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Bioengineering

Desarrollo rápido de circuitos de identificación del estado celular con politransfección

Published: February 24, 2023 doi: 10.3791/64793
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 1,3
1Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2School of Biological Engineering, University of British Columbia, 3Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology

Summary

Los circuitos genéticos complejos requieren mucho tiempo para diseñar, probar y optimizar. Para facilitar este proceso, las células de mamíferos se transfectan de una manera que permite la prueba de múltiples estequiometrías de los componentes del circuito en un solo pozo. Este protocolo describe los pasos para la planificación experimental, la transfección y el análisis de datos.

Abstract

Los circuitos genéticos de mamíferos han demostrado el potencial para detectar y tratar una amplia gama de estados de enfermedad, pero la optimización de los niveles de los componentes del circuito sigue siendo un desafío y requiere mucha mano de obra. Para acelerar este proceso, nuestro laboratorio desarrolló la politransfección, una extensión de alto rendimiento de la transfección tradicional de mamíferos. En la politransfección, cada célula de la población transfectada esencialmente realiza un experimento diferente, probando el comportamiento del circuito en diferentes números de copias de ADN y permitiendo a los usuarios analizar un gran número de estequiometrías en una reacción de un solo recipiente. Hasta ahora, se han demostrado politransfecciones que optimizan las proporciones de circuitos de tres componentes en un solo pocillo de células; En principio, el mismo método se puede utilizar para el desarrollo de circuitos aún más grandes. Los resultados de la politransfección se pueden aplicar fácilmente para encontrar proporciones óptimas de ADN a cotransfecto para circuitos transitorios o para elegir niveles de expresión para componentes de circuitos para la generación de líneas celulares estables.

Aquí, demostramos el uso de la politransfección para optimizar un circuito de tres componentes. El protocolo comienza con los principios de diseño experimental y explica cómo la politransfección se basa en los métodos tradicionales de cotransfección. A continuación, se lleva a cabo la politransfección de células y seguida de citometría de flujo unos días después. Finalmente, los datos se analizan examinando cortes de los datos de citometría de flujo de una sola célula que corresponden a subconjuntos de células con ciertas proporciones de componentes. En el laboratorio, la politransfección se ha utilizado para optimizar clasificadores celulares, controladores de retroalimentación y feedforward, motivos biestables y muchos más. Este método simple pero poderoso acelera los ciclos de diseño para circuitos genéticos complejos en células de mamíferos.

Introduction

El campo de la biología sintética de mamíferos ha progresado rápidamente, desde el desarrollo de partes simples de detección y respuesta en líneas celulares cultivadas hasta la optimización de redes complejas de genes para abordar los desafíos del mundo real en diagnóstico y terapéutica1. Estos sofisticados circuitos son capaces de detectar entradas biológicas desde perfiles de microARN hasta citoquinas y fármacos de moléculas pequeñas, e implementar circuitos de procesamiento lógico que incluyen transistores, filtros de paso de banda, interruptores de palanca y osciladores. También han mostrado resultados prometedores en modelos animales de enfermedades como el cáncer, la artritis, la diabetes y muchos más 1,2,3,4,5. Sin embargo, a medida que crece la complejidad de un circuito, optimizar los niveles de cada uno de sus componentes se vuelve cada vez más desafiante.

Un tipo particularmente útil de circuito genético es un clasificador celular, que puede programarse para detectar y responder a los estados celulares. La producción selectiva de proteínas o salidas de ARN en estados celulares específicos es una herramienta poderosa para guiar y programar la diferenciación de células y organoides, identificar y destruir células enfermas y/o tipos de células indeseables, y regular la función de las células terapéuticas 1,2,3,4,5 . Sin embargo, la creación de circuitos en células de mamíferos que puedan clasificar con precisión los estados celulares de múltiples especies celulares de ARN y / o proteínas ha sido muy desafiante.

Uno de los pasos más lentos del desarrollo de un circuito de clasificación celular es optimizar los niveles de expresión relativos de los genes componentes individuales, como sensores y factores de procesamiento, dentro del circuito. Para acelerar la optimización de circuitos y permitir la construcción de circuitos más sofisticados, trabajos recientes han utilizado modelos matemáticos de circuitos clasificadores celulares y sus componentes para predecir composiciones y topologías óptimas 6,7. Si bien esto ha mostrado resultados poderosos hasta ahora, el análisis matemático está limitado por la necesidad de caracterizar sistemáticamente el comportamiento de entrada-salida de los genes componentes en el circuito, lo que lleva mucho tiempo. Además, una miríada de problemas dependientes del contexto pueden surgir en circuitos genéticos complejos, haciendo que el comportamiento de un circuito completo desafíe las predicciones basadas en caracterizaciones de partes individuales 8,9.

Para desarrollar y probar más rápidamente circuitos complejos de mamíferos, como los clasificadores de estado celular, nuestro laboratorio desarrolló una técnica llamada politransfección10, una evolución de los protocolos de cotransfección de plásmidos. En la cotransfección, múltiples especies de ADN plásmido se complejan junto con un reactivo lipídico o polimérico cargado positivamente, y luego se entregan a las células de manera correlacionada (Figura 1A). En la politransfección, los plásmidos se complejan por separado con el reactivo, de modo que el ADN de cada complejo de transfección se entrega a las células de manera descorrelacionada (Figura 1B). Usando este método, las células dentro de la población transfectada están expuestas a numerosas combinaciones de proporciones de dos o más cargas útiles de ADN que transportan diferentes componentes del circuito.

Para medir las proporciones de los componentes del circuito entregados a cada célula, cada complejo de transfección dentro de una politransfección contiene un reportero fluorescente expresado constitutivamente que sirve como un proxy para la absorción celular del complejo. El ADN de relleno que no contiene ningún elemento activo dentro de una célula de mamífero se utiliza para ajustar la cantidad relativa del reportero fluorescente y los componentes del circuito entregados a una célula en un solo complejo de transfección y se discute con más detalle en la discusión. Un ejemplo de ADN de relleno utilizado en el laboratorio de Weiss es un plásmido que contiene una secuencia terminadora, pero no promotor, secuencia codificante, etc. Las células con diferentes proporciones de componentes del circuito se pueden comparar para encontrar proporciones óptimas para la función del circuito génico. Esto a su vez produce predicciones útiles para elegir promotores y otros elementos del circuito para lograr niveles óptimos de expresión génica cuando se combinan componentes del circuito en un solo vector para la integración genética (por ejemplo, un lentivirus, transposón o plataforma de aterrizaje). Por lo tanto, en lugar de elegir relaciones entre los componentes del circuito basadas en la intuición o mediante un proceso de prueba y error que consume mucho tiempo, la politransfección evalúa una amplia gama de estequiometrías entre partes genéticas en una reacción de un solo bote.

En nuestro laboratorio, la politransfección ha permitido la optimización de muchos circuitos genéticos, incluidos clasificadores celulares, controladores de retroalimentación y feedforward, y motivos biestables. Este método simple pero poderoso acelera significativamente los ciclos de diseño para circuitos genéticos complejos en células de mamíferos. Desde entonces, la politransfección se ha utilizado para caracterizar varios circuitos genéticos para revelar sus funciones multidimensionales de transferencia de entrada-salida a alta resolución 10, optimizar una topología de circuito alternativo para la clasificación del estado celular11 y acelerar varios proyectos publicados 12,13 y en curso.

