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Bioengineering

Rápido Desenvolvimento de Circuitos de Identificação do Estado Celular com Poli-Transfecção

Published: February 24, 2023 doi: 10.3791/64793
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 1,3
1Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2School of Biological Engineering, University of British Columbia, 3Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology

Summary

Circuitos genéticos complexos são demorados para projetar, testar e otimizar. Para facilitar esse processo, células de mamíferos são transfectadas de forma a permitir o teste de múltiplas estequiometrias de componentes do circuito em um único poço. Este protocolo descreve as etapas para o planejamento experimental, transfecção e análise dos dados.

Abstract

Circuitos genéticos de mamíferos têm demonstrado o potencial para detectar e tratar uma ampla gama de estados de doenças, mas a otimização dos níveis de componentes do circuito permanece desafiadora e trabalhosa. Para acelerar esse processo, nosso laboratório desenvolveu a politransfecção, uma extensão de alto rendimento da transfecção tradicional de mamíferos. Na politransfecção, cada célula da população transfectada realiza essencialmente um experimento diferente, testando o comportamento do circuito em diferentes números de cópias de DNA e permitindo que os usuários analisem um grande número de estequiometrias em uma reação de pote único. Até o momento, foram demonstradas politransfecções que otimizam as proporções de circuitos de três componentes em um único poço de células; Em princípio, o mesmo método pode ser usado para o desenvolvimento de circuitos ainda maiores. Os resultados da politransfecção podem ser facilmente aplicados para encontrar proporções ótimas de DNA para co-transfect para circuitos transientes ou para escolher níveis de expressão para componentes de circuitos para a geração de linhagens celulares estáveis.

Aqui, demonstramos o uso da politransfecção para otimizar um circuito de três componentes. O protocolo começa com princípios de planejamento experimental e explica como a politransfecção se baseia em métodos tradicionais de cotransfecção. Em seguida, a politransfecção das células é realizada e seguida por citometria de fluxo alguns dias depois. Finalmente, os dados são analisados examinando fatias dos dados de citometria de fluxo de célula única que correspondem a subconjuntos de células com determinadas razões de componentes. No laboratório, a politransfecção tem sido usada para otimizar classificadores de células, controladores de feedback e feedforward, motivos biestáveis e muito mais. Este método simples, mas poderoso, acelera os ciclos de projeto de circuitos genéticos complexos em células de mamíferos.

Introduction

O campo da biologia sintética de mamíferos progrediu rapidamente, desde o desenvolvimento de partes simples de sentido e resposta em linhagens celulares cultivadas até a otimização de redes complexas de genes para enfrentar desafios do mundo real em diagnóstico e terapêutica1. Esses circuitos sofisticados são capazes de detectar entradas biológicas de perfis de microRNA a citocinas e pequenas moléculas de fármacos, e implementar circuitos de processamento lógico, incluindo transistores, filtros passa-banda, chaves de alternância e osciladores. Também têm mostrado resultados promissores em modelos animais de doenças como câncer, artrite, diabetes e muitas outras 1,2,3,4,5. No entanto, à medida que a complexidade de um circuito cresce, otimizar os níveis de cada um de seus componentes torna-se cada vez mais desafiador.

Um tipo particularmente útil de circuito genético é um classificador celular, que pode ser programado para detectar e responder a estados celulares. A produção seletiva de proteínas ou RNA em estados celulares específicos é uma ferramenta poderosa para orientar e programar a diferenciação de células e organoides, identificar e destruir células doentes e/ou tipos celulares indesejáveis e regular a função de células terapêuticas 1,2,3,4,5 . No entanto, a criação de circuitos em células de mamíferos que possam classificar com precisão os estados celulares de várias espécies de RNA e/ou proteínas celulares tem sido altamente desafiadora.

Uma das etapas mais demoradas do desenvolvimento de um circuito de classificação celular é otimizar os níveis de expressão relativa de genes de componentes individuais, como sensores e fatores de processamento, dentro do circuito. Para acelerar a otimização de circuitos e permitir a construção de circuitos mais sofisticados, trabalhos recentes têm utilizado a modelagem matemática de circuitos classificadores de células e seus componentes para prever composições e topologias ótimas 6,7. Embora isso tenha mostrado resultados poderosos até agora, a análise matemática é limitada pela necessidade de caracterizar sistematicamente o comportamento de entrada-saída de genes componentes no circuito, o que é demorado. Além disso, uma miríade de problemas dependentes do contexto pode surgir em circuitos genéticos complexos, fazendo com que o comportamento de um circuito completo desafie as previsões baseadas em caracterizações de partes individuais 8,9.

Para desenvolver e testar mais rapidamente circuitos complexos de mamíferos, como classificadores de estado celular, nosso laboratório desenvolveu uma técnica chamada politransfecção10, uma evolução dos protocolos de cotransfecção de plasmídeos. Na co-transfecção, múltiplas espécies de DNA plasmidial são complexadas juntamente com um reagente lipídico ou polimérico carregado positivamente e, em seguida, entregues às células de forma correlacionada (Figura 1A). Na politransfecção, os plasmídeos são complexados separadamente com o reagente, de modo que o DNA de cada complexo de transfecção é entregue às células de forma descorrelacionada (Figura 1B). Usando este método, as células dentro da população transfectada são expostas a numerosas combinações de razões de duas ou mais cargas úteis de DNA carregando diferentes componentes do circuito.

Para medir as proporções dos componentes do circuito entregues a cada célula, cada complexo de transfecção dentro de uma politransfecção contém um repórter fluorescente constitutivamente expresso que serve como um proxy para a captação celular do complexo. O DNA de preenchimento que não contém nenhum elemento ativo dentro de uma célula de mamífero é usado para ajustar a quantidade relativa do repórter fluorescente e dos componentes do circuito entregues a uma célula em um único complexo de transfecção e é discutido com mais detalhes na discussão. Um exemplo de DNA de preenchimento usado no laboratório de Weiss é um plasmídeo contendo uma sequência de terminador, mas sem promotor, sequência codificadora, etc. Células com diferentes proporções de componentes do circuito podem então ser comparadas para encontrar razões ideais para a função do circuito gênico. Isso, por sua vez, produz previsões úteis para a escolha de promotores e outros elementos do circuito para alcançar níveis ideais de expressão gênica ao combinar componentes do circuito em um único vetor para integração genética (por exemplo, um lentivírus, transposon ou plataforma de pouso). Assim, em vez de escolher razões entre componentes do circuito com base na intuição ou através de um processo demorado de tentativa e erro, a politransfecção avalia uma ampla gama de estequiometrias entre partes genéticas em uma reação de pote único.

Em nosso laboratório, a politransfecção permitiu a otimização de muitos circuitos genéticos, incluindo classificadores celulares, controladores de feedback e feedforward e motivos biestáveis. Este método simples, mas poderoso, acelera significativamente os ciclos de projeto de circuitos genéticos complexos em células de mamíferos. Desde então, a politransfecção tem sido usada para caracterizar vários circuitos genéticos para revelar suas funções multidimensionais de transferência de entrada-saída em alta resolução10, otimizar uma topologia de circuito alternativo para classificação de estado celular 11 e acelerar vários projetos publicados12,13 e em andamento.

