Summary
I circuiti genetici complessi richiedono molto tempo per progettare, testare e ottimizzare. Per facilitare questo processo, le cellule di mammifero vengono trasfettate in modo da consentire il test di più stechiometrie di componenti del circuito in un singolo pozzetto. Questo protocollo delinea le fasi per la pianificazione sperimentale, la trasfezione e l'analisi dei dati.
Abstract
I circuiti genetici dei mammiferi hanno dimostrato il potenziale per rilevare e trattare una vasta gamma di stati patologici, ma l'ottimizzazione dei livelli dei componenti del circuito rimane impegnativa e laboriosa. Per accelerare questo processo, il nostro laboratorio ha sviluppato la poli-trasfezione, un'estensione ad alto rendimento della trasfezione tradizionale dei mammiferi. Nella poli-trasfezione, ogni cellula della popolazione trasfettata esegue essenzialmente un esperimento diverso, testando il comportamento del circuito a diversi numeri di copie del DNA e consentendo agli utenti di analizzare un gran numero di stechiometrie in una reazione single-pot. Finora sono state dimostrate poli-trasfezioni che ottimizzano i rapporti di circuiti a tre componenti in un singolo pozzetto di cellule; In linea di principio, lo stesso metodo può essere utilizzato per lo sviluppo di circuiti ancora più grandi. I risultati della poli-trasfezione possono essere facilmente applicati per trovare rapporti ottimali tra DNA e co-transfettazione per circuiti transitori o per scegliere livelli di espressione per componenti circuitali per la generazione di linee cellulari stabili.
Qui, dimostriamo l'uso della poli-trasfezione per ottimizzare un circuito a tre componenti. Il protocollo inizia con i principi di progettazione sperimentale e spiega come la poli-trasfezione si basa sui tradizionali metodi di co-trasfezione. Successivamente, viene eseguita la poli-trasfezione delle cellule e seguita dalla citometria a flusso pochi giorni dopo. Infine, i dati vengono analizzati esaminando fette dei dati di citometria a flusso a singola cellula che corrispondono a sottoinsiemi di cellule con determinati rapporti componenti. In laboratorio, la poli-trasfezione è stata utilizzata per ottimizzare classificatori cellulari, controller di feedback e feedforward, motivi bistabili e molti altri. Questo metodo semplice ma potente accelera i cicli di progettazione per circuiti genetici complessi nelle cellule di mammifero.
Introduction
Il campo della biologia sintetica dei mammiferi è progredito rapidamente, dallo sviluppo di semplici parti senso-e-risposta in linee cellulari in coltura all'ottimizzazione di reti complesse di geni per affrontare le sfide del mondo reale nella diagnostica e nella terapia1. Questi sofisticati circuiti sono in grado di rilevare input biologici dai profili di microRNA alle citochine ai farmaci a piccole molecole e di implementare circuiti di elaborazione logica tra cui transistor, filtri passa-banda, interruttori a levetta e oscillatori. Hanno anche mostrato risultati promettenti in modelli animali di malattie come cancro, artrite, diabete e molti altri 1,2,3,4,5. Tuttavia, man mano che la complessità di un circuito cresce, l'ottimizzazione dei livelli di ciascuno dei suoi componenti diventa sempre più impegnativa.
Un tipo particolarmente utile di circuito genetico è un classificatore cellulare, che può essere programmato per rilevare e rispondere agli stati cellulari. La produzione selettiva di proteine o RNA in specifici stati cellulari è un potente strumento per guidare e programmare la differenziazione di cellule e organoidi, identificare e distruggere le cellule malate e/o i tipi di cellule indesiderabili e regolare la funzione delle cellule terapeutiche 1,2,3,4,5 . Tuttavia, la creazione di circuiti nelle cellule di mammifero in grado di classificare con precisione gli stati cellulari da più RNA cellulare e / o specie proteiche è stata molto impegnativa.
Uno dei passaggi più dispendiosi in termini di tempo per lo sviluppo di un circuito di classificazione cellulare è ottimizzare i livelli di espressione relativi dei singoli geni componenti, come sensori e fattori di elaborazione, all'interno del circuito. Per accelerare l'ottimizzazione dei circuiti e consentire la costruzione di circuiti più sofisticati, recenti lavori hanno utilizzato la modellazione matematica dei circuiti classificatori di celle e dei loro componenti per prevedere composizioni e topologie ottimali 6,7. Mentre questo ha mostrato risultati potenti finora, l'analisi matematica è limitata dalla necessità di caratterizzare sistematicamente il comportamento input-output dei geni componenti nel circuito, che richiede tempo. Inoltre, una miriade di problemi dipendenti dal contesto possono emergere in circuiti genetici complessi, facendo sì che il comportamento di un circuito completo sfidi le previsioni basate sulle caratterizzazioni delle singole parti 8,9.
Per sviluppare e testare più rapidamente circuiti complessi di mammiferi come i classificatori di stato cellulare, il nostro laboratorio ha sviluppato una tecnica chiamata poli-trasfezione10, un'evoluzione dei protocolli di co-trasfezione plasmidica. Nella co-trasfezione, più specie di DNA plasmidico sono complessate insieme con un reagente lipidico o polimerico caricato positivamente, quindi consegnate alle cellule in modo correlato (Figura 1A). Nella poli-trasfezione, i plasmidi sono complessati separatamente con il reagente, in modo tale che il DNA di ciascun complesso di trasfezione venga consegnato alle cellule in modo de-correlato (Figura 1B). Utilizzando questo metodo, le cellule all'interno della popolazione trasfettata sono esposte a numerose combinazioni di rapporti di due o più carichi utili di DNA che trasportano diversi componenti del circuito.
Per misurare i rapporti dei componenti del circuito consegnati a ciascuna cellula, ogni complesso di trasfezione all'interno di una poli-trasfezione contiene un reporter fluorescente costitutivamente espresso che funge da proxy per l'assorbimento cellulare del complesso. Il DNA di riempimento che non contiene alcun elemento attivo all'interno di una cellula di mammifero viene utilizzato per sintonizzare la quantità relativa del reporter fluorescente e dei componenti del circuito consegnati a una cellula in un singolo complesso di trasfezione e viene discusso più dettagliatamente nella discussione. Un esempio di DNA di riempimento utilizzato nel laboratorio Weiss è un plasmide contenente una sequenza di terminazione, ma nessun promotore, sequenza codificante, ecc. Le cellule con diversi rapporti di componenti del circuito possono quindi essere confrontate per trovare rapporti ottimali per la funzione del circuito genico. Questo a sua volta produce previsioni utili per la scelta di promotori e altri elementi del circuito per raggiungere livelli ottimali di espressione genica quando si combinano componenti del circuito in un singolo vettore per l'integrazione genetica (ad esempio, un lentivirus, un trasposone o una piattaforma di atterraggio). Pertanto, invece di scegliere i rapporti tra i componenti del circuito in base all'intuizione o tramite un processo di prova ed errore che richiede tempo, la poli-trasfezione valuta un'ampia gamma di stechiometrie tra le parti genetiche in una reazione a singolo piatto.
Nel nostro laboratorio, la poli-trasfezione ha permesso l'ottimizzazione di molti circuiti genetici, tra cui classificatori cellulari, controller di feedback e feedforward e motivi bistabili. Questo metodo semplice ma potente accelera significativamente i cicli di progettazione per circuiti genetici complessi nelle cellule di mammifero. Da allora la poli-trasfezione è stata utilizzata per caratterizzare diversi circuiti genetici per rivelare le loro funzioni di trasferimento input-output multidimensionale ad alta risoluzione 10, ottimizzare una topologia circuitale alternativa per la classificazione dello stato cellulare11 e accelerare vari progetti pubblicati12,13 e in corso.
Qui descriviamo e rappresentiamo il flusso di lavoro per l'utilizzo della poli-trasfezione per ottimizzare rapidamente un circuito genetico (Figura 2). Il protocollo mostra come generare dati di poli-trasfezione di alta qualità ed evitare diversi errori comuni nel protocollo di poli-trasfezione e nell'analisi dei dati (Figura 3). Viene quindi illustrato come utilizzare la poli-trasfezione per caratterizzare semplici componenti del circuito e, nel processo, confrontare i risultati della poli-trasfezione con la co-trasfezione (Figura 4). Infine, i risultati della poli-trasfezione mostrano l'ottimizzazione del circuito del classificatore del cancro (Figura 5).
