Summary
מעגלים גנטיים מורכבים גוזלים זמן רב כדי לתכנן, לבדוק ולמטב. כדי להקל על תהליך זה, תאי יונקים נדבקים באופן המאפשר בדיקה של סטויכיומטריה מרובים של רכיבי מעגל בבאר אחת. פרוטוקול זה מתאר את השלבים לתכנון ניסויים, טרנספקציה וניתוח נתונים.
Abstract
מעגלים גנטיים של יונקים הוכיחו את הפוטנציאל לחוש ולטפל במגוון רחב של מצבי מחלה, אך אופטימיזציה של רמות רכיבי המעגלים נותרה מאתגרת ודורשת עבודה. כדי להאיץ את התהליך הזה, המעבדה שלנו פיתחה פולי-טרנספקציה, הרחבה בעלת תפוקה גבוהה של טרנספקציה מסורתית של יונקים. בפולי-טרנספקציה, כל תא באוכלוסייה הנגועה מבצע למעשה ניסוי שונה, בודק את התנהגות המעגל במספרי העתקי דנ"א שונים ומאפשר למשתמשים לנתח מספר רב של סטויכיומטריה בתגובה חד-סירית. עד כה הודגמו פולי-טרנספקציות הממטבות את היחסים של מעגלים תלת-רכיביים בבאר תאים אחת; באופן עקרוני, אותה שיטה יכולה לשמש לפיתוח מעגלים גדולים עוד יותר. ניתן ליישם בקלות תוצאות פולי-טרנספקציה כדי למצוא יחסים אופטימליים בין דנ"א לטרנספקט משותף עבור מעגלים חולפים או כדי לבחור רמות ביטוי עבור רכיבי מעגלים ליצירת קווי תאים יציבים.
כאן, אנו מדגימים את השימוש בפולי-טרנספקציה כדי לייעל מעגל בן שלושה רכיבים. הפרוטוקול מתחיל בעקרונות תכנון ניסיוני ומסביר כיצד פולי-טרנספקציה מתבססת על שיטות מסורתיות של קו-טרנספקציה. לאחר מכן, poly-transfection של תאים מתבצעת ואחריו cytometry זרימה כמה ימים מאוחר יותר. לבסוף, הנתונים מנותחים על ידי בחינת פרוסות של נתוני ציטומטריית זרימה של תא בודד המתאימים לתת-קבוצות של תאים עם יחסי רכיבים מסוימים. במעבדה, פולי-טרנספקציה שימשה לאופטימיזציה של מסווגי תאים, בקרי משוב והזנה, מוטיבים דו-יציבים ורבים אחרים. שיטה פשוטה אך רבת עוצמה זו מאיצה את מחזורי התכנון של מעגלים גנטיים מורכבים בתאי יונקים.
Introduction
תחום הביולוגיה הסינתטית של יונקים התקדם במהירות, מפיתוח חלקים פשוטים של חישה ותגובה בקווי תאים בתרבית ועד אופטימיזציה של רשתות גנים מורכבות כדי להתמודד עם אתגרים בעולם האמיתי באבחון ובטיפול1. מעגלים מתוחכמים אלה מסוגלים לחוש קלט ביולוגי מפרופילי מיקרו-רנ"א, דרך ציטוקינים ועד תרופות של מולקולות קטנות, וליישם מעגלי עיבוד לוגיים הכוללים טרנזיסטורים, מסנני פסים, מתגי החלפה ומתנדים. הם גם הראו תוצאות מבטיחות במודלים של בעלי חיים של מחלות כמו סרטן, דלקת פרקים, סוכרת, ועודרבים 1,2,3,4,5. עם זאת, ככל שהמורכבות של מעגל גדלה, אופטימיזציה של הרמות של כל אחד ממרכיביו הופכת מאתגרת יותר ויותר.
סוג אחד שימושי במיוחד של מעגל גנטי הוא מסווג תאים, אשר ניתן לתכנת לחוש ולהגיב למצבים תאיים. ייצור סלקטיבי של תפוקות חלבון או RNA במצבים תאיים ספציפיים הוא כלי רב עוצמה להנחיה ותכנות התמיינות של תאים ואורגנואידים, לזהות ולהשמיד תאים חולים ו / או סוגי תאים לא רצויים, ולווסת את תפקודם של תאים טיפוליים 1,2,3,4,5 . עם זאת, יצירת מעגלים בתאי יונקים שיכולים לסווג במדויק מצבי תאים ממספר מיני רנ"א תאיים ו/או חלבונים הייתה מאתגרת ביותר.
אחד השלבים הגוזלים זמן רב ביותר בפיתוח מעגל סיווג תאים הוא לייעל את רמות הביטוי היחסי של גנים המרכיבים רכיבים בודדים, כגון חיישנים וגורמי עיבוד, בתוך המעגל. כדי להאיץ את אופטימיזציה של מעגלים ולאפשר בנייה של מעגלים מתוחכמים יותר, עבודה אחרונה השתמשה במידול מתמטי של מעגלים מסווגי תאים ומרכיביהם כדי לחזות הרכבים וטופולוגיות אופטימליים 6,7. בעוד שזה הראה תוצאות חזקות עד כה, ניתוח מתמטי מוגבל על ידי הצורך לאפיין באופן שיטתי את התנהגות הקלט-פלט של גנים המרכיבים במעגל, אשר גוזל זמן. יתר על כן, מספר עצום של בעיות תלויות הקשר יכולות להופיע במעגלים גנטיים מורכבים, ולגרום להתנהגות של מעגל מלא להתריס נגד תחזיות המבוססות על אפיונים של חלקים בודדים 8,9.
כדי לפתח ולבדוק במהירות רבה יותר מעגלים מורכבים של יונקים כגון מסווגי מצב תאים, המעבדה שלנו פיתחה טכניקה הנקראת poly-transfection10, אבולוציה של פרוטוקולי טרנספקציה משותפת של פלסמיד. בטרנספקציה משותפת, מיני דנ"א פלסמידים מרובים מורכבים יחד עם מגיב שומנים או פולימר טעון חיובית, ואז מועברים לתאים באופן מתואם (איור 1A). בפולי-טרנספקציה, פלסמידים מורכבים בנפרד עם המגיב, כך שהדנ"א מכל קומפלקס טרנספקציה מועבר לתאים באופן דה-קורלציה (איור 1B). באמצעות שיטה זו, תאים בתוך האוכלוסייה הנגועה נחשפים לשילובים רבים של יחסים של שני מטעני דנ"א או יותר הנושאים רכיבי מעגל שונים.
כדי למדוד את היחסים בין רכיבי המעגלים המועברים לכל תא, כל קומפלקס טרנספקציה בתוך פולי-טרנספקציה מכיל כתב פלואורסצנטי מבוטא באופן קונסטיטוטיבי המשמש כפרוקסי לקליטה תאית של המכלול. דנ"א מילוי שאינו מכיל יסודות הפעילים בתוך תא יונק משמש לכוונון הכמות היחסית של רכיבי הכתב הפלואורסצנטי והמעגלים המועברים לתא בקומפלקס טרנספקציה יחיד ונדון ביתר פירוט בדיון. דוגמה לדנ"א מילוי המשמש במעבדת וייס הוא פלסמיד המכיל רצף טרמינטור, אך ללא פרומוטור, רצף קידוד וכו'. לאחר מכן ניתן להשוות תאים עם יחסים שונים של רכיבי מעגל כדי למצוא יחסים אופטימליים לתפקוד מעגל הגנים. זה בתורו מניב תחזיות שימושיות לבחירת מקדמים ורכיבי מעגל אחרים כדי להשיג רמות ביטוי גנים אופטימליות בעת שילוב רכיבי מעגל לווקטור יחיד לאינטגרציה גנטית (למשל, לנטיוירוס, טרנספוזון או משטח נחיתה). לכן, במקום לבחור יחסים בין רכיבי מעגל בהתבסס על אינטואיציה או באמצעות תהליך ניסוי וטעייה הגוזל זמן, פולי-טרנספקציה מעריכה מגוון רחב של סטויכיומטריה בין חלקים גנטיים בתגובה חד-סירית.
במעבדה שלנו, פולי-טרנספקציה אפשרה אופטימיזציה של מעגלים גנטיים רבים, כולל מסווגי תאים, בקרי משוב והזנה, ומוטיבים דו-יציבים. שיטה פשוטה אך רבת עוצמה זו מאיצה באופן משמעותי את מחזורי התכנון של מעגלים גנטיים מורכבים בתאי יונקים. פולי-טרנספקציה שימשה מאז לאפיון מספר מעגלים גנטיים כדי לחשוף את פונקציות העברת הקלט-פלט הרב-ממדיות שלהם ברזולוציה גבוהה 10, לייעל טופולוגיית מעגל חלופית עבור סיווג מצב התא11, ולהאיץ פרויקטים שונים שפורסמו12,13 ומתמשכים.
כאן אנו מתארים ומתארים את זרימת העבודה לשימוש בפולי-טרנספקציה כדי למטב במהירות מעגל גנטי (איור 2). הפרוטוקול מראה כיצד להפיק נתוני פולי-טרנספקציה באיכות גבוהה ולהימנע ממספר שגיאות נפוצות בפרוטוקול הפולי-טרנספקציה ובניתוח הנתונים (איור 3). לאחר מכן הוא מדגים כיצד להשתמש בפולי-טרנספקציה כדי לאפיין רכיבי מעגלים פשוטים, ותוך כדי כך, למדוד תוצאות פולי-טרנספקציה כנגד קו-טרנספקציה (איור 4). לבסוף, התוצאות של פולי-טרנספקציה מראות אופטימיזציה של מעגל מסווג הסרטן (איור 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: טבלה 1 וטבלה 2 משמשות כהפניות משמעותיות לפרוטוקול זה. טבלה 1 מציגה קנה מידה של מגיבים עבור תגובות, וטבלה 2 מציגה אריתמטיקה של יחס דנ"א עבור דוגמה לפולי-טרנספקציה המתוארת בפרוטוקול (המחצית העליונה) ולניסוי המשך אפשרי (המחצית התחתונה).