Aqui descrevemos e descrevemos o fluxo de trabalho para o uso da politransfecção para otimizar rapidamente um circuito genético (Figura 2). O protocolo mostra como gerar dados de politransfecção de alta qualidade e evitar vários erros comuns no protocolo de politransfecção e na análise dos dados (Figura 3). Em seguida, demonstra como usar a politransfecção para caracterizar componentes de circuitos simples e, no processo, comparar os resultados da politransfecção com a cotransfecção (Figura 4). Finalmente, os resultados da politransfecção mostram otimização do circuito classificador de câncer (Figura 5).

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Protocol

NOTA: A Tabela 1 e a Tabela 2 servem como referências significativas para este protocolo. A Tabela 1 mostra a escala de reagentes para as reações, e a Tabela 2 mostra a aritmética da razão de DNA para um exemplo de politransfecção descrito no protocolo (metade superior) e para um possível experimento de seguimento (metade inferior).

1. Preparação das células para transfecção

  1. Certifique-se de que a cultura de células de rim embrionário humano (HEK293) seja 60%-80% confluente antes de iniciar o protocolo. Para isso, semeie 1 x 106 células em uma placa de Petri de cultura de tecido de 100 mm x 15 mm 2 dias antes e incube a 37 °C com 5% de CO2.
    NOTA: Embora nosso protocolo se concentre em células HEK293, outros tipos de células podem ser substituídos.
  2. Prepare os meios e células para transfecções conforme descrito abaixo.
    1. Pré-aquecer pelo menos 20 ml de uma solução de meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de aminoácidos não essenciais (NEAA; ver Tabela de Materiais) a 37 °C. Pré-aquecer pelo menos 2,4 mL de tripsina e 2,4 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 37 °C também. Meio de soro pré-aquecido reduzido para ~16 °C.
      OBS: Todo trabalho de cultura de tecidos deve ser realizado com cuidado em uma cabine de biossegurança.
  3. Ressuspenda as células na solução DMEM conforme descrito abaixo.
    1. Aspirar e descartar os meios atuais. Dispensar 2 mL de PBS na cultura de células HEK293 para lavar as células. Aspirar e eliminar o PBS.
    2. Dispensar 2 mL de tripsina na cultura celular HEK293. Coloque a placa de Petri em uma incubadora a 37 °C por 3 min ou até que as células não aderam mais à placa. Devolver a placa ao armário de biossegurança e diluir a solução celular dispensando 8 ml de solução de DMEM na placa.
    3. Misture a solução pipetando suavemente para cima e para baixo várias vezes. Aspirar todo o meio e colocá-lo em um tubo cônico de 15 mL.
  4. Centrifugar as células a 300 x g por 3 min para pastilha-las. Aspirar o meio (tomando cuidado para não aspirar as células) e descartá-lo. Ressuspender as células em 5 mL de solução de DMEM, misturando suavemente pipetando para cima e para baixo.
  5. Estime a concentração celular atual usando um contador de células automatizado (listado na Tabela de Materiais). Semeando seis poços (neste exemplo) em uma placa de 24 poços com 1 x 105 células (para uma densidade de semeadura de 50.000 células/cm2).
  6. Adicione a solução de DMEM até 500 μL (adicione a solução de DMEM aos poços primeiro) e, em seguida, rotule um poço por tratamento da seguinte forma: nenhum controle de cor, controle mKO2, controle TagBFP, controle NeonGreen, controle de todas as cores e politransfecção 1. Os poços de controle TagBFP, mKO2 e NeonGreen são controles de cor única para todas as proteínas fluorescentes incluídas na politransfecção.

2. Realização da transfecção

  1. Prepare tubos para cada agregado de DNA. Separe tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e rotule os tubos como: nenhum controle de cor, controle mKO2, controle TagBFP, controle NeonGreen, controle de todas as cores, mistura de politransfecção 1 e mistura de politransfecção 2.
    1. Adicione 36 μL de meio de soro reduzido ao controle sem cor, controle mKO2, controle TagBFP, controle NeonGreen e todos os tubos de controle de cor. Adicionar 18 μL de soro reduzido a cada um dos tubos da mistura de politransfecção 1 e da mistura de politransfecção 2.
      NOTA: As concentrações plasmidiais são assumidas como sendo 150 ng/μL.
    2. Adicione 600 ng de plasmídeo de enchimento ao tubo de controle sem cor. Adicione 300 ng de mKO2 e 300 ng de plasmídeo de enchimento ao tubo de controle de cor mKO2. Adicione 300 ng de TagBFP e 300 ng de plasmídeo de enchimento ao tubo de controle de cor TagBFP.
    3. Adicionar 300 ng de plasmídeo constitutivo NeonGreen e 300 ng de plasmídeo de enchimento ao tubo de controle de cor NeonGreen. Adicione 100 ng cada de mKO2, TagBFP e NeonGreen constitutivo, bem como 300 ng de plasmídeo de enchimento, ao tubo de controle de todas as cores.
    4. Adicionar 150 ng de mKO2 ao tubo de mistura de politransfecção 1. Adicione 75 ng de plasmídeo NeonGreen e 75 ng de plasmídeo de enchimento ao tubo de mistura de politransfecção 1.
    5. Adicione 150 ng de TagBFP ao tubo de mistura de politransfecção 2. Adicionar 75 ng de plasmídeo L7ae e 75 ng de plasmídeo de enchimento ao tubo de mistura de politransfecção 2.
  2. Crie a mistura mestre de transfecção em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL combinando 216 μL de meio de soro reduzido com 9,48 μL de reagente de transfecção (consulte a Tabela 1 para proporções de reagentes e escala de reação). Misture bem, pipetando para cima e para baixo, e reserve.
  3. Adicione 1,58 μL de reagente intensificador a cada um dos tubos sem controle de cor, controle de cor única e todos os tubos de controle de cor. Adicionar 79 μL de reagente potenciador a cada um dos tubos de mistura de politransfecção. Misture cada tubo individualmente pipetando vigorosamente.
  4. Adicione a mistura mestra de transfecção a cada tubo contendo DNA.
    1. Adicione 37,58 μL de mistura mestre de transfecção a cada um dos tubos sem controle de cor, controle de cor única e todos os tubos de controle de cor. Misture cada tubo individualmente pipetando vigorosamente.
    2. Adicionar 18,79 μL de mistura mestre de transfecção a cada um dos tubos de mistura de politransfecção. Misture cada tubo individualmente pipetando vigorosamente.
  5. Dispense as misturas de transfecção nos poços.
    1. Pipetar 65,97 μL de cada mistura de transfecção para os controles sem cor, cor única e todas as cores para os poços correspondentes.
    2. Pipetar 32,98 μL da mistura de politransfecção 1 no poço de politransfecção e girar a placa rapidamente, mas suavemente, em um padrão apertado de figura oito ao longo de uma superfície plana para distribuir os complexos de forma eficaz. Em seguida, pipetar 32,98 μL da mistura de politransfecção 2 no mesmo poço de politransfecção e girar a placa da mesma maneira.
  6. Colocar a placa em incubadora a 37 °C, com 5% de CO2 e sem agitação, por um período de 48 h.
    NOTA: Para aumentar a viabilidade celular, o meio celular pode ser substituído a cada 6 h após a transfecção (embora isso nem sempre seja necessário, e com células HEK293 e seus derivados, deve-se ter cuidado para não separar as células da placa ao trocar o meio).
Reagente Quantidade Escala
Meio de soro reduzido para mistura de DNA 36 μL por tubo de controle, 18 μL por tubo de politransfecção 0,05 μL Meio sérico reduzido/ng DNA por tubo, com 10-20% de volume extra para explicar a pipetagem
ADN 300-600 ng por tubo
P3000 1,58 μL por tubo de controle, 0,79 μL por tubo de politransfecção 0,0022 μL P3000/ng DNA por tubo, com 10-20% extra
Meio de soro reduzido para Lipo master mix 36 μL por tubo de controle, 18 μL por tubo de politransfecção 0,05 μL de DNA total do meio sérico/ng, com 10-20% de volume extra para explicar a pipetagem
Transfecção e reagente potencializador 1,58 μL por tubo de controle, 0,79 μL por tubo de politransfecção 0,0022 μL de Lipofectamina 3000/ng DNA, com 10-20% extra

