingen 1 og polytransfektionsblandingen 2 reagensglas.
BEMÆRK: Plasmidkoncentrationerne antages at være 150 ng/μL. - Tilsæt 600 ng fyldstofplasmid til røret uden farve. Tilsæt 300 ng mKO2 og 300 ng fyldstofplasmid til mKO2-farvekontrolrøret. Tilsæt 300 ng TagBFP og 300 ng fyldstofplasmid til TagBFP-farvekontrolrøret.
- Tilsæt 300 ng konstitutivt NeonGreen-plasmid og 300 ng fyldstofplasmid til NeonGreen-farvekontrolrøret. Tilsæt 100 ng hver af mKO2, TagBFP og konstitutiv NeonGreen samt 300 ng fyldstofplasmid til hele farvekontrolrøret.
- Tilsæt 150 ng mKO2 til polytransfektionsblandingen 1 rør. Tilsæt 75 ng reporter NeonGreen plasmid og 75 ng fyldstofplasmid til polytransfektionsblandingen 1 rør.
- Tilsæt 150 ng TagBFP til polytransfektionsblandingen 2 rør. Tilsæt 75 ng L7ae-plasmid og 75 ng fyldstofplasmid til polytransfektionsblandingen 2-rør.
- Tilføj 36 μL reduceret serummedium til ingen farvekontrol, mKO2-kontrol, TagBFP-kontrol, NeonGreen-kontrol og alle farvekontrolrør. Der tilsættes 18 μL reduceret serummedium til hvert af polytransfektionsblandingen 1 og polytransfektionsblandingen 2 reagensglas.
- Transfektionsmasterblandingen fremstilles i et 1,5 ml mikrocentrifugerør ved at kombinere 216 μL reduceret serummedium med 9,48 μL transfektionsreagens (se tabel 1 for reagensforhold og reaktionsskalering). Bland godt ved pipettering op og ned, og sæt til side.
- Tilsæt 1,58 μL forstærkerreagens til hver af no-color control, single color control og alle color control tubes. Der tilsættes 79 μL forstærkerreagens til hvert af polytransfektionsblandingsrørene. Hvert rør blandes individuelt ved at pipettere kraftigt.
- Tilsæt transfektionsmasterblandingen til hvert rør, der indeholder DNA.
- Tilføj 37,58 μL transfektionsmasterblanding til hver af no-color control, single color control og alle color control tubes. Hvert rør blandes individuelt ved at pipettere kraftigt.
- Tilsæt 18,79 μL transfektionsmasterblanding til hvert af polytransfektionsblandingsrørene. Hvert rør blandes individuelt ved at pipettere kraftigt.
- Dispenser transfektionsblandingerne i brøndene.
- Der pipetteres 65,97 μL af hver transfektionsblanding for ingen farve, enkeltfarve og alle farvekontroller i de tilsvarende huller.
- Pipette 32,98 μL af polytransfektionen blandes 1 i polytransfektionsbrønden og hvirvler pladen hurtigt, men forsigtigt i et stramt ottetalsmønster langs en plan overflade for at fordele komplekserne effektivt. Derefter pipetteres 32,98 μL af polytransfektionen, blandes 2 i den samme polytransfektionsbrønd og hvirvler pladen på samme måde.
- Pladen anbringes i en inkubator ved 37 °C med 5 % CO2 og uden omrystning i 48 timer.
BEMÆRK: For at øge cellelevedygtigheden kan cellemediet udskiftes hver 6. time efter transfektion (selvom dette ikke altid er nødvendigt, og med HEK293-celler og dets derivater skal man være forsigtig med ikke at løsne cellerne fra pladen, når man skifter medie).
| Reagens | Beløb | Skalering | ||||
| Reduceret serummedium til DNA-blanding | 36 μL pr. kontrolrør, 18 μL pr. polytransfektionsrør | 0,05 μL reduceret serummedium/ng-DNA pr. reagensglas med 10-20 % ekstra volumen for at tage højde for pipettering | ||||
| DNA | 300-600 NG pr. rør | |||||
| P3000 | 1,58 μL pr. Kontrolrør, 0,79 μL pr. Polytransfektionsrør | 0,0022 μL P3000/ng DNA pr. rør, med 10-20% ekstra | ||||
| Reduceret serummedium til Lipo master mix | 36 μL pr. kontrolrør, 18 μL pr. polytransfektionsrør | 0,05 μL reduceret serummedium/ng total DNA, med 10-20% ekstra volumen for at tage højde for pipettering | ||||
| Transfektions- og forstærkerreagens | 1,58 μL pr. Kontrolrør, 0,79 μL pr. Polytransfektionsrør | 0,0022 μL lipofectamin 3000/ng DNA, med 10-20% ekstra | ||||
Tabel 1: Reagensskalering for transfektioner. Tabellen angiver det korrekte forhold mellem reagens, der skal inkluderes for DNA-mængden inkluderet i en enkelt brønd. Dette kan bruges til at skalere reaktioner effektivt og danne masterblandinger. Mængderne af reagens er blevet skaleret til at omfatte en overskridelse på 20%.
3. Forberedelse af celler til flowcytometri
- Forvarm mindst 4,2 ml af DMEM-opløsningen til 37 °C. Forvarm mindst 4,2 ml trypsin og 4,2 ml PBS til 37 °C. Opbevar bufferopløsningen til fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) ved 4 °C, indtil den er klar til brug.
- Resuspender cellerne i FACS-bufferopløsningen (PBS suppleret med 1 % BSA, 5 mM ethylendiamintetraeddikesyre [EDTA] og 0,1 % natriumazid [NaN3] for at reducere sammenklumpning; se materialetabellen) som beskrevet nedenfor.
- Opsug og bortskaf de aktuelle medier i hver brønd. Dispenser 5 ml PBS i hvert hul for at vaske cellerne. Opsug og bortskaf PBS.
- Dispenser 5 ml Trypsin i hver brønd. Pladen anbringes i en inkubator ved 37 °C i 3 minutter, eller indtil cellerne ikke længere klæber til fadet. Sæt pladen tilbage i biosikkerhedsskabet, og fortynd celleopløsningerne ved at dispensere 5 ml DMEM-opløsning i hvert hul.
- Bland opløsningen for hvert hul ved forsigtigt at pipettere op og ned flere gange. For hver brønd skal du aspirere alle medierne og placere det i et 15 ml konisk rør.
- Centrifuger cellerne ved 300 x g i 3 minutter for at pelletere dem. Aspirer medierne, pas på ikke at aspirere cellerne og kassere det. I hvert glas resuspenderes cellerne i 5 ml FACS-bufferopløsning, blandes ved forsigtigt pipettering op og ned.