1. הכנת תאים לטרנספקציה
- יש לוודא כי תרבית תאי הכליה העוברית האנושית (HEK293) היא 60%-80% חופפת לפני תחילת הפרוטוקול. כדי לעשות זאת, זרע 1 x 106 תאים בתרבית רקמה 100 מ"מ x 15 מ"מ צלחת פטרי יומיים לפני, לדגור ב 37 ° C עם 5% CO2.
הערה: למרות שהפרוטוקול שלנו מתמקד בתאי HEK293, ניתן להחליף סוגי תאים אחרים. - הכן את המדיה והתאים לטרנספקציות כמתואר להלן.
- יש לחמם מראש לפחות 20 מ"ל של תמיסה של מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) עם 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-1% חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA; ראו טבלת חומרים) עד 37°C. לחמם מראש לפחות 2.4 מ"ל של טריפסין ו 2.4 מ"ל של מלוחים חוצצים פוספט (PBS) ל 37 ° C גם כן. טרום חם מופחת סרום בינוני ~ 16 ° C.
הערה: כל עבודת תרבית רקמות צריכה להתבצע בזהירות בארון בטיחות ביולוגית.
- יש לחמם מראש לפחות 20 מ"ל של תמיסה של מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) עם 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-1% חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA; ראו טבלת חומרים) עד 37°C. לחמם מראש לפחות 2.4 מ"ל של טריפסין ו 2.4 מ"ל של מלוחים חוצצים פוספט (PBS) ל 37 ° C גם כן. טרום חם מופחת סרום בינוני ~ 16 ° C.
- השהה מחדש את התאים בתמיסת DMEM כמתואר להלן.
- לשאוף ולהיפטר מהתקשורת הנוכחית. יש לפזר 2 מ"ל PBS על תרבית התאים HEK293 כדי לשטוף את התאים. לשאוף ולהיפטר PBS.
- יש לפזר 2 מ"ל טריפסין על תרבית התאים HEK293. מניחים את צלחת הפטרי באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות או עד שהתאים כבר לא נצמדים לצלחת. החזירו את הצלחת לארון הבטיחות הביולוגית ודללו את תמיסת התא על ידי ניפוק 8 מ"ל של תמיסת DMEM לצלחת.
- מערבבים את התמיסה על ידי פיטום עדין למעלה ולמטה מספר פעמים. שואפים את כל המדיה ומניחים אותה בצינור חרוטי של 15 מ"ל.
- צנטריפוגה את התאים ב 300 x גרם במשך 3 דקות כדי להניע אותם. לשאוף את התקשורת (נזהר לא לשאוף את התאים) ולהשליך אותה. להשעות מחדש את התאים ב 5 מ"ל של תמיסת DMEM, ערבוב על ידי pipeting בעדינות למעלה ולמטה.
- הערך את ריכוז התאים הנוכחי באמצעות מונה תאים אוטומטי (המופיע בטבלת החומרים). זרעו שש בארות (בדוגמה זו) בצלחת בת 24 בארות עם 1 x 105 תאים (לצפיפות זריעה של 50,000 תאים לסמ"ק2).
- הוסף את תמיסת ה- DMEM עד 500 μL (הוסף תחילה תמיסת DMEM לבארות), ולאחר מכן תייג באר אחת לכל טיפול באופן הבא: ללא בקרת צבע, בקרת mKO2, בקרת TagBFP, בקרת NeonGreen, בקרת כל הצבעים ופולי-טרנספקציה 1. בארות הבקרה TagBFP, mKO2 ו-NeonGreen הן בקרות צבע יחיד עבור כל החלבונים הפלואורסצנטיים הכלולים בפולי-טרנספקציה.
2. ביצוע טרנספקציה
- הכינו צינורות לכל צבר DNA. הניחו בצד צינורות מיקרוצנטריפוגות בנפח 1.5 מ"ל ותייגו את הצינורות כך: ללא בקרת צבע, בקרת mKO2, בקרת TagBFP, בקרת NeonGreen, כל בקרת הצבע, תערובת פולי-טרנספקציה 1 ומיקס פולי-טרנספקציה 2.
- הוסף 36 μL של מדיום סרום מופחת לבקרת ללא צבע, בקרת mKO2, בקרת TagBFP, בקרת NeonGreen וכל צינורות בקרת הצבע. הוסף 18 μL של מדיום סרום מופחת לכל אחת מתערובת poly-transfection 1 ו- poly-transfection mix 2 tubes.
הערה: ההנחה היא שריכוזי הפלסמיד הם 150 ננוגרם/מיקרוליטר. - הוסף 600 ng של פלסמיד מילוי לצינור הבקרה ללא צבע. הוסף 300 ng של mKO2 ו- 300 ng של פלסמיד מילוי לצינור בקרת הצבע mKO2. הוסף 300 ng של TagBFP ו- 300 ng של פלסמיד מילוי לצינור בקרת הצבע TagBFP.
- הוסף 300 ng של פלסמיד NeonGreen מכונן ו 300 ng של פלסמיד מילוי לצינור בקרת צבע NeonGreen. הוסף 100 ng כל אחד של mKO2, TagBFP ו- NeonGreen המכונן, כמו גם 300 ng של פלסמיד מילוי, לצינור הבקרה של כל הצבעים.
- הוסף 150 ng של mKO2 לשפופרת Poly-transfection Mix 1. הוסף 75 ng של כתב NeonGreen פלסמיד ו 75 ng של פלסמיד מילוי לתערובת poly-transfection 1 צינור.
- הוסף 150 ng של TagBFP לצינור poly-transfection mix 2. הוסף 75 ng של פלסמיד L7ae ו 75 ng של פלסמיד מילוי לתערובת poly-transfection תערובת 2 צינור.
- הוסף 36 μL של מדיום סרום מופחת לבקרת ללא צבע, בקרת mKO2, בקרת TagBFP, בקרת NeonGreen וכל צינורות בקרת הצבע. הוסף 18 μL של מדיום סרום מופחת לכל אחת מתערובת poly-transfection 1 ו- poly-transfection mix 2 tubes.
- צור את תערובת האב של הטרנספקציה בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל על-ידי שילוב של 216 מיקרוליטר של תווך סרום מופחת עם 9.48 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה (ראה טבלה 1 עבור יחסי ריאגנטים וקנה מידה של תגובה). מערבבים היטב על ידי פיטום למעלה ולמטה, ומניחים בצד.
- הוסף 1.58 μL של מגיב משפר לכל אחד מפקדי ללא צבע, בקרת צבע יחידה וכל צינורות בקרת הצבע. הוסף 79 μL של מגיב משפר לכל אחד צינורות תערובת poly-transfection. מערבבים כל צינור בנפרד על ידי פיפטינג נמרץ.
- הוסף את תערובת האב של הטרנספקציה לכל צינור המכיל DNA.
- הוסף 37.58 μL של תערובת מאסטר טרנספקציה לכל אחד מפקדי ללא צבע, בקרת צבע יחידה וכל צינורות בקרת הצבע. מערבבים כל צינור בנפרד על ידי פיפטינג נמרץ.
- הוסף 18.79 μL של תערובת מאסטר transfection לכל אחד מצינורות תערובת poly-transfection. מערבבים כל צינור בנפרד על ידי פיפטינג נמרץ.
- מוציאים את תערובות הטרנספקציה לתוך הבארות.
- פיפטה 65.97 μL של כל תערובת transfection עבור צבע ללא צבע, צבע יחיד, וכל פקדי צבע לתוך הבארות המתאימות.
- פיפטה 32.98 μL של פולי-טרנספקציה מערבבים 1 לתוך באר הפולי-טרנספקציה ומערבלים את הצלחת במהירות אך בעדינות בתבנית הספרה שמונה הדוקה לאורך משטח שטוח כדי לפזר את הקומפלקסים ביעילות. לאחר מכן, פיפטה 32.98 μL של poly-transfection לערבב 2 לתוך אותה באר poly-transfection ולערבל את הצלחת באותו אופן.
- מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 ° C, עם 5% CO2 וללא טלטול, לתקופה של 48 שעות.