Aquí describimos y describimos el flujo de trabajo para usar la politransfección para optimizar rápidamente un circuito genético (Figura 2). El protocolo muestra cómo generar datos de politransfección de alta calidad y evitar varios errores comunes en el protocolo de politransfección y el análisis de datos (Figura 3). Luego demuestra cómo usar la politransfección para caracterizar componentes de circuitos simples y, en el proceso, comparar los resultados de la politransfección con la cotransfección (Figura 4). Finalmente, los resultados de la politransfección muestran una optimización del circuito clasificador de cáncer (Figura 5).

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Protocol

NOTA: La Tabla 1 y la Tabla 2 sirven como referencias significativas para este protocolo. La Tabla 1 muestra la escala de reactivos para las reacciones, y la Tabla 2 muestra la aritmética de la relación de ADN para un ejemplo de politransfección descrita en el protocolo (mitad superior) y para un posible experimento de seguimiento (mitad inferior).

1. Preparación de células para la transfección

  1. Asegúrese de que el cultivo de células de riñón embrionario humano (HEK293) sea 60% -80% confluente antes de iniciar el protocolo. Para ello, sembrar 1 x 106 células en un cultivo de tejido de 100 mm x 15 mm en placa de Petri 2 días antes, e incubar a 37 °C con 5% deCO2.
    NOTA: Aunque nuestro protocolo se centra en las células HEK293, otros tipos de células pueden ser sustituidas.
  2. Prepare los medios y las células para las transfecciones como se describe a continuación.
    1. Precaliente al menos 20 ml de una solución del medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de aminoácidos no esenciales (NEAA; ver Tabla de materiales) a 37 °C. Precaliente al menos 2,4 ml de tripsina y 2,4 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 37 °C también. Precalentamiento reducido del medio sérico a ~16 °C.
      NOTA: Todo el trabajo de cultivo de tejidos debe realizarse con cuidado en un gabinete de bioseguridad.
  3. Vuelva a suspender las células en la solución DMEM como se describe a continuación.
    1. Aspirar y desechar los medios actuales. Dispense 2 ml de PBS en el cultivo celular HEK293 para lavar las células. Aspirar y desechar el PBS.
    2. Dispensar 2 ml de tripsina en el cultivo celular HEK293. Coloque la placa de Petri en una incubadora a 37 °C durante 3 minutos o hasta que las células ya no se adhieran a la placa. Devuelva el plato al gabinete de bioseguridad y diluya la solución celular dispensando 8 ml de solución DMEM en la placa.
    3. Mezcle la solución pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo varias veces. Aspirar todos los medios y colocarlos en un tubo cónico de 15 ml.
  4. Centrifugar las células a 300 x g durante 3 min para granularlas. Aspirar el medio (teniendo cuidado de no aspirar las células) y desecharlo. Resuspender las células en 5 ml de solución DMEM, mezclando pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.
  5. Calcule la concentración actual de células utilizando un contador de células automatizado (enumerado en la Tabla de materiales). Siembre seis pocillos (en este ejemplo) en una placa de 24 pocillos con 1 x 105 celdas (para una densidad de siembra de 50,000 células / cm2).
  6. Agregue la solución DMEM hasta 500 μL (agregue primero la solución DMEM a los pocillos) y luego etiquete un pocillo por tratamiento como el siguiente: sin control de color, control mKO2, control TagBFP, control NeonGreen, control de todo color y politransfección 1. Los pocillos de control TagBFP, mKO2 y NeonGreen son controles de un solo color para todas las proteínas fluorescentes incluidas en la politransfección.

2. Realización de la transfección

  1. Prepare tubos para cada agregado de ADN. Deje a un lado los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y etiquete los tubos como: sin control de color, control de mKO2, control de TagBFP, control de NeonGreen, control de todo color, mezcla de politransfección 1 y mezcla de politransfección 2.
    1. Agregue 36 μL de medio sérico reducido al control sin color, el control mKO2, el control TagBFP, el control NeonGreen y todos los tubos de control de color. Añadir 18 μL de medio sérico reducido a cada uno de los tubos de la mezcla de politransfección 1 y de la mezcla de politransfección 2.
      NOTA: Se supone que las concentraciones de plásmidos son de 150 ng/μL.
    2. Agregue 600 ng de plásmido de relleno al tubo sin control de color. Agregue 300 ng de mKO2 y 300 ng de plásmido de relleno al tubo de control de color mKO2. Agregue 300 ng de TagBFP y 300 ng de plásmido de relleno al tubo de control de color TagBFP.
    3. Agregue 300 ng de plásmido constitutivo NeonGreen y 300 ng de plásmido de relleno al tubo de control de color NeonGreen. Agregue 100 ng de mKO2, TagBFP y NeonGreen constitutivo, así como 300 ng de plásmido de relleno, al tubo de control de todo el color.
    4. Añadir 150 ng de mKO2 a la mezcla de politransfección 1 tubo. Agregue 75 ng de plásmido reportero NeonGreen y 75 ng de plásmido de relleno a la mezcla de politransfección 1 tubo.
    5. Añadir 150 ng de TagBFP a la mezcla de poli-transfección de 2 tubos. Agregue 75 ng de plásmido L7ae y 75 ng de plásmido de relleno al tubo de mezcla de politransfección 2.
  2. Cree la mezcla maestra de transfección en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml combinando 216 μL de medio sérico reducido con 9,48 μL de reactivo de transfección (consulte la Tabla 1 para conocer las proporciones de reactivos y la escala de reacción). Mezclar bien pipeteando arriba y abajo, y reservar.
  3. Agregue 1.58 μL de reactivo potenciador a cada uno de los tubos sin control de color, control de color único y todos los tubos de control de color. Añadir 79 μL de reactivo potenciador a cada uno de los tubos de mezcla de politransfección. Mezclar cada tubo individualmente pipeteando vigorosamente.
  4. Agregue la mezcla maestra de transfección a cada tubo que contenga ADN.
    1. Agregue 37.58 μL de mezcla maestra de transfección a cada uno de los tubos sin control de color, control de color único y todos los tubos de control de color. Mezclar cada tubo individualmente pipeteando vigorosamente.
    2. Añadir 18,79 μL de mezcla maestra de transfección a cada uno de los tubos de mezcla de politransfección. Mezclar cada tubo individualmente pipeteando vigorosamente.
  5. Dispense las mezclas de transfección en los pozos.
    1. Pipetear 65,97 μL de cada mezcla de transfección para los controles sin color, de un solo color y de todos los colores en los pocillos correspondientes.
    2. Pipetear 32,98 μL de la mezcla de politransfección 1 en el pocillo de politransfección y agitar la placa rápida pero suavemente en un patrón apretado en forma de ocho a lo largo de una superficie plana para distribuir los complejos de manera efectiva. A continuación, pipetear 32,98 μL de la mezcla de politransfección 2 en el mismo pocillo de politransfección y agitar la placa de la misma manera.
  6. Colocar la placa en una incubadora a 37 °C, con un 5% deCO2 y sin agitar, durante un período de 48 h.
    NOTA: Para aumentar la viabilidad celular, los medios celulares se pueden reemplazar cada 6 h después de la transfección (aunque esto no siempre es necesario, y con las células HEK293 y sus derivados, se debe tener cuidado de no separar las células de la placa al cambiar el medio).
Reactivo Importe Escalada
Medio sérico reducido para la mezcla de ADN 36 μL por tubo de control, 18 μL por tubo de politransfección 0,05 μL Medio sérico reducido/ng de ADN por tubo, con un volumen adicional del 10-20% para tener en cuenta el pipeteo
ADN 300-600 ng por tubo
P3000 1,58 μL por tubo de control, 0,79 μL por tubo de politransfección 0,0022 μL P3000/ng de ADN por tubo, con un 10-20% adicional
Medio sérico reducido para Lipo master mix 36 μL por tubo de control, 18 μL por tubo de politransfección 0,05 μL de medio sérico reducido/ng de ADN total, con un volumen adicional del 10-20% para tener en cuenta el pipeteo
Reactivo de transfección y potenciador 1,58 μL por tubo de control, 0,79 μL por tubo de politransfección 0.0022 μL Lipofectamina 3000/ng ADN, con 10-20% extra