- Før hver cellesuspensionsopløsning gennem en sil (for at fjerne klumper) i separate koniske rør til flowcytometri. Opbevar disse rør på is i højst 1 time, og udfør flowcytometri så hurtigt som muligt.
4. Udførelse af flowcytometri
BEMÆRK: Betjening af et flowcytometer kræver korrekt træning og viden om de nødvendige opgaver. Da software og udstyr kan variere, og brugerne generelt skal trænes, henviser dette afsnit til specifikke handlinger, der er nyttige at udføre.
- Undersøg først cellerne transfekteret med fyldstofplasmidkontrollen (ingen farvekontrol) for at vælge celleegenskaber og undgå anomalier (inklusive aggregater, snavs osv.). Selvom der er mange kombinationer af parametre til at skelne celler, skal du bruge følgende tre generelle indstillinger som en god måde at visualisere kendetegn på.
- Se på sidespredningsområdet (log eller lineær skala pr. præference/celletype) versus det fremadrettede spredningsområde (lineær skala).
- Se på sidespredningshøjden (logskala) versus sidespredningsbredden (lineær skala).
- Se på spredningsbredden fremad (lineær skala) versus spredningshøjden fremad (lineær skala).
- Se derefter på de enkelte farvekontroller. Brug alle farvekontroller til at indstille instrumentspændingerne, således at signalerne fra hvert fluorescerende protein normaliseres til ækvivalente vilkårlige enheder (a.u.) af fluorescens. Kør derefter enkeltfarvekontrollerne for hvert fluorescerende protein, som bruges til at indstille kompensationsmatrixen, hvilket muliggør gennemblødningskorrektion.
BEMÆRK: Ideelt set bør det fulde dynamiske område af fluorescensværdierne være synligt. Yderligere normalisering af fluorescerende proteinsignaler kan ske via konvertering til standardiserede enheder (f.eks. molekyler af ækvivalent fluorescein [MEFL'er; se Beal et al.15]). For at aktivere MEFL-konvertering under analyse skal du køre regnbuekalibreringsperler. En sådan kalibrering er også nyttig til at reducere instrument-til-instrument og daglig signalvariation16. - Kør polytransfektionsprøverøret.
BEMÆRK: Hvor det er muligt, anbefales det at køre 1.000 x 10^ (^ = blandinger) celler, da højere dimensionelle polytransfektioner skal opdeles i flere bakker under analysen, og hver beholder har brug for nok celler (ideelt >10) til at foretage statistisk signifikante sammenligninger.
5. Udførelse af analyse efter eksperiment
- Brug først data fra kontrollerne (og, hvis det er relevant, perlerne) for at sikre nøjagtige resultater. Brug et af de tilgængelige softwareværktøjer til at udføre live cell gating (ved hjælp af porte beskrevet ovenfor), kompensation og autofluorescenskorrektion.
BEMÆRK: Vi bruger typisk enten brugerdefineret MATLAB-kode (f.eks. https://github.com/jonesr18/MATLAB_Flow_Analysis eller Cytoflow17), som både har en grafisk brugergrænseflade og et pythonbibliotek, der er egnet til forbehandlingsfasen og til polytransfektionsanalyse.
| Metode | Kompleks | ng fluorescerende markør | ng L7ae (fraktion) | ng Reporter (fraktion) | ng Filler DNA (fraktion) | I alt (ng) |
| Poly-transfektion 1 | 600 | |||||
| → | 1 | 150 | 75 (½) | 75 (½) | 300 | |
| → | 2 | 150 | 75 (½) | 75 (½) | 300 | |
| Poly-transfektion 2 | 600 | |||||
| → | 1 | 150 | 25 (1/6) | 125 (5/6) | 300 | |
| → | 2 | 150 | 125 (5/6) | 25(1/6) | 300 |
Tabel 2: DNA-mængder for polytransfektion demonstreret i protokollen og et eksempel på opfølgningsforsøg med indstillede plasmidforhold. Den øverste halvdel af tabellen viser sammensætningen af plasmider anvendt i et simpelt polytransfektionseksperiment. Den nederste halvdel viser sammensætningen af et opdateret eksperiment, der justerer plasmidforholdene for bedre at underprøve et hypotetisk koncentrationsrum, hvor genekspressionsmodulatoren er i et mere optimalt 1: 5-forhold i forhold til sin reporter, hvilket giver flere transfekterede celler til prøve omkring dette forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I figur 1 sammenligner vi co-transfektion med poly-transfektion. I en co-transfektion leveres alle plasmider i den samme transfektionsblanding, hvilket resulterer i høj korrelation mellem mængden af hvert plasmid, som en enkelt celle modtager (figur 1A). Mens antallet af samlede plasmider, der leveres til hver celle, varierer betydeligt, er fluorescensen af de to reporterproteiner i de enkelte celler på tværs af befolkningen godt korreleret, hvilket indikerer, at de to plasmider leveres sammen i et ret konstant forhold. Transfekterede celler kan optage få eller mange komplekser, men da hvert kompleks har korrelerede mængder af hvert plasmid, udforsker co-transfektionen kun et lille diagonalt område af koncentrationsrummet mellem de to plasmider. I modsætning hertil leveres plasmider i en polytransfektion i flere transfektionskomplekser, hvilket resulterer i dekorreleret levering af plasmider i forskellige transfektionsblandinger (figur 1B). Transfekterede celler optager forskellige kombinationer af komplekserne, hvilket resulterer i celler, der indeholder varierende doser af plasmider fra hverken, et eller begge komplekser.
Figur 2 viser en repræsentativ poly-transfektion arbejdsgang. Generelt består et polytransfektionseksperiment af følgende trin: definere problemet, oprette transfektionsblandingerne, inkubere cellerne, flowcytometri og analyse. Der er også et valgfrit trin til at gentage polytransfektionen med optimerede delforhold, hvis de indledende polytransfektionsresultater ikke er i stand til præcist at indsnævre de optimale delforhold. Disse trin er beskrevet i protokollen.
I figur 3 gives nogle eksempler på veludførte co- og polytransfektioner og almindelige fejl. Figur 3A viser en veludført co-transfektion med en tæt sammenhæng mellem TagBFP og eYFP-ekspressive plasmider, der blev leveret sammen. I modsætning hertil viser co-transfektionen i figur 3B dårlig korrelation mellem disse to plasmider. I den viste figur skyldes den dårlige korrelation tilsætning af forstærkerreagens til det reducerede serummedium, før plasmiderne blev tilsat. En sådan dårlig korrelation i eksperimenterne kan også skyldes, at forskellige promotorer driver ekspression af de fluorescerende proteiner, dårlig blanding under transfektionsblandingsdannelse eller tillader komplekset at inkubere i for kort eller for langt interval.