Tabela 1: Escalonamento de reagentes para transfecções. A tabela indica a proporção correta de reagente a ser incluída para a quantidade de DNA incluída em um único poço. Isso pode ser usado para escalar reações de forma eficaz e formar misturas mestras. As quantidades de reagente foram dimensionadas para incluir um excesso de 20%.

3. Preparação das células para citometria de fluxo

  1. Pré-aquecer pelo menos 4,2 ml da solução de DMEM a 37 °C. Pré-aquecer pelo menos 4,2 mL de tripsina e 4,2 mL de PBS a 37 °C. Mantenha a solução tampão de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) a 4 °C até estar pronta para uso.
  2. Ressuspender as células na solução tampão FACS (PBS suplementado com BSA a 1%, ácido etilenodiaminotetracético a 5 mM [EDTA] e azida sódica a 0,1% [NaN3], para reduzir a aglomeração; ver Tabela de Materiais), conforme descrito abaixo.
    1. Aspirar e descartar os meios atuais em cada poço. Dispense 5 mL de PBS em cada poço para lavar as células. Aspirar e eliminar o PBS.
    2. Dispense 5 mL de tripsina em cada poço. Coloque o prato numa incubadora a 37 °C durante 3 minutos ou até que as células deixem de aderir ao prato. Devolver a placa ao gabinete de biossegurança e diluir as soluções celulares dispensando 5 ml de solução de DMEM em cada poço.
    3. Para cada poço, misture a solução pipetando suavemente para cima e para baixo várias vezes. Para cada poço, aspirar todo o meio e colocá-lo em um tubo cônico de 15 mL.
  3. Centrifugar as células a 300 x g por 3 min para pastilha-las. Aspirar o meio, tomando cuidado para não aspirar as células e descartá-lo. Em cada tubo, ressuspenda as células em 5 mL de solução tampão FACS, misturando suavemente pipetando para cima e para baixo.
  4. Passe cada solução de suspensão celular através de um filtro (para remover aglomerados) em tubos cônicos separados de citometria de fluxo. Mantenha esses tubos no gelo por no máximo 1 h e realize citometria de fluxo o mais rápido possível.

4. Realização de citometria de fluxo

NOTA: Operar um citômetro de fluxo requer treinamento adequado e conhecimento das tarefas necessárias. Como o software e o equipamento podem variar e os usuários devem ser treinados em geral, esta seção refere-se a operações específicas que são úteis para executar.

  1. Primeiro, examine as células transfectadas com o controle do plasmídeo de carga (sem controle de cor) para selecionar as características celulares e evitar anomalias (incluindo agregados, detritos, etc.). Embora existam muitas combinações de parâmetros para distinguir células, use as três opções gerais a seguir como uma boa maneira de visualizar características distintivas.
    1. Observe a área de dispersão lateral (log ou escala linear por preferência/tipo de célula) versus a área de dispersão direta (escala linear).
    2. Observe a altura da dispersão lateral (escala logarítmica) versus a largura da dispersão lateral (escala linear).
    3. Observe a largura de dispersão para frente (escala linear) versus a altura de dispersão para frente (escala linear).
  2. Em seguida, observe os controles de cor única. Use o controle de todas as cores para sintonizar as tensões do instrumento, de modo que os sinais de cada proteína fluorescente sejam normalizados para unidades arbitrárias equivalentes (u.a.) de fluorescência. Em seguida, execute os controles de cor única para cada proteína fluorescente, que são usados para definir a matriz de compensação, permitindo a correção de sangria.
    NOTA: Idealmente, o intervalo dinâmico completo dos valores de fluorescência deve estar visível. A normalização adicional dos sinais de proteínas fluorescentes pode ser feita através da conversão para unidades padronizadas ( por exemplo, moléculas de fluoresceína equivalente [MEFLs; ver Beal et al.15]). Para habilitar a conversão de MEFL durante a análise, execute contas de calibração do arco-íris. Essa calibração também é útil para reduzir a variação instrumental e do sinal do dia-a-dia16.
  3. Execute o tubo de amostra de politransfecção.
    NOTA: Sempre que possível, recomenda-se executar células de 1.000 x 10^ (^ = misturas), pois as politransfecções de dimensões mais altas precisam ser subdivididas em mais compartimentos durante a análise, e cada compartimento precisa de células suficientes (idealmente >10) para fazer comparações estatisticamente significativas.

5. Realização de análise pós-experimento

  1. Inicialmente, use os dados dos controles (e, se aplicável, das contas) para garantir resultados precisos. Use uma das ferramentas de software disponíveis para realizar o fechamento de células vivas (usando portões descritos acima), compensação e correção de autofluorescência.
    NOTA: Normalmente, usamos código MATLAB personalizado (por exemplo, https://github.com/jonesr18/MATLAB_Flow_Analysis ou Cytoflow17), que tem uma interface gráfica do usuário e uma biblioteca python adequada para a fase de pré-processamento e para análise de politransfecção.
Método Complexo ng Marcador fluorescente ng L7ae (fração) ng Repórter (fração) ng Filler DNA (fração) Total (ng)
Politransfecção 1 600
→ 1 150 75 (½) 75 (½) 300
→ 2 150 75 (½) 75 (½) 300
Politransfecção 2 600
→ 1 150 25 (1/6) 125 (5/6) 300
→ 2 150 125 (5/6) 25(1/6) 300

Tabela 2: Quantidades de DNA para politransfecção demonstradas no protocolo e um exemplo de experimento de acompanhamento com proporções de plasmídios sintonizados. A metade superior da tabela mostra a composição dos plasmídeos usados em um experimento simples de politransfecção. A metade inferior mostra a composição de um experimento atualizado que ajusta as razões de plasmídios para melhor subamostrar um espaço de concentração hipotético, onde o modulador de expressão gênica está em uma proporção mais ótima de 1:5 em relação ao seu repórter, produzindo mais células transfectadas para amostragem em torno dessa razão.

