Summary
Komplekse genetiske kretser er tidkrevende å designe, teste og optimalisere. For å lette denne prosessen transfekderes pattedyrceller på en måte som tillater testing av flere støkiometrier av kretskomponenter i en enkelt brønn. Denne protokollen skisserer trinnene for eksperimentell planlegging, transfeksjon og dataanalyse.
Abstract
Pattedyrs genetiske kretser har vist potensialet til å fornemme og behandle et bredt spekter av sykdomstilstander, men optimalisering av nivåene av kretskomponenter er fortsatt utfordrende og arbeidskrevende. For å akselerere denne prosessen utviklet laboratoriet vårt polytransfeksjon, en utvidelse med høy gjennomstrømning av tradisjonell pattedyrtransfeksjon. I polytransfeksjon utfører hver celle i den transfekterte populasjonen i hovedsak et annet eksperiment, tester oppførselen til kretsen ved forskjellige DNA-kopinumre og tillater brukere å analysere et stort antall støkiometrier i en enkeltpottreaksjon. Så langt har polytransfeksjoner som optimaliserer forholdet mellom trekomponentkretser i en enkelt brønn av celler blitt demonstrert; I prinsippet kan samme metode brukes til utvikling av enda større kretser. Poly-transfeksjonsresultater kan enkelt brukes for å finne optimale forhold mellom DNA og ko-transfeksjon for forbigående kretser eller for å velge ekspresjonsnivåer for kretskomponenter for generering av stabile cellelinjer.
Her demonstrerer vi bruken av poly-transfeksjon for å optimalisere en trekomponentkrets. Protokollen begynner med eksperimentelle designprinsipper og forklarer hvordan poly-transfeksjon bygger på tradisjonelle co-transfeksjonsmetoder. Deretter utføres polytransfeksjon av celler og etterfulgt av flowcytometri noen dager senere. Til slutt analyseres dataene ved å undersøke skiver av enkeltcellestrømningscytometridataene som tilsvarer delmengder av celler med visse komponentforhold. I laboratoriet har polytransfeksjon blitt brukt til å optimalisere celleklassifiserere, tilbakemeldings- og feedforward-kontrollere, bistabile motiver og mange flere. Denne enkle, men kraftige metoden fremskynder designsykluser for komplekse genetiske kretser i pattedyrceller.
Introduction
Feltet pattedyrs syntetiske biologi har raskt utviklet seg, fra å utvikle enkle sanse-og-respons-deler i dyrkede cellelinjer til optimalisering av komplekse nettverk av gener for å løse virkelige utfordringer innen diagnostikk og terapi1. Disse sofistikerte kretsene er i stand til å registrere biologiske innganger fra mikroRNA-profiler til cytokiner til småmolekylære legemidler, og implementere logiske prosesseringskretser, inkludert transistorer, båndpassfiltre, vippebrytere og oscillatorer. De har også vist lovende resultater i dyremodeller av sykdommer som kreft, leddgikt, diabetes og mange flere 1,2,3,4,5. Men etter hvert som kompleksiteten til en krets vokser, blir optimalisering av nivåene til hver av komponentene stadig mer utfordrende.
En spesielt nyttig type genetisk krets er en celleklassifiserer, som kan programmeres til å fornemme og reagere på cellulære tilstander. Selektiv produksjon av protein- eller RNA-utganger i spesifikke cellulære tilstander er et kraftig verktøy for å veilede og programmere differensiering av celler og organoider, identifisere og ødelegge syke celler og / eller uønskede celletyper, og regulere funksjonen til terapeutiske celler 1,2,3,4,5 . Imidlertid har det vært svært utfordrende å skape kretser i pattedyrceller som nøyaktig kan klassifisere celletilstander fra flere cellulære RNA- og / eller proteinarter.
En av de mest tidkrevende trinnene for å utvikle en celleklassifiseringskrets er å optimalisere de relative uttrykksnivåene av individuelle komponentgener, for eksempel sensorer og prosesseringsfaktorer, i kretsen. For å øke hastigheten på kretsoptimalisering og tillate konstruksjon av mer sofistikerte kretser, har nylig arbeid brukt matematisk modellering av celleklassifiseringskretser og deres komponenter for å forutsi optimale sammensetninger og topologier 6,7. Selv om dette har vist kraftige resultater så langt, er matematisk analyse begrenset av behovet for systematisk å karakterisere inngangsutgangsoppførselen til komponentgener i kretsen, noe som er tidkrevende. Videre kan et mylder av kontekstavhengige problemer dukke opp i komplekse genetiske kretser, noe som får oppførselen til en full krets til å trosse spådommer basert på individuelle delkarakteriseringer 8,9.
For raskere å utvikle og teste komplekse pattedyrkretser som celletilstandsklassifiserere, utviklet laboratoriet vår en teknikk som kalles polytransfeksjon10, en utvikling av plasmid-ko-transfeksjonsprotokoller. Ved ko-transfeksjon kompleksiseres flere plasmid-DNA-arter sammen med et positivt ladet lipid- eller polymerreagens, og leveres deretter til celler på en korrelert måte (figur 1A). Ved polytransfeksjon kompleksiseres plasmider separat med reagenset, slik at DNA fra hvert transfeksjonskompleks leveres til celler på en dekorrelert måte (figur 1B). Ved hjelp av denne metoden blir celler i den transfekterte populasjonen utsatt for mange kombinasjoner av forhold mellom to eller flere DNA-nyttelaster som bærer forskjellige kretskomponenter.
For å måle forholdet mellom kretskomponenter levert til hver celle, inneholder hvert transfeksjonskompleks i en poly-transfeksjon en konstitutivt uttrykt fluorescerende reporter som tjener som en proxy for cellulær opptak av komplekset. Filler DNA som ikke inneholder noen elementer som er aktive i en pattedyrcelle, brukes til å justere den relative mengden av fluorescerende reporter og kretskomponenter levert til en celle i et enkelt transfeksjonskompleks og diskuteres mer detaljert i diskusjonen. Et eksempel på filler-DNA brukt i Weiss-laboratoriet er et plasmid som inneholder en terminatorsekvens, men ingen promotor, kodingssekvens, etc. Celler med forskjellige forhold mellom kretskomponenter kan deretter sammenlignes for å finne optimale forhold for genkretsfunksjon. Dette gir igjen nyttige prediksjoner for å velge promotorer og andre kretselementer for å oppnå optimale genuttrykksnivåer når man kombinerer kretskomponenter i en enkelt vektor for genetisk integrasjon (f.eks. Et lentivirus, transposon eller landingspute). I stedet for å velge forhold mellom kretskomponenter basert på intuisjon eller via en tidkrevende prøve- og feilprosess, evaluerer polytransfeksjon et bredt spekter av støkiometrier mellom genetiske deler i en enkeltpottreaksjon.
I vårt laboratorium har poly-transfeksjon muliggjort optimalisering av mange genetiske kretser, inkludert celleklassifiserere, tilbakemeldings- og feedforward-kontrollere og bistabile motiver. Denne enkle, men kraftige metoden øker designsyklusene betydelig for komplekse genetiske kretser i pattedyrceller. Poly-transfeksjon har siden blitt brukt til å karakterisere flere genetiske kretser for å avsløre deres flerdimensjonale inngangsutgangsoverføringsfunksjoner ved høy oppløsning 10, optimalisere en alternativ kretstopologi for celletilstandsklassifisering11, og akselerere ulike publiserte12,13 og pågående prosjekter.
Her beskriver og skildrer vi arbeidsflyten for bruk av polytransfeksjon for raskt å optimalisere en genetisk krets (figur 2). Protokollen viser hvordan man genererer polytransfeksjonsdata av høy kvalitet og unngår flere vanlige feil i polytransfeksjonsprotokollen og dataanalysen (figur 3). Den demonstrerer deretter hvordan man bruker poly-transfeksjon for å karakterisere enkle kretskomponenter og i prosessen benchmark poly-transfeksjonsresultater mot ko-transfeksjon (figur 4). Endelig viser resultatene av polytransfeksjon optimalisering av kreftklassifiseringskretsen (figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Tabell 1 og tabell 2 tjener som viktige referanser for denne protokollen. Tabell 1 viser reagensskalering for reaksjoner, og tabell 2 viser DNA-ratioaritmetikk for et eksempel polytransfeksjon beskrevet i protokollen (øvre halvdel) og for et mulig oppfølgingseksperiment (nedre halvdel).