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Protocol
NOTA: la Tabella 1 e la Tabella 2 fungono da riferimenti significativi per questo protocollo. La Tabella 1 mostra il ridimensionamento del reagente per le reazioni, e la Tabella 2 mostra l'aritmetica del rapporto DNA per un esempio di poli-trasfezione descritta nel protocollo (metà superiore) e per un possibile esperimento di follow-up (metà inferiore).
1. Preparare le cellule per la trasfezione
- Assicurarsi che la coltura di cellule di rene embrionale umano (HEK293) sia confluente al 60% -80% prima di iniziare il protocollo. Per fare questo, seminare 1 x 106 cellule in una coltura tissutale di 100 mm x 15 mm 2 giorni prima e incubare a 37 ° C con il 5% di CO2.
NOTA: Sebbene il nostro protocollo si concentri sulle cellule HEK293, altri tipi di cellule possono essere sostituiti. - Preparare i mezzi e le cellule per le trasfezioni come descritto di seguito.
- Preriscaldare almeno 20 mL di una soluzione di terreno di aquila modificato (DMEM) di Dulbecco con siero bovino fetale (FBS) al 10% e amminoacidi non essenziali (NEAA; vedere Tabella dei materiali) a 37 °C. Preriscaldare almeno 2,4 mL di tripsina e 2,4 mL di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) a 37 °C. Pre-caldo ridotto siero medio a ~16 °C.
NOTA: Tutti i lavori di coltura tissutale devono essere eseguiti con cura in un armadio di biosicurezza.
- Preriscaldare almeno 20 mL di una soluzione di terreno di aquila modificato (DMEM) di Dulbecco con siero bovino fetale (FBS) al 10% e amminoacidi non essenziali (NEAA; vedere Tabella dei materiali) a 37 °C. Preriscaldare almeno 2,4 mL di tripsina e 2,4 mL di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) a 37 °C. Pre-caldo ridotto siero medio a ~16 °C.
- Risospendere le celle nella soluzione DMEM come descritto di seguito.
- Aspirare e smaltire i supporti attuali. Erogare 2 ml di PBS sulla coltura cellulare HEK293 per lavare le cellule. Aspirare e smaltire il PBS.
- Erogare 2 mL di tripsina sulla coltura cellulare HEK293. Porre la capsula di Petri in un'incubatrice a 37 °C per 3 minuti o fino a quando le cellule non aderiscono più alla capsula. Riportare il piatto nell'armadio di biosicurezza e diluire la soluzione cellulare erogando 8 ml di soluzione DMEM nella piastra.
- Mescolare la soluzione pipettando delicatamente su e giù più volte. Aspirare tutti i fluidi e posizionarli in un tubo conico da 15 ml.
- Centrifugare le celle a 300 x g per 3 minuti per pellettizzarle. Aspirare il mezzo (facendo attenzione a non aspirare le cellule) e scartarlo. Risospendere le cellule in 5 mL di soluzione DMEM, mescolando delicatamente pipettando su e giù.
- Stimare la concentrazione attuale di celle utilizzando un contatore automatico di celle (elencato nella tabella dei materiali). Semina sei pozzetti (in questo esempio) in una piastra da 24 pozzetti con 1 x 105 celle (per una densità di semina di 50.000 cellule / cm2).
- Aggiungere la soluzione DMEM fino a 500 μL (aggiungere prima la soluzione DMEM ai pozzetti), quindi etichettare un pozzetto per trattamento come segue: nessun controllo del colore, controllo mKO2, controllo TagBFP, controllo NeonGreen, controllo di tutti i colori e poli-trasfezione 1. I pozzetti di controllo TagBFP, mKO2 e NeonGreen sono controlli a colore singolo per tutte le proteine fluorescenti incluse nella poli-trasfezione.
2. Esecuzione della trasfezione
- Preparare provette per ogni aggregato di DNA. Mettere da parte i tubi di microcentrifuga da 1,5 ml ed etichettare i tubi come: nessun controllo del colore, controllo mKO2, controllo TagBFP, controllo NeonGreen, controllo di tutti i colori, mix di politrasfezione 1 e mix di politrasfezione 2.
- Aggiungere 36 μL di mezzo sierico ridotto al controllo senza colore, al controllo mKO2, al controllo TagBFP, al controllo NeonGreen e a tutti i tubi di controllo del colore. Aggiungere 18 μL di mezzo sierico ridotto a ciascuna delle provette della miscela di politrasfezione 1 e della miscela di politrasfezione 2.
NOTA: Si presume che le concentrazioni di plasmide siano 150 ng/μL. - Aggiungere 600 ng di plasmide di riempimento al tubo di controllo senza colore. Aggiungere 300 ng di mKO2 e 300 ng di plasmide di riempimento al tubo di controllo del colore mKO2. Aggiungere 300 ng di TagBFP e 300 ng di plasmide di riempimento al tubo di controllo del colore TagBFP.
- Aggiungere 300 ng di plasmide NeonGreen costitutivo e 300 ng di plasmide di riempimento al tubo di controllo del colore NeonGreen. Aggiungere 100 ng ciascuno di mKO2, TagBFP e NeonGreen costitutivo, nonché 300 ng di plasmide di riempimento, al tubo di controllo di tutti i colori.
- Aggiungere 150 ng di mKO2 al tubo di mix 1 di poli-trasfezione. Aggiungere 75 ng di plasmide NeonGreen reporter e 75 ng di plasmide di riempimento al tubo di mix 1 di poli-trasfezione.
- Aggiungere 150 ng di TagBFP al tubo della miscela 2 di politrasfezione. Aggiungere 75 ng di plasmide L7ae e 75 ng di plasmide di riempimento al tubo di miscela 2 di poli-trasfezione.
- Aggiungere 36 μL di mezzo sierico ridotto al controllo senza colore, al controllo mKO2, al controllo TagBFP, al controllo NeonGreen e a tutti i tubi di controllo del colore. Aggiungere 18 μL di mezzo sierico ridotto a ciascuna delle provette della miscela di politrasfezione 1 e della miscela di politrasfezione 2.
- Creare la miscela master di trasfezione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL combinando 216 μL di mezzo sierico ridotto con 9,48 μL di reagente di trasfezione (vedere Tabella 1 per i rapporti dei reagenti e il ridimensionamento della reazione). Mescolare bene pipettando su e giù e mettere da parte.
- Aggiungere 1,58 μL di reagente enhancer a ciascuno dei tubi di controllo del colore senza colore, controllo del colore singolo e tutti i tubi di controllo del colore. Aggiungere 79 μL di reagente enhancer a ciascuno dei tubi di miscela di poli-trasfezione. Mescolare ogni tubo singolarmente pipettando energicamente.
- Aggiungere la miscela master di trasfezione a ciascuna provetta contenente DNA.
- Aggiungere 37,58 μL di master mix di trasfezione a ciascuno dei tubi senza controllo colore, controllo colore singolo e tutti i tubi di controllo colore. Mescolare ogni tubo singolarmente pipettando energicamente.
- Aggiungere 18,79 μL di master mix di trasfezione a ciascuno dei tubi di mix di politrasfezione. Mescolare ogni tubo singolarmente pipettando energicamente.
- Erogare le miscele di trasfezione nei pozzetti.
- Pipettare 65,97 μL di ogni miscela di trasfezione per i controlli senza colore, colore singolo e tutti i colori nei pozzetti corrispondenti.
- Pipetta 32,98 μL della poli-trasfezione mescolare 1 nel pozzetto di poli-trasfezione e ruotare la piastra rapidamente ma delicatamente in un modello a otto figure stretto lungo una superficie piana per distribuire efficacemente i complessi. Quindi, pipettare 32,98 μL della poli-trasfezione mescolare 2 nello stesso pozzo di poli-trasfezione e ruotare la piastra nello stesso modo.