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Representative Results

Na Figura 1, comparamos a co-transfecção com a politransfecção. Em uma co-transfecção, todos os plasmídeos são liberados na mesma mistura de transfecção, resultando em alta correlação entre a quantidade de cada plasmídeo que uma única célula recebe (Figura 1A). Enquanto o número de plasmídeos totais entregues a cada célula varia significativamente, a fluorescência das duas proteínas repórteres nas células individuais em toda a população está bem correlacionada, indicando que os dois plasmídeos estão sendo co-entregues em uma proporção bastante constante. As células transfectadas podem absorver poucos ou muitos complexos, mas como cada complexo tem quantidades correlacionadas de cada plasmídeo, a co-transfecção explora apenas uma pequena região diagonal do espaço de concentração entre os dois plasmídeos. Em contraste, em uma politransfecção, os plasmídeos são liberados em múltiplos complexos de transfecção, resultando em liberação descorrelacionada de plasmídeos em diferentes misturas de transfecção (Figura 1B). As células transfectadas absorvem diferentes combinações dos complexos, resultando em células que contêm dosagens variadas de plasmídeos de nenhum dos dois, um ou ambos os complexos.

A Figura 2 mostra um fluxo de trabalho representativo de politransfecção. Em geral, um experimento de politransfecção consiste nas seguintes etapas: definir o problema, criar as misturas de transfecção, incubar as células, citometria de fluxo e análise. Há também uma etapa opcional para repetir a politransfecção com proporções de peça otimizadas se os resultados iniciais de politransfecção não forem capazes de restringir com precisão as proporções ideais de peças. Essas etapas estão descritas no protocolo.

Na Figura 3, são apresentados alguns exemplos de co-transfecções e politransfecções bem realizadas e erros comuns. A Figura 3A mostra uma co-transfecção bem realizada com uma estreita correlação entre TagBFP e plasmídeos que expressam eYFP que foram co-entregues. Em contraste, a co-transfecção na Figura 3B mostra fraca correlação entre esses dois plasmídeos. Na figura mostrada, a fraca correlação deve-se à adição do reagente intensificador ao meio sérico reduzido antes da adição dos plasmídeos. Essa fraca correlação nos experimentos também pode ser devido a diferentes promotores que impulsionam a expressão das proteínas fluorescentes, mistura pobre durante a criação da mistura de transfecção ou permitindo que o complexo incube por um intervalo muito curto ou muito longo.

A Figura 3C mostra uma politransfecção bem realizada, com boa cobertura do espaço bidimensional e boa compensação de qualquer sangramento espectral entre proteínas fluorescentes. A Figura 3D mostra dados de politransfecção com um baixo número de células vivas, o que é difícil de subdividir em compartimentos suficientes com um número suficiente de células em cada silo para análise. Para amenizar essa questão, a população celular inicial deve estar em boa saúde e não crescer demais, e a toxicidade experimental reduzida usando um reagente de transfecção diferente e/ou transfectando com menos DNA total. A Figura 3E mostra uma politransfecção em que a eficiência da transfecção foi baixa, resultando novamente em cobertura esparsa do espaço bidimensional para análise. Neste caso, o número de células que passam pelo gating morfológico é alto, mas as células não expressam proteínas fluorescentes. Para melhorar a eficiência, a escolha do reagente de transfecção deve ser otimizada e o protocolo do fabricante seguido rigorosamente. Cada mistura de transfecção deve conter uma quantidade equivalente de massa de DNA, garantindo que as células tenham uma chance aproximadamente igual de receber cada tipo de complexo, e cada mistura de transfecção deve ser feita de acordo com as instruções do kit. Diferentes kits de transfecção são ideais para diferentes tipos de células; Deve-se utilizar o kit que der a melhor eficiência no tipo de célula de interesse. Por fim, alguns tipos celulares são de difícil transfecção, independentemente do kit utilizado. Nesses casos, um número maior de células deve ser transfectado e o maior número possível coletado durante a citometria de fluxo para garantir um número suficiente de células para análise. A Figura 3F mostra os dados de politransfecção em que um dos marcadores de proteína fluorescente está mostrando claramente sangramento espectral em outra proteína fluorescente. Controles de cor única devem sempre ser executados para todas as proteínas fluorescentes no sistema e usados para gerar uma matriz de compensação que deve ser aplicada a todas as politransfecções antes da análise.

Ao realizar experimentos de politransfecção pela primeira vez (global ou para um novo sistema experimental), deve-se realizar benchmarking em relação à cotransfecção padrão. Uma abordagem é medir individualmente a função de transferência de entrada-saída para peças-chave do sistema usando co-transfecção (através de ajustes de dosagens de DNA) e politransfecção.

Na Figura 4, demonstramos o benchmarking do repressor translacional L7Ae, aqui adaptado da publicação original de politransfecção10. L7Ae é uma proteína ligadora de RNA que reconhece motivos de dobra de RNA (KT)20; quando dois KTs (2xKT) são colocados na região não traduzida (UTR) de 5' de um mRNA, a tradução do quadro de leitura aberta (ORF) a jusante pode ser efetivamente suprimida por L7Ae21. L7Ae tem sido usado anteriormente para construir classificadores de tipo celular baseados em RNA21 e outros circuitos baseados em RNA22. Para testar L7Ae por co-transfecção padrão, pode-se ajustar as proporções dos plasmídeos que codificam L7Ae e seu repórter alvo dentro de diferentes misturas de transfecção (Figura 4A e Tabela 3). Para a politransfecção, deve-se entregar independentemente L7Ae constitutiva e correspondente 2xKT em misturas de transfecção separadas, de modo que uma ampla gama de proporções plasmidiais seja entregue às células (Figura 4B). Após a realização da transfecção e citometria de fluxo, pode-se realizar a análise dos dados. Para tornar os dados comparáveis, pode-se agrupar os resultados individuais de co-transfecção em um único conjunto de dados e, em seguida, realizar uma ligação multidimensional semelhante aos dados de politransfecção (Figura 4C,D). Comparando-se as curvas dose-resposta da L7Ae reprimindo o repórter de saída, pode-se observar que o nível mediano de saída por silo é muito semelhante entre os dados de co-transfecção e politransfecção (Figura 4E-G).

Em geral, vimos que os dados de politransfecção se correlacionam bem com os dados de cotransfecção em amplas proporções de DNA, com menos precisão em razões de dosagem de DNA altamente distorcidas (em parte devido à menor cobertura celular em silos para experimentos de politransfecção, especialmente para partes que são muito fortemente ativas em baixas doses de plasmídeos). Para melhorar a precisão da medição dessas partes sensíveis, seu nível de expressão pode ser reduzido com um promotor mais fraco, quadros de leitura abertos a montante18 ou sintonizadores finos mediados por silenciamento de microRNA (miSFITs)19.

A Figura 5 demonstra uma aplicação bem sucedida da politransfecção para otimização de um classificador tipo celular, novamente adaptado de Gam e cols.10. O classificador é um desenho relativamente simples que produz uma saída em resposta à expressão de miR-21-5p, um miRNA superexpresso em muitas célulastumorais23. Na ausência do miR-21, a saída do classificador é reprimida por um repressor transcricional derivado de bactérias, BM3R124, cuja adaptação foi previamente demonstrada para funcionar em células de mamíferos25. Quando o miR-21 está presente, ele se liga a quatro sítios alvo colocados nas UTRs 3' e 5' do BM3R1, derrubando sua expressão e, assim, permitindo a transcrição da saída (Figura 5A). Para otimizar este sistema, os três componentes do circuito foram entregues em misturas de transfecção separadas: (1) BM3R1 (com sítios alvo miR-21), (2) repórter de saída (mKO2) e (3) Gal4-VP16, que ativa a transcrição da saída (Tabela 4). Note que o promotor de saída opera na lógica (Gal4-VP16) e não BM3R1, que suprime a saída mesmo na presença de Gal4-VP1625. Cada peça codifica um marcador de transfecção, TagBFP, mNeonGreen e iRFP720, respectivamente, no mesmo plasmídeo para indicar a dosagem relativa de DNA de cada complexo. Em geral, o aumento da expressão de Gal4-VP16 deve aumentar a saída do repórter mKO2, enquanto o aumento da expressão de BM3R1 deve resultar em menor saída de mKO2. Como o BM3R1 é derrubado pelo miR-21-5p, a expressão de saída deve ser maior nas células HeLa, que têm níveis mais altos de miR-21-5p e, portanto, expressam menos BM3R1 do que nas células HEK.