1. Forbereder celler for transfeksjon
- Sørg for at kulturen til humane embryonale nyreceller (HEK293) er 60% -80% konfluent før protokollen startes. For å gjøre dette, frø 1 x 106 celler i en 100 mm x 15 mm vevskultur petriskål 2 dager før, og inkuber ved 37 ° C med 5% CO2.
MERK: Selv om protokollen vår fokuserer på HEK293-celler, kan andre celletyper erstattes. - Forbered mediet og cellene for transfeksjoner som beskrevet nedenfor.
- Forvarm minst 20 ml av en oppløsning av Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM) med 10 % føtal bovint serum (FBS) og 1 % ikke-essensielle aminosyrer (NEAA; se materialtabell) til 37 °C. Forvarm minst 2,4 ml trypsin og 2,4 ml fosfatbufret saltvann (PBS) til 37 °C også. Forvarm redusert serummedium til ~16 °C.
MERK: Alt vevskulturarbeid skal utføres med forsiktighet i et biosikkerhetsskap.
- Forvarm minst 20 ml av en oppløsning av Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM) med 10 % føtal bovint serum (FBS) og 1 % ikke-essensielle aminosyrer (NEAA; se materialtabell) til 37 °C. Forvarm minst 2,4 ml trypsin og 2,4 ml fosfatbufret saltvann (PBS) til 37 °C også. Forvarm redusert serummedium til ~16 °C.
- Resuspender cellene i DMEM-oppløsningen som beskrevet nedenfor.
- Aspirere og avhende dagens medier. Dispenser 2 ml PBS på HEK293 cellekulturen for å vaske cellene. Aspirer og kast PBS.
- Dispenser 2 ml Trypsin på HEK293 cellekultur. Legg petriskålen i en kuvøse ved 37 °C i 3 minutter eller til cellene ikke lenger fester seg til fatet. Sett parabolen tilbake i biosikkerhetsskapet og fortynn celleoppløsningen ved å dispensere 8 ml DMEM-oppløsning i platen.
- Bland oppløsningen ved å pipettere forsiktig opp og ned flere ganger. Aspirer alle mediene og plasser det i et 15 ml konisk rør.
- Sentrifuge cellene ved 300 x g i 3 minutter for å pelletere dem. Aspirer mediet (pass på at du ikke aspirerer cellene) og kast det. Resuspender cellene i 5 ml DMEM-oppløsning, bland ved å pipettere forsiktig opp og ned.
- Beregn gjeldende cellekonsentrasjon ved hjelp av en automatisert celleteller (oppført i materialfortegnelsen). Frø seks brønner (i dette eksemplet) i en 24-brønnsplate med 1 x 105 celler (for en såtetthet på 50.000 celler / cm2).
- Legg til DMEM-løsningen opp til 500 μL (legg til DMEM-løsning til brønnene først), og merk deretter en brønn per behandling som følgende: ingen fargekontroll, mKO2-kontroll, TagBFP-kontroll, NeonGreen-kontroll, all fargekontroll og polytransfeksjon 1. TagBFP, mKO2 og NeonGreen kontrollbrønner er enkeltfargekontroller for alle fluorescerende proteiner som inngår i polytransfeksjonen.
2. Utføre transfeksjon
- Forbered rør for hvert DNA-aggregat. Sett til side 1,5 ml mikrosentrifugerør og merk rørene som: ingen fargekontroll, mKO2-kontroll, TagBFP-kontroll, NeonGreen-kontroll, all fargekontroll, polytransfeksjonsblanding 1 og polytransfeksjonsblanding 2.
- Legg til 36 μL redusert serummedium til ingen fargekontroll, mKO2-kontroll, TagBFP-kontroll, NeonGreen-kontroll og alle fargekontrollrør. Tilsett 18 μL redusert serummedium til hver av poly-transfeksjonsblandingen 1 og poly-transfeksjon bland 2 rør.
MERK: Plasmidkonsentrasjonene antas å være 150 ng / μL. - Tilsett 600 ng fyllstoffplasmid til det ikke-fargekontrollrøret. Tilsett 300 ng mKO2 og 300 ng fyllstoffplasmid til mKO2 fargekontrollrøret. Tilsett 300 ng TagBFP og 300 ng fyllstoffplasmid til TagBFP-fargekontrollrøret.
- Tilsett 300 ng konstituerende NeonGreen-plasmid og 300 ng fyllstoffplasmid til NeonGreen fargekontrollrør. Legg til 100 ng hver av mKO2, TagBFP og konstitutiv NeonGreen, samt 300 ng fyllstoffplasmid, til fargekontrollrøret.
- Tilsett 150 ng mKO2 til poly-transfeksjonsblandingen 1 rør. Tilsett 75 ng reporter NeonGreen plasmid og 75 ng filler plasmid til poly-transfeksjon bland 1 rør.
- Tilsett 150 ng TagBFP til poly-transfeksjonsblandingen 2-røret. Tilsett 75 ng L7ae-plasmid og 75 ng fyllstoffplasmid til poly-transfeksjonsblandingen 2-røret.
- Legg til 36 μL redusert serummedium til ingen fargekontroll, mKO2-kontroll, TagBFP-kontroll, NeonGreen-kontroll og alle fargekontrollrør. Tilsett 18 μL redusert serummedium til hver av poly-transfeksjonsblandingen 1 og poly-transfeksjon bland 2 rør.
- Lag transfeksjonsmasterblandingen i et 1,5 ml mikrosentrifugerør ved å kombinere 216 μL redusert serummedium med 9,48 μL transfeksjonsreagens (se tabell 1 for reagensforhold og reaksjonsskalering). Bland godt ved å pipettere opp og ned, og sett til side.
- Legg til 1,58 μL forsterkerreagens til hver av de ingen fargekontrollene, enkeltfargekontrollen og alle fargekontrollrørene. Tilsett 79 μL forsterkerreagens til hvert av polytransfeksjonsblandingsrørene. Bland hver tube individuelt ved å pipettere kraftig.
- Legg til transfeksjonsmasterblandingen til hvert rør som inneholder DNA.
- Legg til 37,58 μL transfeksjonsmasterblanding til hver av rørene uten fargekontroll, enkeltfargekontroll og alle fargekontrollører. Bland hver tube individuelt ved å pipettere kraftig.
- Tilsett 18,79 μL transfeksjonsmasterblanding til hvert av poly-transfeksjonsblandingsrørene. Bland hver tube individuelt ved å pipettere kraftig.
- Dispenser transfeksjonsblandingene i brønnene.
- Pipette 65,97 μL av hver transfeksjonsblanding for kontroller uten farge, enkeltfarge og alle farger i de tilsvarende brønnene.
- Pipette 32,98 μL av polytransfeksjonen blander 1 inn i polytransfeksjonsbrønnen og virvler platen raskt, men forsiktig i et tett figur-åtte mønster langs en flat overflate for å fordele kompleksene effektivt. Deretter blander pipett 32, 98 μL av polytransfeksjonen 2 i samme polytransfeksjonsbrønn og virvler platen på samme måte.
- Plasser platen i en inkubator ved 37 °C, med 5% CO2 og uten risting, i en periode på 48 timer.
