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Bioengineering

Développement rapide de circuits d’identification de l’état cellulaire avec poly-transfection

Published: February 24, 2023 doi: 10.3791/64793
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 1,3
1Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2School of Biological Engineering, University of British Columbia, 3Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology

Summary

Les circuits génétiques complexes prennent beaucoup de temps à concevoir, à tester et à optimiser. Pour faciliter ce processus, les cellules de mammifères sont transfectées de manière à permettre de tester plusieurs stœchiométrie des composants du circuit dans un seul puits. Ce protocole décrit les étapes de la planification expérimentale, de la transfection et de l’analyse des données.

Abstract

Les circuits génétiques des mammifères ont démontré le potentiel de détecter et de traiter un large éventail d’états pathologiques, mais l’optimisation des niveaux de composants du circuit reste difficile et exigeante en main-d’œuvre. Pour accélérer ce processus, notre laboratoire a développé la poly-transfection, une extension à haut débit de la transfection traditionnelle des mammifères. Dans la poly-transfection, chaque cellule de la population transfectée effectue essentiellement une expérience différente, testant le comportement du circuit à différents nombres de copies d’ADN et permettant aux utilisateurs d’analyser un grand nombre de stœchiométrie dans une réaction à pot unique. Jusqu’à présent, des polytransfections qui optimisent les rapports des circuits à trois composants dans un seul puits de cellules ont été démontrées; En principe, la même méthode peut être utilisée pour le développement de circuits encore plus grands. Les résultats de la polytransfection peuvent être facilement appliqués pour trouver des rapports optimaux d’ADN à co-transfect pour les circuits transitoires ou pour choisir des niveaux d’expression pour les composants du circuit pour la génération de lignées cellulaires stables.

Ici, nous démontrons l’utilisation de la poly-transfection pour optimiser un circuit à trois composants. Le protocole commence par des principes de conception expérimentale et explique comment la polytransfection s’appuie sur les méthodes traditionnelles de co-transfection. Ensuite, la poly-transfection des cellules est réalisée et suivie d’une cytométrie en flux quelques jours plus tard. Enfin, les données sont analysées en examinant des tranches des données de cytométrie en flux unicellulaire qui correspondent à des sous-ensembles de cellules avec certains rapports de composants. En laboratoire, la polytransfection a été utilisée pour optimiser les classificateurs cellulaires, les contrôleurs de rétroaction et de feedforward, les motifs bistables et bien d’autres. Cette méthode simple mais puissante accélère les cycles de conception de circuits génétiques complexes dans les cellules de mammifères.

Introduction

Le domaine de la biologie synthétique des mammifères a rapidement progressé, passant du développement de simples parties sensorielles et réactives dans des lignées cellulaires cultivées à l’optimisation de réseaux complexes de gènes pour relever les défis du monde réel en matière de diagnostic et de thérapeutique1. Ces circuits sophistiqués sont capables de détecter les entrées biologiques des profils de microARN aux cytokines en passant par les médicaments à petites molécules, et de mettre en œuvre des circuits de traitement logique, notamment des transistors, des filtres passe-bande, des interrupteurs à bascule et des oscillateurs. Ils ont également montré des résultats prometteurs dans des modèles animaux de maladies comme le cancer, l’arthrite, le diabète et bien d’autres 1,2,3,4,5. Cependant, à mesure que la complexité d’un circuit augmente, l’optimisation des niveaux de chacun de ses composants devient de plus en plus difficile.

Un type de circuit génétique particulièrement utile est un classificateur cellulaire, qui peut être programmé pour détecter et répondre aux états cellulaires. La production sélective de protéines ou d’ARN dans des états cellulaires spécifiques est un outil puissant pour guider et programmer la différenciation des cellules et des organoïdes, identifier et détruire les cellules malades et/ou les types de cellules indésirables, et réguler la fonction des cellules thérapeutiques 1,2,3,4,5 . Cependant, la création de circuits dans les cellules de mammifères capables de classer avec précision les états cellulaires de plusieurs espèces d’ARN cellulaire et / ou de protéines a été très difficile.

L’une des étapes les plus chronophages du développement d’un circuit de classification cellulaire consiste à optimiser les niveaux d’expression relatifs des gènes composants individuels, tels que les capteurs et les facteurs de traitement, dans le circuit. Pour accélérer l’optimisation des circuits et permettre la construction de circuits plus sophistiqués, des travaux récents ont utilisé la modélisation mathématique des circuits de classificateur de cellules et de leurs composants pour prédire des compositions et des topologies optimales 6,7. Bien que cela ait montré des résultats puissants jusqu’à présent, l’analyse mathématique est limitée par la nécessité de caractériser systématiquement le comportement d’entrée-sortie des gènes composant dans le circuit, ce qui prend du temps. En outre, une myriade de problèmes dépendants du contexte peuvent émerger dans des circuits génétiques complexes, ce qui fait que le comportement d’un circuit complet défie les prédictions basées sur des caractérisations de parties individuelles 8,9.

Pour développer et tester plus rapidement des circuits complexes de mammifères tels que les classificateurs d’état cellulaire, notre laboratoire a développé une technique appelée poly-transfection10, une évolution des protocoles de co-transfection plasmidique. Dans la co-transfection, plusieurs espèces d’ADN plasmidique sont complexées avec un réactif lipidique ou polymère chargé positivement, puis livrées aux cellules de manière corrélée (Figure 1A). Dans la polytransfection, les plasmides sont complexés séparément avec le réactif, de sorte que l’ADN de chaque complexe de transfection est livré aux cellules de manière décorrélée (Figure 1B). En utilisant cette méthode, les cellules de la population transfectée sont exposées à de nombreuses combinaisons de rapports de deux charges utiles d’ADN ou plus portant différents composants de circuit.

Pour mesurer les rapports des composants du circuit délivrés à chaque cellule, chaque complexe de transfection au sein d’une polytransfection contient un rapporteur fluorescent exprimé de manière constitutive qui sert d’indicateur de l’absorption cellulaire du complexe. L’ADN de remplissage qui ne contient aucun élément actif dans une cellule de mammifère est utilisé pour ajuster la quantité relative du rapporteur fluorescent et des composants du circuit livrés à une cellule dans un seul complexe de transfection et est discuté plus en détail dans la discussion. Un exemple d’ADN de remplissage utilisé dans le laboratoire Weiss est un plasmide contenant une séquence terminatrice, mais pas de promoteur, de séquence codante, etc. Les cellules avec différents ratios de composants de circuit peuvent ensuite être comparées pour trouver des rapports optimaux pour la fonction du circuit génétique. Cela donne à son tour des prédictions utiles pour choisir les promoteurs et autres éléments du circuit afin d’atteindre des niveaux optimaux d’expression génique lors de la combinaison de composants de circuit en un seul vecteur d’intégration génétique (par exemple, un lentivirus, un transposon ou une aire d’atterrissage). Ainsi, au lieu de choisir des rapports entre les composants du circuit en fonction de l’intuition ou d’un processus d’essais et d’erreurs fastidieux, la polytransfection évalue un large éventail de stœchiométrie entre les parties génétiques dans une réaction à pot unique.

Dans notre laboratoire, la polytransfection a permis l’optimisation de nombreux circuits génétiques, y compris les classificateurs cellulaires, les contrôleurs de rétroaction et de feedforward, et les motifs bistables. Cette méthode simple mais puissante accélère considérablement les cycles de conception de circuits génétiques complexes dans les cellules de mammifères. La polytransfection a depuis été utilisée pour caractériser plusieurs circuits génétiques afin de révéler leurs fonctions de transfert d’entrées-sorties multidimensionnelles à haute résolution 10, d’optimiser une topologie de circuit alternative pour la classification de l’état cellulaire11 et d’accélérer divers projets publiés12,13 et en cours.