Após a politransfecção em ambas as células HEK293 e HeLa, obtivemos uma distribuição 3D de diferentes proporções plasmidiais (Figura 5B-células HEK). Gam et al.10 subamostraram essa distribuição em várias proporções, considerando células dentro de uma determinada distância euclidiana de uma razão de interesse; Essa distância deve ser ampla o suficiente para incluir células suficientes para permitir resultados estatisticamente significativos da análise, mas estreita o suficiente para evitar que ruídos desnecessários incluam um conjunto muito amplo de proporções de componentes das três partes. Gam et al.10 utilizaram então um algoritmo de otimização para identificar a proporção de partes que maximizou a precisão da classificação para a co-transfecção (ou seja, células HeLa transfectadas são positivas para expressão de saída, enquanto células HEK transfectadas não são). A proporção ótima das peças encontrada foi de 10,9:1,5:1: Gal4-VP16:output:BM3R1; células subamostradas em torno da razão ótima dentro de todo o espaço de politransfecção são mostradas na Figura 5C. Essa subamostragem previu que, nessa relação, o circuito co-transfectado tem especificidade de 91%, sensibilidade de 62% e acurácia de 77% ao classificar células HEK293 versus células HeLa (Figura 5D). A co-transfecção com proporções de plasmídeos ajustadas para esse ótimo produziu resultados ainda melhores: especificidade de 99%, sensibilidade de 68% e acurácia de 84%10. Além disso, as razões guiaram a implementação de uma versão de plasmídeo único do circuito, com expressão relativa sintonizada usando diferentes promotores truncados e ORFs upstream (uORFs), produzindo um circuito com 91% de especificidade, 90% de sensibilidade e 90% de precisão10. Assim, a politransfecção é uma ferramenta poderosa para guiar o projeto de classificadores celulares e circuitos gênicos de forma mais ampla.