Figur 3C viser en veludført polytransfektion med god dækning af det todimensionelle rum og god kompensation for enhver spektral gennemblødning mellem fluorescerende proteiner. Figur 3D viser polytransfektionsdata med et lavt antal levende celler, hvilket er vanskeligt at opdele i nok bakker med et tilstrækkeligt antal celler i hver skraldespand til analyse. For at forbedre dette problem skal startcellepopulationen være ved godt helbred og ikke tilgroet, og den eksperimentelle toksicitet reduceres ved anvendelse af et andet transfektionsreagens og / eller transfektering med mindre total DNA. Figur 3E viser en polytransfektion, hvor transfektionseffektiviteten var dårlig, hvilket igen resulterede i sparsom dækning af det todimensionelle analyserum. I dette tilfælde er antallet af celler, der passerer morfologi gating, højt, men cellerne udtrykker ikke fluorescerende proteiner. For at forbedre effektiviteten bør valg af transfektionsreagens optimeres, og producentens protokol følges nøje. Hver transfektionsblanding skal indeholde en tilsvarende mængde DNA-masse, hvilket sikrer, at cellerne har en omtrent lige chance for at modtage hver type kompleks, og hver transfektionsblanding skal laves i overensstemmelse med kitinstruktionerne. Forskellige transfektionssæt er optimale til forskellige celletyper; Det kit, der giver den bedste effektivitet i celletypen af interesse, skal bruges. Endelig er nogle celletyper vanskelige at transfektere, uanset hvilket sæt der anvendes. I disse tilfælde skal et større antal celler transfekteres, og så mange som muligt indsamles under flowcytometri for at sikre et tilstrækkeligt antal celler til analyse. Figur 3F viser polytransfektionsdata, hvor en af fluorescerende proteinmarkører tydeligt viser spektral gennemblødning til et andet fluorescerende protein. Enkeltfarvekontroller skal altid køres for alle fluorescerende proteiner i systemet og bruges til at generere en kompensationsmatrix, der skal anvendes på alle polytransfektioner før analyse.
Når man udfører polytransfektionseksperimenter for første gang (samlet eller for et nyt eksperimentelt system), bør man udføre benchmarking mod standard co-transfektion. En tilgang er individuelt at måle input-output overførselsfunktionen for vigtige systemdele ved hjælp af både co-transfektion (via tuning DNA-doser) og polytransfektion.
I figur 4 demonstrerer vi benchmarking af den translationelle repressor L7Ae, her tilpasset fra den originale polytransfektionspublikation10. L7Ae er et RNA-bindende protein, der genkender RNA kink-turn (KT) motiver20; når to KT'er (2xKT) placeres i 5' uoversat region (UTR) af et mRNA, kan downstream open reading frame (ORF) oversættelse effektivt undertrykkes af L7Ae21. L7Ae er tidligere blevet brugt til at opbygge RNA-baserede celletypeklassifikatorer21 og andre RNA-baserede kredsløb22. For at teste L7Ae ved standard co-transfektion kan man indstille forholdet mellem plasmiderne, der koder for L7Ae, og dets målreporter inden for forskellige transfektionsblandinger (figur 4A og tabel 3). Til polytransfektion skal man uafhængigt levere konstitutiv L7Ae og tilsvarende 2xKT-reporter i separate transfektionsblandinger, således at en bred vifte af plasmidforhold leveres til cellerne (figur 4B). Efter udførelse af transfektion og flowcytometri kan dataanalyse udføres. For at gøre dataene sammenlignelige kan man samle de individuelle co-transfektionsresultater i et enkelt datasæt og derefter udføre en lignende multidimensionel binning som polytransfektionsdataene (figur 4C, D). Ved at sammenligne dosis-responskurverne for L7Ae, der undertrykker outputrapporteren, kan det ses, at medianudgangsniveauet pr. beholder er meget ens mellem co-transfektions- og polytransfektionsdataene (figur 4E-G).
Generelt har vi set, at polytransfektionsdata korrelerer godt med co-transfektionsdata på tværs af brede DNA-forhold, med mindre præcision ved meget skæve DNA-doseringsforhold (delvis på grund af lavere celledækning i skraldespande til polytransfektionseksperimenter, især for dele, der er meget stærkt aktive ved lave plasmiddoser). For at forbedre målenøjagtigheden for sådanne følsomme dele kan deres ekspressionsniveau reduceres med en svagere promotor, opstrøms åbne læserammer18 eller mikroRNA-hæmningsmedierede finjusteringer (miSFIT'er)19.
Figur 5 viser en vellykket anvendelse af polytransfektion til optimering af en celletypeklassifikator, igen tilpasset fra Gam et al10. Klassifikatoren er et relativt simpelt design, der producerer et output som reaktion på ekspression af miR-21-5p, et miRNA overudtrykt i mange tumorceller23. I fravær af miR-21 undertrykkes klassifikatoroutput af en bakterielt afledt transkriptionsrepressor, BM3R124, hvis tilpasning tidligere viste sig at virke i pattedyrceller25. Når miR-21 er til stede, binder den fire målsteder placeret i både 3' og 5' UTR'erne i BM3R1, hvilket slår dens udtryk ned og derved tillader outputtranskription (figur 5A). For at optimere dette system blev de tre kredsløbskomponenter leveret i separate transfektionsblandinger: (1) BM3R1 (med miR-21 målsteder), (2) output reporter (mKO2) og (3) Gal4-VP16, som aktiverer transkription af output (tabel 4). Bemærk, at outputpromotoren fungerer på logikken (Gal4-VP16) og ikke BM3R1, som undertrykker output selv i nærværelse af Gal4-VP1625. Hver del koder for henholdsvis en transfektionsmarkør, TagBFP, mNeonGreen og iRFP720 på det samme plasmid for at indikere den relative DNA-dosering af hvert kompleks. Generelt bør øget Gal4-VP16-ekspression øge reporterens mKO2-output, mens øget BM3R1-ekspression bør resultere i lavere mKO2-output. Fordi BM3R1 slås ned af miR-21-5p, bør outputekspressionen være højere i HeLa-celler, som har højere niveauer af miR-21-5p og dermed udtrykker mindre BM3R1 end i HEK-celler.
