Summary
Komplexa genetiska kretsar är tidskrävande att designa, testa och optimera. För att underlätta denna process transfekteras däggdjursceller på ett sätt som möjliggör testning av flera stökiometrier av kretskomponenter i en enda brunn. Detta protokoll beskriver stegen för experimentell planering, transfektion och dataanalys.
Abstract
Däggdjurs genetiska kretsar har visat potentialen att känna av och behandla ett brett spektrum av sjukdomstillstånd, men optimering av nivåerna av kretskomponenter är fortfarande utmanande och arbetsintensiv. För att påskynda denna process utvecklade vårt laboratorium polytransfektion, en förlängning med hög genomströmning av traditionell däggdjurstransfektion. Vid polytransfektion utför varje cell i den transfekterade populationen i huvudsak ett annat experiment, testar kretsens beteende vid olika DNA-kopieringsnummer och tillåter användare att analysera ett stort antal stökiometrier i en enkelpottreaktion. Hittills har polytransfektioner som optimerar förhållandena för trekomponentkretsar i en enda brunn av celler visats; I princip kan samma metod användas för utveckling av ännu större kretsar. Polytransfektionsresultat kan enkelt tillämpas för att hitta optimala förhållanden mellan DNA och samtransfekt för transienta kretsar eller för att välja uttrycksnivåer för kretskomponenter för generering av stabila cellinjer.
Här demonstrerar vi användningen av polytransfektion för att optimera en trekomponentkrets. Protokollet börjar med experimentella designprinciper och förklarar hur polytransfektion bygger på traditionella samtransfektionsmetoder. Därefter utförs polytransfektion av celler och följs av flödescytometri några dagar senare. Slutligen analyseras data genom att undersöka skivor av encellsflödescytometridata som motsvarar delmängder av celler med vissa komponentförhållanden. I labbet har polytransfektion använts för att optimera cellklassificerare, återkopplings- och feedforward-kontroller, bistabila motiv och många fler. Denna enkla men kraftfulla metod påskyndar designcykler för komplexa genetiska kretsar i däggdjursceller.
Introduction
Området syntetisk biologi hos däggdjur har snabbt utvecklats, från att utveckla enkla sense-and-respond-delar i odlade cellinjer till optimering av komplexa nätverk av gener för att ta itu med verkliga utmaningar inom diagnostik och terapi1. Dessa sofistikerade kretsar kan känna av biologiska ingångar från mikroRNA-profiler till cytokiner till småmolekylära läkemedel och implementera logiska bearbetningskretsar inklusive transistorer, bandpassfilter, vippomkopplare och oscillatorer. De har också visat lovande resultat i djurmodeller av sjukdomar som cancer, artrit, diabetes och många fler 1,2,3,4,5. Men när komplexiteten hos en krets växer blir optimering av nivåerna för var och en av dess komponenter alltmer utmanande.
En särskilt användbar typ av genetisk krets är en cellklassificerare, som kan programmeras för att känna av och svara på cellulära tillstånd. Selektiv produktion av protein- eller RNA-utgångar i specifika cellulära tillstånd är ett kraftfullt verktyg för att styra och programmera differentiering av celler och organoider, identifiera och förstöra sjuka celler och / eller oönskade celltyper och reglera funktionen hos terapeutiska celler 1,2,3,4,5 . Att skapa kretsar i däggdjursceller som exakt kan klassificera celltillstånd från flera cellulära RNA och / eller proteinarter har dock varit mycket utmanande.
Ett av de mest tidskrävande stegen för att utveckla en cellklassificeringskrets är att optimera de relativa uttrycksnivåerna för enskilda komponentgener, såsom sensorer och bearbetningsfaktorer, inom kretsen. För att påskynda kretsoptimering och möjliggöra konstruktion av mer sofistikerade kretsar har nyligen arbete använt matematisk modellering av cellklassificerarkretsar och deras komponenter för att förutsäga optimala kompositioner och topologier 6,7. Även om detta hittills har visat kraftfulla resultat, begränsas matematisk analys av behovet av att systematiskt karakterisera input-output-beteendet hos komponentgener i kretsen, vilket är tidskrävande. Vidare kan en myriad av kontextberoende problem uppstå i komplexa genetiska kretsar, vilket gör att beteendet hos en hel krets trotsar förutsägelser baserade på enskilda delkarakteriseringar 8,9.
För att snabbare utveckla och testa komplexa däggdjurskretsar som celltillståndsklassificerare utvecklade vårt laboratorium en teknik som kallas polytransfektion10, en utveckling av plasmid-samtransfektionsprotokoll. Vid samtransfektion komplexiseras flera plasmid-DNA-arter tillsammans med ett positivt laddat lipid- eller polymerreagens och levereras sedan till celler på ett korrelerat sätt (figur 1A). Vid polytransfektion komplexiseras plasmider separat med reagenset, så att DNA från varje transfektionskomplex levereras till celler på ett dekorrelerat sätt (figur 1B). Med hjälp av denna metod utsätts celler inom den transfekterade populationen för många kombinationer av förhållanden mellan två eller flera DNA-nyttolaster som bär olika kretskomponenter.