MERK: For å øke cellenes levedyktighet, kan cellemediet byttes ut hver 6. time etter transfeksjon (selv om dette ikke alltid er nødvendig, og med HEK293-celler og dets derivater, må man være forsiktig så man ikke løsner cellene fra platen når man bytter medium).
| Reagent | Beløp | Skalering | ||||
| Redusert serummedium for DNA-blanding | 36 μL per kontrollrør, 18 μL per polytransfeksjonsrør | 0,05 μL redusert serummedium/ng DNA per rør, med 10-20 % ekstra volum for å ta hensyn til pipettering | ||||
| DNA | 300-600 ng per rør | |||||
| P3000 | 1,58 μL per kontrollrør, 0,79 μL per polytransfeksjonsrør | 0,0022 μL P3000/ng DNA per rør, med 10-20% ekstra | ||||
| Redusert serummedium for Lipo master mix | 36 μL per kontrollrør, 18 μL per polytransfeksjonsrør | 0,05 μL redusert serummedium/ng totalt DNA, med 10-20 % ekstra volum for å ta hensyn til pipettering | ||||
| Transfeksjon og forsterkerreagens | 1,58 μL per kontrollrør, 0,79 μL per polytransfeksjonsrør | 0,0022 μL lipofektamin 3000/ng DNA, med 10-20% ekstra | ||||
Tabell 1: Reagensskalering for transfeksjoner. Tabellen indikerer riktig forhold mellom reagens som skal inkluderes for DNA-mengden som inngår i en enkelt brønn. Dette kan brukes til å skalere reaksjoner effektivt og danne masterblandinger. Mengder av reagens har blitt skalert for å inkludere en 20% overskudd.
3. Klargjøre celler for flowcytometri
- Forvarm minst 4,2 ml av DMEM oppløsningen til 37 °C. Forvarm minst 4,2 ml trypsin og 4,2 ml PBS til 37 °C. Oppbevar fluorescensaktivert cellesorteringsbufferløsning (FACS) ved 4 °C til den er klar til bruk.
- Resuspender cellene i FACS-bufferløsningen (PBS supplert med 1 % BSA, 5 mM etylendiamintetraeddiksyre [EDTA] og 0,1 % natriumazid [NaN3], for å redusere klumping, se materialfortegnelse) som beskrevet nedenfor.
- Aspirer og kast dagens medier i hver brønn. Dispenser 5 ml PBS i hver brønn for å vaske cellene. Aspirer og kast PBS.
- Dispenser 5 ml Trypsin i hver brønn. Legg platen i en kuvøse ved 37 °C i 3 minutter, eller til cellene ikke lenger fester seg til fatet. Sett platen tilbake i biosikkerhetsskapet og fortynn celleoppløsningene ved å dispensere 5 ml DMEM-oppløsning i hver brønn.
- For hver brønn, bland løsningen ved å pipettere forsiktig opp og ned flere ganger. For hver brønn, aspirer alle mediene og plasser det i et 15 ml konisk rør.
- Sentrifuge cellene ved 300 x g i 3 minutter for å pelletere dem. Aspirer mediet, pass på at du ikke aspirerer cellene og kaster det. Resuspender cellene i 5 ml FACS-bufferløsning i hvert rør, bland ved å pipettere forsiktig opp og ned.
- Før hver cellesuspensjonsoppløsning gjennom en sil (for å fjerne klumper) i separate koniske rør for flowcytometri. Hold disse rørene på is i høyst 1 time, og utfør flowcytometri så snart som mulig.
4. Utføre flowcytometri
MERK: Drift av et flowcytometer krever riktig opplæring og kunnskap om de nødvendige oppgavene. Siden programvare og utstyr kan variere og brukere bør læres opp generelt, refererer denne delen til spesifikke operasjoner som er nyttige å utføre.
- Undersøk først cellene som er transfektert med fyllstoffplasmidkontrollen (ingen fargekontroll) for å velge celleegenskaper og unngå anomalier (inkludert aggregater, rusk osv.). Selv om det er mange kombinasjoner av parametere for å skille celler, bruk følgende tre generelle alternativer som en god måte å visualisere kjennetegn på.
- Se på sidespredningsområdet (logg eller lineær skala per preferanse / celletype) kontra det fremovergående spredningsområdet (lineær skala).
- Se på sidepunkthøyden (loggskalaen) kontra sidespredningsbredden (lineær skala).
- Se på spredningsbredden fremover (lineær skala) kontra spredningshøyden fremover (lineær skala).
- Deretter ser du på enkeltfargekontrollene. Bruk all color-kontrollen til å stille inn instrumentspenningene, slik at signalene fra hvert fluorescerende protein normaliseres til ekvivalente vilkårlige enheter (a.u.) av fluorescens. Deretter kjører du enkeltfargekontrollene for hvert fluorescerende protein, som brukes til å angi kompensasjonsmatrisen, noe som muliggjør gjennomblødningskorreksjon.
MERK: Ideelt sett bør hele det dynamiske området til fluorescensverdiene være synlig. Videre normalisering av fluorescerende proteinsignaler kan gjøres via konvertering til standardiserte enheter (f.eks. molekyler av ekvivalent fluorescein [MEFLs; se Beal et al.15]). For å aktivere MEFL-konvertering under analyse, kjør regnbuekalibreringsperler. Slik kalibrering er også nyttig for å redusere instrument-til-instrument og daglig signalvariasjon16. - Kjør prøverøret for polytransfeksjon.
MERK: Der det er mulig, anbefales det å kjøre 1000 x 10 ^ (^ = blandinger) celler, da høyere dimensjonale polytransfeksjoner må deles inn i flere hyller under analysen, og hver kasse trenger nok celler (ideelt >10) for å gjøre statistisk signifikante sammenligninger.
5. Utføre analyse etter eksperimentet
- Bruk først data fra kontrollene (og eventuelt perlene) for å sikre nøyaktige resultater. Bruk et av de tilgjengelige programvareverktøyene til å utføre live cellegating (ved hjelp av portene som er skissert ovenfor), kompensasjon og autofluorescenskorreksjon.
MERK: Vi bruker vanligvis enten tilpasset MATLAB-kode (f.eks. https://github.com/jonesr18/MATLAB_Flow_Analysis eller Cytoflow17), som har både et grafisk brukergrensesnitt og et pythonbibliotek som er egnet for forbehandlingsfasen og for polytransfeksjonsanalyse.
| Metode | Kompleks | ng fluorescerende markør | ng L7ae (brøkdel) | ng Reporter (brøkdel) | ng Filler DNA (fraksjon) | Totalt (ng) |
| Poly-transfeksjon 1 | 600 | |||||
| → | 1 | 150 | 75 (½) | 75 (½) | 300 | |
| → | 2 | 150 | 75 (½) | 75 (½) | 300 | |
| Poly-transfeksjon 2 | 600 | |||||
| → | 1 | 150 | 25 (1/6) | 125 (5/6) | 300 | |
| → | 2 | 150 | 125 (5/6) | 25(1/6) | 300 |
Tabell 2: DNA-mengder for polytransfeksjon demonstrert i protokollen, og et eksempel på oppfølgingseksperiment med innstilte plasmidforhold. Den øvre halvdelen av tabellen viser sammensetningen av plasmider brukt i et enkelt poly-transfeksjonseksperiment. Den nedre halvdelen viser sammensetningen av et oppdatert eksperiment som justerer plasmidforholdene for bedre å underprøve et hypotetisk konsentrasjonsrom, hvor genuttrykksmodulatoren er i et mer optimalt 1: 5-forhold i forhold til reporteren, noe som gir flere transfekterte celler å prøve rundt dette forholdet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I figur 1 sammenligner vi ko-transfeksjon med poly-transfeksjon. I en ko-transfeksjon leveres alle plasmider i samme transfeksjonsblanding, noe som resulterer i høy korrelasjon mellom mengden av hvert plasmid en enkelt celle mottar (figur 1A). Mens antall totale plasmider levert til hver celle varierer betydelig, er fluorescensen av de to reporterproteinene i de enkelte cellene over hele befolkningen godt korrelert, noe som indikerer at de to plasmidene blir levert sammen i et ganske konstant forhold. Transfekterte celler kan ta opp få eller mange komplekser, men siden hvert kompleks har korrelerte mengder av hvert plasmid, utforsker ko-transfeksjonen bare en liten diagonal region av konsentrasjonsrommet mellom de to plasmidene. I motsetning til dette, i en polytransfeksjon, leveres plasmider i flere transfeksjonskomplekser, noe som resulterer i dekorrelert levering av plasmider i forskjellige transfeksjonsblandinger (figur 1B). Transfekterte celler tar opp forskjellige kombinasjoner av kompleksene, noe som resulterer i celler som inneholder varierende doser av plasmider fra verken, ett eller begge kompleksene.