- Porre la piastra in un incubatore a 37 °C, con il 5% di CO2 e senza agitare, per un periodo di 48 ore.
NOTA: Per aumentare la vitalità cellulare, i mezzi cellulari possono essere sostituiti ogni 6 ore dopo la trasfezione (anche se questo non è sempre necessario, e con le cellule HEK293 e i suoi derivati, bisogna fare attenzione a non staccare le cellule dalla piastra quando si cambia il supporto).
| Reagente | Importo | Scalata | ||||
| Mezzo sierico ridotto per la miscela di DNA | 36 μL per tubo di controllo, 18 μL per tubo di politrasfezione | 0,05 μL Riduzione del terreno sierico/ng DNA per provetta, con il 10-20% di volume extra per tenere conto del pipettaggio | ||||
| DNA | 300-600 ng per tubo | |||||
| P3000 | 1,58 μL per tubo di controllo, 0,79 μL per tubo di poli-trasfezione | 0,0022 μL P3000/ng DNA per provetta, con il 10-20% in più | ||||
| Mezzo sierico ridotto per Lipo master mix | 36 μL per tubo di controllo, 18 μL per tubo di politrasfezione | 0,05 μL di terreno sierico ridotto/ng DNA totale, con il 10-20% di volume extra per tenere conto del pipettaggio | ||||
| Reagente di trasfezione e potenziatore | 1,58 μL per tubo di controllo, 0,79 μL per tubo di poli-trasfezione | 0,0022 μL di Lipofectamine 3000/ng DNA, con il 10-20% in più | ||||
Tabella 1: Ridimensionamento del reagente per le trasfezioni. La tabella indica il corretto rapporto di reagente da includere per la quantità di DNA inclusa in un singolo pozzetto. Questo può essere usato per scalare le reazioni in modo efficace e formare master mix. Le quantità di reagente sono state scalate per includere un eccesso del 20%.
3. Preparazione delle cellule per la citometria a flusso
- Preriscaldare almeno 4,2 mL della soluzione DMEM a 37 °C. Preriscaldare almeno 4,2 mL di tripsina e 4,2 mL di PBS a 37 °C. Conservare la soluzione tampone di selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) a 4 °C fino al momento dell'uso.
- Risospendere le cellule nella soluzione tampone FACS (PBS integrato con 1% BSA, 5 mM di acido etilendiamminotetraacetico [EDTA] e 0,1% di azoturo di sodio [NaN3], per ridurre l'aggregazione; vedere Tabella dei materiali) come descritto di seguito.
- Aspirare e smaltire il fluido corrente in ciascun pozzetto. Erogare 5 ml di PBS in ciascun pozzetto per lavare le cellule. Aspirare e smaltire il PBS.
- Erogare 5 mL di tripsina in ciascun pozzetto. Posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 °C per 3 minuti o fino a quando le celle non aderiscono più al piatto. Riportare la piastra nell'armadio di biosicurezza e diluire le soluzioni cellulari erogando 5 ml di soluzione DMEM in ciascun pozzetto.
- Per ogni pozzetto, mescolare la soluzione pipettando delicatamente su e giù più volte. Per ogni pozzetto, aspirare tutti i mezzi e posizionarli in un tubo conico da 15 ml.
- Centrifugare le celle a 300 x g per 3 minuti per pellettizzarle. Aspirare il mezzo, facendo attenzione a non aspirare le cellule e scartarlo. In ogni provetta, risospendere le cellule in 5 mL di soluzione tampone FACS, mescolando delicatamente pipettando su e giù.
- Far passare ogni soluzione di sospensione cellulare attraverso un filtro (per rimuovere i grumi) in tubi conici di citometria a flusso separati. Tenere questi tubi sul ghiaccio per non più di 1 ora ed eseguire la citometria a flusso il prima possibile.
4. Esecuzione della citometria a flusso
NOTA: l'utilizzo di un citometro a flusso richiede una formazione adeguata e la conoscenza dei compiti necessari. Poiché il software e le apparecchiature possono variare e gli utenti devono essere formati in generale, questa sezione fa riferimento a operazioni specifiche che sono utili da eseguire.
- In primo luogo, esaminare le cellule trasfettate con il controllo plasmidico di riempimento (nessun controllo del colore) per selezionare le caratteristiche della cella ed evitare anomalie (inclusi aggregati, detriti, ecc.). Sebbene esistano molte combinazioni di parametri per distinguere le celle, utilizzare le tre opzioni generali seguenti come un buon modo per visualizzare le caratteristiche distintive.
- Osservate l'area di dispersione laterale (scala logaritmica o lineare per preferenza/tipo di cella) rispetto all'area di dispersione diretta (scala lineare).
- Osservate l'altezza di dispersione laterale (scala logaritmica) rispetto alla larghezza di dispersione laterale (scala lineare).
- Osservate la larghezza di dispersione in avanti (scala lineare) rispetto all'altezza di dispersione in avanti (scala lineare).
- Quindi, guarda i controlli a colore singolo. Utilizzare il controllo all color per sintonizzare le tensioni dello strumento, in modo tale che i segnali provenienti da ciascuna proteina fluorescente siano normalizzati in unità arbitrarie equivalenti (u.a.) di fluorescenza. Quindi, eseguire i controlli a colore singolo per ciascuna proteina fluorescente, che vengono utilizzati per impostare la matrice di compensazione, consentendo la correzione del bleed-through.
NOTA: Idealmente, dovrebbe essere visibile l'intera gamma dinamica dei valori di fluorescenza. Un'ulteriore normalizzazione dei segnali proteici fluorescenti può essere effettuata tramite conversione in unità standardizzate (ad esempio, molecole di fluoresceina equivalente [MEFL; vedi Beal et al.15]). Per consentire la conversione MEFL durante l'analisi, eseguire le perle di calibrazione arcobaleno. Tale calibrazione è utile anche per ridurre la variazione del segnale da strumento a strumento e da giorno a giorno16. - Eseguire la provetta di campionamento di poli-trasfezione.
NOTA: Dove possibile, si consiglia di eseguire celle di 1.000 x 10^ (^ = miscele), poiché le poli-trasfezioni di dimensione superiore devono essere suddivise in più contenitori durante l'analisi e ogni contenitore ha bisogno di celle sufficienti (idealmente >10) per fare confronti statisticamente significativi.
5. Esecuzione di analisi post-esperimento
- Inizialmente, utilizzare i dati dei controlli (e, se applicabile, delle perline) per garantire risultati accurati. Utilizzare uno degli strumenti software disponibili per eseguire il gating cellulare sotto tensione (utilizzando i gate descritti sopra), la compensazione e la correzione dell'autofluorescenza.
NOTA: In genere utilizziamo codice MATLAB personalizzato (ad esempio, https://github.com/jonesr18/MATLAB_Flow_Analysis o Cytoflow17), che ha sia un'interfaccia utente grafica che una libreria python adatta per la fase di pre-elaborazione e per l'analisi della poli-trasfezione.
| Metodo | Complesso | ng Marcatore fluorescente | ng L7ae (frazione) | ng Reporter (frazione) | ng DNA di riempimento (frazione) | Totale (ng) |
| Poli-trasfezione 1 | 600 | |||||
| → | 1 | 150 | 75 (½) | 75 (½) | 300 | |
| → | 2 | 150 | 75 (½) | 75 (½) | 300 | |
| Poli-trasfezione 2 | 600 | |||||
| → | 1 | 150 | 25 (1/6) | 125 (5/6) | 300 | |
| → | 2 | 150 | 125 (5/6) | 25(1/6) | 300 |
Tabella 2: quantità di DNA per la poli-trasfezione dimostrate nel protocollo e un esempio di esperimento di follow-up con rapporti plasmidici sintonizzati. La metà superiore della tabella mostra la composizione dei plasmidi utilizzati in un semplice esperimento di poli-trasfezione. La metà inferiore mostra la composizione di un esperimento aggiornato che regola i rapporti plasmidi per sottocampionare meglio uno spazio di concentrazione ipotetico, in cui il modulatore dell'espressione genica è ad un rapporto 1: 5 più ottimale rispetto al suo reporter, producendo più cellule trasfettate da campionare intorno a questo rapporto.