Figure 1
Figura 1: Comparação entre co-transfecção e politransfecção. (A,B) Visão geral e comparação da liberação plasmidial com co-transfecção de dois plasmídeos e politransfecção de dois plasmídeos. Para cada método de transfecção, o diagrama mais à esquerda mostra a formação de complexos de transfecção entre DNA carregado negativamente e lipídios carregados positivamente. Nesses exemplos, cada plasmídeo colorido (azul e vermelho) codifica a expressão de uma proteína fluorescente diferente. O diagrama central mostra exemplos de entrega de plasmídios às células e também um esquema para as distribuições esperadas em um histograma ou gráfico de dispersão. A intensidade de cor no histograma corresponde à fluorescência da cor do plasmídeo correspondente. O diagrama mais à direita mostra dados reais de células transfectadas usando cada método dado. (A) Em uma co-transfecção com dois plasmídeos diferentes, ambos os plasmídeos são misturados antes da adição do reagente de transfecção, resultando em embalagens altamente correlacionadas das duas espécies de plasmídeos. Em dados reais de co-transfecção, as células exibem entrega correlacionada de ambos os plasmídeos (direita). (B) Em uma politransfecção, cada conjunto de plasmídeos co-liberados correspondente a uma parte do circuito e um marcador de transfecção é misturado com o reagente de transfecção separadamente, resultando em complexos que contêm apenas esses plasmídeos (esquerda). Em dados reais de politransfecção, as células exploram uma ampla gama de espaços de concentração com muitas estequiometrias plasmidiais diferentes exploradas simultaneamente (à direita). Este número foi modificado de10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Fluxo de trabalho de politransfecção. Passo 1: Defina o problema. Comece com um sistema com várias partes componentes para as quais a proporção ideal entre as peças é desconhecida e escolha uma relação inicial entre as partes componentes. Passo 2: Crie as misturas de transfecção. Cada mistura de transfecção contém um componente de circuito e um marcador de transfecção fluorescente. A quantidade de peça do circuito entregue a uma célula correlaciona-se com a fluorescência do marcador. Passo 3: Incubar as células. Em um fluxo de trabalho típico, incubamos células por 48 h entre a transfecção e a citometria de fluxo. Passo 4: Citometria de fluxo. Execute os controles apropriados, conforme discutido no protocolo e, em seguida, execute os exemplos. Passo 5: Análise.Use os marcadores de transfecção para lixar as células de acordo com a quantidade ou proporções de partes que a célula recebeu. Use a(s) proteína(s) de saída para medir o desempenho do circuito. Encontre os compartimentos/relações de peças que otimizam o desempenho do circuito. Passo 6: Repita com proporções de peça otimizadas (opcional). Se os compartimentos/proporções ideais estiverem em proporções altamente distorcidas, a politransfecção piloto pode não restringir as proporções ótimas de peças com precisão. Repita a politransfecção com proporções de peças ajustadas, de modo que uma célula que recebeu uma quantidade igual de cada mistura de transfecção agora receba uma proporção próxima da ótima de peças, conforme determinado pela rodada anterior. Este número foi modificado de10. Utilizou-se a imagem de uma incubadora da Servier Medical Art e a imagem de um citômetro da BioRender. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Resultados representativos positivos e negativos da politransfecção . (A) Co-transfecção bem realizada de dois repórteres fluorescentes, mostrando uma correlação estreita. Um total de 20.000 células são plotadas aqui e em (B) para comparação. É uma boa ideia realizar um pequeno teste semelhante de co-transfecção de dois repórteres fluorescentes antes de iniciar um experimento de politransfecção, para garantir que os plasmídeos estejam bem correlacionados dentro das misturas de transfecção. (B) Co-transfecção mais ruidosa: plasmídeos não estão bem correlacionados dentro de cada mistura de transfecção, o que pode fazer com que marcadores fluorescentes em uma politransfecção sejam um marcador pobre de razões plasmidiais. (C) Resultados de politransfecção bem realizados mostrando boa contagem de células, eficiência de transfecção e compensação. (D) Baixa contagem de células vivas, que não permite a subamostragem em silos com número estatisticamente significativo de células. (E) Baixa eficiência de transfecção, que não permite a subamostragem em silos com número estatisticamente significativo de células. (F) Falta de compensação adequada, o que faz com que os dados de fluorescência sejam uma proxy pobre para a quantidade de proteína fluorescente no sistema. Use controles de cor única para determinar uma matriz de compensação linear ideal e aplique-a aos dados antes de processamento adicional. Todos os controles de cores também são recomendados, dependendo da escolha do software. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Comparando a politransfecção com a cotransfecção. (A) Em uma co-transfecção, uma proporção de repressor translacional L7Ae para plasmídeos repórteres fluorescentes pode ser testada em cada poço experimental. (B) Na politransfecção, muitas proporções de L7Ae para repórteres podem ser testadas no mesmo poço. Consulte a Tabela 3 para detalhes das misturas de plasmídeos de politransfecção. (C,D) Fluxo de trabalho de binning para comparar a politransfecção com várias cotransfecções. Um total de 10 silos espaçados biexponencialmente foram atribuídos para cada dimensão do marcador de transfecção, que se aproxima dos níveis de cada um dos dois plasmídeos. Aqui, compartimentos que denotam diferentes níveis de plasmídeo #2 são mostrados. A binning foi realizada em um conjunto agrupado de 11 amostras de co-transfecção abrangendo várias razões de plasmídios (C) e dados de uma única politransfecção, compreendendo cerca de 500.000 células cada (D). As cores correspondem a conjuntos de silos definidos pelos níveis do gene 2 (TagBFP). (E-G) Benchmarking de poli-transfecção contra co-transfecção para um circuito representativo. A fluorescência mediana de saída foi avaliada para as células em cada silo e comparada entre os métodos para o sistema representativo, L7Ae de repressão translacional. (E) Construtos para medir a atividade de L7Ae. A fluorescência mKO2 serve como uma estimativa para a entrega de L7Ae (gene #1), enquanto a fluorescência TagBFP serve como uma estimativa para a entrega da saída regulada de mNeonGreen (gene #2). (F) Curvas de titulação multidimensional para L7Ae. Cada linha representa o conjunto de compartimentos em um nível de TagBFP, conforme indicado em (C) e (D). Linhas sólidas denotam dados de politransfecção, enquanto linhas tracejadas denotam dados de cotransfecção. Em cada nível binned do plasmídeo do repórter, a saída do repórter diminui à medida que a L7Ae aumenta. (G) Comparação visual entre co-transfecção e politransfecção para o sistema L7Ae. Cada ponto representa a saída medida em silos correspondentes para medições de politransfecção e cotransfecção, onde valores mais equivalentes estão mais próximos da linha vermelha 1:1. Em geral, as diferenças observadas entre a politransfecção e a cotransfecção derivadas são baixas, o que confere confiança na confiabilidade do método de politransfecção. Este número foi modificado de10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Análise dos dados para politransfecção. Na politransfecção, as células podem ser agrupadas em silos ou fatias para análise. A Figura 4 mostra uma forma de análise em que as células são agrupadas em fatias que correspondem aos níveis de um componente do sistema, como o nível de plasmídeo do repórter, o que pode ser útil para o ajuste do modelo e a compreensão das respostas de dosagem. Outra estratégia útil é analisar o desempenho do circuito em diferentes proporções de componentes do circuito. (A) Diagrama de um circuito classificador para otimização. Os níveis de TagBFP, NeonGreen e iRFP720 correspondem aos níveis de BM3R1, mKO2 de saída e Gal4-VP16, respectivamente. Veja a Tabela 4 para detalhes das misturas de plasmídios de politransfecção. (B) Montagem experimental de misturas de politransfecção. (C) Dados de citometria de fluxo coletados da politransfecção com o circuito em (A). Os níveis de cada uma das três proteínas fluorescentes do repórter como resultado da politransfecção do circuito em células HEK, mostrando a ampla gama de razões de componentes do circuito presentes nos dados. Resultados semelhantes foram obtidos a partir da transfecção do circuito em ambas as células HEK e HeLa. (D) Politransfecção por subamostragem em uma proporção específica. Para analisar os dados, escaneamos um grande número de relações entre os componentes do circuito e determinamos o desempenho do classificador em cada relação. Como exemplo, mostramos aqui uma razão particular que demonstrou bom desempenho (Gal4-VP16 = 435 ng de DNA, repórter = 60 ng, e BM3R1 = 40 ng). Plotado em azul é a razão correspondente dos marcadores fluorescentes para os três diferentes componentes do circuito. Em seguida, subamostramos os dados considerando apenas pontos dentro de uma determinada distância euclidiana da trajetória da fluorescência. Subamostramos células na mesma trajetória das transfecções HEK e HeLa. (E) Comparação do desempenho do circuito na mesma trajetória em células HEK e HeLa. Ao comparar estatísticas como sensibilidade, especificidade e precisão de classificação em muitas proporções, as razões de componentes podem ser otimizadas para gerar um circuito genético ideal. Este número foi modificado de10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Complexo ng plasmídeo L7Ae ng Plasmídeo do repórter OptiMEM (μL) P3000 (μL) Lipo 3000 (μL)
1 250 75 1.5 1.5
2 250 75 1.5 1.5

Tabela 3: Misturas de transfecção correspondentes à Figura 4. As células HEK293 foram politransfectadas com essas misturas de transfecção em um poço de uma placa de 24 poços.

Complexo ng BM3R1 plasmídeo ng Gal4-VP16 plasmídeo ng Plasmídeo do repórter OptiMEM (μL) P3000 (μL) Lipo 3000 (μL)
1 900 75 1.5 1.5
2 900 75 1.5 1.5
3 900 75 1.5 1.5

Tabela 4: Misturas de transfecção correspondentes à Figura 5. As células HEK293 e HeLa foram politransfectadas com essas misturas de transfecção em um poço cada de uma placa de 6 poços.

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Discussion

Métodos de prototipagem rápida, como CAD (computer-aided design), protoboard e impressão 3D, revolucionaram as disciplinas de engenharia mecânica, elétrica e civil. A capacidade de pesquisar rapidamente muitas soluções possíveis para um determinado desafio acelera muito o progresso em um campo. Acreditamos que a politransfecção é uma tecnologia análoga para a engenharia biológica, permitindo a prototipagem rápida de circuitos genéticos. Além disso, outras tecnologias de prototipagem rápida requerem iteração sequencial prática de várias soluções possíveis, enquanto a politransfecção é capaz de explorar muitas soluções simultaneamente. A politransfecção permite testar um grande número de combinações de razões de componentes de circuitos genéticos em um único poço e tem sido utilizada para otimizar vários circuitos genéticos publicados10,11,13. O protocolo experimental é uma extensão simples da co-transfecção padrão, permitindo a adoção direta por muitos pesquisadores de células de mamíferos. Geralmente, observa-se uma concordância muito estreita entre os resultados da politransfecção e da cotransfecção10 (um exemplo é a Figura 4). Assim, a politransfecção pode ser usada na maioria dos casos em que as razões plasmidiais são tituladas dentro de misturas de co-transfecção e as saídas são medidas em nível de célula única.

A complexidade e a escala da politransfecção aumentam com a complexidade dos circuitos genéticos a serem otimizados. À medida que o número de dimensões a analisar aumenta, as razões combinatórias de diferentes partes e o número de células necessárias para sua análise aumentam exponencialmente. Por exemplo, para otimizar o classificador na Figura 5, as células foram transfectadas em um formato de placa de 6 poços, e dados foram coletados em pelo menos 1,5 milhão de células vivas. Também otimizamos um classificador com um componente adicional do circuito 10, necessitando de transfecção em escala de placa de10 cm e a coleta de milhões de células. Nessa escala e acima, a produção de DNA é demorada e os reagentes de transfecção são caros. Dito isso, a politransfecção usa ordens de magnitude menos células, DNA e reagentes de transfecção do que testar um número comparável de combinações de razão de componentes de circuito em poços individuais. Além disso, uma quantidade considerável de tempo é economizada fazendo ordens de magnitude menos misturas de transfecção.