הערה: כדי להגדיל את כדאיות התא, ניתן להחליף את המדיה התאית כל 6 שעות לאחר הטרנספקציה (אם כי זה לא תמיד הכרחי, ועם תאי HEK293 ונגזרותיו, יש להיזהר לא לנתק את התאים מהצלחת בעת שינוי המדיה).
| מגיב | כמות | שינוי גודל | ||||
| מדיום מופחת בסרום לתערובת DNA | 36 μL לכל צינור בקרה, 18 μL לכל צינור poly-transfection | 0.05 μL DNA מופחת בסרום בינוני/טבעי לכל צינור, עם נפח נוסף של 10-20% לטיפול בצנרת | ||||
| דנ א | 300-600 ננוגרם לכל צינור | |||||
| P3000 | 1.58 μL לכל צינור בקרה, 0.79 μL לכל צינור poly-transfection | 0.0022 μL P3000/ng DNA לכל צינור, עם תוספת של 10-20% | ||||
| מדיום סרום מופחת לתערובת מאסטר Lipo | 36 μL לכל צינור בקרה, 18 μL לכל צינור poly-transfection | 0.05 μL הפחית את הדנ"א הבינוני/טבעי הכולל בסרום, עם נפח נוסף של 10-20% כדי להסביר את הפיפטינג | ||||
| מגיב טרנספקציה ומשפר | 1.58 μL לכל צינור בקרה, 0.79 μL לכל צינור poly-transfection | 0.0022 μL Lipofectamine 3000/ng DNA, עם 10-20% תוספת | ||||
טבלה 1: קנה מידה מגיב עבור טרנספקציות. הטבלה מציינת את היחס הנכון של מגיב שיש לכלול עבור כמות הדנ"א הכלולה בבאר יחידה. זה יכול לשמש כדי לשנות את קנה המידה של תגובות ביעילות וליצור תערובות אב. כמויות של מגיב הוגדלו כדי לכלול עודף של 20%.
3. הכנת תאים לציטומטריית זרימה
- מראש לחמם לפחות 4.2 מ"ל של פתרון DMEM ל 37 ° C. טרום חם לפחות 4.2 מ"ל של טריפסין ו 4.2 מ"ל של PBS עד 37 ° C. שמור על תמיסת חיץ מיון תאים המופעלת על ידי פלואורסצנטיות (FACS) ב- 4 ° צלזיוס עד שהיא מוכנה לשימוש.
- השהה מחדש את התאים בתמיסת החיץ FACS (PBS בתוספת 1% BSA, 5 mM ethylenediaminetetraacetic acid [EDTA] ו-0.1% נתרן אזיד [NaN3], כדי להפחית גושים; ראה טבלת חומרים) כמתואר להלן.
- לשאוף ולהשליך את המדיה הנוכחית בכל באר. יש לפזר 5 מ"ל של PBS לתוך כל באר כדי לשטוף את התאים. לשאוף ולהיפטר PBS.
- יש להוציא 5 מ"ל טריפסין לכל באר. מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, או עד שהתאים כבר לא נצמדים למנה. החזר את הצלחת לארון הבטיחות הביולוגית ודלל את תמיסות התאים על ידי חלוקת 5 מ"ל של תמיסת DMEM לכל באר.
- עבור כל באר, לערבב את הפתרון על ידי pipeting בעדינות למעלה ולמטה מספר פעמים. עבור כל באר, לשאוף את כל התקשורת ומניחים אותו בצינור חרוטי 15 מ"ל.
- צנטריפוגה את התאים ב 300 x גרם במשך 3 דקות כדי להניע אותם. לשאוף את התקשורת, להיזהר לא לשאוף את התאים ולהשליך אותו. בכל צינור, להשהות מחדש את התאים ב 5 מ"ל של תמיסת חיץ FACS, ערבוב על ידי pipeting בעדינות למעלה ולמטה.
- מעבירים כל תמיסת תרחיף תאים דרך מסננת (להסרת גושים) לצינורות חרוטיים ציטומטריית זרימה נפרדים. שמור צינורות אלה על קרח לא יותר מ 1 שעה, ולבצע ציטומטריה זרימה בהקדם האפשרי.
4. ביצוע ציטומטריית זרימה
הערה: הפעלת ציטומטר זרימה דורשת הכשרה מתאימה וידע במשימות הדרושות. מכיוון שתוכנה וציוד עשויים להשתנות ויש להדריך משתמשים באופן כללי, סעיף זה מתייחס לפעולות ספציפיות שכדאי לבצע.
- ראשית, בדקו את התאים הנגועים בבקרת פלסמיד המילוי (ללא בקרת צבע) כדי לבחור מאפייני תאים ולהימנע מחריגות (כולל אגרגטים, פסולת וכו '). אמנם ישנם שילובים רבים של פרמטרים להבחנה בין תאים, אך השתמש בשלוש האפשרויות הכלליות הבאות כדרך טובה להמחיש תכונות מבחינות.
- הסתכל על אזור הפיזור הצדדי (יומן רישום או קנה מידה ליניארי לפי העדפה/סוג תא) לעומת אזור הפיזור קדימה (קנה מידה ליניארי).
- הסתכלו על גובה הפיזור הצדדי (סולם היומן) לעומת רוחב הפיזור הצדדי (קנה מידה ליניארי).
- הסתכל על רוחב הפיזור קדימה (קנה מידה ליניארי) לעומת גובה הפיזור קדימה (קנה מידה ליניארי).
- לאחר מכן, התבונן בפקדי הצבע היחיד. השתמש בבקרת כל הצבעים כדי לכוונן את מתחי המכשיר, כך שהאותות מכל חלבון פלואורסצנטי מנורמלים ליחידות שרירותיות שוות ערך (a.u.) של פלואורסצנטיות. לאחר מכן, הפעל את פקדי הצבע היחיד עבור כל חלבון פלואורסצנטי, המשמשים לקביעת מטריצת הפיצוי, ומאפשרים תיקון דימום.
הערה: באופן אידיאלי, הטווח הדינמי המלא של ערכי הפלואורסצנטיות אמור להיות גלוי. נורמליזציה נוספת של אותות חלבון פלואורסצנטי יכולה להיעשות באמצעות המרה ליחידות סטנדרטיות (למשל, מולקולות של פלואורסצאין שווה ערך [MEFLs; ראו Beal et al.15]). כדי לאפשר המרת MEFL במהלך ניתוח, הפעל חרוזי כיול קשת. כיול כזה שימושי גם להפחתת שונות האות ממכשיר למכשיר ומהשתנות האות היומיומית16. - הפעל את צינור הדגימה poly-transfection.
הערה: במידת האפשר, מומלץ להריץ תאים בגודל 1,000 x 10^ (^ = תערובות), מכיוון שיש לחלק את הפולי-טרנספקציות בממדים גבוהים יותר לפחים נוספים במהלך הניתוח, וכל סל זקוק למספיק תאים (באופן אידיאלי >10) כדי לבצע השוואות מובהקות סטטיסטית.
5. ביצוע ניתוח לאחר הניסוי
- בתחילה, השתמש בנתונים מהפקדים (ואם רלוונטי, החרוזים) כדי להבטיח תוצאות מדויקות. השתמש באחד מכלי התוכנה הזמינים כדי לבצע gating תאים חיים (באמצעות שערים שתוארו לעיל), פיצוי ותיקון autofluorescence.
הערה: בדרך כלל אנו משתמשים בקוד MATLAB מותאם אישית (לדוגמה, https://github.com/jonesr18/MATLAB_Flow_Analysis או Cytoflow17), הכולל גם ממשק משתמש גרפי וגם ספריית Python המתאימה לשלב העיבוד המוקדם ולניתוח פולי-טרנספקציה.
| שיטת | מורכב | ng סמן פלואורסצנטי | ng L7ae (שבר) | ng כתב (שבר) | ng מילוי DNA (שבר) | סה"כ (ng) |
| פולי-טרנספקציה 1 | 600 | |||||
| → | 1 | 150 | 75 (½) | 75 (½) | 300 | |
| → | 2 | 150 | 75 (½) | 75 (½) | 300 | |
| פולי-טרנספקציה 2 | 600 | |||||
| → | 1 | 150 | 25 (1/6) | 125 (5/6) | 300 | |
| → | 2 | 150 | 125 (5/6) | 25(1/6) | 300 |
טבלה 2: כמויות דנ"א עבור פולי-טרנספקציה שהודגמו בפרוטוקול, וניסוי מעקב לדוגמה עם יחסי פלסמיד מכווננים. החצי העליון של הטבלה מראה את הרכב הפלסמידים המשמשים בניסוי פולי-טרנספקציה פשוט. המחצית התחתונה מציגה את הרכבו של ניסוי מעודכן המתאים את יחסי הפלסמיד לתת-דגימה טובה יותר של מרחב ריכוז היפותטי, שבו אפנן ביטוי הגנים נמצא ביחס אופטימלי יותר של 1:5 ביחס למדווח שלו, מה שמניב יותר תאים נגועים לדגום סביב יחס זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באיור 1 אנו משווים קו-טרנספקציה לפולי-טרנספקציה. בטרנספקציה משותפת, כל הפלסמידים מועברים באותה תערובת טרנספקציה, והתוצאה היא מתאם גבוה בין כמות כל פלסמיד שכל תא בודד מקבל (איור 1A). בעוד שמספר הפלסמידים הכולל המועבר לכל תא משתנה באופן משמעותי, הפלואורסצנטיות של שני חלבוני הדיווח בתאים בודדים באוכלוסייה מתואמת היטב, מה שמצביע על כך ששני הפלסמידים מועברים יחד ביחס קבוע למדי. תאים נגועים עשויים לספוג קומפלקסים מעטים או רבים, אך מכיוון שלכל קומפלקס יש כמויות מתואמות של כל פלסמיד, הטרנספקציה המשותפת חוקרת רק אזור אלכסוני קטן של מרחב הריכוז בין שני הפלסמידים. לעומת זאת, בפולי-טרנספקציה, פלסמידים מועברים בקומפלקסים מרובים של טרנספקציה, וכתוצאה מכך העברה דה-קורלציה של פלסמידים בתערובות טרנספקציה שונות (איור 1B). תאים נגועים סופגים שילובים שונים של קומפלקסים, וכתוצאה מכך תאים המכילים מינונים משתנים של פלסמידים מאף אחד מהקומפלקסים, אחד או שניהם.