För att mäta förhållandena mellan kretskomponenter som levereras till varje cell innehåller varje transfektionskomplex inom en polytransfektion en konstitutivt uttryckt fluorescerande reporter som fungerar som en proxy för cellulärt upptag av komplexet. Filler-DNA som inte innehåller några element som är aktiva i en däggdjurscell används för att ställa in den relativa mängden fluorescerande reporter och kretskomponenter som levereras till en cell i ett enda transfektionskomplex och diskuteras mer detaljerat i diskussionen. Ett exempel på fyllnads-DNA som används i Weiss-laboratoriet är en plasmid som innehåller en terminatorsekvens, men ingen promotorisk, kodande sekvens etc. Celler med olika förhållanden av kretskomponenter kan sedan jämföras för att hitta optimala förhållanden för genkretsfunktion. Detta ger i sin tur användbara förutsägelser för att välja promotorer och andra kretselement för att uppnå optimala genuttrycksnivåer när man kombinerar kretskomponenter till en enda vektor för genetisk integration (t.ex. ett lentivirus, transposon eller landningsplatta). Således, istället för att välja förhållanden mellan kretskomponenter baserat på intuition eller via en tidskrävande försök och felprocess, utvärderar polytransfektion ett brett spektrum av stökiometrier mellan genetiska delar i en enkelpottreaktion.
I vårt laboratorium har polytransfektion möjliggjort optimering av många genetiska kretsar, inklusive cellklassificerare, återkopplings- och feedforward-kontroller och bistabila motiv. Denna enkla men kraftfulla metod påskyndar avsevärt designcykler för komplexa genetiska kretsar i däggdjursceller. Polytransfektion har sedan dess använts för att karakterisera flera genetiska kretsar för att avslöja deras flerdimensionella input-output-överföringsfunktioner vid hög upplösning10, optimera en alternativ kretstopologi för celltillståndsklassificering 11 och påskynda olika publicerade12,13 och pågående projekt.
Här beskriver och skildrar vi arbetsflödet för att använda polytransfektion för att snabbt optimera en genetisk krets (Figur 2). Protokollet visar hur man genererar högkvalitativa polytransfektionsdata och undviker flera vanliga fel i polytransfektionsprotokollet och dataanalysen (figur 3). Den visar sedan hur man använder polytransfektion för att karakterisera enkla kretskomponenter och, i processen, jämföra polytransfektionsresultat mot samtransfektion (figur 4). Slutligen visar resultaten av polytransfektion optimering av cancerklassificeringskretsen (figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Tabell 1 och tabell 2 tjänar som viktiga referenser för detta protokoll. Tabell 1 visar reagensskalning för reaktioner, och tabell 2 visar DNA-kvot aritmetik för ett exempel på polytransfektion som beskrivs i protokollet (övre halvan) och för ett eventuellt uppföljningsexperiment (nedre halvan).
1. Förbereda celler för transfektion
- Se till att kulturen av humana embryonala njurceller (HEK293) är 60% -80% konfluent innan protokollet initieras. För att göra detta, frö 1 x 106 celler i en 100 mm x 15 mm vävnadskultur petriskål 2 dagar före och inkubera vid 37 ° C med 5% CO2.
OBS: Även om vårt protokoll fokuserar på HEK293-celler kan andra celltyper ersättas. - Förbered media och celler för transfektioner enligt beskrivningen nedan.
- Förvärm minst 20 ml av en lösning av Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM) med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% icke-essentiella aminosyror (NEAA; se materialtabell) till 37 °C. Förvärm minst 2,4 ml trypsin och 2,4 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till 37 ° C också. Förvärm reducerat serummedium till ~16 °C.
OBS: Allt vävnadsodlingsarbete ska utföras med försiktighet i ett biosäkerhetsskåp.
- Förvärm minst 20 ml av en lösning av Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM) med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% icke-essentiella aminosyror (NEAA; se materialtabell) till 37 °C. Förvärm minst 2,4 ml trypsin och 2,4 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till 37 ° C också. Förvärm reducerat serummedium till ~16 °C.
- Resuspendera cellerna i DMEM-lösningen enligt beskrivningen nedan.
- Aspirera och kassera nuvarande media. Dispensera 2 ml PBS på HEK293-cellkulturen för att tvätta cellerna. Aspirera och kassera PBS.
- Dispensera 2 ml trypsin på HEK293-cellkulturen. Placera petriskålen i en inkubator vid 37 °C i 3 minuter eller tills cellerna inte längre fastnar på skålen. Sätt tillbaka skålen i biosäkerhetsskåpet och späd celllösningen genom att dosera 8 ml DMEM-lösning i plattan.
- Blanda lösningen genom att försiktigt pipettera upp och ner flera gånger. Aspirera alla medier och placera det i ett 15 ml koniskt rör.
- Centrifugera cellerna vid 300 x g i 3 minuter för att pellet dem. Aspirera media (var noga med att inte aspirera cellerna) och kassera det. Återsuspendera cellerna i 5 ml DMEM-lösning, blanda genom att försiktigt pipettera upp och ner.
- Uppskatta den aktuella cellkoncentrationen med hjälp av en automatiserad cellräknare (listad i materialtabellen). Frö sex brunnar (i detta exempel) i en platta med 24 brunnar med 1 x 105 celler (för en sådddensitet på 50 000 celler / cm2).