Efter polytransfektion i både HEK293- og HeLa-celler opnåede vi en 3D-fordeling af forskellige plasmidforhold (figur 5B-HEK-celler). Gam et al.10 delsamplede denne fordeling i forskellige forhold ved at overveje celler inden for en bestemt euklidisk afstand fra et interesseforhold; Denne afstand skal være stor nok til at omfatte nok celler til at muliggøre statistisk signifikante resultater fra analysen, men smal nok til at undgå unødig støj fra at inkludere et for bredt sæt komponentforhold mellem de tre dele. Gam et al.10 brugte derefter en optimeringsalgoritme til at identificere forholdet mellem dele, der maksimerede klassificeringsnøjagtigheden for co-transfektion (dvs. transfekterede HeLa-celler er positive for outputekspression, mens transfekterede HEK-celler ikke er). Det optimale forhold mellem delene viste sig at være 10,9:1,5:1: Gal4-VP16:output:BM3R1; celler, der er deludtaget omkring det optimale forhold inden for hele polytransfektionsrummet, er vist i figur 5C. Denne delsampling forudsagde, at det co-transfekterede kredsløb ved dette forhold har en 91% specificitet, 62% følsomhed og 77% nøjagtighed ved klassificering af HEK293 versus HeLa-celler (figur 5D). Co-transfektion med plasmidforhold indstillet til dette optimale gav endnu bedre resultater: 99% specificitet, 68% følsomhed og 84% nøjagtighed10. Endvidere styrede forholdene implementeringen af en enkeltplasmidversion af kredsløbet med relativ ekspression indstillet ved hjælp af forskellige afkortede promotorer og opstrøms ORF'er (uORF'er), hvilket gav et kredsløb med 91% specificitet, 90% følsomhed og 90% nøjagtighed10. Polytransfektion er således et kraftfuldt værktøj til at styre designet af celleklassifikatorer og genkredsløb mere bredt.
Figur 1: Sammenligning af co-transfektion og polytransfektion. (A,B) Oversigt over og sammenligning af plasmidafgivelse med co-transfektion af to plasmider og polytransfektion af to plasmider. For hver transfektionsmetode viser diagrammet længst til venstre dannelsen af transfektionskomplekser mellem negativt ladet DNA og positivt ladede lipider. I disse eksempler koder hvert farvet plasmid (blåt og rødt) ekspressionen af et andet fluorescerende protein. Centerdiagrammet viser eksempler på plasmidlevering til celler og også et skema for de forventede fordelinger i et histogram eller spredningsplot. Farveintensitet på histogrammet svarer til fluorescens fra den tilsvarende plasmidfarve. Diagrammet yderst til højre viser reelle data fra celler transfekteret ved hjælp af hver given metode. (A) I en co-transfektion med to forskellige plasmider blandes begge plasmider sammen, før der tilsættes transfektionsreagens, hvilket resulterer i stærkt korreleret emballering af de to plasmidarter. I faktiske co-transfektionsdata udviser celler korreleret levering af begge plasmider (højre). (B) I en polytransfektion blandes hvert sæt co-leverede plasmider svarende til en kredsløbsdel og en transfektionsmarkør separat med transfektionsreagenset, hvilket resulterer i komplekser, der kun indeholder disse plasmider (venstre). I faktiske polytransfektionsdata udforsker celler en bred vifte af koncentrationsrum med mange forskellige plasmidstøkiometrier udforsket samtidigt (højre). Dette tal er ændret fra10. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Poly-transfektion arbejdsgang. Trin 1: Definer problemet. Start med et system med flere komponentdele, hvor det ideelle forhold mellem dele er ukendt, og vælg et startforhold mellem komponentdele. Trin 2: Opret transfektionsblandingerne. Hver transfektionsblanding indeholder en kredsløbskomponent og en fluorescerende transfektionsmarkør. Mængden af kredsløbsdel, der leveres til en celle, korrelerer med markørens fluorescens. Trin 3: Inkuber cellerne. I en typisk arbejdsgang inkuberer vi celler i 48 timer mellem transfektion og flowcytometri. Trin 4: Flowcytometri. Kør de relevante kontrolelementer, som beskrevet i protokollen, og kør derefter eksemplerne. Trin 5: Analyse.Brug transfektionsmarkørerne til at placere cellerne i henhold til mængden eller forholdet mellem dele, som cellen modtog. Brug udgangsproteinerne til at måle kredsløbets ydeevne. Find skraldespande/forhold mellem dele, der optimerer kredsløbets ydeevne. Trin 6: Gentag med optimerede delforhold (valgfrit). Hvis de optimale beholdere/forhold er ved meget skæve forhold, kan pilotpolytransfektionen muligvis ikke indsnævre de optimale delforhold præcist. Gentag polytransfektionen med indstillede delforhold, således at en celle, der modtog en lige stor mængde af hver transfektionsblanding, nu modtager et tæt på optimalt forhold mellem dele, som bestemt af den foregående runde. Dette tal er ændret fra10. Billedet af en inkubator blev brugt fra Servier Medical Art og billedet af et cytometer fra BioRender. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative positive og negative polytransfektionsresultater . (A) Veludført co-transfektion af to fluorescerende reportere, der viser en tæt sammenhæng. I alt 20.000 celler er plottet både her og i (B) til sammenligning. Det er en god ide at udføre en lignende lille forsøgs co-transfektion af to fluorescerende reportere, før du starter et polytransfektionseksperiment for at sikre, at plasmider er godt korreleret inden for transfektionsblandinger. (B) Noisier co-transfektion: plasmider er ikke godt korreleret inden for hver transfektionsblanding, hvilket kan forårsage, at fluorescerende markører i en polytransfektion er en dårlig markør for plasmidforhold. (C) Veludførte polytransfektionsresultater, der viser godt celletal, transfektionseffektivitet og kompensation. D) Lavt antal levende celler, hvilket ikke giver mulighed for delprøveudtagning i beholdere med statistisk signifikante antal celler. (E) Dårlig transfektionseffektivitet, som ikke tillader delprøveudtagning i skraldespande med statistisk signifikant antal celler. (F) Mangel på passende kompensation, hvilket får fluorescensdata til at være en dårlig proxy for mængden af fluorescerende protein i systemet. Brug enkeltfarvekontrolelementer til at bestemme en ideel lineær kompensationsmatrix, og anvend den på dataene, før du behandler den yderligere. Alle farvekontroller anbefales også afhængigt af valg af software. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Benchmarking af polytransfektion mod co-transfektion. (A) I en co-transfektion kan et forhold mellem translationel repressor L7Ae og fluorescerende reporterplasmider testes i hver eksperimentel brønd. (B) Ved polytransfektion kan mange forhold mellem L7Ae og indberettere testes i samme brønd. Se tabel 3 for detaljer om polytransfektionsplasmidblandingerne. (C,D) Binning workflow til benchmarking af polytransfektion mod flere co-transfektioner. I alt 10 bieksponentielt adskilte beholdere blev tildelt for hver transfektionsmarkørdimension, som tilnærmer niveauerne af hver af de to plasmider. Her vises skraldespande, der angiver forskellige niveauer af plasmid #2. Binning blev udført på både et samlet sæt af 11 co-transfektionsprøver, der spænder over forskellige plasmidforhold (C) og data fra en enkelt polytransfektion, der omfattede ca. 500.000 celler hver (D). Farver svarer til sæt af skraldespande defineret af gen 2 (TagBFP) niveauer. (E-G) Benchmarking af polytransfektion mod co-transfektion for et repræsentativt kredsløb. Median output fluorescens blev evalueret for cellerne i hver beholder og sammenlignet mellem metoder til det repræsentative system, L7Ae translationel undertrykkelse. E) Konstruktioner til måling af L7Ae-aktivitet. mKO2-fluorescens fungerer som et estimat for levering af L7Ae (gen #1), mens TagBFP-fluorescens fungerer som et estimat for levering af det regulerede mNeonGreen-output (gen #2). F) Multidimensionale titreringskurver for L7Ae. Hver linje repræsenterer sættet af placeringer på et niveau af TagBFP, som angivet i (C) og (D). Ubrudte linjer angiver polytransfektionsdata, mens stiplede linjer angiver co-transfektionsdata. På hvert binned niveau af reporterplasmid falder reporteroutputtet, når L7Ae stiger. (G) Visuel sammenligning mellem co-transfektion og polytransfektion for L7Ae-systemet. Hvert punkt repræsenterer det målte output i tilsvarende beholdere til polytransfektions- og co-transfektionsmålinger, hvor flere ækvivalente værdier er tættere på den røde 1:1-linje. Samlet set er de forskelle, der observeres mellem polytransfektions- og co-transfektionsafledte lave, hvilket giver tillid til pålideligheden af polytransfektionsmetoden. Dette tal er ændret fra10. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Dataanalyse for polytransfektion. Ved polytransfektion kan celler grupperes i bakker eller skiver til analyse. Figur 4 viser en form for analyse, hvor cellerne er binned i skiver, der svarer til niveauer af en systemkomponent, såsom reporterplasmidniveau, hvilket kan være nyttigt til modeltilpasning og forståelse af doseringsresponser. En anden nyttig strategi er at analysere kredsløbets ydeevne ved forskellige forhold mellem kredsløbskomponenter. (A) Diagram over et klassificeringskredsløb til optimering. Niveauer af TagBFP, NeonGreen og iRFP720 svarer til niveauer af henholdsvis BM3R1, output mKO2 og Gal4-VP16. Se tabel 4 for detaljer om polytransfektionsplasmidblandingerne. (B) Eksperimentel opsætning af polytransfektionsblandinger. (C) Flowcytometridata indsamlet fra polytransfektion med kredsløbet i (A). Niveauerne af hver af de tre reporter fluorescerende proteiner som følge af kredsløbspolytransfektion i HEK celler, der viser den brede vifte af kredsløbskomponentforhold, der findes i dataene. Lignende resultater blev opnået fra kredsløbstransfektion i både HEK og HeLa celler. D) Delprøveudtagning af polytransfektion i et bestemt forhold. For at analysere dataene scannede vi et stort antal forhold mellem kredsløbskomponenter og bestemte klassificeringsydelsen ved hvert forhold. Som et eksempel viser vi her et bestemt forhold, der viste god ydeevne (Gal4-VP16 = 435 ng DNA, reporter = 60 ng og BM3R1 = 40 ng). Afbildet i blåt er det tilsvarende forhold mellem fluorescerende markører for de tre forskellige kredsløbskomponenter. Dernæst undersamplede vi dataene ved kun at overveje punkter inden for en bestemt euklidisk afstand fra fluorescensbanen. Vi delsamplede celler i samme bane fra både HEK og HeLa transfektioner. (E) Sammenligning af kredsløbets ydeevne ved samme bane i HEK og HeLa-celler. Ved at sammenligne statistikker som følsomhed, specificitet og nøjagtighed af klassificering på tværs af mange forhold kan komponentforhold optimeres til at generere et ideelt genetisk kredsløb. Dette tal er ændret fra10. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Kompleks | ng L7Ae plasmid | ng Reporter plasmid | OptiMEM (μL) | P3000 (μL) | Lipo 3000 (μL) |
| 1 | 250 | 75 | 1.5 | 1.5 | |
| 2 | 250 | 75 | 1.5 | 1.5 |
Tabel 3: Transfektionsblandinger svarende til figur 4. HEK293-celler blev polytransfekteret med disse transfektionsblandinger i en brønd i en 24-brøndplade.
| Kompleks | ng BM3R1 plasmid | ng Gal4-VP16 plasmid | ng Reporter plasmid | OptiMEM (μL) | P3000 (μL) | Lipo 3000 (μL) |
| 1 | 900 | 75 | 1.5 | 1.5 | ||
| 2 | 900 | 75 | 1.5 | 1.5 | ||
| 3 | 900 | 75 | 1.5 | 1.5 |
Tabel 4: Transfektionsblandinger svarende til figur 5. HEK293 og HeLa-celler blev hver polytransfekteret med disse transfektionsblandinger i en brønd hver af en 6-brønds plade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hurtige prototypemetoder som computerstøttet design (CAD), breadboarding og 3D-udskrivning har revolutioneret mekaniske, elektriske og civilingeniørdiscipliner. Evnen til hurtigt at søge gennem mange mulige løsninger på en given udfordring fremskynder i høj grad fremskridt inden for et felt. Vi mener, at polytransfektion er en analog teknologi til biologisk teknik, der muliggør hurtig prototyping af genetiske kredsløb. Derudover kræver andre hurtige prototypeteknologier praktisk sekventiel iteration af flere mulige løsninger, mens polytransfektion er i stand til at udforske mange løsninger samtidigt. Polytransfektion gør det muligt at teste et stort antal kombinationer af genetiske kredsløbskomponentforhold i en enkelt brønd og er blevet brugt til at optimere flere offentliggjorte genetiske kredsløb10,11,13. Den eksperimentelle protokol er en simpel udvidelse af standard co-transfektion, hvilket giver mulighed for ligetil vedtagelse af mange pattedyrcelleforskere. Generelt ses en meget tæt overensstemmelse mellem polytransfektions- og co-transfektionsresultater10 (et eksempel er figur 4). Således kan polytransfektion anvendes i de fleste tilfælde, hvor plasmidforhold titreres inden for co-transfektionsblandinger, og output måles på enkeltcelleniveau.