Figur 2 viser en representativ arbeidsflyt for poly-transfeksjon. Generelt består et polytransfeksjonseksperiment av følgende trinn: definere problemet, lage transfeksjonsblandingene, inkubere cellene, flowcytometri og analyse. Det er også et valgfritt trinn for å gjenta polytransfeksjonen med optimaliserte delforhold hvis de første polytransfeksjonsresultatene ikke er i stand til nøyaktig å begrense de optimale delforholdene. Disse trinnene er beskrevet i protokollen.
I figur 3 er det gitt noen eksempler på godt utførte ko- og polytransfeksjoner og vanlige feil. Figur 3A viser en godt utført co-transfeksjon med en tett korrelasjon mellom TagBFP og eYFP-uttrykkende plasmider som ble levert samtidig. Derimot viser ko-transfeksjonen i figur 3B dårlig korrelasjon mellom disse to plasmidene. I figuren vist skyldes den dårlige korrelasjonen tilsetning av forsterkerreagens til det reduserte serummediet før plasmidene ble tilsatt. Slik dårlig korrelasjon i forsøkene kan også skyldes forskjellige promotorer som driver ekspresjon av fluorescerende proteiner, dårlig blanding under transfeksjonsblandingsdannelse, eller tillater komplekset å inkubere for kort eller for langt av et intervall.
Figur 3C viser en godt utført polytransfeksjon, med god dekning av det todimensjonale rommet og god kompensasjon av eventuell spektral gjennomblødning mellom fluorescerende proteiner. Figur 3D viser polytransfeksjonsdata med et lavt antall levende celler, som er vanskelig å dele opp i nok binger med et tilstrekkelig antall celler i hver kasse for analyse. For å bøte på dette problemet bør startcellepopulasjonen være ved god helse og ikke gjengrodd, og den eksperimentelle toksisiteten reduseres ved bruk av et annet transfeksjonsreagens og/eller transfeksjon med mindre totalt DNA. Figur 3E viser en poly-transfeksjon der transfeksjonseffektiviteten var dårlig, noe som igjen resulterte i sparsom dekning av det todimensjonale rommet for analyse. I dette tilfellet er antall celler som passerer morfologigating høyt, men cellene uttrykker ikke fluorescerende proteiner. For å forbedre effektiviteten bør valg av transfeksjonsreagens optimaliseres og produsentens protokoll følges nøye. Hver transfeksjonsblanding må inneholde en tilsvarende mengde DNA-masse, slik at cellene har omtrent like stor sjanse til å motta hver type kompleks, og hver transfeksjonsblanding skal gjøres i samsvar med settinstruksjonene. Ulike transfeksjonssett er optimale for forskjellige celletyper; Settet som gir best effektivitet i celletypen av interesse, bør brukes. Til slutt er noen celletyper vanskelige å transfektere, uavhengig av settet som brukes. I disse tilfellene bør et større antall celler transfeksjoneres, og så mange som mulig samles under flowcytometri for å sikre et tilstrekkelig antall celler å analysere. Figur 3F viser polytransfeksjonsdata hvor en av de fluorescerende proteinmarkørene tydelig viser spektral gjennomblødning til et annet fluorescerende protein. Enkeltfargekontroller bør alltid kjøres for alle fluorescerende proteiner i systemet og brukes til å generere en kompensasjonsmatrise som skal brukes på alle polytransfeksjoner før analyse.
Når man utfører polytransfeksjonseksperimenter for første gang (samlet eller for et nytt eksperimentelt system), bør man utføre benchmarking mot standard ko-transfeksjon. En tilnærming er å individuelt måle inngangsutgangsoverføringsfunksjonen for viktige systemdeler ved bruk av både ko-transfeksjon (via innstilling av DNA-doser) og polytransfeksjon.
I figur 4 viser vi benchmarking av translasjonsrepressoren L7Ae, her tilpasset fra den opprinnelige polytransfeksjonspublikasjonen10. L7Ae er et RNA-bindende protein som gjenkjenner RNA kink-turn (KT) motiver20; når to KT-er (2xKT) plasseres i 5' uoversatt region (UTR) av et mRNA, kan nedstrøms oversettelse av åpen leseramme (ORF) effektivt undertrykkes av L7Ae21. L7Ae har tidligere blitt brukt til å bygge RNA-baserte celletypeklassifiserere21 og andre RNA-baserte kretser22. For å teste L7Ae ved standard ko-transfeksjon, kan man justere forholdene mellom plasmidene som koder for L7Ae og dens målreporter innenfor forskjellige transfeksjonsblandinger (figur 4A og tabell 3). For polytransfeksjon skal man uavhengig levere konstitutiv L7Ae og tilsvarende 2xKT reporter i separate transfeksjonsblandinger, slik at et bredt spekter av plasmidforhold leveres til cellene (figur 4B). Etter å ha utført transfeksjon og flowcytometri, kan dataanalyse utføres. For å gjøre dataene sammenlignbare, kan man samle de enkelte co-transfeksjonsresultatene i et enkelt datasett, og deretter utføre en lignende flerdimensjonal binning til polytransfeksjonsdataene (figur 4C, D). Sammenligning av dose-responskurvene for L7Ae som undertrykker utgangsreporteren, kan man se at medianutgangsnivået per kasse er svært likt mellom ko-transfeksjons- og polytransfeksjonsdataene (figur 4E-G).
Generelt har vi sett at polytransfeksjonsdata korrelerer godt med ko-transfeksjonsdata over brede DNA-forhold, med mindre presisjon ved svært skjeve DNA-doseringsforhold (delvis på grunn av lavere celledekning i bins for polytransfeksjonseksperimenter, spesielt for deler som er svært sterkt aktive ved lave plasmiddoser). For å forbedre målenøyaktigheten for slike følsomme deler kan uttrykksnivået reduseres med en svakere promotor, oppstrøms åpne leserammer18 eller mikroRNA-silencing-medierte finjusteringer (miSFITs)19.
Figur 5 viser en vellykket anvendelse av polytransfeksjon for optimalisering av en celletypeklassifiserer, igjen tilpasset fra Gam et al10. Klassifikatoren er en relativt enkel design som produserer en utgang som respons på ekspresjon av miR-21-5p, et miRNA overuttrykt i mange tumorceller23. I fravær av miR-21 undertrykkes klassifiseringsutgangen av en bakterielt avledet transkripsjonsrepressor, BM3R124, hvis tilpasning tidligere ble vist å fungere i pattedyrceller25. Når miR-21 er til stede, binder den fire målsteder plassert i både 3' og 5' UTR av BM3R1, slår ned uttrykket og tillater dermed utgangstranskripsjon (figur 5A). For å optimalisere dette systemet ble de tre kretskomponentene levert i separate transfeksjonsblandinger: (1) BM3R1 (med miR-21-målsteder), (2) utgangsreporter (mKO2) og (3) Gal4-VP16, som aktiverer transkripsjon av utgangen (tabell 4). Merk at utgangspromotoren opererer på logikken (Gal4-VP16) og ikke BM3R1, som undertrykker utgang selv i nærvær av Gal4-VP1625. Hver del koder for en transfeksjonsmarkør, henholdsvis TagBFP, mNeonGreen og iRFP720, på samme plasmid for å indikere den relative DNA-doseringen av hvert kompleks. Generelt bør økt Gal4-VP16-uttrykk øke reporterens mKO2-utgang, mens økt BM3R1-uttrykk bør resultere i lavere mKO2-utgang. Fordi BM3R1 slås ned av miR-21-5p, bør utgangsuttrykket være høyere i HeLa-celler, som har høyere nivåer av miR-21-5p og dermed uttrykker mindre BM3R1 enn i HEK-celler.