- Tillsätt DMEM-lösningen upp till 500 μL (tillsätt DMEM-lösning till brunnarna först) och märk sedan en brunn per behandling enligt följande: ingen färgkontroll, mKO2-kontroll, TagBFP-kontroll, NeonGreen-kontroll, all färgkontroll och polytransfektion 1. TagBFP, mKO2 och NeonGreen kontrollbrunnar är enfärgade kontroller för alla fluorescerande proteiner som ingår i polytransfektionen.
2. Utföra transfektion
- Förbered rör för varje DNA-aggregat. Lägg åt sidan 1,5 ml mikrocentrifugrör och märk rören som: ingen färgkontroll, mKO2-kontroll, TagBFP-kontroll, NeonGreen-kontroll, all färgkontroll, poly-transfektionsblandning 1 och polytransfektionsblandning 2.
- Tillsätt 36 μL reducerat serummedium till ingen färgkontroll, mKO2-kontroll, TagBFP-kontroll, NeonGreen-kontroll och alla färgkontrollrör. Tillsätt 18 μl reducerat serummedium till vart och ett av rören polytransfektionsblandning 1 och polytransfektionsblandning 2.
OBS: Plasmidkoncentrationerna antas vara 150 ng/μl. - Tillsätt 600 ng fyllnadsplasmid till kontrollröret utan färg. Tillsätt 300 ng mKO2 och 300 ng fyllnadsplasmid till mKO2-färgkontrollröret. Tillsätt 300 ng TagBFP och 300 ng fyllnadsplasmid till TagBFP-färgkontrollröret.
- Tillsätt 300 ng konstitutiv NeonGreen-plasmid och 300 ng fyllnadsplasmid till NeonGreen-färgkontrollröret. Tillsätt 100 ng vardera av mKO2, TagBFP och konstitutiv NeonGreen, samt 300 ng fyllnadsplasmid, till hela färgkontrollröret.
- Tillsätt 150 ng mKO2 till polytransfektionsblandning 1-röret. Tillsätt 75 ng reporter NeonGreen-plasmid och 75 ng fyllnadsplasmid till polytransfektionsblandning 1-röret.
- Tillsätt 150 ng TagBFP till polytransfektionsmix 2-röret. Tillsätt 75 ng L7ae-plasmid och 75 ng fyllnadsplasmid till polytransfektionsblandning 2-röret.
- Tillsätt 36 μL reducerat serummedium till ingen färgkontroll, mKO2-kontroll, TagBFP-kontroll, NeonGreen-kontroll och alla färgkontrollrör. Tillsätt 18 μl reducerat serummedium till vart och ett av rören polytransfektionsblandning 1 och polytransfektionsblandning 2.
- Skapa transfektionsmasterblandningen i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör genom att kombinera 216 μL reducerat serummedium med 9,48 μL transfektionsreagens (se tabell 1 för reagensförhållanden och reaktionsskalning). Blanda väl genom att pipettera upp och ner och lägg åt sidan.
- Tillsätt 1,58 μL förstärkarereagens till vart och ett av ingen färgkontroll, enfärgskontroll och alla färgkontrollrör. Tillsätt 79 μl förstärkaree till vart och ett av blandningsrören för polytransfektion. Blanda varje rör individuellt genom kraftig pipettering.
- Tillsätt transfektionsmasterblandningen till varje rör som innehåller DNA.
- Tillsätt 37,58 μL transfektionsmastermix till vart och ett av ingen färgkontroll, enfärgskontroll och alla färgkontrollrör. Blanda varje rör individuellt genom kraftig pipettering.
- Tillsätt 18,79 μl transfektionsmasterblandning till vart och ett av polytransfektionsblandningsrören. Blanda varje rör individuellt genom kraftig pipettering.
- Fördela transfektionsblandningarna i brunnarna.
- Pipettera 65,97 μL av varje transfektionsblandning för kontrollerna ingen färg, en färg och alla färger i motsvarande brunnar.
- Pipettera 32,98 μL av polytransfektionen blanda 1 i polytransfektionsbrunnen och virvla plattan snabbt men försiktigt i ett tätt åttafigurmönster längs en plan yta för att fördela komplexen effektivt. Pipettera sedan 32,98 μL av polytransfektionen blanda 2 i samma polytransfektionsbrunn och virvla plattan på samma sätt.
- Placera plattan i en inkubator vid 37 °C, med 5 %CO2 och utan skakning, under 48 timmar.
OBS: För att öka cellviabiliteten kan cellmediet bytas ut var 6: e timme efter transfektion (även om detta inte alltid är nödvändigt, och med HEK293-celler och dess derivat måste man vara försiktig så att man inte lossnar cellerna från plattan när man byter media).
| Reagens | Belopp | Skalning | ||||
| Reducerat serummedium för DNA-blandning | 36 μL per reglerrör, 18 μL per polytransfektionsrör | 0,05 μL reducerat serummedium/ng-DNA per rör, med 10-20% extra volym för att ta hänsyn till pipettering | ||||
| DNA | 300-600 ng per rör | |||||
| P3000 | 1,58 μl per reglerrör, 0,79 μl per polytransfektionsrör | 0,0022 μL P3000/ng DNA per rör, med 10-20% extra | ||||
| Reducerat serummedium för Lipo master mix | 36 μL per reglerrör, 18 μL per polytransfektionsrör | 0,05 μL reducerat serummedium/ng totalt DNA, med 10-20% extra volym för att ta hänsyn till pipettering | ||||
| Transfektion och förstärkare reagens | 1,58 μl per reglerrör, 0,79 μl per polytransfektionsrör | 0,0022 μL lipofektamin 3000/ng DNA, med 10-20% extra | ||||
Tabell 1: Reagensskalning för transfektioner. Tabellen anger det korrekta förhållandet mellan reagens som ska inkluderas för den DNA-kvantitet som ingår i en enda brunn. Detta kan användas för att skala reaktioner effektivt och bilda masterblandningar. Mängden reagens har skalats till ett överskott på 20 %.