Kompleksiteten og omfanget af polytransfektion øges med kompleksiteten af genetiske kredsløb for at optimere. Efterhånden som antallet af dimensioner, der skal analyseres, øges, øges de kombinatoriske forhold mellem forskellige dele og antallet af celler, der er nødvendige til deres analyse, eksponentielt. For eksempel for at optimere klassifikatoren i figur 5 blev celler transfekteret i et 6-brønds pladeformat, og data blev indsamlet på mindst 1,5 millioner levende celler. Vi har også optimeret en klassifikator med en ekstra kredsløbskomponent 10, hvilket kræver transfektion på en10 cm pladeskala og indsamling af millioner af celler. På den skala og derover er DNA-produktion tidskrævende, og transfektionsreagenser er dyre. Når det er sagt, bruger polytransfektion størrelsesordener mindre celler, DNA og transfektionsreagenser end at teste et sammenligneligt antal kredsløbskomponentkombinationer i individuelle brønde. Derudover spares en betydelig mængde tid ved at gøre størrelsesordener færre transfektionsblandinger.
Polytransfektion muliggør avancerede analysemetoder til flowcytometridata. De to hovedmetoder er (1) binning af celler i henhold til ekspressionen af hver transfektionsmarkør og (2) ekstraktion af celler i definerede forhold mellem transfektionsmarkører og derved simulering af co-transfektion. Førstnævnte vælger celler med en specifik kombination af DNA-dosering for hvert kompleks (og dermed hver del), hvilket giver input-output overførselsfunktioner. Sidstnævnte vælger celler i et specifikt forhold mellem DNA-doser for hver del, der simulerer co-transfektion ved et sådant forhold mellem plasmid-DNA-masser. Afbildning af ekspressionsniveauet for kredsløbsoutputreporter(e) i delstikprøvemarkeringerne giver et mål for output på de definerede niveauer eller forhold mellem input. Til kredsløbsoptimering kan man identificere de bedst ydende bins / ratios som defineret af formålet med kredsløbet - i tilfælde af celleklassifikatorer er dette bins / ratios, hvor kredsløbet er ON i målcelletypen og OFF i ikke-målcelletyper. Når man vælger en beholderstørrelse, skal man tage højde for det krævede præcisionsniveau samt antallet af celler pr. Beholder. Mindre skraldespande fokuserer mere præcist på den ideelle kombination af kredsløbskomponenter, men hvis en skraldespand har for få celler, kan den introducere uønsket støj til målingerne.
Fremtidige forbedringer i beregningsanalyse af polytransfektionsdata kan lette optimering, selv med lav celledækning pr. Beholder / forhold. I øjeblikket ekskluderer vi data fra placeringer med færre end en indstillet tærskel for celler (f.eks. 10) for at undgå alt for støjende målinger. I kombination med gentagne målinger muliggør dette mere nøjagtige og præcise beregninger af dosis-responskurver, klassificeringsakraknøjagtigheder og andre målinger, der er defineret pr. beholder. Imidlertid kan hver celle i polytransfektion betragtes som et uafhængigt eksperiment, der måler kredsløbets output (er) med en fin opløsning på et præcist niveau af input. Med dette i tankerne kan mekanistiske og fænotypiske modeller af dosisresponser og kredsløbsoptimeringer passe direkte til fordelingen af genekspression fra hver markør og reporter snarere end deres binned summariske statistikker10. Dette muliggør mere robuste målinger og udnytter de mange individuelle datapunkter, der indsamles pr. Eksperiment. Sådanne modelleringsmetoder kunne derved give prædiktiv kredsløbskarakterisering og optimering selv med sparsomt samplede højdimensionelle polytransfektioner. Desuden kan maskinlæringsmetoder såsom responsoverflademetode og tilfældig skovregression bruges til at analysere relativt sparsomme, højdimensionelle data10.
En alternativ tilgang til stadig større polytransfektioner er sekventielt at optimere kredsløb ved hjælp af hierarkier af polytransfektioner. I denne tilgang bruges polytransfektion først til at optimere et modul, der omfatter en delmængde af genetiske komponenter inden for et større kredsløb. Derefter leveres disse optimerede moduler som separate polytransfektionsblandinger, hvilket gør det muligt at finde det optimale forhold / dosering for hvert kredsløbsmodul. Denne tilgang bruger et signifikant lavere antal celler, DNA og transfektionsreagenser. Grupper af komponenter er imidlertid ikke nødvendigvis modulære i forhold til andre komponenter, og derfor kan et optimalt forhold mellem komponenter i et modul målt isoleret set være suboptimalt inden for den større kredsløbskontekst8.
Polytransfektionsmetoder er også begrænset af laser-/filterkonfigurationen af flowcytometeret, der bruges til at indsamle data. Ud over målte fluorescerende output indeholder hver transfektionsblanding en fluorescerende proteinmarkør. Det er således afgørende at vælge fluorescerende proteiner, der kan kompenseres godt på cytometeret. Vi analyserede tidligere systematisk gennemblødningen af et panel af 22 fluorescerende proteiner på et fem-laser flowcytometer (BD LSRFortessa) og fandt ud af, at sættet Sirius, TagBFP, mNeonGreen, mKO2 og iRFP720 kunne bruges sammen og kompenseres godt uden væsentlige problemer10. Optimering af større kredsløb kan dog kræve avancerede cytometrimetoder, såsom spektral cytometri for at adskille fluorescerende proteiner med mere overlappende spektre, som vores laboratorium i øjeblikket optimerer med op til otte fluorescerende proteiner. Databaser som fluorescerende proteindatabase (https://www.fpbase.org) er nyttige til udvælgelse af fluorescerende proteiner med særlig spektral overlapning. Denne proces kan imidlertid kompliceres af forskellige faktorer, hvoraf nogle er specifikke for bestemte cytometre. For eksempel kan brugen af visse røde proteiner som tdTomato kun resultere i uønsket gennemblødning i blå kanaler i visse laser-/filterkonfigurationer10. Derudover har flere langt røde proteiner vist ikke-lineære forhold mellem DNA-dosering og fluorescensoutput10, hvilket reducerer deres anvendelse som effektive markører for DNA-dosering.