Tabla 1: Incrustación de reactivos para transfecciones. La tabla indica la proporción correcta de reactivo a incluir para la cantidad de ADN incluida en un solo pozo. Esto se puede usar para escalar reacciones de manera efectiva y formar mezclas maestras. Las cantidades de reactivo se han escalado para incluir un exceso del 20%.

3. Preparación de células para citometría de flujo

  1. Precaliente al menos 4,2 ml de la solución DMEM a 37 °C. Precaliente al menos 4,2 ml de tripsina y 4,2 ml de PBS a 37 °C. Mantenga la solución tampón de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) a 4 °C hasta que esté lista para usar.
  2. Resuspender las células en la solución tampón FACS (PBS suplementado con BSA al 1%, ácido etilendiaminotetraacético [EDTA] de 5 mM y azida de sodio al 0,1% [NaN3], para reducir la aglutinación; consulte la Tabla de materiales) como se describe a continuación.
    1. Aspirar y desechar los medios actuales en cada pozo. Dispense 5 ml de PBS en cada pocillo para lavar las células. Aspirar y desechar el PBS.
    2. Dispense 5 ml de tripsina en cada pocillo. Coloque el plato en una incubadora a 37 °C durante 3 minutos, o hasta que las células ya no se adhieran al plato. Devuelva la placa al gabinete de bioseguridad y diluya las soluciones celulares dispensando 5 ml de solución DMEM en cada pocillo.
    3. Para cada pocillo, mezcle la solución pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo varias veces. Para cada pocillo, aspire todos los medios y colóquelos en un tubo cónico de 15 ml.
  3. Centrifugar las células a 300 x g durante 3 min para granularlas. Aspirar el medio, teniendo cuidado de no aspirar las células y desecharlo. En cada tubo, resuspender las células en 5 ml de solución tampón FACS, mezclando pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.
  4. Pase cada solución de suspensión celular a través de un colador (para eliminar grumos) en tubos cónicos de citometría de flujo separados. Mantenga estos tubos en hielo durante no más de 1 h y realice la citometría de flujo lo antes posible.

4. Realización de citometría de flujo

NOTA: El funcionamiento de un citómetro de flujo requiere una capacitación adecuada y el conocimiento de las tareas necesarias. Como el software y el equipo pueden variar y los usuarios deben ser entrenados en general, esta sección se refiere a operaciones específicas que son útiles para realizar.

  1. Primero, examine las células transfectadas con el control del plásmido de relleno (sin control de color) para seleccionar las características celulares y evitar anomalías (incluidos agregados, desechos, etc.). Si bien hay muchas combinaciones de parámetros para distinguir celdas, utilice las siguientes tres opciones generales como una buena manera de visualizar las características distintivas.
    1. Mire el área de dispersión lateral (escala logarítmica o lineal por preferencia/tipo de celda) frente al área de dispersión directa (escala lineal).
    2. Mire la altura de dispersión lateral (escala logarítmica) frente al ancho de dispersión lateral (escala lineal).
    3. Mire el ancho de dispersión hacia adelante (escala lineal) frente a la altura de dispersión hacia adelante (escala lineal).
  2. A continuación, observe los controles de un solo color. Utilice el control de todo el color para ajustar los voltajes del instrumento, de modo que las señales de cada proteína fluorescente se normalicen a unidades arbitrarias equivalentes (u.a.) de fluorescencia. A continuación, ejecute los controles de color único para cada proteína fluorescente, que se utilizan para establecer la matriz de compensación, lo que permite la corrección del sangrado.
    NOTA: Idealmente, el rango dinámico completo de los valores de fluorescencia debería ser visible. Se puede hacer una mayor normalización de las señales de proteínas fluorescentes mediante la conversión a unidades estandarizadas (por ejemplo, moléculas de fluoresceína equivalente [MEFL; ver Beal et al.15]). Para habilitar la conversión MEFL durante el análisis, ejecute perlas de calibración arco iris. Dicha calibración también es útil para reducir la variación de la señal de instrumento a instrumento y del día a día16.
  3. Haga funcionar el tubo de muestra de politransfección.
    NOTA: Siempre que sea posible, se recomienda ejecutar celdas de 1,000 x 10^ (^ = mezclas), ya que las politransfecciones de dimensiones superiores deben subdividirse en más contenedores durante el análisis, y cada contenedor necesita suficientes celdas (idealmente >10) para hacer comparaciones estadísticamente significativas.

5. Realización de análisis post-experimento

  1. Inicialmente, utilice los datos de los controles (y, si corresponde, las cuentas) para garantizar resultados precisos. Utilice una de las herramientas de software disponibles para realizar la activación de células vivas (utilizando las puertas descritas anteriormente), la compensación y la corrección de autofluorescencia.
    NOTA: Normalmente utilizamos código MATLAB personalizado (por ejemplo, https://github.com/jonesr18/MATLAB_Flow_Analysis o Cytoflow17), que tiene una interfaz gráfica de usuario y una biblioteca de Python adecuada para la fase de preprocesamiento y para el análisis de politransfección.
Método Complejo ng Marcador fluorescente ng L7ae (fracción) ng Reportero (fracción) ng ADN de relleno (fracción) Total (ng)
Politransfección 1 600
→ 1 150 75 (½) 75 (½) 300
→ 2 150 75 (½) 75 (½) 300
Politransfección 2 600
→ 1 150 25 (1/6) 125 (5/6) 300
→ 2 150 125 (5/6) 25(1/6) 300

Tabla 2: Cantidades de ADN para poli-transfección demostradas en el protocolo, y un ejemplo de experimento de seguimiento con proporciones de plásmidos sintonizados. La mitad superior de la tabla muestra la composición de los plásmidos utilizados en un experimento simple de politransfección. La mitad inferior muestra la composición de un experimento actualizado que ajusta las proporciones de plásmidos para submuestrear mejor un espacio de concentración hipotético, donde el modulador de la expresión génica está en una proporción más óptima de 1: 5 en relación con su reportero, produciendo más células transfectadas para muestrear alrededor de esta relación.