3. Förbereda celler för flödescytometri
- Förvärm minst 4,2 ml DMEM-lösning till 37 °C. Förvärm minst 4,2 ml trypsin och 4,2 ml PBS till 37 °C. Håll fluorescensaktiverad cellsorteringslösning (FACS) buffertlösning vid 4 °C tills den är klar att användas.
- Resuspendera cellerna i FACS-buffertlösningen (PBS kompletterat med 1 % BSA, 5 mM etylendiamintetraättiksyra [EDTA] och 0,1 % natriumazid [NaN3] för att minska klumpbildning; se Materialförteckning) enligt beskrivningen nedan.
- Aspirera och kassera nuvarande media i varje brunn. Dispensera 5 ml PBS i varje brunn för att tvätta cellerna. Aspirera och kassera PBS.
- Dispensera 5 ml trypsin i varje brunn. Placera plattan i en inkubator vid 37 °C i 3 minuter, eller tills cellerna inte längre fastnar på skålen. Sätt tillbaka plattan i biosäkerhetsskåpet och späd celllösningarna genom att dispensera 5 ml DMEM-lösning i varje brunn.
- För varje brunn, blanda lösningen genom att försiktigt pipettera upp och ner flera gånger. För varje brunn, sug alla medier och placera det i ett 15 ml koniskt rör.
- Centrifugera cellerna vid 300 x g i 3 minuter för att pellet dem. Aspirera media, var försiktig så att du inte aspirerar cellerna och kasserar det. I varje rör, återsuspendera cellerna i 5 ml FACS-buffertlösning, blanda genom att försiktigt pipettera upp och ner.
- För varje cellsuspensionslösning genom en sil (för att avlägsna klumpar) i separata flödescytometriska koniska rör. Håll dessa rör på is i högst 1 h och utför flödescytometri så snart som möjligt.
4. Utföra flödescytometri
OBS: Att använda en flödescytometer kräver korrekt utbildning och kunskap om nödvändiga uppgifter. Eftersom programvara och utrustning kan variera och användarna bör utbildas i allmänhet hänvisar det här avsnittet till specifika åtgärder som är användbara att utföra.
- Undersök först cellerna transfekterade med fyllnadsplasmidkontrollen (ingen färgkontroll) för att välja cellegenskaper och undvika avvikelser (inklusive aggregat, skräp etc.). Även om det finns många kombinationer av parametrar för att skilja celler, använd följande tre allmänna alternativ som ett bra sätt att visualisera särskiljande funktioner.
- Titta på sidospridningsområdet (logg eller linjär skala per preferens/celltyp) jämfört med spridningsområdet framåt (linjär skala).
- Titta på sidospridningshöjden (loggskalan) jämfört med sidospridningsbredden (linjär skala).
- Titta på spridningsbredden framåt (linjär skala) kontra den främre spridningshöjden (linjär skala).
- Titta sedan på enfärgskontrollerna. Använd färgkontrollen för att ställa in instrumentspänningarna, så att signalerna från varje fluorescerande protein normaliseras till ekvivalenta godtyckliga enheter (a.u.) fluorescens. Kör sedan enfärgskontrollerna för varje fluorescerande protein, som används för att ställa in kompensationsmatrisen, vilket möjliggör genomblödningskorrigering.
OBS: Helst bör det fulla dynamiska området för fluorescensvärdena vara synligt. Ytterligare normalisering av fluorescerande proteinsignaler kan göras via omvandling till standardiserade enheter (t.ex. molekyler av ekvivalent fluorescein [MEFLs; se Beal et al.15]). För att aktivera MEFL-konvertering under analys, kör regnbågskalibreringspärlor. Sådan kalibrering är också användbar för att minska instrument-till-instrument och daglig signalvariation16. - Kör polytransfektionsprovröret.
OBS: Där det är möjligt rekommenderas att köra 1 000 x 10 ^ (^ = blandningar) celler, eftersom högre dimensionella polytransfektioner måste delas upp i fler fack under analysen, och varje fack behöver tillräckligt med celler (helst >10) för att göra statistiskt signifikanta jämförelser.
5. Utföra analys efter experiment
- Använd inledningsvis data från kontrollerna (och, om tillämpligt, pärlorna) för att säkerställa korrekta resultat. Använd ett av de tillgängliga programvaruverktygen för att utföra levande cellgrind (med grindar som beskrivs ovan), kompensation och autofluorescenskorrigering.