Nous décrivons et décrivons ici le flux de travail pour utiliser la polytransfection afin d’optimiser rapidement un circuit génétique (Figure 2). Le protocole montre comment générer des données de polytransfection de haute qualité et éviter plusieurs erreurs courantes dans le protocole de polytransfection et l’analyse des données (Figure 3). Il montre ensuite comment utiliser la polytransfection pour caractériser des composants de circuits simples et, ce faisant, comparer les résultats de la polytransfection à la co-transfection (Figure 4). Enfin, les résultats de la poly-transfection montrent une optimisation du circuit classificateur du cancer (Figure 5).

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Protocol

NOTE: Les tableaux 1 et 2 servent de références importantes pour ce protocole. Le tableau 1 montre la mise à l’échelle des réactifs pour les réactions, et le tableau 2 montre l’arithmétique du rapport ADN pour un exemple de polytransfection décrit dans le protocole (moitié supérieure) et pour une éventuelle expérience de suivi (moitié inférieure).

1. Préparation des cellules pour la transfection

  1. Assurez-vous que la culture de cellules rénales embryonnaires humaines (HEK293) est confluente à 60% à 80% avant de commencer le protocole. Pour ce faire, ensemencez 1 x 106 cellules dans une boîte de Pétri de culture tissulaire de 100 mm x 15 mm 2 jours auparavant, et incuber à 37 °C avec 5% de CO2.
    REMARQUE: Bien que notre protocole se concentre sur les cellules HEK293, d’autres types de cellules peuvent être substitués.
  2. Préparer les milieux et les cellules pour les transfections comme décrit ci-dessous.
    1. Préchauffer au moins 20 mL d’une solution de milieu aigle modifié (DMEM) de Dulbecco avec 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % d’acides aminés non essentiels (NEAA; voir le tableau des matières) à 37 °C. Préchauffer au moins 2,4 mL de trypsine et 2,4 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 37 °C également. Préchauffer le milieu sérique réduit à ~16 °C.
      REMARQUE : Tous les travaux de culture tissulaire doivent être effectués avec soin dans une enceinte de biosécurité.
  3. Remettez les cellules en suspension dans la solution DMEM comme décrit ci-dessous.
    1. Aspirer et éliminer les supports actuels. Distribuer 2 ml de PBS sur la culture cellulaire HEK293 pour laver les cellules. Aspirer et éliminer le PBS.
    2. Distribuer 2 mL de trypsine sur la culture cellulaire HEK293. Placer la boîte de Petri dans un incubateur à 37 °C pendant 3 min ou jusqu’à ce que les cellules n’adhèrent plus à la boîte. Remettre la capsule dans l’enceinte de biosécurité et diluer la solution cellulaire en distribuant 8 ml de solution de DMEM dans la plaque.
    3. Mélanger la solution en pipitant doucement de haut en bas plusieurs fois. Aspirer tout le média et le placer dans un tube conique de 15 mL.
  4. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 3 min pour les granuler. Aspirez le média (en prenant soin de ne pas aspirer les cellules) et jetez-le. Remettez les cellules en suspension dans 5 mL de solution DMEM, en mélangeant en pipitant doucement de haut en bas.
  5. Estimer la concentration actuelle des cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé (répertorié dans le tableau des matériaux). Ensemencer six puits (dans cet exemple) dans une plaque de 24 puits avec 1 x 105 cellules (pour une densité d’ensemencement de 50 000 cellules/cm2).
  6. Ajouter la solution DMEM jusqu’à 500 μL (ajouter d’abord la solution DMEM aux puits), puis étiqueter un puits par traitement comme suit : aucun contrôle de couleur, contrôle mKO2, contrôle TagBFP, contrôle NeonGreen, contrôle toutes couleurs et poly-transfection 1. Les puits de contrôle TagBFP, mKO2 et NeonGreen sont des témoins unicolores pour toutes les protéines fluorescentes incluses dans la polytransfection.

2. Effectuer la transfection

  1. Préparer des tubes pour chaque agrégat d’ADN. Mettez de côté les tubes microcentrifugeuses de 1,5 mL et étiquetez les tubes comme suit : aucun contrôle de couleur, contrôle mKO2, contrôle TagBFP, contrôle NeonGreen, contrôle toutes couleurs, mélange de polytransfection 1 et mélange de polytransfection 2.
    1. Ajouter 36 μL de milieu sérique réduit au contrôle sans couleur, au contrôle mKO2, au contrôle TagBFP, au contrôle NeonGreen et à tous les tubes de contrôle de couleur. Ajouter 18 μL de milieu sérique réduit à chacun des tubes du mélange de polytransfection 1 et du mélange de polytransfection 2.
      REMARQUE : Les concentrations de plasmides sont supposées être de 150 ng/μL.
    2. Ajouter 600 ng de plasmide de comblement dans le tube de contrôle sans couleur. Ajouter 300 ng de mKO2 et 300 ng de plasmide de comblement dans le tube de contrôle de couleur mKO2. Ajoutez 300 ng de TagBFP et 300 ng de plasmide de remplissage au tube de contrôle de couleur TagBFP.
    3. Ajouter 300 ng de plasmide constitutif NeonGreen et 300 ng de plasmide de remplissage au tube de contrôle de couleur NeonGreen. Ajouter 100 ng de mKO2, TagBFP et NeonGreen constitutif, ainsi que 300 ng de plasmide de remplissage, au tube de contrôle toutes couleurs.
    4. Ajouter 150 ng de mKO2 au mélange de polytransfection 1 tube. Ajouter 75 ng de plasmide rapporteur NeonGreen et 75 ng de plasmide de comblement au mélange de polytransfection 1 tube.
    5. Ajouter 150 ng de TagBFP au mélange de polytransfection 2 tubes. Ajouter 75 ng de plasmide L7ae et 75 ng de plasmide de comblement au mélange de polytransfection 2 tubes.
  2. Créer le mélange maître de transfection dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL en combinant 216 μL de milieu sérique réduit avec 9,48 μL de réactif de transfection (voir le tableau 1 pour les rapports de réactifs et l’échelle de la réaction). Bien mélanger en tuytant de haut en bas et de réserver.
  3. Ajoutez 1,58 μL de réactif amplificateur à chacun des tubes de contrôle sans couleur, de contrôle de couleur unique et de tous les tubes de contrôle de couleur. Ajouter 79 μL de réactif amplificateur à chacun des tubes de mélange de polytransfection. Mélanger chaque tube individuellement en pipetant vigoureusement.
  4. Ajouter le mélange maître de transfection à chaque tube contenant de l’ADN.
    1. Ajoutez 37,58 μL de mélange maître de transfection à chacun des tubes de contrôle sans couleur, de contrôle de couleur unique et de tous les tubes de contrôle de couleur. Mélanger chaque tube individuellement en pipetant vigoureusement.
    2. Ajouter 18,79 μL de mélange maître de transfection à chacun des tubes de mélange de polytransfection. Mélanger chaque tube individuellement en pipetant vigoureusement.
  5. Distribuer les mélanges de transfection dans les puits.
    1. Pipeter 65,97 μL de chaque mélange de transfection pour les contrôles sans couleur, couleur unique et toutes les couleurs dans les puits correspondants.
    2. Pipeter 32,98 μL du mélange de polytransfection 1 dans le puits de polytransfection et agiter la plaque rapidement mais doucement en huit serrés le long d’une surface plane pour répartir efficacement les complexes. Ensuite, pipeter 32,98 μL de la poly-transfection mélanger 2 dans le même puits de poly-transfection et agiter la plaque de la même manière.
  6. Placer la plaque dans un incubateur à 37 °C, avec 5% de CO2 et sans agitation, pendant une durée de 48 h.
    REMARQUE: Pour augmenter la viabilité cellulaire, le milieu cellulaire peut être remplacé toutes les 6 heures après la transfection (bien que cela ne soit pas toujours nécessaire, et avec les cellules HEK293 et ses dérivés, il faut faire attention à ne pas détacher les cellules de la plaque lors du changement du média).
Réactif Quantité Détartrage
Milieu sérique réduit pour mélange d’ADN 36 μL par tube témoin, 18 μL par tube de polytransfection 0,05 μL Milieu sérique réduit/ng ADN par tube, avec 10-20% de volume supplémentaire pour tenir compte du pipetage
ADN 300-600 ng par tube
P3000 1,58 μL par tube témoin, 0,79 μL par tube de polytransfection 0,0022 μL P3000/ng ADN par tube, avec 10-20% supplémentaires
Milieu sérique réduit pour Lipo master mix 36 μL par tube témoin, 18 μL par tube de polytransfection 0,05 μL de milieu sérique réduit/ng d’ADN total, avec 10 à 20 % de volume supplémentaire pour tenir compte du pipetage
Réactif de transfection et d’amplificateur 1,58 μL par tube témoin, 0,79 μL par tube de polytransfection 0,0022 μL de lipofectamine 3000/ng d’ADN, avec 10-20% d’extra