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Representative Results

En la Figura 1, comparamos la co-transfección con la poli-transfección. En una co-transfección, todos los plásmidos se entregan en la misma mezcla de transfección, lo que resulta en una alta correlación entre la cantidad de cada plásmido que recibe cualquier célula individual (Figura 1A). Si bien el número total de plásmidos entregados a cada célula varía significativamente, la fluorescencia de las dos proteínas reporteras en las células individuales en toda la población está bien correlacionada, lo que indica que los dos plásmidos se están administrando conjuntamente en una proporción bastante constante. Las células transfectadas pueden absorber pocos o muchos complejos, pero dado que cada complejo tiene cantidades correlacionadas de cada plásmido, la co-transfección solo explora una pequeña región diagonal del espacio de concentración entre los dos plásmidos. En contraste, en una politransfección, los plásmidos se entregan en múltiples complejos de transfección, lo que resulta en la administración descorrelacionada de plásmidos en diferentes mezclas de transfección (Figura 1B). Las células transfectadas absorben diferentes combinaciones de los complejos, lo que resulta en células que contienen dosis variables de plásmidos de ninguno, uno o ambos complejos.

La figura 2 muestra un flujo de trabajo de politransfección representativo. En general, un experimento de politransfección consta de los siguientes pasos: definir el problema, crear las mezclas de transfección, incubar las células, citometría de flujo y análisis. También hay un paso opcional para repetir la politransfección con relaciones de pieza optimizadas si los resultados iniciales de la politransfección no pueden reducir con precisión las relaciones de pieza óptimas. Estos pasos se describen en el protocolo.

En la Figura 3, se proporcionan algunos ejemplos de cotransfecciones y politransfecciones bien realizadas y errores comunes. La Figura 3A muestra una co-transfección bien realizada con una estrecha correlación entre TagBFP y plásmidos que expresan eYFP que fueron administrados conjuntamente. En contraste, la co-transfección en la Figura 3B muestra una correlación pobre entre estos dos plásmidos. En la figura mostrada, la mala correlación se debe a la adición de reactivo potenciador al medio sérico reducido antes de que se agregaran los plásmidos. Tal correlación pobre en los experimentos también podría deberse a diferentes promotores que impulsan la expresión de las proteínas fluorescentes, una mezcla deficiente durante la creación de la mezcla de transfección o permiten que el complejo se incube durante un intervalo demasiado corto o demasiado largo.

La Figura 3C muestra una politransfección bien realizada, con buena cobertura del espacio bidimensional y buena compensación de cualquier sangrado espectral entre proteínas fluorescentes. La Figura 3D muestra datos de politransfección con un bajo número de células vivas, que es difícil de subdividir en suficientes contenedores con un número suficiente de celdas en cada contenedor para su análisis. Para mejorar este problema, la población celular inicial debe gozar de buena salud y no estar demasiado crecida, y la toxicidad experimental debe reducirse mediante el uso de un reactivo de transfección diferente y / o transfección con menos ADN total. La Figura 3E muestra una politransfección en la que la eficiencia de la transfección fue pobre, lo que resultó nuevamente en una cobertura escasa del espacio bidimensional para el análisis. En este caso, el número de células que pasan la morfología es alto, pero las células no expresan proteínas fluorescentes. Para mejorar la eficiencia, se debe optimizar la elección del reactivo de transfección y seguir de cerca el protocolo del fabricante. Cada mezcla de transfección debe contener una cantidad equivalente de masa de ADN, asegurando que las células tengan aproximadamente la misma probabilidad de recibir cada tipo de complejo, y cada mezcla de transfección debe hacerse de acuerdo con las instrucciones del kit. Diferentes kits de transfección son óptimos para diferentes tipos de células; Se debe utilizar el kit que proporcione la mejor eficiencia en el tipo de célula de interés. Finalmente, algunos tipos de células son difíciles de transfectar, independientemente del kit utilizado. En estos casos, se debe transfectar un mayor número de células y recolectar tantas como sea posible durante la citometría de flujo para garantizar un número suficiente de células para analizar. La Figura 3F muestra datos de politransfección donde uno de los marcadores de proteínas fluorescentes muestra claramente el sangrado espectral en otra proteína fluorescente. Los controles de un solo color siempre deben ejecutarse para todas las proteínas fluorescentes en el sistema y usarse para generar una matriz de compensación que debe aplicarse a todas las politransfecciones antes del análisis.

Cuando se realizan experimentos de politransfección por primera vez (en general o para un nuevo sistema experimental), se debe realizar una evaluación comparativa contra la cotransfección estándar. Un enfoque es medir individualmente la función de transferencia de entrada-salida para partes clave del sistema utilizando tanto co-transfección (a través del ajuste de las dosis de ADN) como poli-transfección.

En la Figura 4, demostramos la evaluación comparativa del represor traslacional L7Ae, adaptado aquí de la publicación original de politransfección10. L7Ae es una proteína de unión al ARN que reconoce los motivos de giro torcido de ARN (KT)20; cuando se colocan dos KT (2xKT) en la región no traducida (UTR) de 5' de un ARNm, la traducción del marco de lectura abierto (ORF) aguas abajo puede ser suprimida eficazmente por L7Ae21. L7Ae se ha utilizado previamente para construir clasificadores de tipo celular basados en ARN21 y otros circuitos basados en ARN22. Para probar L7Ae por co-transfección estándar, se pueden ajustar las proporciones de los plásmidos que codifican L7Ae y su reportero objetivo dentro de diferentes mezclas de transfección (Figura 4A y Tabla 3). Para la politransfección, se debe administrar independientemente L7Ae constitutiva y el reportero 2xKT correspondiente en mezclas de transfección separadas, de modo que se entregue una amplia gama de proporciones de plásmidos a las células (Figura 4B). Después de realizar la transfección y la citometría de flujo, se puede realizar el análisis de datos. Para que los datos sean comparables, se pueden cotejar los resultados individuales de la cotransfección en un solo conjunto de datos, luego realizar un binning multidimensional similar a los datos de politransfección (Figura 4C, D). Comparando las curvas dosis-respuesta de L7Ae que reprimen el reportero de salida, se puede observar que el nivel medio de salida por contenedor es muy similar entre los datos de co-transfección y poli-transfección (Figura 4E-G).

En general, hemos visto que los datos de politransfección se correlacionan bien con los datos de cotransfección a través de proporciones amplias de ADN, con menos precisión en proporciones de dosis de ADN altamente sesgadas (en parte debido a una menor cobertura celular en contenedores para experimentos de politransfección, especialmente para partes que son muy activas a dosis bajas de plásmidos). Para mejorar la precisión de la medición de estas partes sensibles, su nivel de expresión puede reducirse con un promotor más débil, marcos de lectura abiertos aguas arriba18 o afinadores mediados por silenciamiento de microARN (miSFIT)19.

La Figura 5 demuestra una aplicación exitosa de la politransfección para la optimización de un clasificador de tipo celular, nuevamente adaptado de Gam et al10. El clasificador es un diseño relativamente simple que produce una salida en respuesta a la expresión de miR-21-5p, un miARN sobreexpresado en muchas células tumorales23. En ausencia de miR-21, la salida del clasificador es reprimida por un represor transcripcional derivado de bacterias, BM3R124, cuya adaptación se demostró previamente que funciona en células de mamíferos25. Cuando miR-21 está presente, se une a cuatro sitios objetivo colocados en los UTR 3' y 5' de BM3R1, derribando su expresión y permitiendo así la transcripción de salida (Figura 5A). Para optimizar este sistema, los tres componentes del circuito se entregaron en mezclas de transfección separadas: (1) BM3R1 (con sitios de destino miR-21), (2) reportero de salida (mKO2) y (3) Gal4-VP16, que activa la transcripción de la salida (Tabla 4). Tenga en cuenta que el promotor de salida opera en la lógica (Gal4-VP16) y no BM3R1, que suprime la salida incluso en presencia de Gal4-VP1625. Cada parte codifica un marcador de transfección, TagBFP, mNeonGreen e iRFP720, respectivamente, en el mismo plásmido para indicar la dosis relativa de ADN de cada complejo. En general, el aumento de la expresión Gal4-VP16 debería aumentar la salida mKO2 del reportero, mientras que el aumento de la expresión BM3R1 debería dar como resultado una menor salida de mKO2. Debido a que BM3R1 es derribado por miR-21-5p, la expresión de salida debería ser mayor en las células HeLa, que tienen niveles más altos de miR-21-5p y, por lo tanto, expresan menos BM3R1 que en las células HEK.