OBS: Vi använder vanligtvis antingen anpassad MATLAB-kod (t.ex. https://github.com/jonesr18/MATLAB_Flow_Analysis eller Cytoflow17), som har både ett grafiskt användargränssnitt och ett pythonbibliotek som är lämpligt för förbehandlingsfasen och för polytransfektionsanalys.
| Metod | Komplex | ng fluorescerande markör | ng L7ae (fraktion) | ng Reporter (bråk) | ng Filler-DNA (fraktion) | Totalt (ng) |
| Poly-transfektion 1 | 600 | |||||
| → | 1 | 150 | 75 (½) | 75 (½) | 300 | |
| → | 2 | 150 | 75 (½) | 75 (½) | 300 | |
| Poly-transfektion 2 | 600 | |||||
| → | 1 | 150 | 25 (1/6) | 125 (5/6) | 300 | |
| → | 2 | 150 | 125 (5/6) | 25(1/6) | 300 |
Tabell 2: DNA-mängder för polytransfektion demonstrerad i protokollet och ett exempel på uppföljningsexperiment med inställda plasmidförhållanden. Den övre halvan av tabellen visar sammansättningen av plasmider som används i ett enkelt polytransfektionsexperiment. Den nedre halvan visar sammansättningen av ett uppdaterat experiment som justerar plasmidförhållandena för att bättre delprov ett hypotetiskt koncentrationsutrymme, där genuttrycksmodulatorn har ett mer optimalt 1: 5-förhållande i förhållande till sin rapportör, vilket ger fler transfekterade celler att prova runt detta förhållande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I figur 1 jämför vi samtransfektion med polytransfektion. I en samtransfektion levereras alla plasmider i samma transfektionsblandning, vilket resulterar i hög korrelation mellan mängden av varje plasmid som en enskild cell tar emot (figur 1A). Medan antalet totala plasmider som levereras till varje cell varierar avsevärt, är fluorescensen hos de två rapportproteinerna i de enskilda cellerna över hela befolkningen väl korrelerad, vilket indikerar att de två plasmiderna levereras tillsammans med ett ganska konstant förhållande. Transfekterade celler kan ta upp få eller många komplex, men eftersom varje komplex har korrelerade mängder av varje plasmid, utforskar samtransfektionen bara en liten diagonal region av koncentrationsutrymmet mellan de två plasmiderna. Däremot levereras plasmider i flera transfektionskomplex i polytransfektion, vilket resulterar i dekorrelerad leverans av plasmider i olika transfektionsblandningar (figur 1B). Transfekterade celler upptar olika kombinationer av komplexen, vilket resulterar i celler som innehåller varierande doser av plasmider från varken, ett eller båda komplexen.
Figur 2 visar ett representativt arbetsflöde för polytransfektion. I allmänhet består ett polytransfektionsexperiment av följande steg: definiera problemet, skapa transfektionsblandningarna, inkubera cellerna, flödescytometri och analys. Det finns också ett valfritt steg för att upprepa polytransfektionen med optimerade delförhållanden om de initiala polytransfektionsresultaten inte exakt kan begränsa de optimala delförhållandena. Dessa steg beskrivs i protokollet.
I figur 3 ges några exempel på väl utförda sam- och polytransfektioner och vanliga fel. Figur 3A visar en väl utförd samtransfektion med en tät korrelation mellan TagBFP och eYFP-uttryckande plasmider som levererades samtidigt. Däremot visar samtransfektionen i figur 3B dålig korrelation mellan dessa två plasmider. I den visade figuren beror den dåliga korrelationen på att tillsats av förstärkarereagens till det reducerade serummediet innan plasmiderna tillsattes. Sådan dålig korrelation i experimenten kan också bero på att olika promotorer driver uttryck av de fluorescerande proteinerna, dålig blandning under skapandet av transfektionsblandningen, eller låter komplexet inkubera för kort eller för långt intervall.
Figur 3C visar en väl utförd polytransfektion, med god täckning av det tvådimensionella rummet och god kompensation av eventuell spektralgenomblödning mellan fluorescerande proteiner. Figur 3D visar polytransfektionsdata med ett lågt antal levande celler, vilket är svårt att dela upp i tillräckligt många fack med ett tillräckligt antal celler i varje behållare för analys. För att förbättra detta problem bör utgångscellpopulationen vara vid god hälsa och inte övervuxen, och den experimentella toxiciteten minskas genom användning av ett annat transfektionsreagens och/eller transfektering med mindre totalt DNA. Figur 3E visar en polytransfektion där transfektionseffektiviteten var dålig, vilket återigen resulterade i gles täckning av det tvådimensionella utrymmet för analys. I detta fall är antalet celler som passerar morfologigrind högt, men cellerna uttrycker inte fluorescerande proteiner. För att förbättra effektiviteten bör valet av transfektionsreagens optimeras och tillverkarens protokoll följas noga. Varje transfektionsblandning måste innehålla en motsvarande mängd DNA-massa, vilket säkerställer att cellerna har ungefär lika stor chans att ta emot varje typ av komplex, och varje transfektionsblandning ska göras i enlighet med satsinstruktionerna. Olika transfektionssatser är optimala för olika celltyper; Det kit som ger bäst effektivitet i celltypen av intresse bör användas. Slutligen är vissa celltyper svåra att transfekt, oavsett vilket kit som används. I dessa fall bör ett större antal celler transfekteras och så många som möjligt samlas in under flödescytometri för att säkerställa ett tillräckligt antal celler att analysera. Figur 3F visar polytransfektionsdata där en av de fluorescerande proteinmarkörerna tydligt visar spektral genomblödning till ett annat fluorescerande protein. Enfärgskontroller bör alltid köras för alla fluorescerande proteiner i systemet och användas för att generera en kompensationsmatris som ska tillämpas på alla polytransfektioner före analys.