Tableau 1 : Mise à l’échelle des réactifs pour les transfections. Le tableau indique le rapport correct de réactif à inclure pour la quantité d’ADN incluse dans un seul puits. Cela peut être utilisé pour mettre à l’échelle efficacement les réactions et former des mélanges maîtres. Les quantités de réactifs ont été mises à l’échelle pour inclure un excès de 20%.

3. Préparer les cellules à la cytométrie en flux

  1. Préchauffer au moins 4,2 mL de la solution DMEM à 37 °C. Préchauffer au moins 4,2 mL de trypsine et 4,2 mL de PBS à 37 °C. Conserver la solution tampon de tri cellulaire activée par fluorescence (FACS) à 4 °C jusqu’à ce qu’elle soit prête à être utilisée.
  2. Resuspendre les cellules dans la solution tampon FACS (PBS supplémenté avec 1% de BSA, 5 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique [EDTA] et 0,1% d’azoture de sodium [NaN3], pour réduire l’agglutination; voir le tableau des matériaux) comme décrit ci-dessous.
    1. Aspirer et éliminer les milieux actuels dans chaque puits. Distribuez 5 mL de PBS dans chaque puits pour laver les cellules. Aspirer et éliminer le PBS.
    2. Verser 5 mL de trypsine dans chaque puits. Placer la plaque dans un incubateur à 37 °C pendant 3 min, ou jusqu’à ce que les cellules n’adhèrent plus à la boîte. Remettre la plaque dans l’enceinte de biosécurité et diluer les solutions cellulaires en distribuant 5 mL de solution DMEM dans chaque puits.
    3. Pour chaque puits, mélanger la solution en remontant et descendant doucement plusieurs fois. Pour chaque puits, aspirez tous les milieux et placez-les dans un tube conique de 15 mL.
  3. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 3 min pour les granuler. Aspirez le média, en prenant soin de ne pas aspirer les cellules et de les jeter. Dans chaque tube, remettre les cellules en suspension dans 5 mL de solution tampon FACS, en mélangeant en pipetant doucement de haut en bas.
  4. Faire passer chaque solution de suspension cellulaire à travers une passoire (pour éliminer les touffes) dans des tubes coniques de cytométrie en flux séparés. Gardez ces tubes sur la glace pendant pas plus de 1 h et effectuez la cytométrie en flux dès que possible.

4. Effectuer la cytométrie en flux

REMARQUE: L’utilisation d’un cytomètre en flux nécessite une formation appropriée et une connaissance des tâches nécessaires. Étant donné que les logiciels et l’équipement peuvent varier et que les utilisateurs doivent être formés de manière générale, cette section fait référence à des opérations spécifiques qui sont utiles à effectuer.

  1. Tout d’abord, examinez les cellules transfectées avec le contrôle plasmidique de remplissage (pas de contrôle de couleur) pour sélectionner les caractéristiques cellulaires et éviter les anomalies (y compris les agrégats, les débris, etc.). Bien qu’il existe de nombreuses combinaisons de paramètres pour distinguer les cellules, utilisez les trois options générales suivantes comme un bon moyen de visualiser les caractéristiques distinctives.
    1. Comparez la zone de diffusion latérale (échelle logarithmique ou linéaire par préférence/type de cellule) par rapport à la zone de diffusion vers l’avant (échelle linéaire).
    2. Comparez la hauteur de diffusion latérale (échelle logarithmique) par rapport à la largeur de diffusion latérale (échelle linéaire).
    3. Comparez la largeur de diffusion vers l’avant (échelle linéaire) par rapport à la hauteur de diffusion vers l’avant (échelle linéaire).
  2. Ensuite, regardez les contrôles à couleur unique. Utilisez le contrôle toutes couleurs pour régler les tensions de l’instrument, de sorte que les signaux de chaque protéine fluorescente soient normalisés à des unités arbitraires équivalentes (u.a.) de fluorescence. Ensuite, exécutez les commandes de couleur unique pour chaque protéine fluorescente, qui sont utilisées pour définir la matrice de compensation, ce qui permet une correction du fond perdu.
    REMARQUE: Idéalement, la plage dynamique complète des valeurs de fluorescence devrait être visible. Une normalisation plus poussée des signaux de protéines fluorescentes peut se faire par conversion en unités normalisées (p. ex., molécules de fluorescéine équivalente [MEFL; voir Beal et coll.15]). Pour activer la conversion MEFL pendant l’analyse, exécutez des perles d’étalonnage arc-en-ciel. Un tel étalonnage est également utile pour réduire la variation du signal d’instrument à instrument et de jour en jour16.
  3. Exécutez le tube à échantillon de polytransfection.
    REMARQUE : Dans la mesure du possible, il est recommandé d’exécuter des cellules de 1 000 x 10^ (^ = mélanges), car les polytransfections de dimensions supérieures doivent être subdivisées en plusieurs cellules pendant l’analyse, et chaque cellule a besoin de suffisamment de cellules (idéalement >10) pour faire des comparaisons statistiquement significatives.

5. Effectuer une analyse post-expérience

  1. Dans un premier temps, utilisez les données des contrôles (et, le cas échéant, des perles) pour assurer des résultats précis. Utilisez l’un des outils logiciels disponibles pour effectuer le contrôle des cellules sous tension (à l’aide des portes décrites ci-dessus), la compensation et la correction de l’autofluorescence.
    REMARQUE: Nous utilisons généralement du code MATLAB personnalisé (par exemple, https://github.com/jonesr18/MATLAB_Flow_Analysis ou Cytoflow17), qui possède à la fois une interface utilisateur graphique et une bibliothèque python adaptée à la phase de prétraitement et à l’analyse de polytransfection.
Méthode Complexe Marqueur fluorescent ng ng L7ae (fraction) ng Reporter (fraction) ng Filler DNA (fraction) Total (ng)
Poly-transfection 1 600
→ 1 150 75 (½) 75 (½) 300
→ 2 150 75 (½) 75 (½) 300
Poly-transfection 2 600
→ 1 150 25 (1/6) 125 (5/6) 300
→ 2 150 125 (5/6) 25(1/6) 300

Tableau 2 : Quantités d’ADN pour la polytransfection démontrées dans le protocole, et un exemple d’expérience de suivi avec des rapports plasmidiques accordés. La moitié supérieure du tableau montre la composition des plasmides utilisés dans une expérience simple de polytransfection. La moitié inférieure montre la composition d’une expérience mise à jour qui ajuste les rapports plasmidiques pour mieux sous-échantillonner un espace de concentration hypothétique, où le modulateur d’expression génique est à un rapport plus optimal de 1:5 par rapport à son rapporteur, ce qui donne plus de cellules transfectées à échantillonner autour de ce rapport.