Después de la politransfección en células HEK293 y HeLa, obtuvimos una distribución 3D de diferentes proporciones de plásmidos (Figura 5B-HEK). Gam et al.10 submuestrearon esta distribución en varias proporciones considerando células dentro de una distancia euclidiana particular de una razón de interés; Esta distancia debe ser lo suficientemente amplia como para incluir suficientes celdas para permitir resultados estadísticamente significativos del análisis, pero lo suficientemente estrecha como para evitar el ruido innecesario de incluir un conjunto demasiado amplio de proporciones de componentes de las tres partes. Gam et al.10 utilizaron un algoritmo de optimización para identificar la proporción de partes que maximizaban la precisión de clasificación para la co-transfección (es decir, las células HeLa transfectadas son positivas para la expresión de salida, mientras que las células HEK transfectadas no lo son). Se encontró que la relación óptima de las piezas era 10.9: 1.5: 1: Gal4-VP16: salida: BM3R1; Las células submuestreadas alrededor de la proporción óptima dentro de todo el espacio de politransfección se muestran en la Figura 5C. Este submuestreo predijo que, en esta proporción, el circuito cotransfectado tiene una especificidad del 91%, una sensibilidad del 62% y una precisión del 77% al clasificar HEK293 frente a las células HeLa (Figura 5D). La co-transfección con proporciones de plásmidos establecidas en este óptimo produjo resultados aún mejores: 99% de especificidad, 68% de sensibilidad y 84% de precisión10. Además, las proporciones guiaron la implementación de una versión de un solo plásmido del circuito, con expresión relativa ajustada mediante el uso de diferentes promotores truncados y ORF aguas arriba (uORF), produciendo un circuito con 91% de especificidad, 90% de sensibilidad y 90% de precisión10. Por lo tanto, la politransfección es una herramienta poderosa para guiar el diseño de clasificadores celulares y circuitos genéticos de manera más amplia.

Figure 1
Figura 1: Comparación de la co-transfección y la poli-transfección. (A,B) Visión general y comparación de la administración de plásmidos con la co-transfección de dos plásmidos y la poli-transfección de dos plásmidos. Para cada método de transfección, el diagrama de la izquierda muestra la formación de complejos de transfección entre el ADN cargado negativamente y los lípidos cargados positivamente. En estos ejemplos, cada plásmido coloreado (azul y rojo) codifica la expresión de una proteína fluorescente diferente. El diagrama central muestra ejemplos de entrega de plásmidos a las células y también un esquema para las distribuciones esperadas en un histograma o diagrama de dispersión. La intensidad del color en el histograma corresponde a la fluorescencia del color plásmido correspondiente. El diagrama situado más a la derecha muestra datos reales de las celdas transfectadas utilizando cada método dado. (A) En una co-transfección con dos plásmidos diferentes, ambos plásmidos se mezclan antes de agregar reactivo de transfección, lo que resulta en un empaquetamiento altamente correlacionado de las dos especies de plásmidos. En los datos reales de co-transfección, las células exhiben una entrega correlacionada de ambos plásmidos (derecha). (B) En una politransfección, cada conjunto de plásmidos co-entregados correspondientes a una parte del circuito y un marcador de transfección se mezcla con el reactivo de transfección por separado, dando como resultado complejos que contienen solo esos plásmidos (izquierda). En los datos reales de politransfección, las células exploran un amplio rango de espacio de concentración con muchas estequiometrías plásmidas diferentes exploradas simultáneamente (derecha). Esta cifra se ha modificado de10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Flujo de trabajo de politransfección. Paso 1: Definir el problema. Comience con un sistema con múltiples componentes para el que se desconoce la relación ideal entre las piezas, y elija una relación inicial entre las partes componentes. Paso 2: Crear las mezclas de transfección. Cada mezcla de transfección contiene un componente de circuito y un marcador de transfección fluorescente. La cantidad de parte del circuito entregada a una celda se correlaciona con la fluorescencia del marcador. Paso 3: Incubar las células. En un flujo de trabajo típico, incubamos células durante 48 h entre transfección y citometría de flujo. Paso 4: Citometría de flujo. Ejecute los controles adecuados, como se describe en el protocolo, y, a continuación, ejecute los ejemplos. Paso 5: Análisis.Utilice los marcadores de transfección para agrupar las células de acuerdo con la cantidad o proporción de partes que recibió la célula. Utilice la(s) proteína(s) de salida para medir el rendimiento del circuito. Encuentre los contenedores/proporciones de piezas que optimizan el rendimiento del circuito. Paso 6: Repita con proporciones de pieza optimizadas (opcional). Si los contenedores/proporciones óptimos están en proporciones muy sesgadas, la politransfección piloto puede no reducir las relaciones óptimas de la pieza con precisión. Repita la politransfección con proporciones de piezas ajustadas, de modo que una celda que recibió una cantidad igual de cada mezcla de transfección ahora reciba una relación de partes cercana a la óptima, según lo determinado por la ronda anterior. Esta cifra se ha modificado de10. La imagen de una incubadora se utilizó de Servier Medical Art y la imagen de un citómetro de BioRender. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Resultados representativos positivos y negativos de la politransfección . (A) Co-transfección bien realizada de dos reporteros fluorescentes, mostrando una estrecha correlación. Un total de 20.000 celdas se trazan tanto aquí como en (B) para la comparación. Es una buena idea realizar una pequeña prueba similar de co-transfección de dos reporteros fluorescentes antes de comenzar un experimento de poli-transfección, para asegurarse de que los plásmidos estén bien correlacionados dentro de las mezclas de transfección. (B) Co-transfección más ruidosa: los plásmidos no están bien correlacionados dentro de cada mezcla de transfección, lo que puede causar que los marcadores fluorescentes en una poli-transfección sean un marcador pobre de las proporciones de plásmidos. (C) Resultados de politransfección bien realizados que muestran un buen recuento celular, eficiencia de transfección y compensación. (D) Bajo recuento de células vivas, que no permite el submuestreo en contenedores con números estadísticamente significativos de células. (E) Pobre eficiencia de transfección, que no permite el submuestreo en contenedores con números estadísticamente significativos de células. (F) Falta de compensación apropiada, lo que hace que los datos de fluorescencia sean un proxy deficiente de la cantidad de proteína fluorescente en el sistema. Utilice controles de un solo color para determinar una matriz de compensación lineal ideal y aplíquela a los datos antes de seguir procesándolos. También se recomiendan todos los controles de color dependiendo de la elección del software. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Comparación de la politransfección con la cotransfección. (A) En una cotransfección, se puede probar una proporción de represor traslacional L7Ae a plásmidos reporteros fluorescentes en cada pocillo experimental. (B) En la politransfección, muchas proporciones de L7Ae a reporteros pueden probarse en el mismo pozo. Consulte la Tabla 3 para obtener detalles sobre las mezclas de plásmidos de politransfección. (C,D) Flujo de trabajo de agrupación para comparar la politransfección con múltiples cotransfecciones. Se asignaron un total de 10 contenedores espaciados biexponencialmente para cada dimensión del marcador de transfección, que se aproximan a los niveles de cada uno de los dos plásmidos. Aquí, se muestran los contenedores que denotan diferentes niveles de plásmido # 2. El binning se realizó tanto en un conjunto cotejado de 11 muestras de co-transfección que abarcan varias proporciones de plásmidos (C) como en datos de una sola poli-transfección, que comprende aproximadamente 500,000 células cada una (D). Los colores corresponden a conjuntos de bins definidos por los niveles del gen 2 (TagBFP). (E-G) Comparación de la politransfección con la cotransfección para un circuito representativo. La mediana de fluorescencia de salida se evaluó para las células en cada contenedor y se comparó entre los métodos para el sistema representativo, la represión traslacional L7Ae. (E) Constructos para medir la actividad de L7Ae. La fluorescencia mKO2 sirve como una estimación para la entrega de L7Ae (gen # 1), mientras que la fluorescencia TagBFP sirve como una estimación para la entrega de la salida regulada de mNeonGreen (gen # 2). (F) Curvas de valoración multidimensionales para L7Ae. Cada línea representa el conjunto de contenedores en un nivel de TagBFP, como se indica en (C) y (D). Las líneas continuas denotan datos de politransfección, mientras que las líneas discontinuas denotan datos de cotransfección. En cada nivel binned de plásmido reportero, la producción del reportero disminuye a medida que aumenta L7Ae. (G) Comparación visual entre co-transfección y poli-transfección para el sistema L7Ae. Cada punto representa la salida medida en los contenedores correspondientes para mediciones de politransfección y cotransfección, donde los valores más equivalentes están más cerca de la línea roja 1:1. En general, las diferencias observadas entre la politransfección y la cotransfección derivadas son bajas, lo que proporciona confianza en la fiabilidad del método de politransfección. Esta cifra se ha modificado de10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Análisis de datos para politransfección. En la politransfección, las células se pueden agrupar en contenedores o rodajas para su análisis. La Figura 4 muestra una forma de análisis en la que las células se agrupan en cortes que corresponden a los niveles de un componente del sistema, como el nivel de plásmido informador, que puede ser útil para el ajuste del modelo y la comprensión de las respuestas de dosificación. Otra estrategia útil es analizar el rendimiento del circuito en diferentes proporciones de componentes del circuito. (A) Diagrama de un circuito clasificador para optimización. Los niveles de TagBFP, NeonGreen e iRFP720 corresponden a los niveles de BM3R1, mKO2 de salida y Gal4-VP16, respectivamente. Ver Tabla 4 para detalles de las mezclas de plásmidos de poli-transfección. (B) Configuración experimental de mezclas de poli-transfección. (C) Datos de citometría de flujo recogidos de la politransfección con el circuito en (A). Los niveles de cada una de las tres proteínas fluorescentes reporteras como resultado de la politransfección del circuito en células HEK, mostrando la amplia gama de relaciones de componentes del circuito presentes en los datos. Se obtuvieron resultados similares de la transfección de circuitos en células HEK y HeLa. D) Submuestreo de politransfección en una proporción determinada. Para analizar los datos, escaneamos una gran cantidad de relaciones entre los componentes del circuito y determinamos el rendimiento del clasificador en cada relación. Como ejemplo, mostramos aquí una relación particular que demostró un buen rendimiento (Gal4-VP16 = 435 ng de ADN, reportero = 60 ng y BM3R1 = 40 ng). Trazada en azul es la relación correspondiente de los marcadores fluorescentes para los tres componentes diferentes del circuito. A continuación, submuestreamos los datos considerando solo puntos dentro de una distancia euclidiana particular de la trayectoria de fluorescencia. Submuestreamos células en la misma trayectoria de las transfecciones HEK y HeLa. (E) Comparación del rendimiento del circuito en la misma trayectoria en celdas HEK y HeLa. Al comparar estadísticas como la sensibilidad, la especificidad y la precisión de la clasificación en muchas proporciones, las proporciones de componentes se pueden optimizar para generar un circuito genético ideal. Esta cifra se ha modificado de10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Complejo plásmido ng L7Ae ng Plásmido reportero OptiMEM (μL) P3000 (μL) Lipo 3000 (μL)
1 250 75 1.5 1.5
2 250 75 1.5 1.5