Etter polytransfeksjon til både HEK293- og HeLa-celler fikk vi en 3D-fordeling av forskjellige plasmidforhold (figur 5B-HEK-celler). Gam et al.10 undersamplet denne fordelingen ved forskjellige forhold ved å vurdere celler innenfor en bestemt euklidsk avstand fra et forhold av interesse; Denne avstanden bør være bred nok til å inkludere nok celler til å tillate statistisk signifikante resultater fra analysen, men smal nok til å unngå unødvendig støy fra å inkludere for bredt et sett med komponentforhold for de tre delene. Gam et al.10 brukte deretter en optimaliseringsalgoritme for å identifisere forholdet mellom deler som maksimerte klassifiseringsnøyaktigheten for co-transfeksjon (dvs. transfekterte HeLa-celler er positive for utgangsuttrykk mens transfekterte HEK-celler ikke er det). Det optimale forholdet mellom delene ble funnet å være 10.9: 1.5: 1: Gal4-VP16: output: BM3R1; celler subsamplet rundt det optimale forholdet innenfor hele poly-transfeksjonsrommet er vist i figur 5C. Denne delsamplingen spådde at ved dette forholdet har den kotransfekterte kretsen en 91% spesifisitet, 62% følsomhet og 77% nøyaktighet når man klassifiserer HEK293 versus HeLa-celler (figur 5D). Ko-transfeksjon med plasmidforhold satt til dette optimale ga enda bedre resultater: 99% spesifisitet, 68% sensitivitet og 84% nøyaktighet10. Videre styrte forholdene implementeringen av en enkeltplasmidversjon av kretsen, med relativt uttrykk innstilt ved å bruke forskjellige avkortede promotorer og oppstrøms ORFer (uORF), noe som ga en krets med 91% spesifisitet, 90% følsomhet og 90% nøyaktighet10. Dermed er poly-transfeksjon et kraftig verktøy for å veilede utformingen av celleklassifiserere og genkretser bredere.
Figur 1: Sammenligning av ko-transfeksjon og poly-transfeksjon. (A,B) Oversikt og sammenligning av plasmidlevering med ko-transfeksjon av to plasmider og poly-transfeksjon av to plasmider. For hver transfeksjonsmetode viser diagrammet lengst til venstre dannelsen av transfeksjonskomplekser mellom negativt ladet DNA og positivt ladede lipider. I disse eksemplene koder hvert farget plasmid (blått og rødt) for uttrykket av et annet fluorescerende protein. Senterdiagrammet viser eksempler på plasmidlevering til celler og også et skjema for de forventede fordelingene i et histogram eller spredningsplott. Fargeintensitet på histogrammet tilsvarer fluorescens fra den tilsvarende plasmidfargen. Diagrammet lengst til høyre viser reelle data fra celler transfektet ved hjelp av hver gitt metode. (A) I en ko-transfeksjon med to forskjellige plasmider blandes begge plasmidene sammen før tilsetning av transfeksjonsreagens, noe som resulterer i høyt korrelert emballasje av de to plasmidartene. I faktiske ko-transfeksjonsdata viser celler korrelert levering av begge plasmider (høyre). (B) I en poly-transfeksjon blandes hvert sett med samleverte plasmider som svarer til en kretsdel og en transfeksjonsmarkør med transfeksjonsreagenset separat, noe som resulterer i komplekser som bare inneholder de plasmidene (venstre). I faktiske polytransfeksjonsdata utforsker celler et bredt spekter av konsentrasjonsrom med mange forskjellige plasmidstøkiometrier utforsket samtidig (høyre). Dette tallet er endret fra10. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Arbeidsflyt for polytransfeksjon. Trinn 1: Definer problemet. Start med et system med flere komponentdeler der det ideelle forholdet mellom deler er ukjent, og velg et startforhold mellom komponentene. Trinn 2: Lag transfeksjonsblandingene. Hver transfeksjonsblanding inneholder en kretskomponent og en fluorescerende transfeksjonsmarkør. Mengden kretsdel levert til en celle korrelerer med fluorescensen til markøren. Trinn 3: Inkuber cellene. I en typisk arbeidsflyt inkuberer vi celler i 48 timer mellom transfeksjon og flowcytometri. Trinn 4: Flowcytometri. Kjør de riktige kontrollene, som beskrevet i protokollen, og kjør deretter eksemplene. Trinn 5: Analyse.Bruk transfeksjonsmarkørene til å kaste cellene i henhold til mengden eller forholdene mellom deler som cellen mottok. Bruk utgangsproteinet (e) til å måle kretsytelsen. Finn hyller / forhold mellom deler som optimaliserer kretsytelsen. Trinn 6: Gjenta med optimaliserte delforhold (valgfritt). Hvis de optimale bins/ratios er i svært skjeve forhold, kan det hende at pilotens poly-transfeksjon ikke begrenser de optimale delforholdene nøyaktig. Gjenta poly-transfeksjonen med innstilte delforhold, slik at en celle som mottok en lik mengde av hver transfeksjonsblanding, nå mottar et nær optimalt forhold mellom deler, som bestemt av forrige runde. Dette tallet er endret fra10. Bildet av en inkubator ble brukt fra Servier Medical Art og bildet av et cytometer fra BioRender. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative positive og negative polytransfeksjonsresultater . (A) Godt utført samtransfeksjon av to fluorescerende reportere, som viser en tett korrelasjon. Totalt 20 000 celler er plottet både her og i (B) til sammenligning. Det er en god ide å utføre en lignende liten prøvetransfeksjon av to fluorescerende reportere før du starter et polytransfeksjonseksperiment, for å sikre at plasmider er godt korrelert i transfeksjonsblandinger. (B) Støyende ko-transfeksjon: plasmider er ikke godt korrelert i hver transfeksjonsblanding, noe som kan føre til at fluorescerende markører i en poly-transfeksjon er en dårlig markør for plasmidforhold. (C) Godt utførte polytransfeksjonsresultater som viser godt celletall, transfeksjonseffektivitet og kompensasjon. (D) Lavt antall levende celler, som ikke tillater sub-prøvetaking i bins med statistisk signifikant antall celler. (E) Dårlig transfeksjonseffektivitet, som ikke tillater sub-sampling i bins med statistisk signifikant antall celler. (F) Mangel på passende kompensasjon, noe som fører til at fluorescensdata er en dårlig proxy for mengden fluorescerende protein i systemet. Bruk enkeltfargekontroller til å bestemme en ideell lineær kompensasjonsmatrise, og bruk den på dataene før videre behandling. Alle fargekontroller anbefales også, avhengig av valg av programvare. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Benchmarking av polytransfeksjon mot ko-transfeksjon. (A) I en ko-transfeksjon kan ett forhold mellom translasjonsrepressor L7Ae og fluorescerende reporterplasmider testes i hver eksperimentell brønn. (B) I poly-transfeksjon kan mange forhold mellom L7Ae og reportere testes i samme brønn. Se tabell 3 for detaljer om poly-transfeksjon plasmidblandinger. (C,D) Binning arbeidsflyt for benchmarking poly-transfeksjon mot flere co-transfeksjoner. Totalt 10 bieksponentielt fordelte binger ble tildelt for hver transfeksjonsmarkørdimensjon, som tilnærmer nivåene av hver av de to plasmidene. Her vises kasser som angir forskjellige nivåer av plasmid #2. Binning ble utført på både et sammenstilt sett med 11 ko-transfeksjonsprøver som spenner over forskjellige plasmidforhold (C) og data fra en enkelt poly-transfeksjon, bestående av ca. 500 000 celler hver (D). Farger tilsvarer sett med bins definert av gen 2 (TagBFP) nivåer. (VG Nett) Benchmarking poly-transfeksjon mot co-transfeksjon for en representativ krets. Median utgangsfluorescens ble evaluert for cellene i hver kasse og sammenlignet mellom metoder for det representative systemet, L7Ae translasjonsundertrykkelse. (E) Konstruksjoner for måling av L7Ae-aktivitet. mKO2-fluorescens fungerer som et estimat for levering av L7Ae (gen #1), mens TagBFP-fluorescens fungerer som et estimat for levering av den regulerte mNeonGreen-utgangen (gen #2). (F) Flerdimensjonale titreringskurver for L7Ae. Hver linje representerer settet med hyller på ett nivå av TagBFP, som angitt i (C) og (D). Heltrukne linjer angir polytransfeksjonsdata, mens stiplede linjer angir ko-transfeksjonsdata. Ved hvert binned nivå av reporterplasmid reduseres reporterutgangen når L7Ae øker. (G) Visuell sammenligning mellom ko-transfeksjon og poly-transfeksjon for L7Ae-systemet. Hvert punkt representerer den målte utgangen i tilsvarende hyller for polytransfeksjons- og kotransfeksjonsmålinger, der mer ekvivalente verdier er nærmere den røde 1:1-linjen. Samlet sett er forskjellene observert mellom poly-transfeksjons- og ko-transfeksjonsderiverte lave, noe som gir tillit til påliteligheten av poly-transfeksjonsmetoden. Dette tallet er endret fra10. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Dataanalyse for poly-transfeksjon. I polytransfeksjon kan celler grupperes i hyller eller skiver for analyse. Figur 4 viser en form for analyse der cellene er binned i skiver som tilsvarer nivåer av en systemkomponent, for eksempel reporterplasmidnivå, som kan være nyttig for modelltilpasning og forståelse av doseringsresponser. En annen nyttig strategi er å analysere kretsytelsen ved forskjellige forhold mellom kretskomponenter. (A) Diagram over en klassifiseringskrets for optimalisering. Nivåene av TagBFP, NeonGreen og iRFP720 tilsvarer nivåene av henholdsvis BM3R1, mKO2 og Gal4-VP16. Se tabell 4 for detaljer om polytransfeksjonsplasmidblandingene. (B) Eksperimentelt oppsett av poly-transfeksjonsblandinger. (C) Flowcytometridata samlet inn fra polytransfeksjon med kretsen i (A). Nivåene av hver av de tre reporterfluorescerende proteinene som et resultat av kretspolytransfeksjon i HEK-celler, som viser det brede spekteret av kretskomponentforhold som er tilstede i dataene. Lignende resultater ble oppnådd fra kretstransfeksjon i både HEK og HeLa-celler. (D) Subsampling poly-transfeksjon i et bestemt forhold. For å analysere dataene skannet vi et stort antall forhold mellom kretskomponenter og bestemte klassifiseringsytelsen ved hvert forhold. Som et eksempel viser vi her et bestemt forhold som viste god ytelse (Gal4-VP16 = 435 ng DNA, reporter = 60 ng og BM3R1 = 40 ng). Plottet i blått er det tilsvarende forholdet mellom fluorescerende markører for de tre forskjellige kretskomponentene. Deretter undersamplet vi dataene ved bare å vurdere punkter innenfor en bestemt euklidsk avstand fra fluorescensbanen. Vi subsamplet celler i samme bane fra både HEK og HeLa transfeksjoner. (E) Sammenligning av kretsytelse i samme bane i HEK- og HeLa-celler. Ved å sammenligne statistikk som følsomhet, spesifisitet og nøyaktighet av klassifisering over mange forhold, kan komponentforhold optimaliseres for å generere en ideell genetisk krets. Dette tallet er endret fra10. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Kompleks | ng L7Ae plasmid | ng Reporter plasmid | OptiMEM (μL) | P3000 (μL) | Lipo 3000 (μL) |
| 1 | 250 | 75 | 1.5 | 1.5 | |
| 2 | 250 | 75 | 1.5 | 1.5 |
Tabell 3: Transfeksjonsblandinger tilsvarende figur 4. HEK293-celler ble polytransfeksjonert med disse transfeksjonsblandingene i en brønn på en 24-brønnsplate.
| Kompleks | ng BM3R1 plasmid | ng Gal4-VP16 plasmid | ng Reporter plasmid | OptiMEM (μL) | P3000 (μL) | Lipo 3000 (μL) |
| 1 | 900 | 75 | 1.5 | 1.5 | ||
| 2 | 900 | 75 | 1.5 | 1.5 | ||
| 3 | 900 | 75 | 1.5 | 1.5 |
Tabell 4: Transfeksjonsblandinger tilsvarende figur 5. HEK293 og HeLa Cells ble hver polytransfeksjonert med disse transfeksjonsblandingene i en brønn hver av en 6-brønnsplate.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Raske prototypingsmetoder som dataassistert design (CAD), breadboarding og 3D-utskrift har revolusjonert mekaniske, elektriske og siviltekniske disipliner. Evnen til raskt å søke gjennom mange mulige løsninger på en gitt utfordring akselererer i stor grad fremgang i et felt. Vi tror at poly-transfeksjon er en analog teknologi for biologisk engineering, som muliggjør rask prototyping av genetiske kretser. I tillegg krever andre raske prototypingsteknologier praktisk sekvensiell iterasjon av flere mulige løsninger, mens poly-transfeksjon er i stand til å utforske mange løsninger samtidig. Poly-transfeksjon gjør det mulig å teste et stort antall kombinasjoner av genetiske kretskomponentforhold i en enkelt brønn og har blitt brukt til å optimalisere flere publiserte genetiske kretser10,11,13. Den eksperimentelle protokollen er en enkel utvidelse av standard co-transfeksjon, noe som muliggjør enkel adopsjon av mange pattedyrcelleforskere. Generelt er det svært nært samsvar mellom polytransfeksjons- og kotransfeksjonsresultater10 (et eksempel er figur 4). Dermed kan polytransfeksjon brukes i de fleste tilfeller hvor plasmidforhold titreres i ko-transfeksjonsblandinger og utganger måles på enkeltcellenivå.
Kompleksiteten og omfanget av poly-transfeksjon øker med kompleksiteten til genetiske kretser for å optimalisere. Etter hvert som antall dimensjoner som skal analyseres øker, øker kombinatoriske forhold mellom forskjellige deler og antall celler som trengs for analysen eksponentielt. For eksempel, for å optimalisere klassifiseringen i figur 5, ble celler transfeksjonert i et 6-brønns plateformat, og data ble samlet inn på minst 1,5 millioner levende celler. Vi har også optimalisert en klassifisering med en ekstra kretskomponent 10, noe som krever transfeksjon i en10 cm plateskala og innsamling av millioner av celler. I den skalaen og over er DNA-produksjon tidkrevende, og transfeksjonsreagenser er dyre. Når det er sagt, bruker polytransfeksjon størrelsesordener mindre celler, DNA og transfeksjonsreagenser enn å teste et sammenlignbart antall kretskomponentkombinasjoner i individuelle brønner. I tillegg spares en betydelig mengde tid ved å gjøre størrelsesordener færre transfeksjonsblandinger.
Polytransfeksjon muliggjør avanserte analysemetoder for flowcytometridata. De to hovedtilnærmingene er (1) binning celler i henhold til uttrykket av hver transfeksjonsmarkør og (2) ekstrahering av celler ved definerte forhold mellom transfeksjonsmarkører, og simulerer dermed co-transfeksjon. Førstnevnte velger celler med en spesifikk kombinasjon av DNA-dosering for hvert kompleks (og dermed hver del), noe som gir inngangs-utgangsoverføringsfunksjoner. Sistnevnte velger celler ved et spesifikt forhold mellom DNA-doser for hver del, simulerer co-transfeksjon ved et slikt forhold mellom plasmid-DNA-masser. Plotting av uttrykksnivået for kretsutgangsreporter (er) i de undersamplede valgene gir et mål på produksjonen på de definerte nivåene eller forholdene mellom innganger. For kretsoptimalisering kan man identifisere de beste overføringene / forholdene som definert av formålet med kretsen - når det gjelder celleklassifiserere, er disse hyllene / forholdene der kretsen er PÅ i målcelletypen og OFF i ikke-målcelletyper. Når du velger en kassestørrelse, bør man ta hensyn til presisjonsnivået som kreves, samt antall celler per søppel. Mindre beholdere fokuserer på den ideelle kombinasjonen av kretskomponenter mer presist, men hvis en kasse har for få celler, kan den introdusere uønsket støy til målingene.
Fremtidige forbedringer i beregningsanalyse av polytransfeksjonsdata kan lette optimaliseringen selv med lav celledekning per bin/ratio. For øyeblikket ekskluderer vi data fra beholdere med færre enn en angitt terskel av celler (f.eks. 10) for å unngå altfor støyende målinger. I kombinasjon med gjentatte målinger muliggjør dette mer nøyaktige og presise beregninger av dose-responskurver, klassifiseringsnøyaktigheter og andre beregninger definert per kasse. Imidlertid kan hver celle i poly-transfeksjon betraktes som et uavhengig eksperiment, som måler kretsutgangen (e) på et presist nivå av innganger med fin oppløsning. Med dette i bakhodet kan mekanistiske og fenotypiske modeller av doseresponser og kretsoptimaliseringer direkte passe til fordelingen av genuttrykk fra hver markør og reporter, i stedet for deres binned sammendragsstatistikk10. Dette muliggjør mer robuste målinger og drar nytte av de mange individuelle datapunktene som samles inn per eksperiment. Slike modelleringstilnærminger kan dermed gi prediktiv kretskarakterisering og optimalisering selv med sparsomt samplede høydimensjonale polytransfeksjoner. Videre kan maskinlæringsmetoder som responsflatemetodikk og tilfeldig skogregresjon brukes til å analysere relativt sparsomme, høydimensjonale data10.