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Representative Results

Dans la figure 1, nous comparons la co-transfection à la poly-transfection. Dans une co-transfection, tous les plasmides sont livrés dans le même mélange de transfection, ce qui entraîne une forte corrélation entre la quantité de chaque plasmide qu’une seule cellule reçoit (Figure 1A). Bien que le nombre total de plasmides délivrés à chaque cellule varie considérablement, la fluorescence des deux protéines rapporteures dans les cellules individuelles de la population est bien corrélée, ce qui indique que les deux plasmides sont co-délivrés à un rapport assez constant. Les cellules transfectées peuvent absorber peu ou beaucoup de complexes, mais comme chaque complexe a des quantités corrélées de chaque plasmide, la co-transfection n’explore qu’une petite région diagonale de l’espace de concentration entre les deux plasmides. En revanche, dans une polytransfection, les plasmides sont délivrés dans de multiples complexes de transfection, ce qui entraîne une livraison décorrélée des plasmides dans différents mélanges de transfection (Figure 1B). Les cellules transfectées absorbent différentes combinaisons des complexes, ce qui donne des cellules qui contiennent des doses variables de plasmides de l’un ou l’autre ou des deux complexes.

La figure 2 montre un flux de travail de polytransfection représentatif. En général, une expérience de polytransfection comprend les étapes suivantes: définir le problème, créer les mélanges de transfection, incuber les cellules, cytométrie en flux et analyse. Il existe également une étape facultative pour répéter la poly-transfection avec des rapports de pièces optimisés si les résultats initiaux de la poly-transfection ne sont pas en mesure d’affiner avec précision les rapports de pièces optimaux. Ces étapes sont décrites dans le protocole.

La figure 3 présente quelques exemples de cotransfections et de polytransfections bien exécutées et d’erreurs courantes. La figure 3A montre une co-transfection bien réalisée avec une corrélation étroite entre TagBFP et les plasmides exprimant eYFP qui ont été co-délivrés. En revanche, la co-transfection de la figure 3B montre une faible corrélation entre ces deux plasmides. Dans la figure montrée, la faible corrélation est due à l’ajout d’un réactif amplificateur au milieu sérique réduit avant l’ajout des plasmides. Une telle faible corrélation dans les expériences pourrait également être due à différents promoteurs conduisant l’expression des protéines fluorescentes, à un mauvais mélange lors de la création du mélange de transfection ou à permettre au complexe d’incuber pendant un intervalle trop court ou trop long.

La figure 3C montre une poly-transfection bien réalisée, avec une bonne couverture de l’espace bidimensionnel et une bonne compensation de tout saignement spectral entre protéines fluorescentes. La figure 3D montre des données de polytransfection avec un faible nombre de cellules vivantes, ce qui est difficile à subdiviser en suffisamment de bacs avec un nombre suffisant de cellules dans chaque bac pour l’analyse. Pour améliorer ce problème, la population de cellules de départ doit être en bonne santé et ne pas être envahie par la végétation, et la toxicité expérimentale réduite en utilisant un réactif de transfection différent et / ou en transfectant avec moins d’ADN total. La figure 3E montre une polytransfection dans laquelle l’efficacité de la transfection était faible, ce qui a entraîné à nouveau une couverture clairsemée de l’espace bidimensionnel pour l’analyse. Dans ce cas, le nombre de cellules passant par la morphologie gating est élevé, mais les cellules n’expriment pas de protéines fluorescentes. Pour améliorer l’efficacité, le choix du réactif de transfection doit être optimisé et le protocole du fabricant doit être suivi de près. Chaque mélange de transfection doit contenir une quantité équivalente de masse d’ADN, garantissant aux cellules une chance approximativement égale de recevoir chaque type de complexe, et chaque mélange de transfection doit être fabriqué conformément aux instructions de la trousse. Différents kits de transfection sont optimaux pour différents types de cellules; Le kit qui donne la meilleure efficacité dans le type de cellule d’intérêt doit être utilisé. Enfin, certains types de cellules sont difficiles à transfecter, quel que soit le kit utilisé. Dans ces cas, un plus grand nombre de cellules doivent être transfectées et autant que possible collectées pendant la cytométrie en flux pour assurer un nombre suffisant de cellules à analyser. La figure 3F montre les données de polytransfection où l’un des marqueurs de protéines fluorescentes montre clairement une purge spectrale dans une autre protéine fluorescente. Des contrôles monocolores doivent toujours être exécutés pour toutes les protéines fluorescentes du système et utilisés pour générer une matrice de compensation qui doit être appliquée à toutes les polytransfections avant l’analyse.

Lors de la première exécution d’expériences de polytransfection (globalement ou pour un nouveau système expérimental), il convient d’effectuer une analyse comparative par rapport à la co-transfection standard. Une approche consiste à mesurer individuellement la fonction de transfert entrées-sorties pour les parties clés du système en utilisant à la fois la co-transfection (via le réglage des dosages d’ADN) et la poly-transfection.

Dans la figure 4, nous démontrons l’analyse comparative du répresseur translationnel L7Ae, adapté ici de la publication originale de poly-transfection10. L7Ae est une protéine de liaison à l’ARN qui reconnaît les motifs de repli de l’ARN (KT)20; lorsque deux KT (2xKT) sont placées dans la région non traduite (UTR) 5' d’un ARNm, la traduction en aval du cadre de lecture ouvert (ORF) peut être efficacement supprimée par L7Ae21. L7Ae a déjà été utilisé pour construire des classificateurs de type cellulaire à base d’ARN21 et d’autres circuits basés sur l’ARN22. Pour tester L7Ae par co-transfection standard, on peut ajuster les rapports des plasmides codant pour L7Ae et son rapporteur cible dans différents mélanges de transfection (Figure 4A et Tableau 3). Pour la polytransfection, il faut délivrer indépendamment la L7Ae constitutive et le rapporteur 2xKT correspondant dans des mélanges de transfection séparés, de sorte qu’une large gamme de rapports plasmidiques soient délivrés aux cellules (Figure 4B). Après avoir effectué la transfection et la cytométrie en flux, l’analyse des données peut être effectuée. Pour rendre les données comparables, on peut rassembler les résultats individuels de la co-transfection en un seul ensemble de données, puis effectuer un regroupement multidimensionnel similaire aux données de poly-transfection (Figure 4C,D). En comparant les courbes dose-réponse de L7Ae réprimant le déclarant de sortie, on peut voir que le niveau de sortie médian par bac est très similaire entre les données de co-transfection et de poly-transfection (Figure 4E-G).

En général, nous avons vu que les données de poly-transfection sont bien corrélées avec les données de co-transfection sur les rapports d’ADN généraux, avec moins de précision à des rapports de dosage d’ADN très asymétriques (en partie à cause de la couverture cellulaire plus faible dans les bacs pour les expériences de poly-transfection, en particulier pour les parties qui sont très fortement actives à de faibles doses plasmidiques). Pour améliorer la précision de mesure de ces parties sensibles, leur niveau d’expression peut être réduit avec un promoteur plus faible, des cadres de lecture ouverts en amont18 ou des accordeurs fins médiés par le silençage des microARN (miSFIT)19.