Tabla 3: Mezclas de transfección correspondientes a la Figura 4. Las células HEK293 se politransfectaron con estas mezclas de transfección en un pocillo de una placa de 24 pocillos.

Complejo ng Plásmido BM3R1 ng Plásmido Gal4-VP16 ng Plásmido reportero OptiMEM (μL) P3000 (μL) Lipo 3000 (μL)
1 900 75 1.5 1.5
2 900 75 1.5 1.5
3 900 75 1.5 1.5

Tabla 4: Mezclas de transfección correspondientes a la Figura 5. Las células HEK293 y HeLa se politransfectaron con estas mezclas de transfección en un pocillo cada una de una placa de 6 pocillos.

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Discussion

Los métodos de creación rápida de prototipos, como el diseño asistido por computadora (CAD), el breadboard y la impresión 3D, han revolucionado las disciplinas mecánicas, eléctricas y de ingeniería civil. La capacidad de buscar rápidamente a través de muchas soluciones posibles a un desafío dado acelera enormemente el progreso en un campo. Creemos que la politransfección es una tecnología análoga para la ingeniería biológica, que permite la creación rápida de prototipos de circuitos genéticos. Además, otras tecnologías de prototipado rápido requieren una iteración secuencial práctica de múltiples soluciones posibles, mientras que la politransfección puede explorar muchas soluciones simultáneamente. La politransfección permite probar un gran número de combinaciones de proporciones de componentes de circuitos genéticos en un solo pocillo y se ha utilizado para optimizar varios circuitos genéticos publicados10,11,13. El protocolo experimental es una simple extensión de la co-transfección estándar, lo que permite la adopción directa por parte de muchos investigadores de células de mamíferos. En general, se observa una concordancia muy estrecha entre los resultados de la politransfección y la cotransfección10 (un ejemplo es la Figura 4). Por lo tanto, la politransfección se puede utilizar en la mayoría de los casos en que las proporciones de plásmidos se titulan dentro de las mezclas de cotransfección y las salidas se miden a nivel de una sola célula.

La complejidad y la escala de la politransfección aumentan con la complejidad de los circuitos genéticos para optimizar. A medida que aumenta el número de dimensiones a analizar, las relaciones combinatorias de diferentes partes y el número de celdas necesarias para su análisis aumentan exponencialmente. Por ejemplo, para optimizar el clasificador en la Figura 5, las celdas se transfectaron en un formato de placa de 6 pocillos y se recopilaron datos de al menos 1,5 millones de células vivas. También hemos optimizado un clasificador con un componente de circuito adicional 10, lo que requiere transfección a una escala de placa de10 cm y la recolección de millones de células. A esa escala y superior, la producción de ADN lleva mucho tiempo y los reactivos de transfección son caros. Dicho esto, la politransfección utiliza órdenes de magnitud menos células, ADN y reactivos de transfección que probar un número comparable de combinaciones de relación de componentes de circuito en pozos individuales. Además, se ahorra una cantidad considerable de tiempo al hacer órdenes de magnitud menos mezclas de transfección.