איור 2 מציג זרימת עבודה מייצגת של פולי-טרנספקציה. באופן כללי, ניסוי פולי-טרנספקציה מורכב מהשלבים הבאים: הגדרת הבעיה, יצירת תערובות הטרנספקציה, דגירה על התאים, ציטומטריית זרימה ואנליזה. יש גם שלב אופציונלי לחזור על פולי-טרנספקציה עם יחסי חלקים אופטימליים אם תוצאות הפולי-טרנספקציה הראשוניות אינן מסוגלות לצמצם במדויק את יחסי החלקים האופטימליים. שלבים אלה מתוארים בפרוטוקול.
באיור 3 מובאות כמה דוגמאות של טרנספקציות משותפות ופולי-טרנספקציות שביצועיהן טובים ושגיאות נפוצות. איור 3A מראה טרנספקציה משותפת שבוצעה היטב עם מתאם הדוק בין פלסמידים בעלי ביטוי TagBFP ו-eYFP שנמסרו במשותף. לעומת זאת, הטרנספקציה המשותפת באיור 3B מראה מתאם גרוע בין שני הפלסמידים האלה. באיור המוצג, המתאם הגרוע נובע מהוספת מגיב משפר למדיום הסרום המופחת לפני הוספת הפלסמידים. מתאם גרוע כזה בניסויים יכול לנבוע גם ממקדמים שונים המניעים ביטוי של החלבונים הפלואורסצנטיים, ערבוב לקוי במהלך יצירת תערובת טרנספקציה, או מתן אפשרות לקומפלקס לדגור במשך מרווח זמן קצר מדי או ארוך מדי.
איור 3C מראה פולי-טרנספקציה מבוצעת היטב, עם כיסוי טוב של המרחב הדו-ממדי ופיצוי טוב של כל דימום ספקטרלי בין חלבונים פלואורסצנטיים. איור 3D מראה נתוני פולי-טרנספקציה עם מספר נמוך של תאים חיים, שקשה לחלק למספיק פחים עם מספר מספיק של תאים בכל סל לניתוח. כדי להקל על בעיה זו, אוכלוסיית התאים ההתחלתית צריכה להיות במצב בריאותי טוב ולא מגודלת יתר על המידה, והרעילות הניסיונית מופחתת על ידי שימוש בריאגנט טרנספקציה אחר ו / או הדבקה עם פחות DNA כולל. איור 3E מראה פולי-טרנספקציה שבה יעילות הטרנספקציה הייתה ירודה, וכתוצאה מכך שוב כיסוי דליל של המרחב הדו-ממדי לניתוח. במקרה זה, מספר התאים העוברים מורפולוגיה גבוה, אך התאים אינם מבטאים חלבונים פלואורסצנטיים. כדי לשפר את היעילות, יש לייעל את בחירת מגיב הטרנספקציה ולעקוב מקרוב אחר פרוטוקול היצרן. כל תערובת טרנספקציה חייבת להכיל כמות שווה של מסת DNA, מה שמבטיח שלתאים יש סיכוי שווה בקירוב לקבל כל סוג של קומפלקס, וכל תערובת טרנספקציה צריכה להיעשות בהתאם להוראות הערכה. ערכות טרנספקציה שונות הן אופטימליות עבור סוגי תאים שונים; יש להשתמש בערכה שנותנת את היעילות הטובה ביותר בסוג התא של עניין. לבסוף, חלק מסוגי התאים קשים לטרנספקט, ללא קשר לערכה שבה נעשה שימוש. במקרים אלה, מספר גדול יותר של תאים צריך להיות transfected, וכמה שיותר אסף במהלך cytometry זרימה כדי להבטיח מספר מספיק של תאים לנתח. איור 3F מראה נתוני פולי-טרנספקציה שבהם אחד מסמני החלבון הפלואורסצנטי מראה בבירור דימום ספקטרלי לתוך חלבון פלואורסצנטי אחר. בקרות צבע יחיד צריכות תמיד להיות מופעלות עבור כל החלבונים הפלואורסצנטיים במערכת ולהשתמש בהן ליצירת מטריצת פיצוי שיש להחיל על כל הפולי-טרנספקציות לפני הניתוח.
בעת ביצוע ניסויי פולי-טרנספקציה בפעם הראשונה (באופן כללי או עבור מערכת ניסוי חדשה), יש לבצע benchmarking מול co-transfection סטנדרטי. גישה אחת היא למדוד בנפרד את פונקציית העברת הקלט-פלט עבור חלקי מערכת מרכזיים באמצעות קו-טרנספקציה (באמצעות כוונון מינוני DNA) ופולי-טרנספקציה.
באיור 4 אנו מדגימים השוואת ביצועים של המדחיק התרגומי L7Ae, שהותאם כאן מהפרסום המקורי של פולי-טרנספקציה10. L7Ae הוא חלבון קושר RNA המזהה מוטיבים של RNA kink-turn (KT)20; כאשר שני KT (2xKT) ממוקמים באזור הלא מתורגם (UTR) של 5' של mRNA, תרגום מסגרת קריאה פתוחה במורד הזרם (ORF) יכול להיות מדוכא ביעילות על ידי L7Ae21. L7Ae שימש בעבר לבניית מסווגי סוג תאים מבוססי RNA21 ומעגלים אחרים מבוססי RNA22. כדי לבדוק את L7Ae באמצעות טרנספקציה משותפת סטנדרטית, אפשר לכוונן את היחסים בין הפלסמידים המקודדים L7Ae לבין כתב המטרה שלהם בתוך תערובות טרנספקציה שונות (איור 4A וטבלה 3). עבור פולי-טרנספקציה, יש לספק באופן עצמאי L7Ae מכונן וכתב 2xKT מתאים בתערובות טרנספקציה נפרדות, כך שמגוון רחב של יחסי פלסמיד מועברים לתאים (איור 4B). לאחר ביצוע טרנספקציה וציטומטריית זרימה, ניתן לבצע ניתוח נתונים. כדי להפוך את הנתונים לברי השוואה, ניתן לאסוף את תוצאות הטרנספקציה המשותפת הבודדות למערך נתונים יחיד, ולאחר מכן לבצע שילוב רב-ממדי דומה לנתוני ההעתקה הפולי-טרנספקציה (איור 4C,D). בהשוואה בין עקומות המינון-תגובה של L7Ae המדכאות את מדווח הפלט, ניתן לראות שרמת התפוקה החציונית לסל דומה מאוד בין נתוני הטרנספקציה המשותפת ונתוני הפולי-טרנספקציה (איור 4E-G).
באופן כללי, ראינו כי נתוני פולי-טרנספקציה מתואמים היטב עם נתוני קו-טרנספקציה על פני יחסי דנ"א רחבים, עם פחות דיוק ביחסי מינון דנ"א מוטים מאוד (בין השאר בשל כיסוי תאים נמוך יותר בפחים לניסויי פולי-טרנספקציה, במיוחד עבור חלקים הפעילים מאוד במינונים נמוכים של פלסמיד). כדי לשפר את דיוק המדידה עבור חלקים רגישים כאלה, ניתן להפחית את רמת הביטוי שלהם באמצעות מקדם חלש יותר, מסגרות קריאה פתוחותבמעלה הזרם 18, או מכווננים עדינים בתיווך השתקת מיקרו-רנ"א (miSFITs)19.
איור 5 מדגים יישום מוצלח של פולי-טרנספקציה לאופטימיזציה של מסווג סוג תא, שהותאם שוב מ-Gam et al10. המסווג הוא תכנון פשוט יחסית המייצר פלט בתגובה לביטוי של miR-21-5p, miRNA המתבטא יתר על המידה בתאי גידול רבים23. בהיעדר miR-21, פלט המסווג מדוכא על ידי מדכא שעתוק שמקורו בחיידקים, BM3R124, שהסתגלותו הוכחה בעבר כפועלת בתאי יונקים25. כאשר miR-21 קיים, הוא קושר ארבעה אתרי מטרה הממוקמים הן ב-UTR 3' והן ב-5' של BM3R1, מפיל את הביטוי שלו ובכך מאפשר שעתוק פלט (איור 5A). כדי לייעל מערכת זו, שלושת רכיבי המעגלים סופקו בתערובות טרנספקציה נפרדות: (1) BM3R1 (עם אתרי מטרה miR-21), (2) כתב פלט (mKO2), ו-(3) Gal4-VP16, המפעיל תמלול של הפלט (טבלה 4). שימו לב שמקדם הפלט פועל על פי הלוגיקה (Gal4-VP16) ולא BM3R1, מה שמדכא את התפוקה גם בנוכחות Gal4-VP1625. כל חלק מקודד סמן טרנספקציה, TagBFP, mNeonGreen ו- iRFP720, בהתאמה, על אותו פלסמיד כדי לציין את מינון ה- DNA היחסי של כל קומפלקס. באופן כללי, ביטוי מוגבר של Gal4-VP16 אמור להגדיל את תפוקת mKO2 של המדווח, בעוד שביטוי BM3R1 מוגבר אמור לגרום לתפוקת mKO2 נמוכה יותר. מכיוון ש- BM3R1 מופל על ידי miR-21-5p, ביטוי הפלט צריך להיות גבוה יותר בתאי HeLa, שיש להם רמות גבוהות יותר של miR-21-5p ולכן מבטאים פחות BM3R1 מאשר בתאי HEK.