La figure 5 démontre une application réussie de la polytransfection pour l’optimisation d’un classificateur de type cellulaire, encore une fois adapté de Gam et al10. Le classificateur est une conception relativement simple qui produit une sortie en réponse à l’expression de miR-21-5p, un miARN surexprimé dans de nombreuses cellules tumorales23. En l’absence de miR-21, la sortie du classificateur est réprimée par un répresseur transcriptionnel dérivé de bactéries, BM3R124, dont l’adaptation a déjà montré son efficacité dans les cellules de mammifères25. Lorsque miR-21 est présent, il lie quatre sites cibles placés dans les UTR 3' et 5' de BM3R1, ce qui réduit son expression et permet ainsi la transcription de sortie (Figure 5A). Pour optimiser ce système, les trois composants du circuit ont été livrés dans des mélanges de transfection distincts : (1) BM3R1 (avec sites cibles miR-21), (2) rapporteur de sortie (mKO2) et (3) Gal4-VP16, qui active la transcription de la sortie (Tableau 4). Notez que le promoteur de sortie fonctionne sur la logique (Gal4-VP16) et non BM3R1, ce qui supprime la sortie même en présence de Gal4-VP1625. Chaque partie code un marqueur de transfection, TagBFP, mNeonGreen et iRFP720, respectivement, sur le même plasmide pour indiquer la dose relative d’ADN de chaque complexe. En général, l’augmentation de l’expression de Gal4-VP16 devrait augmenter la sortie mKO2 du rapporteur, tandis que l’augmentation de l’expression de BM3R1 devrait entraîner une baisse de la sortie mKO2. Parce que BM3R1 est renversé par miR-21-5p, l’expression de sortie devrait être plus élevée dans les cellules HeLa, qui ont des niveaux plus élevés de miR-21-5p et expriment donc moins de BM3R1 que dans les cellules TEK.

Après poly-transfection dans les cellules HEK293 et HeLa, nous avons obtenu une distribution 3D de différents rapports plasmidiques (cellules Figure 5B-HELI). Gam et coll.10 ont sous-échantillonné cette distribution à divers rapports en considérant les cellules situées à une distance euclidienne particulière d’un rapport d’intérêt; Cette distance doit être suffisamment large pour inclure suffisamment de cellules pour permettre des résultats statistiquement significatifs de l’analyse, mais suffisamment étroite pour éviter le bruit inutile lié à l’inclusion d’un ensemble trop large de rapports de composants des trois parties. Gam et al.10 ont ensuite utilisé un algorithme d’optimisation pour identifier le rapport des parties qui maximisait la précision de classification pour la co-transfection (c.-à-d. que les cellules HeLa transfectées sont positives pour l’expression de sortie alors que les cellules HEK transfectées ne le sont pas). Le rapport optimal des pièces s’est avéré être de 10,9:1,5:1 : Gal4-VP16:sortie : BM3R1 ; Les cellules sous-échantillonnées autour du rapport optimal dans l’ensemble de l’espace de polytransfection sont illustrées à la figure 5C. Ce sous-échantillonnage a prédit que, à ce rapport, le circuit co-transfecté a une spécificité de 91%, une sensibilité de 62% et une précision de 77% lors de la classification des cellules HEK293 par rapport aux cellules HeLa (Figure 5D). La co-transfection avec des rapports plasmidiques réglés à cet optimum a donné des résultats encore meilleurs : spécificité de 99 %, sensibilité de 68 % et précision de 84 %10. De plus, les rapports ont guidé la mise en œuvre d’une version monoplasmidique du circuit, avec une expression relative ajustée en utilisant différents promoteurs tronqués et ORF en amont (uORF), ce qui donne un circuit avec une spécificité de 91%, une sensibilité de 90% et une précision de 90%10. Ainsi, la polytransfection est un outil puissant pour guider la conception des classificateurs cellulaires et des circuits géniques plus largement.