La politransfección permite métodos de análisis avanzados para datos de citometría de flujo. Los dos enfoques principales son (1) agrupar células de acuerdo con la expresión de cada marcador de transfección y (2) extraer células en proporciones definidas de marcadores de transfección, simulando así la co-transfección. El primero selecciona células con una combinación específica de dosis de ADN para cada complejo (y por lo tanto cada parte), produciendo funciones de transferencia de entrada-salida. Este último selecciona células en una proporción específica de dosis de ADN para cada parte, simulando la co-transfección a tal proporción de masas de ADN plásmido. Trazar el nivel de expresión del reportero o reporteros de salida de circuito en las selecciones submuestreadas da una medida de la salida en los niveles definidos o proporciones de entradas. Para la optimización del circuito, se pueden identificar los bins/ratios de mejor rendimiento definidos por el propósito del circuito; en el caso de los clasificadores de celdas, estos son los bins/ratios donde el circuito está encendido en el tipo de célula objetivo y OFF en tipos de células no objetivo. Al elegir un tamaño de contenedor, se debe tener en cuenta el nivel de precisión requerido, así como el número de celdas por contenedor. Los contenedores más pequeños se centran en la combinación ideal de componentes del circuito con mayor precisión, pero si un contenedor tiene muy pocas celdas, puede introducir ruido indeseable en las mediciones.

Las mejoras futuras en el análisis computacional de los datos de politransfección pueden facilitar la optimización incluso con una baja cobertura celular por bin/proporción. Actualmente, excluimos los datos de los contenedores con menos de un umbral establecido de celdas (por ejemplo, 10) para evitar mediciones demasiado ruidosas. En combinación con mediciones repetidas, esto permite cálculos más exactos y precisos de curvas dosis-respuesta, precisiones de clasificadores y otras métricas definidas por contenedor. Sin embargo, cada celda en politransfección puede considerarse un experimento independiente, midiendo a una resolución fina la(s) salida(s) del circuito a un nivel preciso de entradas. Con esto en mente, los modelos mecanicistas y fenotípicos de respuestas a la dosis y optimizaciones de circuitos pueden ajustarse directamente a la distribución de la expresión génica de cada marcador y reportero, en lugar de sus estadísticas de resumen binned10. Esto permite mediciones más robustas y aprovecha los muchos puntos de datos individuales recopilados por experimento. Tales enfoques de modelado podrían producir una caracterización y optimización predictiva de circuitos incluso con politransfecciones de alta dimensión escasamente muestreadas. Además, los métodos de aprendizaje automático, como la metodología de superficie de respuesta y la regresión aleatoria de bosques, se pueden utilizar para analizar datos relativamente escasos y de alta dimensión10.

Un enfoque alternativo a las politransfecciones cada vez más grandes es optimizar secuencialmente los circuitos utilizando jerarquías de politransfecciones. En este enfoque, primero, la politransfección se utiliza para optimizar un módulo que comprende un subconjunto de componentes genéticos dentro de un circuito más grande. Luego, estos módulos optimizados se entregan como mezclas de politransfección separadas, lo que permite encontrar la relación / dosis óptima de cada módulo de circuito. Este enfoque utiliza un número significativamente menor de células, ADN y reactivos de transfección. Sin embargo, los grupos de componentes no son necesariamente modulares con respecto a otros componentes, y por lo tanto una relación óptima de componentes en un módulo medido aisladamente podría ser subóptima dentro del contexto de circuito más grande8.

Los métodos de politransfección también están limitados por la configuración láser/filtro del citómetro de flujo utilizado para recopilar datos. Además de las salidas fluorescentes medidas, cada mezcla de transfección contiene un marcador de proteína fluorescente. Por lo tanto, es fundamental seleccionar proteínas fluorescentes que puedan compensarse bien en el citómetro. Previamente analizamos sistemáticamente el sangrado de un panel de 22 proteínas fluorescentes en un citómetro de flujo de cinco láseres (el BD LSRFortessa), y encontramos que el conjunto de Sirius, TagBFP, mNeonGreen, mKO2 e iRFP720 podría usarse juntos y compensarse bien sin problemas significativos10. Sin embargo, la optimización de circuitos más grandes puede requerir métodos avanzados de citometría como la citometría espectral para separar proteínas fluorescentes con espectros más superpuestos, que nuestro laboratorio está optimizando actualmente con hasta ocho proteínas fluorescentes. Las bases de datos como la base de datos de proteínas fluorescentes (https://www.fpbase.org) son útiles para seleccionar proteínas fluorescentes con una superposición espectral particular. Sin embargo, este proceso puede complicarse por varios factores, algunos de los cuales son específicos de citómetros particulares. Por ejemplo, el uso de ciertas proteínas rojas como tdTomato puede resultar en sangrado indeseable en canales azules solo en ciertas configuraciones de láser / filtro10. Además, varias proteínas de color rojo lejano han mostrado relaciones no lineales entre la dosis de ADN y la producción de fluorescencia10, reduciendo su uso como marcadores efectivos para la dosificación de ADN.

Para la consistencia entre experimentos que se realizan con un número variable de complejos (uno, dos, tres, etc.), es útil utilizar la misma cantidad fraccionaria de plásmido por mezcla de transfección. Por ejemplo, si se prueba un sistema de tres genes con cada gen codificado en uno de los tres plásmidos (A, B y C), se podrían cotransfectar los plásmidos del circuito en una proporción de 1: 1: 1 junto con una proporción igual de un plásmido que codifica un marcador de transfección. Esto haría que cada plásmido fuera una cuarta parte de la masa total de la mezcla y, por lo tanto, aproximadamente una cuarta parte de la masa de cada complejo de transfección que se forma. Cuando se politransfectan A, B y C en complejos separados con sus propios reporteros, en lugar de mezclar los plásmidos 1:1 con reporteros o mantener su masa total de ADN, es más consistente mantener cada plásmido en un cuarto de la masa de cada complejo, con el ADN de relleno ocupando la masa restante (ver Tabla 5 para ejemplos). Esto se debe a que la distribución de la expresión génica entre las células transfectadas depende menos de la masa total de ADN entregado en los complejos y más de la cantidad fraccionaria de ADN en cada complejo10. Si se desean proporciones distintas de 1:1:1, calcule las fracciones correspondientes de la masa total de ADN en la mezcla de transfección para cada parte. Por ejemplo, la Tabla 5 [abajo] muestra una proporción de 1:1:4.