A politransfecção permite métodos avançados de análise de dados de citometria de fluxo. As duas principais abordagens são (1) a ligação de células de acordo com a expressão de cada marcador de transfecção e (2) a extração de células em proporções definidas de marcadores de transfecção, simulando assim a co-transfecção. O primeiro seleciona células com uma combinação específica de dosagem de DNA para cada complexo (e, portanto, cada parte), produzindo funções de transferência de entrada-saída. Este último seleciona as células em uma proporção específica de dosagens de DNA para cada parte, simulando a co-transfecção em tal proporção de massas de DNA plasmidial. Plotar o nível de expressão do(s) repórter(es) de saída do circuito nas seleções subamostradas fornece uma medida de saída nos níveis ou razões de entradas definidos. Para otimização de circuitos, pode-se identificar os bins/relações de melhor desempenho conforme definido pela finalidade do circuito - no caso de classificadores de células, estes são os bins/relações onde o circuito está ON no tipo de célula alvo e OFF em tipos de células não-alvo. Ao escolher um tamanho de lixeira, deve-se levar em consideração o nível de precisão necessário, bem como o número de células por lixeira. Compartimentos menores se concentram na combinação ideal de componentes do circuito com mais precisão, mas se um compartimento tiver poucas células, ele pode introduzir ruídos indesejáveis nas medições.

Melhorias futuras na análise computacional de dados de politransfecção podem facilitar a otimização mesmo com baixa cobertura celular por bin/ratio. Atualmente, excluímos dados de compartimentos com menos de um determinado limiar de células (por exemplo, 10) para evitar medições excessivamente ruidosas. Em combinação com medições repetidas, isso permite cálculos mais precisos e precisos de curvas de dose-resposta, precisões de classificadores e outras métricas definidas por compartimento. No entanto, cada célula em politransfecção pode ser considerada um experimento independente, medindo em uma resolução fina a(s) saída(s) do circuito em um nível preciso de entradas. Com isso em mente, modelos mecanicistas e fenotípicos de respostas de dose e otimizações de circuitos podem se ajustar diretamente à distribuição da expressão gênica de cada marcador e repórter, em vez de suas estatísticas de resumo binned10. Isso permite medições mais robustas e aproveita os muitos pontos de dados individuais coletados por experimento. Tais abordagens de modelagem poderiam, assim, produzir caracterização e otimização preditiva de circuitos, mesmo com politransfecções de alta dimensão esparsamente amostradas. Além disso, métodos de aprendizado de máquina, como a metodologia de superfície de resposta e a regressão de floresta aleatória, podem ser usados para analisar dados relativamente esparsos e de alta dimensão10.

Uma abordagem alternativa para politransfecções cada vez maiores é otimizar sequencialmente circuitos usando hierarquias de politransfecções. Nesta abordagem, primeiro, a politransfecção é usada para otimizar um módulo que compreende um subconjunto de componentes genéticos dentro de um circuito maior. Em seguida, esses módulos otimizados são entregues como misturas de politransfecção separadas, permitindo encontrar a relação / dosagem ideal de cada módulo de circuito. Essa abordagem usa um número significativamente menor de células, DNA e reagentes de transfecção. No entanto, grupos de componentes não são necessariamente modulares em relação a outros componentes e, portanto, uma proporção ótima de partes componentes em um módulo medido isoladamente poderia ser subótima dentro do contexto de circuito maior8.

Os métodos de politransfecção também são limitados pela configuração laser/filtro do citômetro de fluxo usado para coletar dados. Além das saídas fluorescentes medidas, cada mistura de transfecção contém um marcador de proteína fluorescente. Assim, é fundamental selecionar proteínas fluorescentes que possam ser bem compensadas no citômetro. Analisamos sistematicamente o bleed-through de um painel de 22 proteínas fluorescentes em um citômetro de fluxo de cinco lasers (BD LSRFortessa) e descobrimos que o conjunto de Sirius, TagBFP, mNeonGreen, mKO2 e iRFP720 poderia ser usado em conjunto e compensado bem sem problemas significativos10. No entanto, a otimização de circuitos maiores pode exigir métodos avançados de citometria, como a citometria espectral para separar proteínas fluorescentes com espectros mais sobrepostos, que nosso laboratório está atualmente otimizando com até oito proteínas fluorescentes. Bancos de dados como o fluorescent protein database (https://www.fpbase.org) são úteis para selecionar proteínas fluorescentes com particular sobreposição espectral. No entanto, este processo pode ser complicado por vários fatores, alguns dos quais são específicos para citômetros específicos. Por exemplo, o uso de certas proteínas vermelhas como o tdTomato pode resultar em sangramento indesejável em canais azuis apenas em certas configurações de laser/filtro10. Além disso, várias proteínas vermelho-distante têm mostrado relações não-lineares entre a dosagem de DNA e a saída de fluorescência10, reduzindo seu uso como marcadores efetivos para dosagem de DNA.

Para consistência entre experimentos que são realizados com números variados de complexos (um, dois, três, etc.), é útil usar a mesma quantidade fracionada de plasmídeo por mistura de transfecção. Por exemplo, se testar um sistema de três genes com cada gene codificado em um dos três plasmídeos (A, B e C), pode-se co-transfectar os plasmídeos do circuito em uma proporção de 1:1:1 juntamente com uma proporção igual de um plasmídeo que codifica um marcador de transfecção. Isso faria com que cada plasmídeo representasse um quarto da massa total da mistura e, portanto, aproximadamente um quarto da massa de cada complexo de transfecção que é formado. Ao politransfectar A, B e C em complexos separados com seus próprios repórteres, em vez de misturar os plasmídeos 1:1 com repórteres ou manter sua massa total de DNA, é mais consistente manter cada plasmídeo em um quarto da massa de cada complexo, com o DNA de preenchimento ocupando a massa restante (ver Tabela 5 para exemplos). Isso ocorre porque a distribuição da expressão gênica entre as células transfectadas depende menos da massa total de DNA entregue nos complexos e mais da quantidade fracionada de DNA em cada complexo10. Se forem desejadas razões diferentes de 1:1:1, calcule as fracções correspondentes da massa total de ADN na mistura de transfecção para cada parte. Por exemplo, a Tabela 5 [inferior] mostra uma proporção de 1:1:4.