Figure 1
Figure 1 : Comparaison de la co-transfection et de la poly-transfection. (A,B) Vue d’ensemble et comparaison de l’administration plasmidique avec la co-transfection de deux plasmides et la polytransfection de deux plasmides. Pour chaque méthode de transfection, le diagramme le plus à gauche montre la formation de complexes de transfection entre l’ADN chargé négativement et les lipides chargés positivement. Dans ces exemples, chaque plasmide coloré (bleu et rouge) code l’expression d’une protéine fluorescente différente. Le diagramme central montre des exemples de livraison plasmidique aux cellules ainsi qu’un schéma pour les distributions attendues dans un histogramme ou un nuage de points. L’intensité de la couleur sur l’histogramme correspond à la fluorescence de la couleur plasmidique correspondante. Le diagramme le plus à droite montre les données réelles des cellules transfectées à l’aide de chaque méthode donnée. (A) Dans une co-transfection avec deux plasmides différents, les deux plasmides sont mélangés avant d’ajouter un réactif de transfection, ce qui entraîne un emballage fortement corrélé des deux espèces plasmidiques. Dans les données réelles de co-transfection, les cellules présentent une livraison corrélée des deux plasmides (à droite). (B) Dans une polytransfection, chaque ensemble de plasmides co-délivrés correspondant à une partie du circuit et un marqueur de transfection est mélangé séparément avec le réactif de transfection, ce qui donne des complexes qui ne contiennent que les plasmides (à gauche). Dans les données réelles de polytransfection, les cellules explorent un large éventail d’espace de concentration avec de nombreuses stœchiométrie plasmidiques différentes explorées simultanément (à droite). Ce chiffre a été modifié par rapport à10. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Flux de travail de polytransfection. Étape 1 : Définissez le problème. Commencez avec un système avec plusieurs composants pour lequel le rapport idéal entre les composants est inconnu et choisissez un rapport de départ entre les composants. Étape 2 : Créez les mélanges de transfection. Chaque mélange de transfection contient un composant de circuit et un marqueur de transfection fluorescent. La quantité de pièce de circuit délivrée à une cellule est en corrélation avec la fluorescence du marqueur. Étape 3 : Incuber les cellules. Dans un flux de travail typique, nous incubons des cellules pendant 48 heures entre la transfection et la cytométrie en flux. Étape 4 : Cytométrie en flux. Exécutez les contrôles appropriés, comme indiqué dans le protocole, puis exécutez les exemples. Étape 5: Analyse.Utilisez les marqueurs de transfection pour classer les cellules en fonction de la quantité ou des ratios de pièces reçues par la cellule. Utilisez la ou les protéines de sortie pour mesurer les performances du circuit. Trouvez les bacs/rapports des pièces qui optimisent les performances du circuit. Étape 6: Répétez avec des rapports de pièces optimisés (facultatif). Si les compartiments/rapports optimaux sont à des rapports très asymétriques, la polytransfection pilote peut ne pas réduire précisément les rapports de pièces optimaux. Répétez la polytransfection avec des rapports de pièces accordés, de sorte qu’une cellule qui a reçu une quantité égale de chaque mélange de transfection reçoive maintenant un rapport de pièces proche de l’optimal, tel que déterminé par le tour précédent. Ce chiffre a été modifié par rapport à10. L’image d’un incubateur a été utilisée de Servier Medical Art et l’image d’un cytomètre de BioRender. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Résultats représentatifs de polytransfection positifs et négatifs. (A) Co-transfection bien effectuée de deux rapporteurs fluorescents, montrant une corrélation étroite. Un total de 20 000 cellules sont tracées ici et en (B) à des fins de comparaison. C’est une bonne idée d’effectuer un petit essai similaire de co-transfection de deux rapporteurs fluorescents avant de commencer une expérience de poly-transfection, afin de s’assurer que les plasmides sont bien corrélés dans les mélanges de transfection. (B) Co-transfection plus bruyante : les plasmides ne sont pas bien corrélés dans chaque mélange de transfection, ce qui peut faire en sorte que les marqueurs fluorescents dans une polytransfection soient un mauvais marqueur des rapports plasmidiques. (C) Résultats de polytransfection bien exécutés montrant un bon nombre de cellules, une bonne efficacité de transfection et une bonne compensation. (D) Faible nombre de cellules vivantes, qui ne permet pas un sous-échantillonnage dans des cellules avec un nombre statistiquement significatif de cellules. (E) Faible efficacité de la transfection, qui ne permet pas le sous-échantillonnage dans des cellules avec un nombre statistiquement significatif de cellules. (F) Absence de compensation appropriée, ce qui fait que les données de fluorescence sont une mauvaise approximation de la quantité de protéines fluorescentes dans le système. Utilisez des contrôles monochromes pour déterminer une matrice de compensation linéaire idéale et appliquez-la aux données avant tout traitement ultérieur. Tous les contrôles de couleur sont également recommandés en fonction du choix du logiciel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Analyse comparative de la polytransfection par rapport à la cotransfection. (A) Dans une co-transfection, un rapport entre le répresseur translationnel L7Ae et les plasmides rapporteurs fluorescents peut être testé dans chaque puits expérimental. (B) Dans la polytransfection, de nombreux rapports de L7Ae par rapport aux rapporteurs peuvent être testés dans le même puits. Voir le tableau 3 pour plus de détails sur les mélanges plasmidiques de polytransfection. (C, D) Flux de travail de regroupement pour comparer la polytransfection par rapport à plusieurs co-transfections. Au total, 10 bacs espacés de manière biexponentielle ont été attribués pour chaque dimension de marqueur de transfection, ce qui correspond approximativement aux niveaux de chacun des deux plasmides. Ici, les bacs qui indiquent différents niveaux de plasmide #2 sont montrés. Le binning a été effectué à la fois sur un ensemble assemblé de 11 échantillons de co-transfection couvrant divers rapports plasmidiques (C) et sur des données provenant d’une seule poly-transfection, comprenant environ 500 000 cellules chacune (D). Les couleurs correspondent à des ensembles de bacs définis par les niveaux du gène 2 (TagBFP). (E-G) Analyse comparative de la poly-transfection par rapport à la co-transfection pour un circuit représentatif. La fluorescence médiane de sortie a été évaluée pour les cellules de chaque bac et comparée entre les méthodes du système représentatif, la répression translationnelle L7Ae. (E) Constructions pour mesurer l’activité L7Ae. La fluorescence mKO2 sert d’estimation de l’administration de L7Ae (gène #1), tandis que la fluorescence TagBFP sert d’estimation de la livraison de la sortie régulée de mNeonGreen (gène #2). (F) Courbes de titrage multidimensionnelles pour L7Ae. Chaque ligne représente l’ensemble des bacs à un niveau de TagBFP, comme indiqué en (C) et (D). Les lignes pleines indiquent les données de polytransfection, tandis que les lignes pointillées indiquent les données de co-transfection. À chaque niveau de plasmide rapporteur classé, la production du rapporteur diminue à mesure que L7Ae augmente. (G) Comparaison visuelle entre la co-transfection et la poly-transfection pour le système L7Ae. Chaque point représente la sortie mesurée dans les bacs correspondants pour les mesures de polytransfection et de cotransfection, où les valeurs plus équivalentes sont plus proches de la ligne rouge 1:1. Dans l’ensemble, les différences observées entre les dérivés de la polytransfection et de la co-transfection sont faibles, ce qui donne confiance dans la fiabilité de la méthode de polytransfection. Ce chiffre a été modifié par rapport à10. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Analyse des données pour la polytransfection. Dans la polytransfection, les cellules peuvent être regroupées en bacs ou en tranches pour analyse. La figure 4 présente une forme d’analyse où les cellules sont regroupées en tranches qui correspondent aux niveaux d’un composant du système, comme le niveau de plasmide rapporteur, ce qui peut être utile pour l’ajustement du modèle et la compréhension des réponses posologiques. Une autre stratégie utile consiste à analyser les performances du circuit à différents rapports de composants du circuit. (A) Schéma d’un circuit classificateur pour l’optimisation. Les niveaux de TagBFP, NeonGreen et iRFP720 correspondent aux niveaux de BM3R1, de sortie mKO2 et Gal4-VP16, respectivement. Voir le tableau 4 pour plus de détails sur les mélanges plasmidiques de polytransfection. B) Mise en place expérimentale de mélanges de polytransfection. (C) Données de cytométrie en flux recueillies à partir de la polytransfection avec le circuit en (A). Les niveaux de chacune des trois protéines fluorescentes rapporteures à la suite de la polytransfection du circuit dans les cellules HEK, mettant en évidence la large gamme de rapports de composants du circuit présents dans les données. Des résultats similaires ont été obtenus à partir de la transfection en circuit dans les cellules HEK et HeLa. (D) Sous-échantillonnage polytransfection à un rapport particulier. Pour analyser les données, nous avons analysé un grand nombre de rapports entre les composants du circuit et déterminé les performances du classificateur à chaque rapport. À titre d’exemple, nous montrons ici un ratio particulier qui a démontré de bonnes performances (Gal4-VP16 = 435 ng d’ADN, rapporteur = 60 ng et BM3R1 = 40 ng). Le rapport correspondant des marqueurs fluorescents pour les trois composants différents du circuit est tracé en bleu. Ensuite, nous avons sous-échantillonné les données en ne considérant que les points situés à une distance euclidienne particulière de la trajectoire de fluorescence. Nous avons sous-échantillonné des cellules sur la même trajectoire à partir des transfections HEK et HeLa. (E) Comparaison des performances des circuits sur la même trajectoire dans les cellules HEK et HeLa. En comparant des statistiques telles que la sensibilité, la spécificité et la précision de la classification sur de nombreux ratios, les rapports de composants peuvent être optimisés pour générer un circuit génétique idéal. Ce chiffre a été modifié par rapport à10. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Complexe ng plasmide L7Ae ng plasmide rapporteur OptiMEM (μL) P3000 (μL) Lipo 3000 (μL)
1 250 75 1.5 1.5
2 250 75 1.5 1.5

Tableau 3 : Mélanges de transfection correspondant à la figure 4. Les cellules HEK293 ont été poly-transfectées avec ces mélanges de transfection dans un puits d’une plaque de 24 puits.

Complexe ng plasmide BM3R1 ng Gal4-VP16 plasmide ng plasmide rapporteur OptiMEM (μL) P3000 (μL) Lipo 3000 (μL)
1 900 75 1.5 1.5
2 900 75 1.5 1.5
3 900 75 1.5 1.5

Tableau 4 : Mélanges de transfection correspondant à la figure 5. Les cellules HEK293 et HeLa ont chacune été poly-transfectées avec ces mélanges de transfection dans un puits chacun d’une plaque de 6 puits.

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Discussion

Les méthodes de prototypage rapide telles que la conception assistée par ordinateur (CAO), la planche à pain et l’impression 3D ont révolutionné les disciplines mécaniques, électriques et de génie civil. La capacité de rechercher rapidement de nombreuses solutions possibles à un défi donné accélère considérablement les progrès dans un domaine. Nous pensons que la polytransfection est une technologie analogue pour le génie biologique, permettant le prototypage rapide de circuits génétiques. De plus, d’autres technologies de prototypage rapide nécessitent une itération séquentielle pratique de plusieurs solutions possibles, tandis que la polytransfection est capable d’explorer de nombreuses solutions simultanément. La polytransfection permet de tester un grand nombre de combinaisons de rapports de composants de circuits génétiques dans un seul puits et a été utilisée pour optimiser plusieurs circuits génétiques publiés10,11,13. Le protocole expérimental est une simple extension de la co-transfection standard, permettant une adoption directe par de nombreux chercheurs sur les cellules de mammifères. En général, un accord très étroit entre les résultats de la polytransfection et de la co-transfection est observé10 (un exemple est la figure 4). Ainsi, la polytransfection peut être utilisée dans la plupart des cas où les rapports plasmidiques sont titrés dans des mélanges de co-transfection et les sorties sont mesurées au niveau de la cellule unique.

La complexité et l’ampleur de la poly-transfection augmentent avec la complexité des circuits génétiques à optimiser. À mesure que le nombre de dimensions à analyser augmente, les rapports combinatoires des différentes parties et le nombre de cellules nécessaires à leur analyse augmentent de façon exponentielle. Par exemple, pour optimiser le classificateur de la figure 5, les cellules ont été transfectées dans un format de plaque à 6 puits, et des données ont été recueillies sur au moins 1,5 million de cellules vivantes. Nous avons également optimisé un classificateur avec un composant de circuit supplémentaire 10, nécessitant une transfection à l’échelle d’une plaque de10 cm et la collecte de millions de cellules. À cette échelle et au-delà, la production d’ADN prend du temps et les réactifs de transfection sont coûteux. Cela dit, la polytransfection utilise des ordres de grandeur inférieurs de cellules, d’ADN et de réactifs de transfection que de tester un nombre comparable de combinaisons de rapports de composants de circuit dans des puits individuels. De plus, un gain de temps considérable est réalisé en réduisant considérablement les mélanges de transfection.