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Representative Results
Nella Figura 1, confrontiamo la co-trasfezione con la poli-trasfezione. In una co-trasfezione, tutti i plasmidi vengono consegnati nello stesso mix di trasfezione, con conseguente alta correlazione tra la quantità di ciascun plasmide che ogni singola cellula riceve (Figura 1A). Mentre il numero di plasmidi totali consegnati a ciascuna cellula varia in modo significativo, la fluorescenza delle due proteine reporter nelle singole cellule in tutta la popolazione è ben correlata, indicando che i due plasmidi vengono co-consegnati ad un rapporto abbastanza costante. Le cellule trasfettate possono assorbire pochi o molti complessi, ma poiché ogni complesso ha quantità correlate di ciascun plasmide, la co-trasfezione esplora solo una piccola regione diagonale dello spazio di concentrazione tra i due plasmidi. Al contrario, in una poli-trasfezione, i plasmidi vengono consegnati in più complessi di trasfezione, con conseguente consegna de-correlata dei plasmidi in diverse miscele di trasfezione (Figura 1B). Le cellule trasfettate assorbono diverse combinazioni dei complessi, risultando in cellule che contengono dosaggi variabili di plasmidi da nessuno dei due, uno o entrambi i complessi.
La Figura 2 mostra un flusso di lavoro rappresentativo della poli-trasfezione. In generale, un esperimento di poli-trasfezione consiste nei seguenti passaggi: definire il problema, creare le miscele di trasfezione, incubare le cellule, citometria a flusso e analisi. C'è anche un passaggio opzionale per ripetere la poli-trasfezione con rapporti di parte ottimizzati se i risultati iniziali della poli-trasfezione non sono in grado di restringere con precisione i rapporti ottimali delle parti. Questi passaggi sono descritti nel protocollo.
Nella Figura 3 vengono forniti alcuni esempi di co- e poli-trasfezioni ben eseguite ed errori comuni. La Figura 3A mostra una co-trasfezione ben eseguita con una stretta correlazione tra TagBFP e plasmidi che esprimono eYFP che sono stati co-consegnati. Al contrario, la co-trasfezione nella Figura 3B mostra una scarsa correlazione tra questi due plasmidi. Nella figura mostrata, la scarsa correlazione è dovuta all'aggiunta di reagente enhancer al mezzo sierico ridotto prima che i plasmidi fossero aggiunti. Tale scarsa correlazione negli esperimenti potrebbe anche essere dovuta a diversi promotori che guidano l'espressione delle proteine fluorescenti, alla scarsa miscelazione durante la creazione della miscela di trasfezione o al permesso al complesso di incubare per un intervallo troppo breve o troppo lungo.
La figura 3C mostra una poli-trasfezione ben eseguita, con una buona copertura dello spazio bidimensionale e una buona compensazione di qualsiasi sanguinamento spettrale tra proteine fluorescenti. La figura 3D mostra i dati di poli-trasfezione con un basso numero di cellule vive, che è difficile da suddividere in un numero sufficiente di contenitori con un numero sufficiente di celle in ciascun contenitore per l'analisi. Per migliorare questo problema, la popolazione cellulare di partenza dovrebbe essere in buona salute e non troppo cresciuta, e la tossicità sperimentale ridotta utilizzando un diverso reagente di trasfezione e / o trasfettando con meno DNA totale. La figura 3E mostra una poli-trasfezione in cui l'efficienza di trasfezione era scarsa, risultando ancora una volta in una scarsa copertura dello spazio bidimensionale per l'analisi. In questo caso, il numero di cellule che passano il gating morfologico è elevato, ma le cellule non esprimono proteine fluorescenti. Per migliorare l'efficienza, la scelta del reagente di trasfezione dovrebbe essere ottimizzata e il protocollo del produttore deve essere seguito attentamente. Ogni miscela di trasfezione deve contenere una quantità equivalente di massa di DNA, assicurando che le cellule abbiano una probabilità approssimativamente uguale di ricevere ogni tipo di complesso, e ogni miscela di trasfezione deve essere realizzata in conformità con le istruzioni del kit. Diversi kit di trasfezione sono ottimali per diversi tipi di cellule; Dovrebbe essere utilizzato il kit che offre la migliore efficienza nel tipo di cella di interesse. Infine, alcuni tipi di cellule sono difficili da trasfettare, indipendentemente dal kit utilizzato. In questi casi, un numero maggiore di cellule dovrebbe essere trasfettato e il maggior numero possibile raccolto durante la citometria a flusso per garantire un numero sufficiente di cellule da analizzare. La figura 3F mostra i dati di poli-trasfezione in cui uno dei marcatori proteici fluorescenti mostra chiaramente il sanguinamento spettrale in un'altra proteina fluorescente. I controlli a colore singolo dovrebbero sempre essere eseguiti per tutte le proteine fluorescenti nel sistema e utilizzati per generare una matrice di compensazione che dovrebbe essere applicata a tutte le poli-trasfezioni prima dell'analisi.
Quando si eseguono esperimenti di poli-trasfezione per la prima volta (in generale o per un nuovo sistema sperimentale), si dovrebbe eseguire il benchmarking rispetto alla co-trasfezione standard. Un approccio consiste nel misurare individualmente la funzione di trasferimento input-output per le parti chiave del sistema utilizzando sia la co-trasfezione (tramite la regolazione dei dosaggi del DNA) che la poli-trasfezione.
Nella Figura 4, dimostriamo il benchmarking del repressore traslazionale L7Ae, adattato qui dalla pubblicazione originale di poli-trasfezione10. L7Ae è una proteina legante l'RNA che riconosce i motivi di curvatura dell'RNA (KT)20; quando due KT (2xKT) sono collocati nella regione 5' non tradotta (UTR) di un mRNA, la traslazione ORF (Downstream Open Reading Frame) può essere efficacemente soppressa da L7Ae21. L7Ae è stato precedentemente utilizzato per costruire classificatori di tipo cellulare basati su RNA21 e altri circuiti basati su RNA22. Per testare L7Ae mediante co-trasfezione standard, è possibile sintonizzare i rapporti dei plasmidi che codificano L7Ae e del suo reporter target all'interno di diversi mix di trasfezione (Figura 4A e Tabella 3). Per la poli-trasfezione, si dovrebbe fornire in modo indipendente L7Ae costitutivo e il corrispondente reporter 2xKT in miscele di trasfezione separate, in modo tale che un'ampia gamma di rapporti plasmidici venga consegnata alle cellule (Figura 4B). Dopo aver eseguito la trasfezione e la citometria a flusso, è possibile eseguire l'analisi dei dati. Per rendere i dati comparabili, è possibile raccogliere i singoli risultati di co-trasfezione in un singolo set di dati, quindi eseguire un binning multidimensionale simile ai dati di poli-trasfezione (Figura 4C,D). Confrontando le curve dose-risposta di L7Ae che reprimono il reporter di output, si può vedere che il livello mediano di output per contenitore è molto simile tra i dati di co-trasfezione e poli-trasfezione (Figura 4E-G).
In generale, abbiamo visto che i dati di poli-trasfezione si correlano bene con i dati di co-trasfezione attraverso ampi rapporti di DNA, con minore precisione a rapporti di dosaggio del DNA altamente distorti (in parte a causa della minore copertura cellulare nei contenitori per esperimenti di poli-trasfezione, specialmente per le parti che sono molto fortemente attive a bassi dosaggi plasmidici). Per migliorare l'accuratezza della misurazione di tali parti sensibili, il loro livello di espressione può essere ridotto con un promotore più debole, frame di lettura aperti a monte18 o sintonizzatori sottili mediati dal silenziamento del microRNA (miSFIT)19.