Método Complejo ng A (fracción) ng B (fracción) ng C (fracción) ng Reportero (fracción) ng ADN de relleno (fracción) Total (ng)
Co-transfección 1 150 (¼) 150 (¼) 150 (¼) 150 (¼) 0 (0) 600
Politransfección 600
→ 1 50 (¼) 50 (¼) 100 (½) 200
→ 2 50 (¼) 50 (¼) 100 (½) 200
→ 3 50 (¼) 50 (¼) 100 (½) 200
Co-transfección 1 75 (⅛) 75 (⅛) 300 (½) 150 (¼) 0 (0) 600
Politransfección 600
→ 1 25 (⅛) 50 (¼) 125 (⅝) 200
→ 2 25 (⅛) 50 (¼) 125 (⅝) 200
→ 3 100 (½) 50 (¼) 50 (¼) 200

Tabla 5: Ejemplos de uso de ADN de relleno para la consistencia en experimentos de co y politransfección. Aquí, se muestran dos ejemplos genéricos de co-transfección de tres plásmidos con la misma cantidad de ADN de relleno. En el ejemplo superior, los plásmidos están todos en masas iguales. En el ejemplo inferior, un plásmido se entrega a una masa más alta en comparación con los demás. La fracción de ADN total que se usaría en un complejo de co-transfección se transmuta a complejos de poli-transfección, con la cantidad restante de ADN (hasta la cantidad total para cada complejo, que es fija e igual a través de complejos) constituida con ADN de relleno.

El objetivo general del ADN de relleno es mantener dosis similares de plásmidos por célula, independientemente del número de mezclas de transfección únicas. Como una aproximación cruda de este principio, separar tres plásmidos en tres mezclas mientras se mantiene la misma masa de ADN de cada uno (y la proporción apropiada de reactivo de transfección) reduce el porcentaje de células que reciben un complejo dado en un tercio en comparación con una sola mezcla que contiene los tres plásmidos. Sin embargo, cada célula transfectada recibe posteriormente una dosis de gen ~ 3 veces más alta. La reducción de la cantidad relativa de plásmidos solos sin ADN de relleno es, por lo tanto, insuficiente para mantener dosis consistentes de plásmidos, ya que esto simplemente disminuye la eficiencia de la transfección sin alterar la distribución subyacente de la expresión entre las células transfectadas10. Por otro lado, el ADN de relleno permite ajustar la dosis de ADN sin afectar la eficiencia general de la transfección (aunque las células transfectadas detectables pueden disminuir debido a una señal más baja)10. Siguiendo la aproximación cruda anterior, reducir la fracción de ADN en las mezclas de poli-transfección a un tercio y agregar ADN de relleno mantiene las dosis genéticas relativas en comparación con la co-transfección original. Por lo tanto, el ADN de relleno garantiza una formación eficiente y precisa del complejo de transfección.

Para alterar el rango de expresión de un gen de interés cubierto por su reportero, la fracción de cada plásmido de prueba y/o promotores utilizados para impulsar el gen allí puede ajustarse en relación con el reportero. Si una parte es fuerte/altamente activa a dosis bajas de ADN, el uso de una fracción de ADN más baja puede ayudar a centrar el rango dinámico de la pieza en el medio de la distribución de fluorescencia del reportero en las células transfectadas. Del mismo modo, para las partes que son débiles / solo activas en dosis altas de ADN, puede ser útil usar una fracción más alta. Sin embargo, se debe tener cuidado con tal ajuste, ya que reducir demasiado las fracciones de ADN aumenta la estocasticidad de la entrega a las células en comparación con el reportero10, y los altos niveles de expresión génica pueden sobrecargar la maquinaria de expresión génica celular12,14. Para evitar la estocasticidad, y en los casos en que cada gen se entrega a las células en una proporción fija (por ejemplo, si el circuito se va a generar como un solo lenti, PiggyBac o vector de plataforma de aterrizaje), la expresión relativa de cada gen se puede ajustar utilizando promotores más fuertes / más débiles, uORFspequeños 18 y / o miSFIT19.

Aunque el protocolo describe una técnica de transfección inversa, la politransfección también es posible con la transfección directa. En la transfección inversa, las células se siembran y transfectan simultáneamente; En la transfección directa, las células se transfectan ~ 24 h después de la primera placa a aproximadamente la mitad de la densidad que se usaría en la transfección inversa (para permitir la división celular en el momento de la transfección). En general, la transfección inversa es más eficiente pero también más tóxica, y hemos notado algunas diferencias en la forma de las distribuciones de transfección basadas en el reactivo, el tiempo de transfección y la línea celular. Por lo tanto, el método de transfección de elección debe optimizarse para cada línea celular para maximizar el número de células transfectadas y la cobertura del espacio de concentración multidimensional de dosis de plásmidos por célula.

En general, la politransfección permite la rápida optimización de los circuitos genéticos de los mamíferos. Muchas combinaciones ratiométricas posibles de componentes de circuitos se pueden probar fácilmente en un solo pozo. Además, dado que la politransfección contiene más información sobre los niveles de cada parte en un sistema que una transfección convencional, se ha encontrado que es muy valiosa para caracterizar el comportamiento de varias partes genéticas10,11,12,13. Se prevé que la adopción de la politransfección acelere el ritmo de desarrollo de circuitos genéticos nuevos y mejorados para su uso en células de mamíferos.

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Disclosures

R.W. es cofundador de Strand Therapeutics y Replay Bio; R.W. y R.J. presentaron una patente provisional relacionada con un clasificador de tipo celular.

Acknowledgments

Nos gustaría agradecer a los antiguos miembros de Weiss Lab que lideraron o contribuyeron al desarrollo del método de politransfección y su aplicación a los clasificadores celulares: Jeremy Gam, Bre DiAndreth y Jin Huh; otros miembros del laboratorio Weiss que han contribuido a un mayor desarrollo / optimización de métodos: Wenlong Xu, Lei Wang y Christian Cuba-Samaniego; Prof. Josh Leonard y miembros del grupo, incluidos Patrick Donahue y Hailey Edelstein, por probar la politransfección y proporcionar retroalimentación; y la profesora Nika Shakiba por invitar a este manuscrito y proporcionar comentarios. También nos gustaría agradecer a los Institutos Nacionales de Salud [R01CA173712, R01CA207029, P50GM098792]; Fundación Nacional de Ciencias [1745645]; Subvención de apoyo al Centro Oncológico (principal) [P30CCA14051, en parte] del NCI y de los Institutos Nacionales de la Salud [P50GM098792] para financiar este trabajo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15mL Corning Falcon conical tubes ThermoFisher Scientific 14-959-53A
24-well petri dish Any company of choice (Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free)
Bovine serum albumin NEB B9000S
Centrifuge Any company of choice Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf
Countess 3 Automated Cell Counter ThermoFisher Scientific AMQAX2000
Countess Cell Counting Chamber Slides ThermoFisher Scientific C10228
Cytoflow Non-commercial software package https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/# 
DMEM VWR 10-013-CV Use the correct media for your cell type
EDTA  ThermoFisher Scientific 03690-100ML
Fetal bovine serum Sigma Aldrich F4135
HEK cells ATCC CRL-1573 Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently.
HeLa cells ATCC CRL-12401 Use the relevant cell type for your experiments.
Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer ThermoFisher Scientific L3000001 Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent
LSRFortessa flow cytometer BD Biosciences N/A
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Gibco 11140050
Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL Any company of choice
Opti-MEM ThermoFisher Scientific 31985070 reduced serum medium
Phosphate buffered saline ThermoFisher Scientific 70011044
Rainbow calibration beads Spherotech URCP-100-2H
Sodium azide Sigma Aldrich S2002
Trypsin VWR 25-053-CI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Desarrollo rápido de circuitos de identificación del estado celular con politransfección
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Wauford, N., Jones, R., Van De Mark, … More

Wauford, N., Jones, R., Van De Mark, C., Weiss, R. Rapid Development of Cell State Identification Circuits with Poly-Transfection. J. Vis. Exp. (192), e64793, doi:10.3791/64793 (2023).

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