לאחר התמרת פולי לתאי HEK293 ו-HeLa, קיבלנו התפלגות תלת-ממדית של יחסי פלסמיד שונים (איור 5B-HEK תאים). Gam et al.10 דגמו תת-דגימה של התפלגות זו ביחסים שונים על ידי התחשבות בתאים במרחק אוקלידי מסוים מיחס של עניין; מרחק זה צריך להיות רחב מספיק כדי לכלול מספיק תאים כדי לאפשר תוצאות מובהקות סטטיסטית מהניתוח, אך צר מספיק כדי למנוע רעש מיותר מלכלול קבוצה רחבה מדי של יחסי רכיבים של שלושת החלקים. Gam et al.10 השתמשו באלגוריתם אופטימיזציה כדי לזהות את היחס בין החלקים שהגדילו את דיוק הסיווג המקסימלי עבור טרנספקציה משותפת (כלומר, תאי HeLa שעברו טרנספקציה הם חיוביים לביטוי פלט בעוד שתאי HEK שעברו טרנספקציה אינם). נמצא כי היחס האופטימלי בין החלקים הוא 10.9:1.5:1: Gal4-VP16:פלט:BM3R1; תאים שנדגמו סביב היחס האופטימלי בתוך כל מרחב הפולי-טרנספקציה מוצגים באיור 5C. תת-דגימה זו חזתה כי ביחס זה, למעגל המשותף יש ספציפיות של 91%, רגישות של 62% ודיוק של 77% בעת סיווג תאי HEK293 לעומת תאי HeLa (איור 5D). קו-טרנספקציה עם יחסי פלסמיד שנקבעו לאופטימליות זו הניבה תוצאות טובות עוד יותר: 99% ספציפיות, 68% רגישות ו-84% דיוק10. יתר על כן, היחסים הנחו את היישום של גרסת פלסמיד יחיד של המעגל, עם ביטוי יחסי מכוונן באמצעות מקדמים קטועים שונים ו- ORFs במעלה הזרם (uORFs), והניבו מעגל עם 91% ספציפיות, 90% רגישות ודיוק של 90%10. לפיכך, poly-transfection הוא כלי רב עוצמה כדי להנחות את התכנון של מסווגי תאים ומעגלי גנים באופן רחב יותר.
איור 1: השוואה בין טרנספקציה משותפת לפולי-טרנספקציה. (A,B) סקירה כללית והשוואה של מסירת פלסמיד עם טרנספקציה משותפת של שני פלסמידים ופולי-טרנספקציה של שני פלסמידים. עבור כל שיטת טרנספקציה, התרשים השמאלי ביותר מראה את היווצרותם של מתחמי טרנספקציה בין DNA טעון שלילית לבין שומנים טעונים חיובית. בדוגמאות אלה, כל פלסמיד צבעוני (כחול ואדום) מקודד ביטוי של חלבון פלואורסצנטי אחר. הדיאגרמה המרכזית מציגה דוגמאות של העברת פלסמיד לתאים וגם סכימה להתפלגויות הצפויות בהיסטוגרמה או בתרשים פיזור. עוצמת הצבע בהיסטוגרמה תואמת פלואורסצנטיות מצבע הפלסמיד המתאים. הדיאגרמה הימנית ביותר מציגה נתונים אמיתיים מתאים שעברו טרנספורמציה בכל שיטה נתונה. (A) בטרנספקציה משותפת עם שני פלסמידים שונים, שני הפלסמידים מעורבבים יחד לפני הוספת מגיב טרנספקציה, והתוצאה היא אריזה מתואמת מאוד של שני מיני הפלסמיד. בנתוני קו-טרנספקציה בפועל, תאים מציגים העברה מתואמת של שני הפלסמידים (מימין). (B) בפולי-טרנספקציה, כל קבוצה של פלסמידים המועברים במשותף המתאימים לחלק מעגל וסמן טרנספקציה מעורבבים עם מגיב הטרנספקציה בנפרד, והתוצאה היא קומפלקסים המכילים רק את הפלסמידים האלה (משמאל). בנתוני פולי-טרנספקציה בפועל, תאים חוקרים טווח רחב של מרחב ריכוז עם סטויכיומטריות פלסמיד רבות ושונות שנחקרו בו זמנית (מימין). נתון זה שונהמ-10. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: זרימת עבודה של פולי-טרנספקציה. שלב 1: הגדר את הבעיה. התחל עם מערכת עם מספר חלקי רכיבים שעבורם היחס האידיאלי בין חלקים אינו ידוע, ובחר יחס התחלתי בין חלקי רכיבים. שלב 2: צור את תערובות הטרנספקציה. כל תערובת טרנספקציה מכילה רכיב מעגל וסמן טרנספקציה פלואורסצנטי. כמות חלק המעגל המועבר לתא מתואמת עם הפלואורסצנטיות של הסמן. שלב 3: לדגור על התאים. בתהליך עבודה טיפוסי, אנו דוגרים על תאים במשך 48 שעות בין ציטומטריית טרנספקציה וזרימה. שלב 4: ציטומטריית זרימה. הפעל את הפקדים המתאימים, כפי שנדון בפרוטוקול, ולאחר מכן הפעל את הדגימות. שלב 5: ניתוח.השתמש בסמני הטרנספקציה כדי לסלק את התאים בהתאם לכמות או ליחסים של חלקים שהתא קיבל. השתמש בחלבוני הפלט כדי למדוד את ביצועי המעגל. מצא את הסלים/יחסים של חלקים הממטבים את ביצועי המעגל. שלב 6: חזור על הפעולה עם יחסי חלקים ממוטבים (אופציונלי). אם הפחים/היחסים האופטימליים הם ביחסים מוטים מאוד, ייתכן שהפולי-טרנספקציה של הפיילוט לא תצמצם את יחסי החלקים האופטימליים במדויק. חזור על הפולי-טרנספקציה עם יחסי חלקים מכווננים, כך שתא שקיבל כמות שווה מכל תערובת טרנספקציה מקבל כעת יחס קרוב לאופטימלי של חלקים, כפי שנקבע בסבב הקודם. נתון זה שונהמ-10. התמונה של אינקובטור שימשה מ Servier Medical Art ואת התמונה של ציטומטר מ BioRender. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תוצאות פולי-טרנספקציה חיוביות ושליליות מייצגות . (A) העברה משותפת מבוצעת היטב של שני כתבים פלואורסצנטיים, המראה מתאם הדוק. בסך הכל 20,000 תאים משורטטים גם כאן וגם ב-(B) לשם השוואה. זה רעיון טוב לבצע ניסוי קטן דומה של טרנספקציה משותפת של שני כתבים פלואורסצנטיים לפני תחילת ניסוי poly-transfection, כדי להבטיח כי פלסמידים מתואמים היטב בתוך תערובות transfection. (B) קו-טרנספקציה רועשת יותר: פלסמידים אינם מתואמים היטב בתוך כל תערובת טרנספקציה, מה שעלול לגרום לסמנים פלואורסצנטיים בפולי-טרנספקציה להיות סמן גרוע של יחסי פלסמיד. (C) תוצאות פולי-טרנספקציה מבוצעות היטב המראות ספירת תאים טובה, יעילות טרנספקציה ופיצוי. (D) ספירת תאים חיים נמוכה, שאינה מאפשרת תת-דגימה לפחים עם מספר תאים מובהק סטטיסטית. (E) יעילות טרנספקציה ירודה, שאינה מאפשרת תת-דגימה לפחים עם מספר תאים מובהק סטטיסטית. (F) היעדר פיצוי הולם, הגורם לנתונים פלואורסצנטיים להיות פרוקסי גרוע לכמות החלבון הפלואורסצנטי במערכת. השתמש בפקדי צבע יחיד כדי לקבוע מטריצת פיצוי ליניארית אידיאלית, והחל אותה על הנתונים לפני עיבוד נוסף. כל פקדי הצבע מומלצים גם בהתאם לבחירת התוכנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: השוואת פולי-טרנספקציה כנגד קו-טרנספקציה. (A) בטרנספקציה משותפת, ניתן לבדוק יחס אחד של מדכא תרגום L7Ae לפלסמידים של כתב פלואורסצנטי בכל באר ניסוי. (B) בפולי-טרנספקציה, יחסים רבים של L7Ae לכתבים יכולים להיבדק באותה באר. ראה טבלה 3 לפרטים על תערובות פלסמיד פולי-טרנספקציה. (ג,ד) Binning workflow להשוואת ביצועים של poly-transfection כנגד טרנספקציות משותפות מרובות. בסך הכל הוקצו 10 פחים במרווחים דו-מעריכיים לכל ממד סמן טרנספקציה, המעריכים את הרמות של כל אחד משני הפלסמידים. כאן, פחים המציינים רמות שונות של פלסמיד #2 מוצגים. בינינג בוצע הן על קבוצה שנאספה של 11 דגימות קו-טרנספקציה המשתרעות על יחסי פלסמיד שונים (C) והן על נתונים מפולי-טרנספקציה אחת, הכוללת כ-500,000 תאים כל אחד (D). הצבעים מתאימים לקבוצות של פחים המוגדרים על-ידי רמות גן 2 (TagBFP). (ה-ג) השוואת פולי-טרנספקציה כנגד טרנספקציה משותפת עבור מעגל מייצג. הפלואורסצנטיות החציונית של התפוקה הוערכה עבור התאים בכל פח והושוותה בין שיטות עבור המערכת המייצגת, דיכוי תרגומי L7Ae. (E) מבנים למדידת פעילות L7Ae. פלואורסצנטיות mKO2 משמשת כאומדן להעברת L7Ae (גן #1), בעוד שפלואורסצנטיות TagBFP משמשת כאומדן להעברת פלט mNeonGreen מוסדר (גן #2). (F) עקומות טיטרציה רב-ממדיות עבור L7Ae. כל שורה מייצגת את קבוצת הסלים ברמה אחת של TagBFP, כפי שמצוין ב- (C) ו- (D). קווים מלאים מציינים נתוני poly-transfection, ואילו קווים מקווקווים מציינים נתוני co-transfection. בכל רמה מאוגדת של פלסמיד כתב, תפוקת הכתב יורדת ככל שה-L7Ae עולה. (G) השוואה חזותית בין קו-טרנספקציה ופולי-טרנספקציה עבור מערכת L7Ae. כל נקודה מייצגת את התפוקה הנמדדת בסלים המתאימים למדידות פולי-טרנספקציה וקו-טרנספקציה, כאשר ערכים שקולים יותר קרובים יותר לקו האדום ביחס של 1:1. בסך הכל, ההבדלים שנצפו בין פולי-טרנספקציה לבין קו-טרנספקציה הנגזרים הם נמוכים, מה שמספק ביטחון באמינות שיטת הפולי-טרנספקציה. נתון זה שונהמ-10. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ניתוח נתונים עבור פולי-טרנספקציה. ב poly-transfection, תאים ניתן לקבץ לפחים או פרוסות לניתוח. איור 4 מציג צורה של ניתוח שבו התאים נקשרים לפרוסות התואמות לרמות של רכיב מערכת, כגון רמת פלסמיד מדווח, אשר יכול להיות שימושי להתאמת מודלים ולהבנת תגובות מינון. אסטרטגיה שימושית נוספת היא לנתח את ביצועי המעגלים ביחסים שונים של רכיבי מעגל. (A) דיאגרמה של מעגל מסווג לאופטימיזציה. רמות TagBFP, NeonGreen ו-iRFP720 תואמות לרמות BM3R1, mKO2 פלט ו-Gal4-VP16, בהתאמה. ראה טבלה 4 לפרטים על תערובות פלסמיד פולי-טרנספקציה. (B) התקנה ניסיונית של תערובות פולי-טרנספקציה. (C) נתוני ציטומטריית זרימה שנאספו מפולי-טרנספקציה עם המעגל ב-(A). הרמות של כל אחד משלושת החלבונים הפלואורסצנטיים כתוצאה מפולי-טרנספקציה מעגלית לתאי HEK, מציגות את הטווח הרחב של יחסי רכיבי המעגלים הקיימים בנתונים. תוצאות דומות התקבלו מהעברת מעגלים הן בתאי HEK והן בתאי HeLa. (D) תת-דגימה של פולי-טרנספקציה ביחס מסוים. כדי לנתח את הנתונים, סרקנו מספר רב של יחסים בין רכיבי המעגל וקבענו ביצועי מסווג בכל יחס. כדוגמה, אנו מראים כאן יחס מסוים אחד שהוכיח ביצועים טובים (Gal4-VP16 = 435 ng של DNA, reporter = 60 ng, ו- BM3R1 = 40 ng). מסומן בכחול הוא היחס המקביל של הסמנים הפלואורסצנטיים עבור שלושת רכיבי המעגל השונים. לאחר מכן, דגמנו את הנתונים על ידי התחשבות רק בנקודות במרחק אוקלידי מסוים ממסלול הפלואורסצנטיות. דגמנו תאים באותו מסלול הן מטרנספקציות HEK והן מטרנספקציות HeLa. (E) השוואה של ביצועי מעגלים באותו מסלול בתאי HEK ו-HeLa. על ידי השוואת נתונים סטטיסטיים כגון רגישות, ספציפיות ודיוק של סיווג על פני יחסים רבים, ניתן למטב את יחסי הרכיבים ליצירת מעגל גנטי אידיאלי. נתון זה שונהמ-10. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| מורכב | ng L7Ae פלסמיד | נג כתב פלסמיד | OptiMEM (μL) | P3000 (μL) | Lipo 3000 (μL) |
| 1 | 250 | 75 | 1.5 | 1.5 | |
| 2 | 250 | 75 | 1.5 | 1.5 |
טבלה 3: תערובות טרנספקציה המתאימות לאיור 4. תאי HEK293 היו נגועים בתערובות טרנספקציה אלה בבאר אחת של צלחת בת 24 בארות.
| מורכב | ng BM3R1 פלסמיד | ng Gal4-VP16 פלסמיד | נג כתב פלסמיד | OptiMEM (μL) | P3000 (μL) | Lipo 3000 (μL) |
| 1 | 900 | 75 | 1.5 | 1.5 | ||
| 2 | 900 | 75 | 1.5 | 1.5 | ||
| 3 | 900 | 75 | 1.5 | 1.5 |
טבלה 4: תערובות טרנספקציה המתאימות לאיור 5. HEK293 ותאי HeLa היו כל אחד פולי-טרנספקט עם תערובות טרנספקציה אלה בבאר אחת כל אחד של צלחת 6 בארות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטות אב טיפוס מהירות כגון תכנון בעזרת מחשב (CAD), breadboarding והדפסה תלת-ממדית חוללו מהפכה בתחומי המכניקה, החשמל וההנדסה האזרחית. היכולת לחפש במהירות פתרונות אפשריים רבים לאתגר נתון מאיצה מאוד את ההתקדמות בתחום. אנו מאמינים כי פולי-טרנספקציה היא טכנולוגיה מקבילה להנדסה ביולוגית, המאפשרת אב טיפוס מהיר של מעגלים גנטיים. בנוסף, טכנולוגיות אב טיפוס מהירות אחרות דורשות איטרציה רציפה מעשית של פתרונות אפשריים מרובים, בעוד שפולי-טרנספקציה מסוגלת לחקור פתרונות רבים בו זמנית. פולי-טרנספקציה מאפשרת לבדוק מספר רב של שילובים של יחסי רכיבי מעגלים גנטיים בבאר אחת ושימשה לאופטימיזציה של מספר מעגלים גנטיים שפורסמו10,11,13. פרוטוקול הניסוי הוא הרחבה פשוטה של טרנספקציה משותפת סטנדרטית, המאפשרת אימוץ פשוט על ידי חוקרי תאי יונקים רבים. באופן כללי, ניתן לראות הסכמה קרובה מאוד בין תוצאות פולי-טרנספקציה ו-co-transfection10 (דוגמה לכך היא איור 4). לפיכך, פולי-טרנספקציה יכולה לשמש ברוב המקרים שבהם יחסי פלסמיד הם titrated בתוך תערובות co-transfection תפוקות נמדדים ברמת התא היחיד.
המורכבות וקנה המידה של פולי-טרנספקציה גדלים עם המורכבות של מעגלים גנטיים כדי לייעל. ככל שמספר הממדים לניתוח גדל, היחסים הקומבינטוריים של חלקים שונים ומספר התאים הדרושים לניתוחם גדלים באופן אקספוננציאלי. לדוגמה, כדי למטב את המסווג באיור 5, תאים עברו טרנספורמציה של צלחת של 6 בארות, ונתונים נאספו על לפחות 1.5 מיליון תאים חיים. ביצענו גם אופטימיזציה של מסווג עם רכיב מעגל נוסף 10, מה שמחייב טרנספקציה בקנה מידה של צלחת10 ס"מ ואיסוף של מיליוני תאים. בקנה מידה זה ומעלה, ייצור הדנ"א גוזל זמן, וריאגנטים טרנספקציה הם יקרים. עם זאת, פולי-טרנספקציה משתמשת בסדרי גודל פחות תאים, דנ"א וריאגנטים של טרנספקציה מאשר בדיקת מספר דומה של שילובי יחס רכיבי מעגל בבארות בודדות. בנוסף, נחסך זמן ניכר על ידי ביצוע סדרי גודל פחות תערובות טרנספקציה.
פולי-טרנספקציה מאפשרת שיטות ניתוח מתקדמות לנתוני ציטומטריית זרימה. שתי הגישות העיקריות הן: (1) קשירת תאים בהתאם לביטוי של כל סמן טרנספקציה ו-(2) חילוץ תאים ביחסים מוגדרים של סמני טרנספקציה, ובכך לדמות טרנספקציה משותפת. הראשון בוחר תאים עם שילוב ספציפי של מינון DNA עבור כל קומפלקס (ולכן כל חלק), ומניב פונקציות העברת קלט-פלט. האחרון בוחר תאים ביחס מסוים של מינוני DNA עבור כל חלק, המדמה co-transfection ביחס כזה של מסות DNA פלסמיד. התוויית רמת הביטוי של מדווח(י) פלט המעגלים בבחירות התת-דגומות נותנת מדד לפלט ברמות או ביחסים המוגדרים של הקלט. עבור אופטימיזציה של מעגלים, ניתן לזהות את הסלים/יחסים בעלי הביצועים הטובים ביותר כפי שהוגדרו על ידי מטרת המעגל - במקרה של מסווגי תאים, אלה הם הסלים/יחסים שבהם המעגל מופעל בסוג תא היעד ו- OFF בסוגי תאים שאינם תאי יעד. בעת בחירת גודל פח, יש לקחת בחשבון את רמת הדיוק הנדרשת, כמו גם את מספר התאים לכל פח. פחים קטנים יותר מתמקדים בשילוב האידיאלי של רכיבי מעגל בצורה מדויקת יותר, אך אם לפח יש מעט מדי תאים, הוא יכול להכניס רעש לא רצוי למדידות.