La Figura 5 dimostra un'applicazione di successo della poli-trasfezione per l'ottimizzazione di un classificatore di tipo cellulare, ancora una volta adattato da Gam et al10. Il classificatore è un disegno relativamente semplice che produce un output in risposta all'espressione di miR-21-5p, un miRNA sovraespresso in molte cellule tumorali23. In assenza di miR-21, l'output del classificatore viene represso da un repressore trascrizionale di derivazione batterica, BM3R124, il cui adattamento ha precedentemente dimostrato di funzionare nelle cellule di mammifero25. Quando miR-21 è presente, lega quattro siti bersaglio posti in entrambi i 3' e 5' UTR di BM3R1, abbattendo la sua espressione e consentendo così la trascrizione dell'output (Figura 5A). Per ottimizzare questo sistema, i tre componenti del circuito sono stati forniti in miscele di trasfezione separate: (1) BM3R1 (con siti target miR-21), (2) reporter di uscita (mKO2) e (3) Gal4-VP16, che attiva la trascrizione dell'uscita (Tabella 4). Si noti che il promotore di uscita opera sulla logica (Gal4-VP16) e non BM3R1, che sopprime l'uscita anche in presenza di Gal4-VP1625. Ogni parte codifica un marcatore di trasfezione, TagBFP, mNeonGreen e iRFP720, rispettivamente, sullo stesso plasmide per indicare il dosaggio relativo del DNA di ciascun complesso. In generale, l'aumento dell'espressione di Gal4-VP16 dovrebbe aumentare l'output mKO2 del reporter, mentre l'aumento dell'espressione di BM3R1 dovrebbe comportare una minore uscita di mKO2. Poiché BM3R1 viene abbattuto da miR-21-5p, l'espressione di uscita dovrebbe essere più alta nelle cellule HeLa, che hanno livelli più elevati di miR-21-5p e quindi esprimono meno BM3R1 rispetto alle cellule HEK.
Dopo la poli-trasfezione in entrambe le cellule HEK293 e HeLa, abbiamo ottenuto una distribuzione 3D di diversi rapporti plasmidici (Figura 5B-cellule HEK). Gam et al.10 hanno sottocampionato questa distribuzione a vari rapporti considerando le cellule entro una particolare distanza euclidea da un rapporto di interesse; Questa distanza dovrebbe essere abbastanza ampia da includere un numero sufficiente di celle per consentire risultati statisticamente significativi dall'analisi, ma abbastanza stretta da evitare che il rumore inutile includa un insieme troppo ampio di rapporti di componenti delle tre parti. Gam et al.10 hanno quindi utilizzato un algoritmo di ottimizzazione per identificare il rapporto tra le parti che massimizzavano l'accuratezza della classificazione per la co-trasfezione (cioè, le cellule HeLa trasfettate sono positive per l'espressione in uscita mentre le cellule HEK trasfettate non lo sono). Il rapporto ottimale delle parti è risultato essere 10.9:1.5:1: Gal4-VP16:output:BM3R1; le cellule sottocampionate attorno al rapporto ottimale all'interno dell'intero spazio di poli-trasfezione sono mostrate nella Figura 5C. Questo sottocampionamento ha previsto che, a questo rapporto, il circuito co-trasfettato ha una specificità del 91%, una sensibilità del 62% e un'accuratezza del 77% quando si classificano le cellule HEK293 rispetto alle cellule HeLa (Figura 5D). La co-trasfezione con rapporti plasmidici impostati su questo ottimale ha prodotto risultati ancora migliori: 99% di specificità, 68% di sensibilità e 84% di accuratezza10. Inoltre, i rapporti hanno guidato l'implementazione di una versione a singolo plasmide del circuito, con espressione relativa sintonizzata utilizzando diversi promotori troncati e ORF a monte (uORF), producendo un circuito con specificità del 91%, sensibilità del 90% e precisione del 90%10. Pertanto, la poli-trasfezione è un potente strumento per guidare la progettazione di classificatori cellulari e circuiti genici in modo più ampio.
Figura 1: Confronto tra co-trasfezione e poli-trasfezione. (A,B) Panoramica e confronto della consegna di plasmidi con co-trasfezione di due plasmidi e poli-trasfezione di due plasmidi. Per ogni metodo di trasfezione, il diagramma più a sinistra mostra la formazione di complessi di trasfezione tra DNA caricato negativamente e lipidi caricati positivamente. In questi esempi, ogni plasmide colorato (blu e rosso) codifica l'espressione di una diversa proteina fluorescente. Il diagramma centrale mostra esempi di consegna del plasmide alle cellule e anche uno schema per le distribuzioni attese in un istogramma o in un grafico a dispersione. L'intensità del colore sull'istogramma corrisponde alla fluorescenza del corrispondente colore plasmide. Il diagramma più a destra mostra dati reali da cellule trasfettate utilizzando ciascun metodo. (A) In una co-trasfezione con due diversi plasmidi, entrambi i plasmidi vengono miscelati insieme prima di aggiungere il reagente di trasfezione, ottenendo un confezionamento altamente correlato delle due specie di plasmidi. Nei dati effettivi di co-trasfezione, le cellule mostrano una consegna correlata di entrambi i plasmidi (a destra). (B) In una poli-trasfezione, ogni serie di plasmidi co-consegnati corrispondenti a una parte del circuito e un marcatore di trasfezione viene miscelato con il reagente di trasfezione separatamente, risultando in complessi che contengono solo quei plasmidi (a sinistra). Nei dati reali di poli-trasfezione, le cellule esplorano una vasta gamma di spazi di concentrazione con molte diverse stechiometrie plasmidiche esplorate simultaneamente (a destra). Questa cifra è stata modificata da10. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Flusso di lavoro della politrasfezione. Passaggio 1: definire il problema. Iniziare con un sistema con più componenti per i quali il rapporto ideale tra le parti è sconosciuto e scegliere un rapporto iniziale tra le parti componenti. Passo 2: Creare i mix di trasfezione. Ogni mix di trasfezione contiene un componente del circuito e un marcatore di trasfezione fluorescente. La quantità di parte del circuito consegnata a una cella è correlata alla fluorescenza del marcatore. Passaggio 3: incubare le cellule. In un flusso di lavoro tipico, incubiamo le cellule per 48 ore tra la trasfezione e la citometria a flusso. Fase 4: citometria a flusso. Eseguire i controlli appropriati, come illustrato nel protocollo, quindi eseguire gli esempi. Passo 5: Analisi.Utilizzare i marcatori di trasfezione per eliminare le celle in base alla quantità o ai rapporti delle parti ricevute dalla cellula. Utilizzare le proteine di uscita per misurare le prestazioni del circuito. Trova i contenitori/rapporti delle parti che ottimizzano le prestazioni del circuito. Passaggio 6: ripetere l'operazione con rapporti di parte ottimizzati (facoltativo). Se i contenitori/rapporti ottimali sono a rapporti altamente inclinati, la poli-trasfezione pilota potrebbe non restringere con precisione i rapporti ottimali delle parti. Ripetete la poli-trasfezione con rapporti di parte sintonizzati, in modo tale che una cella che ha ricevuto una quantità uguale di ciascuna miscela di trasfezione ora riceva un rapporto di parti vicino all'ottimale, come determinato dal round precedente. Questa cifra è stata modificata da10. L'immagine di un'incubatrice è stata utilizzata da Servier Medical Art e l'immagine di un citometro da BioRender. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Risultati rappresentativi positivi e negativi della poli-trasfezione . (A) Co-trasfezione ben eseguita di due reporter fluorescenti, che mostrano una stretta correlazione. Un totale di 20.000 celle sono tracciate sia qui che in (B) per il confronto. È una buona idea eseguire una piccola co-trasfezione di prova simile di due reporter fluorescenti prima di iniziare un esperimento di poli-trasfezione, per garantire che i plasmidi siano ben correlati all'interno delle miscele di trasfezione. (B) Co-trasfezione più rumorosa: i plasmidi non sono ben correlati all'interno di ciascuna miscela di trasfezione, il che può far sì che i marcatori fluorescenti in una poli-trasfezione siano uno scarso marker dei rapporti plasmidici. (C) Risultati di poli-trasfezione ben eseguiti che mostrano un buon numero di cellule, efficienza di trasfezione e compensazione. (D) Basso numero di cellule vive, che non consente il sottocampionamento in contenitori con un numero statisticamente significativo di cellule. (E) Scarsa efficienza di trasfezione, che non consente il sottocampionamento in contenitori con un numero statisticamente significativo di cellule. (F) Mancanza di un'adeguata compensazione, che fa sì che i dati di fluorescenza siano un indicatore scarso della quantità di proteina fluorescente nel sistema. Utilizzare i controlli a colore singolo per determinare una matrice di compensazione lineare ideale e applicarla ai dati prima di un'ulteriore elaborazione. Tutti i controlli del colore sono consigliati anche a seconda della scelta del software. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Benchmarking della poli-trasfezione con la co-trasfezione. (A) In una co-trasfezione, un rapporto tra repressore traslazionale L7Ae e plasmidi reporter fluorescenti può essere testato in ciascun pozzetto sperimentale. (B) Nella poli-trasfezione, molti rapporti di L7Ae rispetto ai giornalisti possono essere testati nello stesso pozzo. Vedere la Tabella 3 per i dettagli delle miscele di plasmidi poli-trasfezione. (C,D) Flusso di lavoro di binning per il benchmarking della poli-trasfezione con più co-trasfezioni. Un totale di 10 contenitori biesponenziali sono stati assegnati per ogni dimensione del marcatore di trasfezione, che approssimano i livelli di ciascuno dei due plasmidi. Qui vengono mostrati i contenitori che indicano diversi livelli di plasmide #2. Il binning è stato eseguito sia su un set collazionato di 11 campioni di co-trasfezione che coprono vari rapporti plasmidici (C) sia su dati provenienti da una singola poli-trasfezione, comprendente circa 500.000 cellule ciascuno (D). I colori corrispondono a insiemi di contenitori definiti dai livelli del gene 2 (TagBFP). (E-G) Benchmarking della poli-trasfezione con la co-trasfezione per un circuito rappresentativo. La fluorescenza mediana in uscita è stata valutata per le cellule in ciascun contenitore e confrontata tra i metodi per il sistema rappresentativo, la repressione traslazionale L7Ae. (E) Costrutti per misurare l'attività di L7Ae. La fluorescenza mKO2 serve come stima per la consegna di L7Ae (gene #1), mentre la fluorescenza TagBFP serve come stima per la consegna dell'output regolato di mNeonGreen (gene #2). (F) Curve di titolazione multidimensionali per L7Ae. Ogni riga rappresenta l'insieme di contenitori a un livello di TagBFP, come indicato in (C) e (D). Le linee continue indicano i dati di poli-trasfezione, mentre le linee tratteggiate indicano i dati di co-trasfezione. Ad ogni livello legato del plasmide reporter, l'output del reporter diminuisce all'aumentare di L7Ae. (G) Confronto visivo tra co-trasfezione e poli-trasfezione per il sistema L7Ae. Ogni punto rappresenta l'output misurato nei contenitori corrispondenti per le misure di poli-trasfezione e co-trasfezione, dove valori più equivalenti sono più vicini alla linea rossa 1:1. Nel complesso, le differenze osservate tra poli-trasfezione e co-trasfezione derivate sono basse, il che fornisce fiducia nell'affidabilità del metodo di poli-trasfezione. Questa cifra è stata modificata da10. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Analisi dei dati per la poli-trasfezione. Nella poli-trasfezione, le celle possono essere raggruppate in contenitori o fette per l'analisi. La Figura 4 mostra una forma di analisi in cui le cellule sono legate in sezioni che corrispondono ai livelli di un componente del sistema, come il livello del plasmide reporter, che può essere utile per l'adattamento del modello e la comprensione delle risposte di dosaggio. Un'altra strategia utile è quella di analizzare le prestazioni del circuito a diversi rapporti di componenti del circuito. (A) Diagramma di un circuito classificatore per l'ottimizzazione. I livelli di TagBFP, NeonGreen e iRFP720 corrispondono rispettivamente ai livelli di BM3R1, output mKO2 e Gal4-VP16. Vedere la Tabella 4 per i dettagli delle miscele di plasmidi di poli-trasfezione. (B) Messa a punto sperimentale di miscele di poli-trasfezione. (C) Dati di citometria a flusso raccolti dalla poli-trasfezione con il circuito in (A). I livelli di ciascuna delle tre proteine fluorescenti reporter come risultato della poli-trasfezione del circuito nelle cellule HEK, mostrando l'ampia gamma di rapporti di componenti del circuito presenti nei dati. Risultati simili sono stati ottenuti dalla trasfezione del circuito in entrambe le cellule HEK e HeLa. (D) Sottocampionamento di poli-trasfezione ad un rapporto particolare. Per analizzare i dati, abbiamo scansionato un gran numero di rapporti tra i componenti del circuito e determinato le prestazioni del classificatore in ciascun rapporto. Ad esempio, mostriamo qui un particolare rapporto che ha dimostrato buone prestazioni (Gal4-VP16 = 435 ng di DNA, reporter = 60 ng e BM3R1 = 40 ng). Tracciato in blu è il rapporto corrispondente dei marcatori fluorescenti per i tre diversi componenti del circuito. Successivamente, abbiamo sottocampionato i dati considerando solo i punti all'interno di una particolare distanza euclidea dalla traiettoria di fluorescenza. Abbiamo sottocampionato le cellule alla stessa traiettoria da entrambe le trasfezioni HEK e HeLa. (E) Confronto delle prestazioni del circuito alla stessa traiettoria nelle celle HEK e HeLa. Confrontando statistiche come sensibilità, specificità e accuratezza della classificazione in molti rapporti, i rapporti dei componenti possono essere ottimizzati per generare un circuito genetico ideale. Questa cifra è stata modificata da10. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Complesso | ng plasmide L7Ae | ng Reporter plasmide | OptiMEM (μL) | P3000 (μL) | Lipo 3000 (μL) |
| 1 | 250 | 75 | 1.5 | 1.5 | |
| 2 | 250 | 75 | 1.5 | 1.5 |
Tabella 3: Miscele di trasfezione corrispondenti alla figura 4. Le cellule HEK293 sono state poli-trasfettate con queste miscele di trasfezione in un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti.
| Complesso | ng BM3R1 plasmide | ng Gal4-VP16 plasmide | ng Reporter plasmide | OptiMEM (μL) | P3000 (μL) | Lipo 3000 (μL) |
| 1 | 900 | 75 | 1.5 | 1.5 | ||
| 2 | 900 | 75 | 1.5 | 1.5 | ||
| 3 | 900 | 75 | 1.5 | 1.5 |
Tabella 4: Miscele di trasfezione corrispondenti alla figura 5. HEK293 e HeLa Cells sono state ciascuna poli-trasfettata con queste miscele di trasfezione in un pozzetto ciascuna di una piastra a 6 pozzetti.
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Discussion
I metodi di prototipazione rapida come la progettazione assistita da computer (CAD), il breadboard e la stampa 3D hanno rivoluzionato le discipline meccaniche, elettriche e di ingegneria civile. La capacità di cercare rapidamente tra molte possibili soluzioni a una determinata sfida accelera notevolmente i progressi in un campo. Riteniamo che la poli-trasfezione sia una tecnologia analoga per l'ingegneria biologica, che consente la prototipazione rapida dei circuiti genetici. Inoltre, altre tecnologie di prototipazione rapida richiedono l'iterazione sequenziale pratica di più soluzioni possibili, mentre la poli-trasfezione è in grado di esplorare molte soluzioni contemporaneamente. La poli-trasfezione consente di testare un gran numero di combinazioni di rapporti di componenti del circuito genetico in un singolo pozzetto ed è stata utilizzata per ottimizzare diversi circuiti genetici pubblicati10,11,13. Il protocollo sperimentale è una semplice estensione della co-trasfezione standard, consentendo l'adozione diretta da parte di molti ricercatori di cellule di mammifero. In generale, si vede un accordo molto stretto tra i risultati della poli-trasfezione e della co-trasfezione10 (un esempio è la Figura 4). Pertanto, la poli-trasfezione può essere utilizzata nella maggior parte dei casi in cui i rapporti plasmidici sono titolati all'interno di miscele di co-trasfezione e le uscite sono misurate a livello di singola cellula.