La polytransfection permet des méthodes d’analyse avancées pour les données de cytométrie en flux. Les deux approches principales sont (1) la classification des cellules en fonction de l’expression de chaque marqueur de transfection et (2) l’extraction des cellules à des rapports définis de marqueurs de transfection, simulant ainsi la co-transfection. Le premier sélectionne des cellules avec une combinaison spécifique de dosage d’ADN pour chaque complexe (et donc chaque partie), ce qui donne des fonctions de transfert entrée-sortie. Ce dernier sélectionne les cellules à un rapport spécifique de dosages d’ADN pour chaque partie, simulant la co-transfection à un tel rapport de masses d’ADN plasmidique. Le tracé du niveau d’expression du ou des rapporteurs de sortie de circuit dans les sélections sous-échantillonnées donne une mesure de la sortie aux niveaux ou rapports définis d’entrées. Pour l’optimisation du circuit, on peut identifier les bins/rapports les plus performants tels que définis par l’objectif du circuit - dans le cas des classificateurs de cellules, ce sont les bins/rapports où le circuit est ON dans le type de cellule cible et OFF dans les types de cellules non cibles. Lors du choix d’une taille de bac, il faut tenir compte du niveau de précision requis, ainsi que du nombre de cellules par bac. Les bacs plus petits se concentrent plus précisément sur la combinaison idéale de composants de circuit, mais si un bac a trop peu de cellules, il peut introduire un bruit indésirable dans les mesures.

Les améliorations futures de l’analyse informatique des données de polytransfection pourraient faciliter l’optimisation, même avec une faible couverture cellulaire par bin/ratio. Actuellement, nous excluons les données des bacs avec moins d’un seuil défini de cellules (par exemple, 10) pour éviter des mesures trop bruyantes. En combinaison avec des mesures répétées, cela permet des calculs plus précis des courbes dose-réponse, de la précision du classificateur et d’autres paramètres définis par catégorie. Cependant, chaque cellule en polytransfection peut être considérée comme une expérience indépendante, mesurant à une résolution fine la ou les sorties du circuit à un niveau précis d’entrées. Dans cette optique, les modèles mécanistes et phénotypiques des doses-réponses et des optimisations de circuits peuvent s’adapter directement à la distribution de l’expression génique de chaque marqueur et rapporteur, plutôt qu’à leurs statistiques sommaires groupées10. Cela permet des mesures plus robustes et tire parti des nombreux points de données individuels collectés par expérience. De telles approches de modélisation pourraient ainsi permettre une caractérisation et une optimisation prédictives des circuits, même avec des polytransfections de grande dimension peu échantillonnées. En outre, des méthodes d’apprentissage automatique telles que la méthodologie de surface de réponse et la régression aléatoire de forêt peuvent être utilisées pour analyser des données relativement rares et de grande dimension10.

Une autre approche pour les polytransfections de plus en plus grandes consiste à optimiser séquentiellement les circuits en utilisant des hiérarchies de polytransfections. Dans cette approche, la polytransfection est d’abord utilisée pour optimiser un module comprenant un sous-ensemble de composants génétiques dans un circuit plus vaste. Ensuite, ces modules optimisés sont livrés sous forme de mélanges de polytransfection séparés, ce qui permet de trouver le rapport / dosage optimal de chaque module de circuit. Cette approche utilise un nombre significativement plus faible de cellules, d’ADN et de réactifs de transfection. Cependant, les groupes de composants ne sont pas nécessairement modulaires par rapport aux autres composants, et donc un rapport optimal de composants dans un module mesuré isolément pourrait être sous-optimal dans le contexte de circuit plus large8.

Les méthodes de polytransfection sont également limitées par la configuration laser/filtre du cytomètre en flux utilisé pour collecter les données. En plus des sorties fluorescentes mesurées, chaque mélange de transfection contient un marqueur protéique fluorescent. Ainsi, il est essentiel de sélectionner des protéines fluorescentes qui peuvent être bien compensées sur le cytomètre. Nous avons précédemment analysé systématiquement le saignement d’un panel de 22 protéines fluorescentes sur un cytomètre en flux à cinq lasers (le BD LSRFortessa), et avons constaté que l’ensemble de Sirius, TagBFP, mNeonGreen, mKO2 et iRFP720 pouvait être utilisé ensemble et bien compensé sans problèmes significatifs10. Cependant, l’optimisation de circuits plus importants peut nécessiter des méthodes de cytométrie avancées, telles que la cytométrie spectrale, pour séparer les protéines fluorescentes avec plus de spectres qui se chevauchent, que notre laboratoire optimise actuellement avec jusqu’à huit protéines fluorescentes. Les bases de données telles que la base de données sur les protéines fluorescentes (https://www.fpbase.org) sont utiles pour sélectionner des protéines fluorescentes présentant un chevauchement spectral particulier. Cependant, ce processus peut être compliqué par divers facteurs, dont certains sont spécifiques à des cytomètres particuliers. Par exemple, l’utilisation de certaines protéines rouges comme tdTomato peut entraîner une purge indésirable dans les canaux bleus uniquement dans certaines configurations laser/filtre10. De plus, plusieurs protéines rouge lointain ont montré des relations non linéaires entre le dosage de l’ADN et la sortie de fluorescence10, réduisant leur utilisation comme marqueurs efficaces pour le dosage de l’ADN.

Pour assurer la cohérence entre les expériences réalisées avec un nombre variable de complexes (un, deux, trois, etc.), il est utile d’utiliser la même quantité fractionnaire de plasmide par mélange de transfection. Par exemple, si vous testez un système à trois gènes avec chaque gène codé dans l’un des trois plasmides (A, B et C), on pourrait co-transfecter les plasmides du circuit à un rapport de 1: 1: 1 avec un rapport égal d’un plasmide codant pour un marqueur de transfection. Cela ferait de chaque plasmide un quart de la masse totale du mélange, et donc environ un quart de la masse de chaque complexe de transfection formé. Lors de la polytransfection de A, B et C dans des complexes séparés avec leurs propres rapporteurs, au lieu de mélanger les plasmides 1: 1 avec des rapporteurs ou de maintenir leur masse totale d’ADN, il est plus cohérent de maintenir chaque plasmide à un quart de la masse de chaque complexe, l’ADN de remplissage occupant la masse restante (voir le tableau 5 pour des exemples). En effet, la distribution de l’expression des gènes parmi les cellules transfectées dépend moins de la masse totale d’ADN délivrée dans les complexes que de la quantité fractionnaire d’ADN dans chaque complexe10. Si des rapports autres que 1:1:1 sont souhaités, calculer les fractions correspondantes de la masse totale d’ADN dans le mélange de transfection pour chaque partie. Par exemple, le tableau 5 [en bas] montre un ratio de 1:1:4.