När man utför polytransfektionsexperiment för första gången (övergripande eller för ett nytt experimentellt system) bör man utföra benchmarking mot standard samtransfektion. Ett tillvägagångssätt är att individuellt mäta input-output-överföringsfunktionen för viktiga systemdelar med både co-transfektion (via tuning DNA-doser) och polytransfektion.
I figur 4 demonstrerar vi benchmarking av translationsrepressorn L7Ae, här anpassad från den ursprungliga polytransfektionspublikationen10. L7Ae är ett RNA-bindande protein som känner igen RNA-kink-turn (KT) motiv20; när två KT (2xKT) placeras i 5'-oöversatt region (UTR) i ett mRNA, kan ORF-översättning (nedströms öppen läsram) effektivt undertryckas av L7Ae21. L7Ae har tidigare använts för att bygga RNA-baserade celltypsklassificerare21 och andra RNA-baserade kretsar22. För att testa L7Ae genom standard samtransfektion kan man ställa in förhållandena mellan plasmiderna som kodar för L7Ae och dess målrapportör inom olika transfektionsblandningar (figur 4A och tabell 3). För polytransfektion bör man oberoende leverera konstitutiv L7Ae och motsvarande 2xKT-rapportör i separata transfektionsblandningar, så att ett brett spektrum av plasmidförhållanden levereras till cellerna (figur 4B). Efter att ha utfört transfektion och flödescytometri kan dataanalys utföras. För att göra data jämförbara kan man samla de enskilda samtransfektionsresultaten i en enda datauppsättning och sedan utföra en liknande flerdimensionell binning som polytransfektionsdata (figur 4C, D). Om man jämför dos-responskurvorna för L7Ae som undertrycker utdatarapportören kan man se att medianutgångsnivån per behållare är mycket likartad mellan samtransfektions- och polytransfektionsdata (figur 4E-G).
I allmänhet har vi sett att polytransfektionsdata korrelerar väl med samtransfektionsdata över breda DNA-förhållanden, med mindre precision vid mycket skeva DNA-doseringsförhållanden (delvis på grund av lägre celltäckning i fack för polytransfektionsexperiment, särskilt för delar som är mycket starkt aktiva vid låga plasmiddoser). För att förbättra mätnoggrannheten för sådana känsliga delar kan deras uttrycksnivå minskas med en svagare promotor, uppströms öppna läsramar18 eller mikroRNA-ljuddämpningsmedierade finjusterare (miSFIT)19.
Figur 5 visar en framgångsrik tillämpning av polytransfektion för optimering av en celltypsklassificerare, återigen anpassad från Gam etal 10. Klassificeraren är en relativt enkel design som producerar en utgång som svar på uttryck av miR-21-5p, ett miRNA som överuttrycks i många tumörceller23. I frånvaro av miR-21 undertrycks klassificerarutgången av en bakteriellt härledd transkriptionsrepressor, BM3R124, vars anpassning tidigare visat sig fungera i däggdjursceller25. När miR-21 är närvarande binder den fyra målplatser placerade i både 3'- och 5'UTR: erna i BM3R1, vilket slår ner dess uttryck och därigenom möjliggör utmatningstranskription (figur 5A). För att optimera detta system levererades de tre kretskomponenterna i separata transfektionsblandningar: (1) BM3R1 (med miR-21-målplatser), (2) utgångsreporter (mKO2) och (3) Gal4-VP16, som aktiverar transkription av utgången (tabell 4). Observera att utgångspromotorn fungerar på logiken (Gal4-VP16) och inte BM3R1, vilket undertrycker utdata även i närvaro av Gal4-VP1625. Varje del kodar för en transfektionsmarkör, TagBFP, mNeonGreen respektive iRFP720, på samma plasmid för att indikera den relativa DNA-dosen för varje komplex. I allmänhet bör ökat Gal4-VP16-uttryck öka reporter mKO2-utgången, medan ökat BM3R1-uttryck bör resultera i lägre mKO2-utgång. Eftersom BM3R1 slås ner av miR-21-5p, bör utgångsuttrycket vara högre i HeLa-celler, som har högre nivåer av miR-21-5p och därmed uttrycker mindre BM3R1 än i HEK-celler.
Efter polytransfektion i både HEK293- och HeLa-celler erhöll vi en 3D-fördelning av olika plasmidförhållanden (figur 5B-HEK-celler). Gam et al.10 delprovtog denna fördelning vid olika förhållanden genom att betrakta celler inom ett visst euklidiskt avstånd från ett intresseförhållande; Detta avstånd bör vara tillräckligt stort för att inkludera tillräckligt många celler för att möjliggöra statistiskt signifikanta resultat från analysen, men tillräckligt smalt för att undvika onödigt brus från att inkludera en alltför bred uppsättning komponentförhållanden för de tre delarna. Gam et al.10 använde sedan en optimeringsalgoritm för att identifiera förhållandet mellan delar som maximerade klassificeringsnoggrannheten för samtransfektion (dvs. transfekterade HeLa-celler är positiva för utdatauttryck medan transfekterade HEK-celler inte är det). Det optimala förhållandet mellan delarna befanns vara 10.9: 1.5: 1: Gal4-VP16: output: BM3R1; Celler som delprovtagits runt det optimala förhållandet inom hela polytransfektionsutrymmet visas i figur 5C. Denna delsampling förutspådde att vid detta förhållande har den samtransfekterade kretsen en 91% specificitet, 62% känslighet och 77% noggrannhet vid klassificering av HEK293 kontra HeLa-celler (figur 5D). Samtransfektion med plasmidförhållanden inställda på detta optimala gav ännu bättre resultat: 99% specificitet, 68% känslighet och 84% noggrannhet10. Vidare styrde förhållandena implementeringen av en enkelplasmidversion av kretsen, med relativt uttryck inställt genom att använda olika trunkerade promotorer och uppströms ORF (uORF), vilket gav en krets med 91% specificitet, 90% känslighet och 90% noggrannhet10. Således är polytransfektion ett kraftfullt verktyg för att styra utformningen av cellklassificerare och genkretsar bredare.