La complessità e la scala della poli-trasfezione aumentano con la complessità dei circuiti genetici da ottimizzare. All'aumentare del numero di dimensioni da analizzare, i rapporti combinatori delle diverse parti e il numero di celle necessarie per la loro analisi aumentano esponenzialmente. Ad esempio, per ottimizzare il classificatore nella Figura 5, le celle sono state trasfettate in un formato di piastra a 6 pozzetti e i dati sono stati raccolti su almeno 1,5 milioni di celle vive. Abbiamo anche ottimizzato un classificatore con un componente circuitale aggiuntivo 10, che richiede la trasfezione su una scala di piastre di10 cm e la raccolta di milioni di celle. A quella scala e oltre, la produzione di DNA richiede molto tempo e i reagenti di trasfezione sono costosi. Detto questo, la poli-trasfezione utilizza ordini di grandezza in meno di cellule, DNA e reagenti di trasfezione rispetto al test di un numero comparabile di combinazioni di rapporti di componenti del circuito nei singoli pozzetti. Inoltre, viene risparmiata una notevole quantità di tempo effettuando ordini di grandezza in meno di miscele di trasfezione.
La poli-trasfezione consente metodi di analisi avanzati per i dati di citometria a flusso. I due approcci principali sono (1) binning delle cellule in base all'espressione di ciascun marcatore di trasfezione e (2) estrazione di cellule a rapporti definiti di marcatori di trasfezione, simulando così la co-trasfezione. Il primo seleziona le cellule con una specifica combinazione di dosaggio del DNA per ogni complesso (e quindi ogni parte), producendo funzioni di trasferimento input-output. Quest'ultimo seleziona le cellule in un rapporto specifico di dosaggi di DNA per ciascuna parte, simulando la co-trasfezione a tale rapporto di masse di DNA plasmide. Tracciando il livello di espressione dei reporter di uscita del circuito nelle selezioni sottocampionate si ottiene una misura dell'output ai livelli o ai rapporti definiti degli ingressi. Per l'ottimizzazione del circuito, è possibile identificare i bin/rapporti più performanti definiti dallo scopo del circuito: nel caso dei classificatori di celle, questi sono i bin/rapporti in cui il circuito è ON nel tipo di cella target e OFF nei tipi di celle non target. Quando si sceglie una dimensione del contenitore, si dovrebbe prendere in considerazione il livello di precisione richiesto, nonché il numero di celle per contenitore. I contenitori più piccoli si concentrano sulla combinazione ideale di componenti del circuito in modo più preciso, ma se un contenitore ha troppe poche celle, può introdurre rumore indesiderato nelle misurazioni.
I futuri miglioramenti nell'analisi computazionale dei dati di poli-trasfezione potrebbero facilitare l'ottimizzazione anche con una bassa copertura cellulare per bin/ratio. Attualmente, escludiamo i dati dai contenitori con meno di una soglia impostata di celle (ad esempio, 10) per evitare misurazioni eccessivamente rumorose. In combinazione con misurazioni ripetute, ciò consente calcoli più accurati e precisi delle curve dose-risposta, delle precisioni del classificatore e di altre metriche definite su base per-bin. Tuttavia, ogni cella in poli-trasfezione può essere considerata un esperimento indipendente, che misura ad una risoluzione fine le uscite del circuito a un livello preciso di ingressi. Con questo in mente, i modelli meccanicistici e fenotipici delle risposte alla dose e delle ottimizzazioni dei circuiti possono adattarsi direttamente alla distribuzione dell'espressione genica da ciascun marcatore e reporter, piuttosto che alle loro statistiche riassuntive binned10. Ciò consente misurazioni più affidabili e sfrutta i numerosi punti dati individuali raccolti per esperimento. Tali approcci di modellazione potrebbero quindi produrre caratterizzazione e ottimizzazione dei circuiti predittivi anche con poli-trasfezioni ad alta dimensione scarsamente campionate. Inoltre, i metodi di apprendimento automatico come la metodologia della superficie di risposta e la regressione casuale della foresta possono essere utilizzati per analizzare dati relativamente scarsi e ad alta dimensione10.
Un approccio alternativo alle poli-trasfezioni sempre più grandi è quello di ottimizzare sequenzialmente i circuiti utilizzando gerarchie di poli-trasfezioni. In questo approccio, in primo luogo, la poli-trasfezione viene utilizzata per ottimizzare un modulo che comprende un sottoinsieme di componenti genetiche all'interno di un circuito più ampio. Quindi, questi moduli ottimizzati vengono forniti come miscele di poli-trasfezione separate, consentendo di trovare il rapporto / dosaggio ottimale di ciascun modulo del circuito. Questo approccio utilizza un numero significativamente inferiore di cellule, DNA e reagenti di trasfezione. Tuttavia, i gruppi di componenti non sono necessariamente modulari rispetto ad altri componenti, e quindi un rapporto ottimale di componenti in un modulo misurato isolatamente potrebbe essere subottimale all'interno del contesto del circuito più ampio8.
I metodi di poli-trasfezione sono anche limitati dalla configurazione laser/filtro del citometro a flusso utilizzato per raccogliere i dati. Oltre alle uscite fluorescenti misurate, ogni miscela di trasfezione contiene un marcatore proteico fluorescente. Pertanto, è fondamentale selezionare proteine fluorescenti che possono essere ben compensate sul citometro. In precedenza abbiamo analizzato sistematicamente il bleed-through di un pannello di 22 proteine fluorescenti su un citometro a flusso a cinque laser (il BD LSRFortessa) e abbiamo scoperto che il set di Sirius, TagBFP, mNeonGreen, mKO2 e iRFP720 potrebbe essere utilizzato insieme e compensato bene senza problemi significativi10. Tuttavia, l'ottimizzazione di circuiti più grandi può richiedere metodi di citometria avanzati, come la citometria spettrale per separare le proteine fluorescenti con più spettri sovrapposti, che il nostro laboratorio sta attualmente ottimizzando con un massimo di otto proteine fluorescenti. Database come il fluorescent protein database (https://www.fpbase.org) sono utili per selezionare proteine fluorescenti con particolare sovrapposizione spettrale. Tuttavia, questo processo può essere complicato da vari fattori, alcuni dei quali sono specifici per particolari citometri. Ad esempio, l'uso di alcune proteine rosse come tdTomato può provocare sanguinamento indesiderato nei canali blu solo in determinate configurazioni laser / filtro10. Inoltre, diverse proteine lontan-red hanno mostrato relazioni non lineari tra il dosaggio del DNA e l'output di fluorescenza10, riducendo il loro uso come marcatori efficaci per il dosaggio del DNA.
Per coerenza tra gli esperimenti che vengono eseguiti con un numero variabile di complessi (uno, due, tre, ecc.), è utile utilizzare la stessa quantità frazionaria di plasmide per miscela di trasfezione. Ad esempio, se si testa un sistema a tre geni con ciascun gene codificato in uno dei tre plasmidi (A, B e C), si potrebbe co-trasfettare i plasmidi del circuito con un rapporto 1: 1: 1 insieme a un rapporto uguale di un plasmide che codifica un marcatore di trasfezione. Ciò renderebbe ogni plasmide un quarto della massa totale della miscela, e quindi circa un quarto della massa di ciascun complesso di trasfezione che si forma. Quando si poli-trasfettano A, B e C in complessi separati con i propri reporter, invece di mescolare i plasmidi 1: 1 con i reporter o mantenere la loro massa totale del DNA, è più coerente mantenere ciascun plasmide a un quarto della massa di ciascun complesso, con il DNA di riempimento che occupa la massa rimanente (vedi Tabella 5 per esempi). Questo perché la distribuzione dell'espressione genica tra le cellule trasfettate dipende meno dalla massa totale di DNA consegnato nei complessi e più dalla quantità frazionaria di DNA in ciascun complesso10. Se si desiderano rapporti diversi da 1:1:1, calcolare le frazioni corrispondenti della massa totale del DNA nella miscela di trasfezione per ciascuna parte. Ad esempio, la tabella 5 [in basso] mostra un rapporto 1:1:4.