For konsistens på tværs af eksperimenter, der udføres med varierende antal komplekser (en, to, tre osv.), Er det nyttigt at anvende den samme brøkdel af plasmid pr. Transfektionsblanding. For eksempel, hvis man tester et tre-gensystem med hvert gen kodet i et af tre plasmider (A, B og C), kunne man co-transfektere kredsløbsplasmiderne i et forhold på 1: 1: 1 sammen med et lige forhold mellem et plasmid, der koder for en transfektionsmarkør. Dette ville gøre hvert plasmid til en fjerdedel af blandingens samlede masse og dermed ca. en fjerdedel af massen af hvert transfektionskompleks, der dannes. Når polytransfektering af A, B og C i separate komplekser med deres egne reportere, i stedet for at blande plasmiderne 1: 1 med reportere eller opretholde deres samlede DNA-masse, er det mere konsekvent at holde hvert plasmid på en fjerdedel af massen af hvert kompleks, hvor fyldstof-DNA optager den resterende masse (se eksempel i tabel 5 ). Dette skyldes, at fordelingen af genekspression blandt transfekterede celler afhænger mindre af den samlede masse af DNA, der leveres i komplekserne, og mere af den brøkdel af DNA i hvert kompleks10. Hvis der ønskes andre forhold end 1:1:1, beregnes de tilsvarende fraktioner af den totale DNA-masse i transfektionsblandingen for hver del. Tabel 5 [nederst] viser f.eks. forholdet 1:1:4.
| Metode | Kompleks | ng A (brøkdel) | ng B (fraktion) | ng C (fraktion) | ng Reporter (fraktion) | ng Filler DNA (fraktion) | I alt (ng) |
| Co-transfektion | 1 | 150 (¼) | 150 (¼) | 150 (¼) | 150 (¼) | 0 (0) | 600 |
| Poly-transfektion | 600 | ||||||
| → | 1 | 50 (¼) | 50 (¼) | 100 (½) | 200 | ||
| → | 2 | 50 (¼) | 50 (¼) | 100 (½) | 200 | ||
| → | 3 | 50 (¼) | 50 (¼) | 100 (½) | 200 | ||
| Co-transfektion | 1 | 75 (⅛) | 75 (⅛) | 300 (½) | 150 (¼) | 0 (0) | 600 |
| Poly-transfektion | 600 | ||||||
| → | 1 | 25 (⅛) | 50 (¼) | 125 (⅝) | 200 | ||
| → | 2 | 25 (⅛) | 50 (¼) | 125 (⅝) | 200 | ||
| → | 3 | 100 (½) | 50 (¼) | 50 (¼) | 200 |
Tabel 5: Eksempler på anvendelse af fyldstof-DNA til konsistens på tværs af co- og polytransfektionseksperimenter. Her vises to generiske eksempler på co-transfektering af tre plasmider med samme mængde fyldstof-DNA. I det øverste eksempel er plasmiderne alle i lige store masser. I det nederste eksempel leveres et plasmid med en højere masse sammenlignet med de andre. Den brøkdel af totalt DNA, der ville blive anvendt i et co-transfektionskompleks, transmuteres til polytransfektionskomplekser, hvor den resterende mængde DNA (op til den samlede mængde for hvert kompleks, som er fast og ens på tværs af komplekser) konstitueret med fyldstof-DNA.
Det overordnede mål med fyldstof-DNA er at opretholde lignende doser plasmider pr. Celle, uanset antallet af unikke transfektionsblandinger. Som en grov tilnærmelse af dette princip reducerer adskillelse af tre plasmider i tre blandinger, samtidig med at den samme DNA-masse af hver (og det passende forhold mellem transfektionsreagens) procentdelen af celler, der modtager et givet kompleks med en tredjedel sammenlignet med en enkelt blanding indeholdende alle tre plasmider. Imidlertid modtager hver transfekteret celle efterfølgende en ~ 3x højere gendosering. Reduktion af den relative mængde plasmider alene uden fyldstof-DNA er således utilstrækkelig til at opretholde konsistente plasmiddoser, da dette simpelthen reducerer transfektionseffektiviteten uden at ændre den underliggende ekspressionsfordeling blandt de transfekterede celler10. På den anden side giver fyldstof-DNA mulighed for at justere DNA-doseringen uden at påvirke den samlede transfektionseffektivitet (selvom detekterbare transfekterede celler kan falde på grund af lavere signal)10. Efter den rå tilnærmelse ovenfor opretholder reduktion af fraktionen af DNA i polytransfektionsblandingerne til en tredjedel og tilsætning af fyldstof-DNA de relative gendoser sammenlignet med den oprindelige co-transfektion. Filler DNA sikrer derfor effektiv og nøjagtig transfektionskompleks dannelse.
For at ændre ekspressionsområdet for et gen af interesse, der er dækket af dets reporter, kan brøkdelen af hvert testplasmid og / eller promotorer, der bruges til at drive genet der, indstilles i forhold til indberetteren. Hvis en del er stærk/meget aktiv ved lave DNA-doser, kan brug af en lavere DNA-fraktion hjælpe med at centrere det dynamiske område af delen midt i fluorescensfordelingen af reporteren i transfekterede celler. Ligeledes, for dele, der er svage / kun aktive ved høje DNA-doser, ved hjælp af en højere fraktion kan være nyttigt. Man skal dog være forsigtig med en sådan indstilling, da reduktion af DNA-fraktioner for meget øger stokasticiteten af levering til cellerne sammenlignet medreporteren 10, og høje genekspressionsniveauer kan overbelaste cellulære genekspressionsmaskiner12,14. For at undgå stokasticitet og i tilfælde, hvor hvert gen leveres til celler i et fast forhold (f.eks. hvis kredsløbet skal genereres som en enkelt lenti-, PiggyBac- eller Landing Pad-vektor), kan den relative ekspression af hvert gen indstilles ved hjælp af stærkere/svagere promotorer, små uORF'er18 og/eller miSFIT'er19.
Selvom protokollen beskriver en omvendt transfektionsteknik, er polytransfektion også mulig med fremadtransfektion. Ved omvendt transfektion podes cellerne samtidigt og transfekteres; I fremadgående transfektion transfekteres cellerne ~ 24 timer efter første plettering ved ca. halvdelen af densiteten, der ville blive brugt i omvendt transfektion (for at muliggøre celledeling på tidspunktet for transfektion). Generelt er omvendt transfektion mere effektiv, men også mere giftig, og vi har bemærket nogle forskelle i form af transfektionsfordelinger baseret på reagenset, transfektionstiden og cellelinjen. Således bør den valgte transfektionsmetode optimeres for hver cellelinje for at maksimere antallet af transfekterede celler og dækningen af det flerdimensionelle koncentrationsrum for plasmiddoser pr. Celle.