Método Complexo ng A (fração) ng B (fração) ng C (fração) ng Repórter (fração) ng Filler DNA (fração) Total (ng)
Co-transfecção 1 150 (¼) 150 (¼) 150 (¼) 150 (¼) 0 (0) 600
Poli-transfecção 600
→ 1 50 (¼) 50 (¼) 100 (½) 200
→ 2 50 (¼) 50 (¼) 100 (½) 200
→ 3 50 (¼) 50 (¼) 100 (½) 200
Co-transfecção 1 75 (⅛) 75 (⅛) 300 (½) 150 (¼) 0 (0) 600
Poli-transfecção 600
→ 1 25 (⅛) 50 (¼) 125 (⅝) 200
→ 2 25 (⅛) 50 (¼) 125 (⅝) 200
→ 3 100 (½) 50 (¼) 50 (¼) 200

Tabela 5: Exemplos de uso de DNA de preenchimento para consistência em experimentos de co- e politransfecção. Aqui, dois exemplos genéricos de co-transfecção de três plasmídeos com a mesma quantidade de DNA de preenchimento são mostrados. No exemplo superior, os plasmídeos estão todos em massas iguais. No exemplo inferior, um plasmídeo é entregue em uma massa maior em comparação com os outros. A fração de DNA total que seria usada em um complexo de co-transfecção é transmutada para complexos de politransfecção, com a quantidade restante de DNA (até a quantidade total para cada complexo, que é fixa e igual entre complexos) constituída com DNA de preenchimento.

O objetivo geral do DNA de preenchimento é manter dosagens semelhantes de plasmídeos por célula, independentemente do número de misturas únicas de transfecção. Como uma aproximação bruta deste princípio, separar três plasmídeos em três misturas, mantendo a mesma massa de DNA de cada um (e a proporção apropriada de reagente de transfecção) reduz a porcentagem de células que recebem um determinado complexo em um terço em comparação com uma única mistura contendo todos os três plasmídeos. No entanto, cada célula transfectada recebe subsequentemente uma dosagem de gene ~3x maior. A redução da quantidade relativa de plasmídeos isoladamente sem DNA de preenchimento é, portanto, insuficiente para manter dosagens plasmidiais consistentes, pois isso simplesmente diminui a eficiência da transfecção sem alterar a distribuição subjacente da expressão entre as células transfectadas10. Por outro lado, o DNA de preenchimento permite ajustar a dosagem de DNA sem afetar a eficiência geral da transfecção (embora células transfectadas detectáveis possam diminuir devido ao menor sinal)10. Seguindo a aproximação bruta acima, reduzir a fração de DNA nas misturas de politransfecção para um terço e adicionar DNA de preenchimento mantém as dosagens relativas do gene em comparação com a co-transfecção original. O DNA de enchimento garante, portanto, a formação eficiente e precisa do complexo de transfecção.

Para alterar a faixa de expressão de um gene de interesse coberto por seu repórter, a fração de cada plasmídeo de teste e/ou promotores usados para conduzir o gene pode ser ajustada em relação ao repórter. Se uma peça é forte/altamente ativa em baixas dosagens de DNA, o uso de uma fração de DNA mais baixa pode ajudar a centralizar a faixa dinâmica da peça no meio da distribuição de fluorescência do repórter em células transfectadas. Da mesma forma, para partes que são fracas/ativas apenas em altas dosagens de DNA, o uso de uma fração mais alta pode ser útil. No entanto, deve-se ter cuidado com essa afinação, pois reduzir demais as frações de DNA aumenta a estocástico de entrega às células em comparação com o repórter10, e altos níveis de expressão gênica podem sobrecarregar a maquinaria de expressão gênica celular12,14. Para evitar a estocasticidade, e nos casos em que cada gene é entregue às células em uma proporção fixa (por exemplo, se o circuito deve ser gerado como um único vetor lenti, PiggyBac ou Landing Pad), a expressão relativa de cada gene pode ser ajustada usando promotores mais fortes/fracos, pequenas uORFs18 e/ou miSFITs19.

Embora o protocolo descreva uma técnica de transfecção reversa, a politransfecção também é possível com a transfecção anterior. Na transfecção reversa, as células são simultaneamente semeadas e transfectadas; Na transfecção direta, as células são transfectadas ~24 h após o primeiro plaqueamento a aproximadamente metade da densidade que seria usada na transfecção reversa (para permitir a divisão celular no momento da transfecção). Em geral, a transfecção reversa é mais eficiente, mas também mais tóxica, e notamos algumas diferenças na forma das distribuições de transfecção com base no reagente, tempo de transfecção e linhagem celular. Assim, o método de transfecção de escolha deve ser otimizado para cada linhagem celular para maximizar o número de células transfectadas e a cobertura do espaço de concentração multidimensional das dosagens plasmidiais por célula.

Em geral, a politransfecção permite a rápida otimização dos circuitos genéticos de mamíferos. Muitas combinações ratiométricas possíveis de componentes de circuito podem ser facilmente testadas em um único poço. Além disso, como a politransfecção contém mais informações sobre os níveis de cada parte em um sistema do que uma transfecção convencional, ela tem se mostrado de grande valor para caracterizar o comportamento de várias partesgenéticas 10,11,12,13. Espera-se que a adoção da politransfecção acelere o ritmo de desenvolvimento de circuitos gênicos novos e aprimorados para uso em células de mamíferos.

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Disclosures

R.W. é co-fundador da Strand Therapeutics e da Replay Bio; R.W. e R.J. registraram uma patente provisória relacionada a um classificador de tipo celular.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer aos ex-membros do Weiss Lab que lideraram ou contribuíram para o desenvolvimento do método de politransfecção e sua aplicação em classificadores celulares: Jeremy Gam, Bre DiAndreth e Jin Huh; outros membros do laboratório Weiss que contribuíram para o desenvolvimento/otimização de métodos: Wenlong Xu, Lei Wang e Christian Cuba-Samaniego; Prof. Josh Leonard e membros do grupo, incluindo Patrick Donahue e Hailey Edelstein, por testar a politransfecção e fornecer feedback; e ao Prof. Nika Shakiba por convidar este manuscrito e fornecer feedback. Também gostaríamos de agradecer aos Institutos Nacionais de Saúde [R01CA173712, R01CA207029, P50GM098792]; Fundação Nacional de Ciência [1745645]; Cancer Center Support (core) Grant [P30CCA14051, em parte] do NCI e National Institutes of Health [P50GM098792] para financiar este trabalho.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15mL Corning Falcon conical tubes ThermoFisher Scientific 14-959-53A
24-well petri dish Any company of choice (Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free)
Bovine serum albumin NEB B9000S
Centrifuge Any company of choice Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf
Countess 3 Automated Cell Counter ThermoFisher Scientific AMQAX2000
Countess Cell Counting Chamber Slides ThermoFisher Scientific C10228
Cytoflow Non-commercial software package https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/# 
DMEM VWR 10-013-CV Use the correct media for your cell type
EDTA  ThermoFisher Scientific 03690-100ML
Fetal bovine serum Sigma Aldrich F4135
HEK cells ATCC CRL-1573 Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently.
HeLa cells ATCC CRL-12401 Use the relevant cell type for your experiments.
Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer ThermoFisher Scientific L3000001 Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent
LSRFortessa flow cytometer BD Biosciences N/A
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Gibco 11140050
Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL Any company of choice
Opti-MEM ThermoFisher Scientific 31985070 reduced serum medium
Phosphate buffered saline ThermoFisher Scientific 70011044
Rainbow calibration beads Spherotech URCP-100-2H
Sodium azide Sigma Aldrich S2002
Trypsin VWR 25-053-CI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Rápido Desenvolvimento de Circuitos de Identificação do Estado Celular com Poli-Transfecção
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Wauford, N., Jones, R., Van De Mark, C., Weiss, R. Rapid Development of Cell State Identification Circuits with Poly-Transfection. J. Vis. Exp. (192), e64793, doi:10.3791/64793 (2023).

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