Méthode Complexe ng A (fraction) ng B (fraction) ng C (fraction) ng Reporter (fraction) ng Filler DNA (fraction) Total (ng)
Co-transfection 1 150 (¼) 150 (¼) 150 (¼) 150 (¼) 0 (0) 600
Poly-transfection 600
→ 1 50 (¼) 50 (¼) 100 (½) 200
→ 2 50 (¼) 50 (¼) 100 (½) 200
→ 3 50 (¼) 50 (¼) 100 (½) 200
Co-transfection 1 75 (⅛) 75 (⅛) 300 (½) 150 (¼) 0 (0) 600
Poly-transfection 600
→ 1 25 (⅛) 50 (¼) 125 (⅝) 200
→ 2 25 (⅛) 50 (¼) 125 (⅝) 200
→ 3 100 (½) 50 (¼) 50 (¼) 200

Tableau 5 : Exemples d’utilisation de l’ADN de remplissage pour assurer la cohérence entre les expériences de cotransfection et de polytransfection. Ici, deux exemples génériques de co-transfectation de trois plasmides avec la même quantité d’ADN de remplissage sont montrés. Dans l’exemple du haut, les plasmides sont tous à des masses égales. Dans l’exemple du bas, un plasmide est délivré à une masse plus élevée par rapport aux autres. La fraction de l’ADN total qui serait utilisée dans un complexe de co-transfection est transmutée en complexes de poly-transfection, la quantité restante d’ADN (jusqu’à la quantité totale pour chaque complexe, qui est fixe et égale d’un complexe à l’autre) étant constituée d’ADN de remplissage.

L’objectif global de l’ADN de remplissage est de maintenir des doses similaires de plasmides par cellule, quel que soit le nombre de mélanges de transfection uniques. Comme approximation grossière de ce principe, séparer trois plasmides en trois mélanges tout en maintenant la même masse d’ADN de chacun (et le rapport approprié de réactif de transfection) réduit le pourcentage de cellules recevant un complexe donné d’un tiers par rapport à un seul mélange contenant les trois plasmides. Cependant, chaque cellule transfectée reçoit par la suite une dose de gène ~3x plus élevée. Réduire la quantité relative des plasmides seuls sans ADN de comblement est donc insuffisant pour maintenir des dosages plasmidiques cohérents, car cela diminue simplement l’efficacité de la transfection sans altérer la distribution sous-jacente de l’expression entre les cellules transfectées10. D’autre part, l’ADN de remplissage permet d’ajuster la dose d’ADN sans affecter l’efficacité globale de la transfection (bien que les cellules transfectées détectables puissent diminuer en raison d’un signal plus faible)10. En suivant l’approximation brute ci-dessus, la réduction de la fraction d’ADN dans les mélanges de polytransfection à un tiers et l’ajout d’ADN de remplissage maintiennent les doses relatives des gènes par rapport à la co-transfection originale. L’ADN de remplissage assure donc une formation efficace et précise du complexe de transfection.

Pour modifier la plage d’expression d’un gène d’intérêt couvert par son rapporteur, la fraction de chaque plasmide de test et/ou promoteurs utilisés pour conduire le gène peut être réglée par rapport au rapporteur. Si une partie est forte / très active à de faibles doses d’ADN, l’utilisation d’une fraction d’ADN inférieure peut aider à centrer la plage dynamique de la partie au milieu de la distribution de fluorescence du rapporteur dans les cellules transfectées. De même, pour les parties qui sont faibles / seulement actives à des doses élevées d’ADN, l’utilisation d’une fraction plus élevée peut être utile. Cependant, il faut faire attention à un tel réglage, car une réduction excessive des fractions d’ADN augmente la stochasticité de la livraison aux cellules par rapport au rapporteur10, et des niveaux élevés d’expression génique peuvent surcharger la machinerie d’expression génique cellulaire12,14. Pour éviter la stochasticité, et dans les cas où chaque gène est délivré aux cellules à un rapport fixe (par exemple, si le circuit doit être généré comme un seul lenti, PiggyBac ou vecteur Landing Pad), l’expression relative de chaque gène peut être ajustée à l’aide de promoteurs plus forts / plus faibles, de petits uORF18 et / ou de miSFIT19.

Bien que le protocole décrive une technique de transfection inverse, la poly-transfection est également possible avec la transfection directe. Dans la transfection inverse, les cellules sont simultanément ensemencées et transfectées; Dans la transfection directe, les cellules sont transfectées ~24 h après le premier placage à environ la moitié de la densité qui serait utilisée dans la transfection inverse (pour permettre la division cellulaire au moment de la transfection). En général, la transfection inverse est plus efficace mais aussi plus toxique, et nous avons remarqué quelques différences dans la forme des distributions de transfection en fonction du réactif, du temps de transfection et de la lignée cellulaire. Ainsi, la méthode de transfection choisie doit être optimisée pour chaque lignée cellulaire afin de maximiser le nombre de cellules transfectées et la couverture de l’espace de concentration multidimensionnel des dosages plasmidiques par cellule.

Globalement, la polytransfection permet l’optimisation rapide des circuits génétiques des mammifères. De nombreuses combinaisons ratiométriques possibles de composants de circuit peuvent être facilement testées dans un seul puits. De plus, étant donné que la polytransfection contient plus d’informations sur les niveaux de chaque partie d’un système qu’une transfection conventionnelle, elle s’est avérée très utile pour caractériser le comportement de diverses parties génétiques10,11,12,13. L’adoption de la polytransfection devrait accélérer le rythme de développement de circuits génétiques nouveaux et améliorés pour une utilisation dans les cellules de mammifères.

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Disclosures

R.W. est cofondateur de Strand Therapeutics et Replay Bio; R.W. et R.J. ont déposé un brevet provisoire relatif à un classificateur de type cellulaire.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier les anciens membres du Weiss Lab qui ont dirigé ou contribué au développement de la méthode de polytransfection et à son application aux classificateurs cellulaires : Jeremy Gam, Bre DiAndreth et Jin Huh; d’autres membres du laboratoire Weiss qui ont contribué au développement et à l’optimisation de la méthode : Wenlong Xu, Lei Wang et Christian Cuba-Samaniego; Le professeur Josh Leonard et les membres du groupe, y compris Patrick Donahue et Hailey Edelstein, pour avoir testé la polytransfection et fourni des commentaires; et le professeur Nika Shakiba pour avoir invité ce manuscrit et fourni des commentaires. Nous tenons également à remercier les National Institutes of Health [R01CA173712, R01CA207029, P50GM098792]; National Science Foundation [1745645]; Cancer Center Support (core) Grant [P30CCA14051, en partie] du NCI et des National Institutes of Health [P50GM098792] pour le financement de ce travail.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15mL Corning Falcon conical tubes ThermoFisher Scientific 14-959-53A
24-well petri dish Any company of choice (Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free)
Bovine serum albumin NEB B9000S
Centrifuge Any company of choice Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf
Countess 3 Automated Cell Counter ThermoFisher Scientific AMQAX2000
Countess Cell Counting Chamber Slides ThermoFisher Scientific C10228
Cytoflow Non-commercial software package https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/# 
DMEM VWR 10-013-CV Use the correct media for your cell type
EDTA  ThermoFisher Scientific 03690-100ML
Fetal bovine serum Sigma Aldrich F4135
HEK cells ATCC CRL-1573 Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently.
HeLa cells ATCC CRL-12401 Use the relevant cell type for your experiments.
Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer ThermoFisher Scientific L3000001 Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent
LSRFortessa flow cytometer BD Biosciences N/A
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Gibco 11140050
Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL Any company of choice
Opti-MEM ThermoFisher Scientific 31985070 reduced serum medium
Phosphate buffered saline ThermoFisher Scientific 70011044
Rainbow calibration beads Spherotech URCP-100-2H
Sodium azide Sigma Aldrich S2002
Trypsin VWR 25-053-CI

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References

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Bioingénierie numéro 192 biologie synthétique circuits génétiques classificateur cellulaire optimisation à haut débit prototypage rapide de circuits génétiques transfection analyse cytométrique en flux
Développement rapide de circuits d’identification de l’état cellulaire avec poly-transfection
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Wauford, N., Jones, R., Van De Mark, … More

Wauford, N., Jones, R., Van De Mark, C., Weiss, R. Rapid Development of Cell State Identification Circuits with Poly-Transfection. J. Vis. Exp. (192), e64793, doi:10.3791/64793 (2023).

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