En alternativ tilnærming til stadig større poly-transfeksjoner er å sekvensielt optimalisere kretser ved hjelp av hierarkier av poly-transfeksjoner. I denne tilnærmingen brukes først polytransfeksjon for å optimalisere en modul som består av en delmengde av genetiske komponenter i en større krets. Deretter leveres disse optimaliserte modulene som separate poly-transfeksjonsblandinger, slik at man kan finne det optimale forholdet / doseringen av hver kretsmodul. Denne tilnærmingen bruker et betydelig lavere antall celler, DNA og transfeksjonsreagenser. Grupper av komponenter er imidlertid ikke nødvendigvis modulære i forhold til andre komponenter, og dermed kan et optimalt forhold mellom komponentdeler i en modul målt isolert sett være suboptimalt innenfor den større kretskonteksten8.
Poly-transfeksjonsmetoder er også begrenset av laser-/filterkonfigurasjonen til flowcytometeret som brukes til å samle inn data. I tillegg til målte fluorescerende utganger inneholder hver transfeksjonsblanding en fluorescerende proteinmarkør. Det er derfor viktig å velge fluorescerende proteiner som kan kompenseres godt på cytometeret. Vi har tidligere systematisk analysert gjennomblødningen av et panel med 22 fluorescerende proteiner på et fem-lasers flowcytometer (BD LSRFortessa), og fant at settet med Sirius, TagBFP, mNeonGreen, mKO2 og iRFP720 kunne brukes sammen og kompenseres godt uten signifikante problemer10. Imidlertid kan optimalisering av større kretser kreve avanserte cytometrimetoder, for eksempel spektral cytometri for å separere fluorescerende proteiner med mer overlappende spektra, som laboratoriet vårt for tiden optimaliserer med opptil åtte fluorescerende proteiner. Databaser som fluorescerende proteindatabase (https://www.fpbase.org) er nyttige for å velge fluorescerende proteiner med spesiell spektral overlapping. Imidlertid kan denne prosessen bli komplisert av ulike faktorer, hvorav noen er spesifikke for bestemte cytometre. For eksempel kan bruk av visse røde proteiner som tdTomato resultere i uønsket gjennomblødning i blå kanaler bare i visse laser / filterkonfigurasjoner10. I tillegg har flere langt røde proteiner vist ikke-lineære forhold mellom DNA-dosering og fluorescensutgang10, noe som reduserer bruken som effektive markører for DNA-dosering.
For konsistens på tvers av eksperimenter som utføres med varierende antall komplekser (en, to, tre osv.), Er det nyttig å bruke samme fraksjonelle mengde plasmid per transfeksjonsblanding. For eksempel, hvis man tester et tre-gensystem med hvert gen kodet i en av tre plasmider (A, B og C), kan man co-transfektere kretsplasmidene i forholdet 1: 1: 1 sammen med et likt forhold mellom et plasmid som koder for en transfeksjonsmarkør. Dette vil gjøre hvert plasmid til en fjerdedel av den totale massen av blandingen, og dermed omtrent en fjerdedel av massen av hvert transfeksjonskompleks som dannes. Når polytransfekter A, B og C i separate komplekser med sine egne reportere, i stedet for å blande plasmidene 1: 1 med reportere eller opprettholde deres totale DNA-masse, er det mer konsistent å holde hvert plasmid på en fjerdedel av massen til hvert kompleks, med fyllstoff-DNA som tar opp den gjenværende massen (se tabell 5 for eksempler). Dette skyldes at fordelingen av genuttrykk blant transfekterte celler avhenger mindre av den totale massen av DNA levert i kompleksene, og mer av den fraksjonelle mengden DNA i hvert kompleks10. Hvis andre forhold enn 1: 1: 1 er ønsket, beregner du de tilsvarende fraksjonene av den totale DNA-massen i transfeksjonsblandingen for hver del. Tabell 5 [nederst] viser for eksempel forholdet 1:1:4.
| Metode | Kompleks | ng A (brøkdel) | ng B (brøk) | ng C (brøkdel) | ng Reporter (brøkdel) | ng Filler DNA (fraksjon) | Totalt (ng) |
| Co-transfeksjon | 1 | 150 (¼) | 150 (¼) | 150 (¼) | 150 (¼) | 0 (0) | 600 |
| Poly-transfeksjon | 600 | ||||||
| → | 1 | 50 (¼) | 50 (¼) | 100 (½) | 200 | ||
| → | 2 | 50 (¼) | 50 (¼) | 100 (½) | 200 | ||
| → | 3 | 50 (¼) | 50 (¼) | 100 (½) | 200 | ||
| Co-transfeksjon | 1 | 75 (⅛) | 75 (⅛) | 300 (½) | 150 (¼) | 0 (0) | 600 |
| Poly-transfeksjon | 600 | ||||||
| → | 1 | 25 (⅛) | 50 (¼) | 125 (⅝) | 200 | ||
| → | 2 | 25 (⅛) | 50 (¼) | 125 (⅝) | 200 | ||
| → | 3 | 100 (½) | 50 (¼) | 50 (¼) | 200 |
Tabell 5: Eksempler på bruk av filler-DNA for konsistens på tvers av ko- og polytransfeksjonseksperimenter. Her vises to generiske eksempler på samtidig transfeksjon av tre plasmider med samme mengde filler-DNA. I det øverste eksemplet er plasmidene alle i like store masser. I det nederste eksemplet leveres ett plasmid ved en høyere masse sammenlignet med de andre. Fraksjonen av totalt DNA som ville bli brukt i et ko-transfeksjonskompleks blir transmutert til polytransfeksjonskomplekser, med gjenværende mengde DNA (opp til total mengde for hvert kompleks, som er fast og likt på tvers av komplekser) utgjort med fyllstoff-DNA.
Det overordnede målet med fyllstoff-DNA er å opprettholde lignende doser av plasmider per celle, uavhengig av antall unike transfeksjonsblandinger. Som en grov tilnærming til dette prinsippet, separerer tre plasmider i tre blandinger samtidig som den samme DNA-massen av hver (og det passende forholdet mellom transfeksjonsreagens) opprettholdes, reduseres prosentandelen av celler som mottar et gitt kompleks med en tredjedel sammenlignet med en enkelt blanding som inneholder alle tre plasmider. Imidlertid mottar hver transfekterte celle deretter en ~ 3x høyere gendose. Å redusere den relative mengden av plasmidene alene uten filler-DNA er derfor utilstrekkelig for å opprettholde konsistente plasmiddoser, da dette ganske enkelt reduserer transfeksjonseffektiviteten uten å endre den underliggende fordelingen av ekspresjon mellom de transfekterte cellene10. På den annen side tillater filler-DNA justering av DNA-doseringen uten å påvirke den totale transfeksjonseffektiviteten (selv om detekterbare transfeksjonsceller kan reduseres på grunn av lavere signal)10. Etter den grove tilnærmingen ovenfor, reduserer fraksjonen av DNA i polytransfeksjonsblandingene til en tredjedel og tilsetning av fyllstoff-DNA de relative gendosene sammenlignet med den opprinnelige ko-transfeksjonen. Filler DNA sikrer derfor effektiv og nøyaktig transfeksjonskompleksdannelse.