Samlet set muliggør polytransfektion hurtig optimering af pattedyrs genetiske kredsløb. Mange mulige ratiometriske kombinationer af kredsløbskomponenter kan let testes i en enkelt brønd. Da polytransfektion indeholder mere information om niveauerne af hver del i et system end en konventionel transfektion, har det vist sig at være yderst værdifuldt til karakterisering af adfærd af forskellige genetiske dele10,11,12,13. Vedtagelsen af polytransfektion forventes at fremskynde tempoet i udviklingen af nye og forbedrede genkredsløb til brug i pattedyrceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
R.W. er medstifter af Strand Therapeutics og Replay Bio; R.W. og R.J. indgav et midlertidigt patent relateret til en celletypeklassifikator.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke tidligere Weiss Lab-medlemmer, der ledede eller bidrog til at udvikle polytransfektionsmetoden og dens anvendelse på celleklassifikatorer: Jeremy Gam, Bre DiAndreth og Jin Huh; andre Weiss laboratoriemedlemmer, der har bidraget til yderligere metodeudvikling/optimering: Wenlong Xu, Lei Wang og Christian Cuba-Samaniego; Prof. Josh Leonard og gruppemedlemmer, herunder Patrick Donahue og Hailey Edelstein, for at teste polytransfektion og give feedback; og professor Nika Shakiba for at invitere dette manuskript og give feedback. Vi vil også gerne takke National Institutes of Health [R01CA173712, R01CA207029, P50GM098792]; National Science Foundation [1745645]; Cancer Center Support (core) Grant [P30CCA14051, delvis] fra NCI og National Institutes of Health [P50GM098792] til finansiering af dette arbejde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15mL Corning Falcon conical tubes | ThermoFisher Scientific | 14-959-53A | |
| 24-well petri dish | Any company of choice | (Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free) | |
| Bovine serum albumin | NEB | B9000S | |
| Centrifuge | Any company of choice | Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX2000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | |
| Cytoflow | Non-commercial software package | https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/# | |
| DMEM | VWR | 10-013-CV | Use the correct media for your cell type |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 03690-100ML | |
| Fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F4135 | |
| HEK cells | ATCC | CRL-1573 | Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently. |
| HeLa cells | ATCC | CRL-12401 | Use the relevant cell type for your experiments. |
| Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer | ThermoFisher Scientific | L3000001 | Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent |
| LSRFortessa flow cytometer | BD Biosciences | N/A | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
| Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | Any company of choice | ||
| Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985070 | reduced serum medium |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Rainbow calibration beads | Spherotech | URCP-100-2H | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Trypsin | VWR | 25-053-CI |
References
- Prochazka, L., Benenson, Y., Zandstra, P. W. Synthetic gene circuits and cellular decision-making in human pluripotent stem cells. Current Opinion in Systems Biology. 5, 93-103 (2017).
- Sayeg, M. K., et al. Rationally designed microRNA-based genetic classifiers target specific neurons in the brain. ACS Synthetic Biology. 4 (7), 788-795 (2015).
- Zhen, X., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. Multi-Input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells. Science. 333 (6047), 1307-1311 (2011).
- Nissim, L., et al. Synthetic RNA-based immunomodulatory gene circuits for cancer immunotherapy. Cell. 171 (5), 1138-1150 (2017).
- Nissim, L., Bar-Ziv, R. H. A tunable dual-promoter integrator for targeting of cancer cells. Molecular Systems Biology. 6, 444 (2010).
- Mohammadi, P., Castel, S. E., Brown, A. A., Lappalainen, T. Quantifying the regulatory effect size of cis-acting genetic variation using allelic fold change. Genome Research. 27 (11), 1872-1884 (2017).
- Prochazka, L., et al. Discrete-to-analog signal pluripotent stem cells conversion in human. BioRxiv. , (2021).
- Del Vecchio, D. Modularity, context-dependence, and insulation in engineered biological circuits. Trends in Biotechnology. 33 (2), 111-119 (2015).
- Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell. Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).
- Gam, J. J., DiAndreth, B., Jones, R. D., Huh, J., Weiss, R. A 'poly-transfection' method for rapid, one-pot characterization and optimization of genetic systems. Nucleic Acids Research. 47 (18), 106 (2019).
- Jones, R. D., et al. Robust and tunable signal processing in mammalian cells via engineered covalent modification cycles. Nature Communications. 13 (1), 1720 (2022).
- Jones, R. D., et al. An endoribonuclease-based feedforward controller for decoupling resource-limited genetic modules in mammalian cells. Nature Communications. 11 (1), 5690 (2020).
- DiAndreth, B., Wauford, N., Hu, E., Palacios, S., Weiss, R. PERSIST platform provides programmable RNA regulation using CRISPR endoRNases. Nature Communications. 13 (1), 2582 (2022).
- Frei, T., et al. Characterization and mitigation of gene expression burden in mammalian cells. Nature Communications. 11 (1), 4641 (2020).
- Beal, J., Weiss, R., Yaman, F., Adler, A., Davidsohn, N. A method for fast, high-precision characterization of synthetic biology devices. Computer Science and Artificial Intelligence Laboratory Technical Report. Massachusetts institute of technology. , Cambridge. MIT-CSAIL-TR-2012-008 (2012).
- Beal, J., et al. Meeting measurement precision requirements for effective engineering of genetic regulatory networks. ACS Synthetic Biology. 11 (3), 1196-1207 (2022).
- Teague, B. Cytoflow: A Python toolbox for flow cytometry. bioRxiv. , (2022).
- Ferreira, J. P., Overton, K. W., Wang, C. L. Tuning gene expression with synthetic upstream open reading frames). Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11284-11289 (2013).
- Michaels, Y. S., et al. Precise tuning of gene expression levels in mammalian cells. Nature Communications. 10 (1), 818 (2019).
- Saito, H., et al. Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch. Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).
- Wroblewska, L., et al. Mammalian synthetic circuits with RNA binding proteins for RNA-only delivery. Nature Biotechnology. 33 (8), 839-841 (2015).
- Wagner, T. E., et al. Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells. Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043-1050 (2018).
- Sekuklu, S. D., Donoghue, M. T. A., Spillane, C. miR-21 as a key regulator of oncogenic processes. Biochemical Society Transactions. 37, 918-925 (2009).
- Stanton, B. C., et al. Genomic mining of prokaryotic repressors for orthogonal logic gates. Nature Chemical Biology. 10 (2), 99-105 (2014).
- Stanton, B. C., et al. Systematic transfer of prokaryotic sensors and circuits to mammalian cells. ACS Synthetic Biology. 3 (12), 880-891 (2014).