שיפורים עתידיים בניתוח חישובי של נתוני פולי-טרנספקציה עשויים להקל על אופטימיזציה אפילו עם כיסוי תאים נמוך לכל בין/יחס. נכון לעכשיו, אנו לא כוללים נתונים מסלים עם פחות מסף מוגדר של תאים (לדוגמה, 10) כדי למנוע מדידות רועשות מדי. בשילוב עם מדידות חוזרות ונשנות, הדבר מאפשר חישובים מדויקים ומדויקים יותר של עקומות מנה-תגובה, דיוקי סיווג ומדדים אחרים המוגדרים על בסיס לכל סל. עם זאת, כל תא בפולי-טרנספקציה יכול להיחשב כניסוי עצמאי, המודד ברזולוציה עדינה את תפוקות המעגל ברמה מדויקת של קלט. בהתחשב בכך, מודלים מכניסטיים ופנוטיפיים של תגובות מינון ואופטימיזציות מעגלים יכולים להתאים ישירות להתפלגות ביטוי הגנים מכל סמן ומדווח, ולא לסטטיסטיקה המסכמת שלהם10. זה מאפשר מדידות חזקות יותר ומנצל את נקודות הנתונים הבודדות הרבות שנאספו בכל ניסוי. גישות מידול כאלה יכולות לפיכך להניב אפיון ואופטימיזציה של מעגלים חזויים אפילו עם פולי-טרנספקציות רב-ממדיות שנדגמו בדלילות. יתר על כן, ניתן להשתמש בשיטות למידת מכונה כגון מתודולוגיית משטח תגובה ורגרסיית יער אקראית כדי לנתח נתונים דלילים יחסית, בעלי ממדים גבוהים10.
גישה חלופית לפולי-טרנספקציות גדולות יותר ויותר היא לייעל מעגלים ברצף באמצעות היררכיות של פולי-טרנספקציות. בגישה זו, ראשית, פולי-טרנספקציה משמשת לאופטימיזציה של מודול המורכב מתת-קבוצה של רכיבים גנטיים בתוך מעגל גדול יותר. לאחר מכן, מודולים ממוטבים אלה מועברים כתערובות פולי-טרנספקציה נפרדות, מה שמאפשר למצוא את היחס/מינון האופטימלי של כל מודול מעגל. גישה זו משתמשת במספר נמוך משמעותית של תאים, דנ"א וריאגנטים טרנספקציה. עם זאת, קבוצות רכיבים אינן בהכרח מודולריות ביחס לרכיבים אחרים, ולכן יחס אופטימלי של חלקי רכיבים במודול הנמדד בבידוד יכול להיות תת-אופטימלי בהקשר של מעגל גדול יותר8.
שיטות פולי-טרנספקציה מוגבלות גם על ידי תצורת הלייזר/מסנן של ציטומטר הזרימה המשמש לאיסוף נתונים. בנוסף לתפוקות פלואורסצנטיות מדודות, כל תערובת טרנספקציה מכילה סמן חלבון פלואורסצנטי. לכן, זה קריטי לבחור חלבונים פלואורסצנטיים שניתן לפצות היטב על הציטומטר. בעבר ניתחנו באופן שיטתי את הדימום של פאנל של 22 חלבונים פלואורסצנטיים על ציטומטר זרימה של חמישה לייזרים (BD LSRFortessa), ומצאנו כי ניתן להשתמש בקבוצה של סיריוס, TagBFP, mNeonGreen, mKO2 ו- iRFP720 יחד ולפצות היטב ללא בעיות משמעותיות10. עם זאת, אופטימיזציה של מעגלים גדולים יותר עשויה לדרוש שיטות ציטומטריה מתקדמות, כגון ציטומטריה ספקטרלית כדי להפריד חלבונים פלואורסצנטיים עם ספקטרום חופף יותר, אשר המעבדה שלנו מבצעת כעת אופטימיזציה עם עד שמונה חלבונים פלואורסצנטיים. מסדי נתונים כגון מסד הנתונים של חלבונים פלואורסצנטיים (https://www.fpbase.org) שימושיים לבחירת חלבונים פלואורסצנטיים בעלי חפיפה ספקטרלית מסוימת. עם זאת, תהליך זה יכול להיות מסובך על ידי גורמים שונים, שחלקם ספציפיים לציטומטרים מסוימים. לדוגמה, השימוש בחלבונים אדומים מסוימים כמו tdTomato עלול לגרום לדמם לא רצוי לתעלות כחולות רק בתצורות לייזר/מסנן מסוימות10. בנוסף, מספר חלבונים אדומים קיצוניים הראו קשרים לא ליניאריים בין מינון הדנ"א לבין תפוקת הפלואורסצנטיות10, מה שמפחית את השימוש בהם כסמנים יעילים למינון הדנ"א.
עבור עקביות על פני ניסויים המבוצעים עם מספר משתנה של קומפלקסים (אחד, שניים, שלושה, וכו '), כדאי להשתמש באותה כמות חלקית של פלסמיד לכל תערובת transfection. לדוגמה, אם בודקים מערכת של שלושה גנים כאשר כל גן מקודד באחד משלושה פלסמידים (A, B ו-C), ניתן לבצע טרנספורמציה משותפת של פלסמידים במעגל ביחס של 1:1:1 יחד עם יחס שווה של פלסמיד המקודד סמן טרנספקציה. זה יהפוך כל פלסמיד רבע מהמסה הכוללת של התערובת, ובכך כרבע מהמסה של כל קומפלקס טרנספקציה שנוצר. כאשר מדביקים פולי-טרנספורמציה A, B ו-C בקומפלקסים נפרדים עם הכתבים שלהם, במקום לערבב את הפלסמידים 1:1 עם כתבים או לשמור על מסת הדנ"א הכוללת שלהם, עקבי יותר לשמור על כל פלסמיד ברבע מהמסה של כל קומפלקס, כאשר דנ"א מילוי תופס את המסה הנותרת (ראו טבלה 5 לדוגמה). הסיבה לכך היא שהתפלגות ביטוי הגנים בין תאים נגועים תלויה פחות במסה הכוללת של הדנ"א המועברת בקומפלקסים, ויותר בכמות החלקית של הדנ"א בכל קומפלקס10. אם רוצים יחסים שאינם 1:1:1, חשב את השברים המתאימים של מסת הדנ"א הכוללת בתערובת הטרנספקציה עבור כל חלק. לדוגמה, טבלה 5 [למטה] מציגה יחס של 1:1:4.
| שיטת | מורכב | ng A (שבר) | ng B (שבר) | ng C (שבר) | ng כתב (שבר) | ng מילוי DNA (שבר) | סה"כ (ng) |
| טרנספקציה משותפת | 1 | 150 (¼) | 150 (¼) | 150 (¼) | 150 (¼) | 0 (0) | 600 |
| פולי-טרנספקציה | 600 | ||||||
| → | 1 | 50 (¼) | 50 (¼) | 100 (½) | 200 | ||
| → | 2 | 50 (¼) | 50 (¼) | 100 (½) | 200 | ||
| → | 3 | 50 (¼) | 50 (¼) | 100 (½) | 200 | ||
| טרנספקציה משותפת | 1 | 75 (⅛) | 75 (⅛) | 300 (½) | 150 (¼) | 0 (0) | 600 |
| פולי-טרנספקציה | 600 | ||||||
| → | 1 | 25 (⅛) | 50 (¼) | 125 (⅝) | 200 | ||
| → | 2 | 25 (⅛) | 50 (¼) | 125 (⅝) | 200 | ||
| → | 3 | 100 (½) | 50 (¼) | 50 (¼) | 200 |
טבלה 5: דוגמאות לשימוש בדנ"א מילוי לעקביות בניסויי קו-טרנספקציה ופולי-טרנספקציה. כאן, שתי דוגמאות גנריות של הדבקה משותפת של שלושה פלסמידים עם אותה כמות של DNA מילוי מוצג. בדוגמה העליונה, הפלסמידים כולם במסות שוות. בדוגמה התחתונה, פלסמיד אחד מועבר במסה גבוהה יותר בהשוואה לאחרים. החלק של הדנ"א הכולל שישמש בקומפלקס קו-טרנספקציה מומר לקומפלקסים של פולי-טרנספקציה, כאשר הכמות הנותרת של דנ"א (עד לכמות הכוללת עבור כל קומפלקס, שהיא קבועה ושווה בין קומפלקסים) מורכבת מדנ"א מילוי.
המטרה הכוללת של DNA מילוי היא לשמור על מינונים דומים של פלסמידים לכל תא, ללא קשר למספר תערובות הטרנספקציה הייחודיות. כקירוב גס של עיקרון זה, הפרדת שלושה פלסמידים לשלוש תערובות תוך שמירה על אותה מסת DNA של כל אחד מהם (והיחס המתאים של מגיב טרנספקציה) מפחיתה את אחוז התאים המקבלים קומפלקס נתון בשליש בהשוואה לתערובת אחת המכילה את כל שלושת הפלסמידים. עם זאת, כל תא נגוע מקבל לאחר מכן מינון גנים גבוה פי ~ 3. לפיכך, הפחתת הכמות היחסית של הפלסמידים בלבד ללא DNA מילוי אינה מספיקה כדי לשמור על מינונים עקביים של פלסמיד, שכן זה פשוט מקטין את יעילות הטרנספקציה מבלי לשנות את התפלגות הביטוי הבסיסית בין התאים הנגועים10. מצד שני, דנ"א מילוי מאפשר להתאים את מינון הדנ"א מבלי להשפיע על יעילות הטרנספקציה הכוללת (אם כי תאים נגועים הניתנים לזיהוי עשויים לרדת עקב אות נמוך יותר)10. בעקבות הקירוב הגולמי לעיל, הפחתת חלק הדנ"א בתערובות הפולי-טרנספקציה לשליש והוספת דנ"א מילוי שומרת על מינוני הגנים היחסיים בהשוואה לטרנספקציה המשותפת המקורית. לפיכך, מילוי DNA מבטיח היווצרות מורכבת יעילה ומדויקת.