For å endre ekspresjonsområdet for et gen av interesse som dekkes av reporteren, kan brøkdelen av hvert testplasmid og/eller promotorer som brukes til å drive genet der, justeres i forhold til reporteren. Hvis en del er sterk/svært aktiv ved lave DNA-doser, kan bruk av en lavere DNA-fraksjon bidra til å sentrere det dynamiske området til delen i midten av fluorescensfordelingen til reporteren i transfekterte celler. På samme måte, for deler som er svake / bare aktive ved høye DNA-doser, kan det være nyttig å bruke en høyere fraksjon. Imidlertid må det utvises forsiktighet med slik innstilling, da reduksjon av DNA-fraksjoner for mye øker stokastisiteten ved levering til cellene sammenlignet med reporter10, og høye genuttrykksnivåer kan overbelaste cellulært genuttrykksmaskineri12,14. For å unngå stokastisitet, og i tilfeller der hvert gen leveres til celler i et fast forhold (f.eks. hvis kretsen skal genereres som en enkelt lenti-, PiggyBac- eller Landing Pad-vektor), kan det relative uttrykket av hvert gen justeres ved hjelp av sterkere / svakere promotorer, små uORFs18 og / eller miSFIT19.
Selv om protokollen beskriver en omvendt transfeksjonsteknikk, er poly-transfeksjon også mulig med fremovertransfeksjon. I omvendt transfeksjon blir cellene samtidig sådd og transfektet; I fremovertransfeksjon transfeksjoneres cellene ~ 24 timer etter første plating ved omtrent halvparten av tettheten som ville bli brukt i omvendt transfeksjon (for å tillate celledeling ved transfeksjonstidspunktet). Generelt er omvendt transfeksjon mer effektiv, men også mer giftig, og vi har lagt merke til noen forskjeller i form av transfeksjonsfordelinger basert på reagenset, transfeksjonstid og cellelinje. Dermed bør den valgte transfeksjonsmetoden optimaliseres for hver cellelinje for å maksimere antall transfekterte celler og dekning av det flerdimensjonale konsentrasjonsrommet for plasmiddoser per celle.
Samlet sett muliggjør poly-transfeksjon rask optimalisering av pattedyrs genetiske kretser. Mange mulige ratiometriske kombinasjoner av kretskomponenter kan enkelt testes i en enkelt brønn. I tillegg, siden polytransfeksjon inneholder mer informasjon om nivåene av hver del i et system enn en konvensjonell transfeksjon, har det vist seg å være svært verdifullt for å karakterisere oppførselen til forskjellige genetiske deler10,11,12,13. Vedtakelsen av poly-transfeksjon forventes å akselerere tempoet i å utvikle nye og forbedrede genkretser for bruk i pattedyrceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
RW er medstifter av Strand Therapeutics og Replay Bio; RW og RJ arkivert et foreløpig patent knyttet til en celletype klassifiserer.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke tidligere Weiss Lab-medlemmer som ledet eller bidro til å utvikle poly-transfeksjonsmetoden og dens anvendelse på celleklassifiserere: Jeremy Gam, Bre DiAndreth og Jin Huh; andre Weiss lab-medlemmer som har bidratt til videre metodeutvikling/optimalisering: Wenlong Xu, Lei Wang og Christian Cuba-Samaniego; Prof. Josh Leonard og gruppemedlemmer, inkludert Patrick Donahue og Hailey Edelstein, for å teste poly-transfeksjon og gi tilbakemelding; og professor Nika Shakiba for å invitere dette manuskriptet og gi tilbakemelding. Vi vil også takke National Institutes of Health [R01CA173712, R01CA207029, P50GM098792]; National Science Foundation [1745645]; Cancer Center Support (kjerne) Grant [P30CCA14051, delvis] fra NCI, og National Institutes of Health [P50GM098792] for finansiering av dette arbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15mL Corning Falcon conical tubes | ThermoFisher Scientific | 14-959-53A | |
| 24-well petri dish | Any company of choice | (Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free) | |
| Bovine serum albumin | NEB | B9000S | |
| Centrifuge | Any company of choice | Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX2000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | |
| Cytoflow | Non-commercial software package | https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/# | |
| DMEM | VWR | 10-013-CV | Use the correct media for your cell type |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 03690-100ML | |
| Fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F4135 | |
| HEK cells | ATCC | CRL-1573 | Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently. |
| HeLa cells | ATCC | CRL-12401 | Use the relevant cell type for your experiments. |
| Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer | ThermoFisher Scientific | L3000001 | Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent |
| LSRFortessa flow cytometer | BD Biosciences | N/A | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
| Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | Any company of choice | ||
| Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985070 | reduced serum medium |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Rainbow calibration beads | Spherotech | URCP-100-2H | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Trypsin | VWR | 25-053-CI |
References
- Prochazka, L., Benenson, Y., Zandstra, P. W. Synthetic gene circuits and cellular decision-making in human pluripotent stem cells. Current Opinion in Systems Biology. 5, 93-103 (2017).
- Sayeg, M. K., et al. Rationally designed microRNA-based genetic classifiers target specific neurons in the brain. ACS Synthetic Biology. 4 (7), 788-795 (2015).
- Zhen, X., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. Multi-Input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells. Science. 333 (6047), 1307-1311 (2011).
- Nissim, L., et al. Synthetic RNA-based immunomodulatory gene circuits for cancer immunotherapy. Cell. 171 (5), 1138-1150 (2017).
- Nissim, L., Bar-Ziv, R. H. A tunable dual-promoter integrator for targeting of cancer cells. Molecular Systems Biology. 6, 444 (2010).
- Mohammadi, P., Castel, S. E., Brown, A. A., Lappalainen, T. Quantifying the regulatory effect size of cis-acting genetic variation using allelic fold change. Genome Research. 27 (11), 1872-1884 (2017).
- Prochazka, L., et al. Discrete-to-analog signal pluripotent stem cells conversion in human. BioRxiv. , (2021).
- Del Vecchio, D. Modularity, context-dependence, and insulation in engineered biological circuits. Trends in Biotechnology. 33 (2), 111-119 (2015).
- Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell. Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).
- Gam, J. J., DiAndreth, B., Jones, R. D., Huh, J., Weiss, R. A 'poly-transfection' method for rapid, one-pot characterization and optimization of genetic systems. Nucleic Acids Research. 47 (18), 106 (2019).
- Jones, R. D., et al. Robust and tunable signal processing in mammalian cells via engineered covalent modification cycles. Nature Communications. 13 (1), 1720 (2022).
- Jones, R. D., et al. An endoribonuclease-based feedforward controller for decoupling resource-limited genetic modules in mammalian cells. Nature Communications. 11 (1), 5690 (2020).
- DiAndreth, B., Wauford, N., Hu, E., Palacios, S., Weiss, R. PERSIST platform provides programmable RNA regulation using CRISPR endoRNases. Nature Communications. 13 (1), 2582 (2022).
- Frei, T., et al. Characterization and mitigation of gene expression burden in mammalian cells. Nature Communications. 11 (1), 4641 (2020).
- Beal, J., Weiss, R., Yaman, F., Adler, A., Davidsohn, N. A method for fast, high-precision characterization of synthetic biology devices. Computer Science and Artificial Intelligence Laboratory Technical Report. Massachusetts institute of technology. , Cambridge. MIT-CSAIL-TR-2012-008 (2012).
- Beal, J., et al. Meeting measurement precision requirements for effective engineering of genetic regulatory networks. ACS Synthetic Biology. 11 (3), 1196-1207 (2022).
- Teague, B. Cytoflow: A Python toolbox for flow cytometry. bioRxiv. , (2022).
- Ferreira, J. P., Overton, K. W., Wang, C. L. Tuning gene expression with synthetic upstream open reading frames). Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11284-11289 (2013).
- Michaels, Y. S., et al. Precise tuning of gene expression levels in mammalian cells. Nature Communications. 10 (1), 818 (2019).
- Saito, H., et al. Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch. Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).
- Wroblewska, L., et al. Mammalian synthetic circuits with RNA binding proteins for RNA-only delivery. Nature Biotechnology. 33 (8), 839-841 (2015).
- Wagner, T. E., et al. Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells. Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043-1050 (2018).
- Sekuklu, S. D., Donoghue, M. T. A., Spillane, C. miR-21 as a key regulator of oncogenic processes. Biochemical Society Transactions. 37, 918-925 (2009).
- Stanton, B. C., et al. Genomic mining of prokaryotic repressors for orthogonal logic gates. Nature Chemical Biology. 10 (2), 99-105 (2014).
- Stanton, B. C., et al. Systematic transfer of prokaryotic sensors and circuits to mammalian cells. ACS Synthetic Biology. 3 (12), 880-891 (2014).