| Metodo | Complesso | ng A (frazione) | ng B (frazione) | ng C (frazione) | ng Reporter (frazione) | ng DNA di riempimento (frazione) | Totale (ng) |
| Co-trasfezione | 1 | 150 (¼) | 150 (¼) | 150 (¼) | 150 (¼) | 0 (0) | 600 |
| Poli-trasfezione | 600 | ||||||
| → | 1 | 50 (¼) | 50 (¼) | 100 (½) | 200 | ||
| → | 2 | 50 (¼) | 50 (¼) | 100 (½) | 200 | ||
| → | 3 | 50 (¼) | 50 (¼) | 100 (½) | 200 | ||
| Co-trasfezione | 1 | 75 (⅛) | 75 (⅛) | 300 (½) | 150 (¼) | 0 (0) | 600 |
| Poli-trasfezione | 600 | ||||||
| → | 1 | 25 (⅛) | 50 (¼) | 125 (⅝) | 200 | ||
| → | 2 | 25 (⅛) | 50 (¼) | 125 (⅝) | 200 | ||
| → | 3 | 100 (½) | 50 (¼) | 50 (¼) | 200 |
Tabella 5: Esempi di utilizzo del DNA di riempimento per la coerenza tra esperimenti di co- e poli-trasfezione. Qui, vengono mostrati due esempi generici di co-trasfettazione di tre plasmidi con la stessa quantità di DNA di riempimento. Nell'esempio in alto, i plasmidi sono tutti a masse uguali. Nell'esempio in basso, un plasmide viene erogato ad una massa superiore rispetto agli altri. La frazione di DNA totale che verrebbe utilizzata in un complesso di co-trasfezione viene trasmutata in complessi di poli-trasfezione, con la quantità rimanente di DNA (fino alla quantità totale per ciascun complesso, che è fissa e uguale tra i complessi) costituita con DNA di riempimento.
L'obiettivo generale del DNA di riempimento è quello di mantenere dosaggi simili di plasmidi per cellula, indipendentemente dal numero di miscele di trasfezione uniche. Come approssimazione approssimativa di questo principio, separare tre plasmidi in tre miscele mantenendo la stessa massa di DNA di ciascuno (e il rapporto appropriato del reagente di trasfezione) riduce la percentuale di cellule che ricevono un dato complesso di un terzo rispetto a una singola miscela contenente tutti e tre i plasmidi. Tuttavia, ogni cellula trasfettata riceve successivamente un dosaggio genico ~ 3 volte superiore. Ridurre la quantità relativa dei plasmidi da soli senza DNA di riempimento è quindi insufficiente per mantenere dosaggi plasmidi coerenti, in quanto ciò diminuisce semplicemente l'efficienza della trasfezione senza alterare la distribuzione sottostante dell'espressione tra le cellule trasfettate10. D'altra parte, il DNA di riempimento consente di regolare il dosaggio del DNA senza influire sull'efficienza complessiva della trasfezione (sebbene le cellule trasfettate rilevabili possano diminuire a causa del segnale inferiore)10. Seguendo l'approssimazione grezza di cui sopra, riducendo la frazione di DNA nelle miscele di poli-trasfezione a un terzo e aggiungendo DNA di riempimento mantiene i dosaggi genici relativi rispetto alla co-trasfezione originale. Il Filler DNA garantisce quindi una formazione efficiente e accurata del complesso di trasfezione.
Per alterare il range di espressione di un gene di interesse coperto dal suo reporter, la frazione di ciascun plasmide e/o promotore utilizzato per guidare il gene può essere sintonizzata rispetto al reporter. Se una parte è forte/altamente attiva a bassi dosaggi di DNA, l'uso di una frazione di DNA inferiore può aiutare a centrare la gamma dinamica della parte nel mezzo della distribuzione di fluorescenza del reporter nelle cellule trasfettate. Allo stesso modo, per le parti che sono deboli / attive solo a dosi elevate di DNA, può essere utile utilizzare una frazione più alta. Tuttavia, bisogna fare attenzione con tale sintonizzazione, poiché ridurre troppo le frazioni di DNA aumenta la stocasticità del rilascio alle cellule rispetto al reporter10, e alti livelli di espressione genica possono sovraccaricare il macchinario di espressione genica cellulare12,14. Per evitare la stocasticità, e nei casi in cui ogni gene viene consegnato alle cellule ad un rapporto fisso (ad esempio, se il circuito deve essere generato come un singolo vettore lenti, PiggyBac o Landing Pad), l'espressione relativa di ciascun gene può essere regolata usando promotori più forti / più deboli, piccoli uORF18 e / o miSFIT19.
Sebbene il protocollo descriva una tecnica di trasfezione inversa, la poli-trasfezione è possibile anche con la trasfezione in avanti. Nella trasfezione inversa, le cellule sono simultaneamente seminate e trasfettate; Nella trasfezione diretta, le cellule vengono trasfettate ~ 24 ore dopo la prima placcatura a circa la metà della densità che verrebbe utilizzata nella trasfezione inversa (per consentire la divisione cellulare al momento della trasfezione). In generale, la trasfezione inversa è più efficiente ma anche più tossica, e abbiamo notato alcune differenze nella forma delle distribuzioni di trasfezione in base al reagente, al tempo di trasfezione e alla linea cellulare. Pertanto, il metodo di trasfezione scelto dovrebbe essere ottimizzato per ciascuna linea cellulare per massimizzare il numero di cellule trasfettate e la copertura dello spazio di concentrazione multidimensionale dei dosaggi plasmidi per cellula.
Nel complesso, la poli-trasfezione consente la rapida ottimizzazione dei circuiti genetici dei mammiferi. Molte possibili combinazioni raziometriche dei componenti del circuito possono essere facilmente testate in un singolo pozzetto. Inoltre, poiché la poli-trasfezione contiene più informazioni sui livelli di ciascuna parte in un sistema rispetto a una trasfezione convenzionale, è stato trovato molto prezioso per caratterizzare il comportamento di varie parti genetiche10,11,12,13. Si prevede che l'adozione della poli-trasfezione accelererà il ritmo di sviluppo di circuiti genici nuovi e migliorati da utilizzare nelle cellule di mammifero.
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Disclosures
R.W. è co-fondatore di Strand Therapeutics e Replay Bio; R.W. e R.J. hanno depositato un brevetto provvisorio relativo a un classificatore di tipo cellulare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare gli ex membri del Weiss Lab che hanno guidato o contribuito allo sviluppo del metodo della poli-trasfezione e alla sua applicazione ai classificatori cellulari: Jeremy Gam, Bre DiAndreth e Jin Huh; altri membri del laboratorio Weiss che hanno contribuito all'ulteriore sviluppo/ottimizzazione del metodo: Wenlong Xu, Lei Wang e Christian Cuba-Samaniego; Il Prof. Josh Leonard e i membri del gruppo, tra cui Patrick Donahue e Hailey Edelstein, per aver testato la poli-trasfezione e fornito feedback; e la Prof.ssa Nika Shakiba per aver invitato questo manoscritto e aver fornito feedback. Vorremmo anche ringraziare il National Institutes of Health [R01CA173712, R01CA207029, P50GM098792]; National Science Foundation [1745645]; Cancer Center Support (core) Grant [P30CCA14051, in parte] dal NCI e National Institutes of Health [P50GM098792] per il finanziamento di questo lavoro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15mL Corning Falcon conical tubes | ThermoFisher Scientific | 14-959-53A | |
| 24-well petri dish | Any company of choice | (Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free) | |
| Bovine serum albumin | NEB | B9000S | |
| Centrifuge | Any company of choice | Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX2000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | |
| Cytoflow | Non-commercial software package | https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/# | |
| DMEM | VWR | 10-013-CV | Use the correct media for your cell type |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 03690-100ML | |
| Fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F4135 | |
| HEK cells | ATCC | CRL-1573 | Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently. |
| HeLa cells | ATCC | CRL-12401 | Use the relevant cell type for your experiments. |
| Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer | ThermoFisher Scientific | L3000001 | Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent |
| LSRFortessa flow cytometer | BD Biosciences | N/A | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
| Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | Any company of choice | ||
| Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985070 | reduced serum medium |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Rainbow calibration beads | Spherotech | URCP-100-2H | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Trypsin | VWR | 25-053-CI |
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