כדי לשנות את טווח הביטוי של גן מעניין המכוסה על ידי המדווח שלו, ניתן לכוונן את החלק של כל פלסמיד בדיקה ו / או מקדמים המשמשים להנעת הגן שם ביחס למדווח. אם חלק הוא חזק/פעיל מאוד במינונים נמוכים של דנ"א, שימוש במקטע דנ"א נמוך יותר יכול לעזור למרכז את הטווח הדינמי של החלק באמצע ההתפלגות הפלואורסצנטית של המדווח בתאים נגועים. באופן דומה, עבור חלקים חלשים/פעילים רק במינונים גבוהים של DNA, שימוש בחלק גבוה יותר יכול להיות שימושי. עם זאת, יש להקפיד על כוונון כזה, שכן הפחתת שברי דנ"א יותר מדי מגדילה את הסטוכסטיות של המסירה לתאים בהשוואה לכתב10, ורמות ביטוי גנים גבוהות יכולות להעמיס על מכונות ביטוי גנים תאיות12,14. כדי למנוע סטוכסטיות, ובמקרים שבהם כל גן מועבר לתאים ביחס קבוע (למשל, אם המעגל אמור להיווצר כווקטור לנטי יחיד, PiggyBac או Landing Pad), ניתן לכוונן את הביטוי היחסי של כל גן באמצעות מקדמים חזקים / חלשים יותר, uORFs קטנים18, ו / או miSFITs19.
למרות שהפרוטוקול מתאר טכניקת טרנספקציה הפוכה, פולי-טרנספקציה אפשרית גם עם טרנספקציה קדימה. בטרנספקציה הפוכה, התאים נזרעים בו זמנית ונגועים; בטרנספקציה קדימה, התאים עוברים טרנספקציה ~ 24 שעות לאחר הציפוי הראשון בכמחצית מהצפיפות שתשמש בטרנספקציה הפוכה (כדי לאפשר חלוקת תאים בזמן הטרנספקציה). באופן כללי, טרנספקציה הפוכה יעילה יותר אך גם רעילה יותר, ושמנו לב לכמה הבדלים בצורת התפלגות הטרנספקציה בהתבסס על המגיב, זמן הטרנספקציה וקו התא. לפיכך, שיטת הטרנספקציה הנבחרת צריכה להיות מותאמת לכל קו תא כדי למקסם את מספר התאים הנגועים ואת הכיסוי של מרחב הריכוז הרב-ממדי של מינוני פלסמיד לתא.
בסך הכל, פולי-טרנספקציה מאפשרת אופטימיזציה מהירה של מעגלים גנטיים של יונקים. שילובים יחסיים אפשריים רבים של רכיבי מעגל ניתנים לבדיקה בקלות בבאר אחת. בנוסף, מכיוון שפולי-טרנספקציה מכילה יותר מידע על הרמות של כל חלק במערכת מאשר טרנספקציה קונבנציונלית, היא נמצאה בעלת ערך רב לאפיון ההתנהגות של חלקים גנטיים שונים10,11,12,13. אימוץ פולי-טרנספקציה צפוי להאיץ את קצב הפיתוח של מעגלי גנים חדשים ומשופרים לשימוש בתאי יונקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ר.ו. הוא מייסד שותף של Strand Therapeutics ו-Replay Bio; ר.ו. ור.ג. הגישו פטנט זמני הקשור למסווג סוג תא.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לחברי מעבדת וייס לשעבר שהובילו או תרמו לפיתוח שיטת הפולי-טרנספקציה ויישומה על מסווגי תאים: ג'רמי גאם, בר דיאנדרת' וג'ין הא; חברי מעבדה נוספים של וייס שתרמו לפיתוח/אופטימיזציה נוספים של השיטה: וונלונג שו, ליי וואנג וכריסטיאן קובה-סמאניגו; פרופ' ג'וש לאונרד וחברי הקבוצה, כולל פטריק דונהיו והיילי אדלשטיין, על בדיקת פולי-טרנספקציה ומתן משוב; ופרופ' ניקה שכיבה, שהזמינה את כתב היד הזה ונתנה משוב. ברצוננו להודות גם למכונים הלאומיים לבריאות [R01CA173712, R01CA207029, P50GM098792]; הקרן הלאומית למדע [1745645]; מענק תמיכה (ליבה) של מרכז הסרטן [P30CCA14051, בחלקו] מה- NCI, ומהמכונים הלאומיים לבריאות [P50GM098792] למימון עבודה זו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15mL Corning Falcon conical tubes | ThermoFisher Scientific | 14-959-53A | |
| 24-well petri dish | Any company of choice | (Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free) | |
| Bovine serum albumin | NEB | B9000S | |
| Centrifuge | Any company of choice | Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX2000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | |
| Cytoflow | Non-commercial software package | https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/# | |
| DMEM | VWR | 10-013-CV | Use the correct media for your cell type |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 03690-100ML | |
| Fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F4135 | |
| HEK cells | ATCC | CRL-1573 | Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently. |
| HeLa cells | ATCC | CRL-12401 | Use the relevant cell type for your experiments. |
| Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer | ThermoFisher Scientific | L3000001 | Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent |
| LSRFortessa flow cytometer | BD Biosciences | N/A | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
| Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | Any company of choice | ||
| Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985070 | reduced serum medium |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Rainbow calibration beads | Spherotech | URCP-100-2H | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Trypsin | VWR | 25-053-CI |
References
- Prochazka, L., Benenson, Y., Zandstra, P. W. Synthetic gene circuits and cellular decision-making in human pluripotent stem cells. Current Opinion in Systems Biology. 5, 93-103 (2017).
- Sayeg, M. K., et al. Rationally designed microRNA-based genetic classifiers target specific neurons in the brain. ACS Synthetic Biology. 4 (7), 788-795 (2015).
- Zhen, X., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. Multi-Input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells. Science. 333 (6047), 1307-1311 (2011).
- Nissim, L., et al. Synthetic RNA-based immunomodulatory gene circuits for cancer immunotherapy. Cell. 171 (5), 1138-1150 (2017).
- Nissim, L., Bar-Ziv, R. H. A tunable dual-promoter integrator for targeting of cancer cells. Molecular Systems Biology. 6, 444 (2010).
- Mohammadi, P., Castel, S. E., Brown, A. A., Lappalainen, T. Quantifying the regulatory effect size of cis-acting genetic variation using allelic fold change. Genome Research. 27 (11), 1872-1884 (2017).
- Prochazka, L., et al. Discrete-to-analog signal pluripotent stem cells conversion in human. BioRxiv. , (2021).
- Del Vecchio, D. Modularity, context-dependence, and insulation in engineered biological circuits. Trends in Biotechnology. 33 (2), 111-119 (2015).
- Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell. Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).
- Gam, J. J., DiAndreth, B., Jones, R. D., Huh, J., Weiss, R. A 'poly-transfection' method for rapid, one-pot characterization and optimization of genetic systems. Nucleic Acids Research. 47 (18), 106 (2019).
- Jones, R. D., et al. Robust and tunable signal processing in mammalian cells via engineered covalent modification cycles. Nature Communications. 13 (1), 1720 (2022).
- Jones, R. D., et al. An endoribonuclease-based feedforward controller for decoupling resource-limited genetic modules in mammalian cells. Nature Communications. 11 (1), 5690 (2020).
- DiAndreth, B., Wauford, N., Hu, E., Palacios, S., Weiss, R. PERSIST platform provides programmable RNA regulation using CRISPR endoRNases. Nature Communications. 13 (1), 2582 (2022).
- Frei, T., et al. Characterization and mitigation of gene expression burden in mammalian cells. Nature Communications. 11 (1), 4641 (2020).
- Beal, J., Weiss, R., Yaman, F., Adler, A., Davidsohn, N. A method for fast, high-precision characterization of synthetic biology devices. Computer Science and Artificial Intelligence Laboratory Technical Report. Massachusetts institute of technology. , Cambridge. MIT-CSAIL-TR-2012-008 (2012).
- Beal, J., et al. Meeting measurement precision requirements for effective engineering of genetic regulatory networks. ACS Synthetic Biology. 11 (3), 1196-1207 (2022).
- Teague, B. Cytoflow: A Python toolbox for flow cytometry. bioRxiv. , (2022).
- Ferreira, J. P., Overton, K. W., Wang, C. L. Tuning gene expression with synthetic upstream open reading frames). Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11284-11289 (2013).
- Michaels, Y. S., et al. Precise tuning of gene expression levels in mammalian cells. Nature Communications. 10 (1), 818 (2019).
- Saito, H., et al. Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch. Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).
- Wroblewska, L., et al. Mammalian synthetic circuits with RNA binding proteins for RNA-only delivery. Nature Biotechnology. 33 (8), 839-841 (2015).
- Wagner, T. E., et al. Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells. Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043-1050 (2018).
- Sekuklu, S. D., Donoghue, M. T. A., Spillane, C. miR-21 as a key regulator of oncogenic processes. Biochemical Society Transactions. 37, 918-925 (2009).
- Stanton, B. C., et al. Genomic mining of prokaryotic repressors for orthogonal logic gates. Nature Chemical Biology. 10 (2), 99-105 (2014).
- Stanton, B. C., et al. Systematic transfer of prokaryotic sensors and circuits to mammalian cells. ACS Synthetic Biology. 3 (12), 880-891 (2014).