Figur 1: Jämförelse av samtransfektion och polytransfektion. (A,B) Översikt och jämförelse av plasmidleverans med samtransfektion av två plasmider och polytransfektion av två plasmider. För varje transfektionsmetod visar diagrammet längst till vänster bildandet av transfektionskomplex mellan negativt laddat DNA och positivt laddade lipider. I dessa exempel kodar varje färgad plasmid (blå och röd) uttrycket av ett annat fluorescerande protein. Mittdiagrammet visar exempel på plasmidleverans till celler och även en schematisk för de förväntade fördelningarna i ett histogram eller spridningsdiagram. Färgintensiteten på histogrammet motsvarar fluorescens från motsvarande plasmidfärg. Diagrammet längst till höger visar verkliga data från celler transfekterade med varje given metod. (A) I en samtransfektion med två olika plasmider blandas båda plasmiderna innan transfektionsreagens tillsätts, vilket resulterar i starkt korrelerad förpackning av de två plasmidarterna. I faktiska co-transfektionsdata uppvisar celler korrelerad leverans av båda plasmiderna (höger). (B) I en polytransfektion blandas varje uppsättning samlevererade plasmider som motsvarar en kretsdel och en transfektionsmarkör med transfektionsreagenset separat, vilket resulterar i komplex som endast innehåller dessa plasmider (vänster). I faktiska polytransfektionsdata utforskar celler ett brett spektrum av koncentrationsutrymme med många olika plasmidstökiometrier utforskade samtidigt (höger). Denna siffra har ändrats från10. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 2: Arbetsflöde för polytransfektion. Steg 1: Definiera problemet. Börja med ett system med flera komponenter för vilka det ideala förhållandet mellan delar är okänt och välj ett startförhållande mellan komponentdelar. Steg 2: Skapa transfektionsblandningarna. Varje transfektionsblandning innehåller en kretskomponent och en fluorescerande transfektionsmarkör. Mängden kretsdel som levereras till en cell korrelerar med markörens fluorescens. Steg 3: Inkubera cellerna. I ett typiskt arbetsflöde inkuberar vi celler i 48 timmar mellan transfektion och flödescytometri. Steg 4: Flödescytometri. Kör lämpliga kontroller, enligt beskrivningen i protokollet, och kör sedan exemplen. Steg 5: Analys.Använd transfektionsmarkörerna för att fästa cellerna enligt mängden eller förhållandena mellan delar som cellen tog emot. Använd utgångsproteinet för att mäta kretsprestanda. Hitta fack / förhållanden för delar som optimerar kretsprestanda. Steg 6: Upprepa med optimerade delförhållanden (tillval). Om de optimala facken/förhållandena har mycket skeva förhållanden kan det hända att pilotpolytransfektionen inte begränsar de optimala delförhållandena exakt. Upprepa polytransfektionen med avstämda delförhållanden, så att en cell som fick lika mycket av varje transfektionsblandning nu får ett nära optimalt förhållande av delar, som bestäms av föregående omgång. Denna siffra har ändrats från10. Bilden av en inkubator användes från Servier Medical Art och bilden av en cytometer från BioRender. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Representativa positiva och negativa polytransfektionsresultat . (A) Väl utförd samtransfektion av två fluorescerande reportrar, vilket visar en tät korrelation. Totalt plottas 20 000 celler både här och i (B) för jämförelse. Det är en bra idé att utföra en liknande liten samtransfektion av två fluorescerande reportrar innan du påbörjar ett polytransfektionsexperiment, för att säkerställa att plasmider är väl korrelerade inom transfektionsblandningar. (B) Bullrigare samtransfektion: plasmider är inte väl korrelerade inom varje transfektionsblandning, vilket kan orsaka fluorescerande markörer i en polytransfektion att vara en dålig markör för plasmidförhållanden. (C) Väl utförda polytransfektionsresultat som visar bra cellantal, transfektionseffektivitet och kompensation. (D) Lågt antal levande celler, vilket inte tillåter delprovtagning i fack med statistiskt signifikant antal celler. (E) Dålig transfektionseffektivitet, vilket inte möjliggör delprovtagning i behållare med statistiskt signifikant antal celler. (F) Brist på lämplig kompensation, vilket gör att fluorescensdata är ett dåligt mått på mängden fluorescerande protein i systemet. Använd enfärgskontroller för att bestämma en idealisk linjär kompensationsmatris och tillämpa den på data före vidare bearbetning. Alla färgkontroller rekommenderas också beroende på val av programvara. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Benchmarking av polytransfektion mot samtransfektion. (A) I en samtransfektion kan ett förhållande mellan translationell repressor L7Ae och fluorescerande reporterplasmider testas i varje experimentell brunn. (B) Vid polytransfektion kan många förhållanden mellan L7Ae och reportrar testas i samma brunn. Se tabell 3 för närmare uppgifter om plasmidblandningarna med polytransfektion. (C,D) Binning-arbetsflöde för benchmarking av polytransfektion mot flera samtransfektioner. Totalt 10 biexponentiellt fördelade fack tilldelades för varje transfektionsmarkördimension, som approximerar nivåerna för var och en av de två plasmiderna. Här visas fack som anger olika nivåer av plasmid #2. Binning utfördes på både en samlad uppsättning av 11 samtransfektionsprover som spänner över olika plasmidförhållanden (C) och data från en enda polytransfektion, omfattande cirka 500 000 celler vardera (D). Färger motsvarar uppsättningar av fack definierade av gen 2 (TagBFP) nivåer. (E-G) Benchmarking av polytransfektion mot samtransfektion för en representativ krets. Median utgångsfluorescens utvärderades för cellerna i varje behållare och jämfördes mellan metoderna för det representativa systemet, L7Ae translationell repression. (E) Konstruktioner för mätning av L7Ae-aktivitet. mKO2-fluorescens fungerar som en uppskattning för leverans av L7Ae (gen #1), medan TagBFP-fluorescens fungerar som en uppskattning för leverans av den reglerade mNeonGreen-utgången (gen #2). (F) Flerdimensionella titrerkurvor för L7Ae. Varje rad representerar uppsättningen lagerplatser på en nivå av TagBFP, som anges i (C) och (D). Heldragna linjer anger polytransfektionsdata, medan streckade linjer anger samtransfektionsdata. Vid varje binned nivå av reporterplasmid minskar rapportutdata när L7Ae ökar. (G) Visuell jämförelse mellan samtransfektion och polytransfektion för L7Ae-systemet. Varje punkt representerar den uppmätta utgången i motsvarande fack för polytransfektions- och samtransfektionsmätningar, där mer likvärdiga värden ligger närmare den röda 1:1-linjen. Sammantaget är skillnaderna som observerats mellan polytransfektions- och co-transfektions-härledda låga, vilket ger förtroende för tillförlitligheten hos poly-transfektionsmetoden. Denna siffra har ändrats från10. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Dataanalys för polytransfektion. Vid polytransfektion kan celler grupperas i lagerplatser eller skivor för analys. Figur 4 visar en form av analys där cellerna är uppdelade i segment som motsvarar nivåer av en systemkomponent, såsom rapporterplasmidnivå, vilket kan vara användbart för modellanpassning och förståelse av doseringssvar. En annan användbar strategi är att analysera kretsprestanda vid olika förhållanden av kretskomponenter. (A) Diagram över en klassificerarkrets för optimering. Nivåerna av TagBFP, NeonGreen och iRFP720 motsvarar nivåerna av BM3R1, utgång mKO2 respektive Gal4-VP16. Se tabell 4 för detaljer om plasmidblandningarna med polytransfektion. (B) Experimentell uppställning av polytransfektionsblandningar. (C) Flödescytometridata som samlats in från polytransfektion med kretsen i (A). Nivåerna av vart och ett av de tre fluorescerande proteinerna som ett resultat av kretspolytransfektion i HEK-celler, vilket visar det breda utbudet av kretskomponentförhållanden som finns i data. Liknande resultat erhölls från kretstransfektion i både HEK- och HeLa-celler. d) Delsampling av polytransfektion i ett visst förhållande. För att analysera data skannade vi ett stort antal förhållanden mellan kretskomponenter och bestämde klassificeringsprestanda vid varje förhållande. Som ett exempel visar vi här ett särskilt förhållande som visade bra prestanda (Gal4-VP16 = 435 ng DNA, reporter = 60 ng och BM3R1 = 40 ng). Plottad i blått är motsvarande förhållande mellan fluorescerande markörer för de tre olika kretskomponenterna. Därefter samplade vi data genom att endast överväga punkter inom ett visst euklidiskt avstånd från fluorescensbanan. Vi delsamplade celler vid samma bana från både HEK- och HeLa-transfektioner. (E) Jämförelse av kretsprestanda vid samma bana i HEK- och HeLa-celler. Genom att jämföra statistik som känslighet, specificitet och noggrannhet i klassificeringen över många förhållanden kan komponentförhållanden optimeras för att generera en idealisk genetisk krets. Denna siffra har ändrats från10. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Komplex | ng L7Ae plasmid | ng Reporter plasmid | OptiMEM (μL) | P3000 (μL) | Lipo 3000 (μL) |
| 1 | 250 | 75 | 1.5 | 1.5 | |
| 2 | 250 | 75 | 1.5 | 1.5 |
Tabell 3: Transfektionsblandningar motsvarande figur 4. HEK293-celler polytransfekterades med dessa transfektionsblandningar i en brunn på en 24-brunnsplatta.
| Komplex | ng BM3R1 plasmid | ng Gal4-VP16 plasmid | ng Reporter plasmid | OptiMEM (μL) | P3000 (μL) | Lipo 3000 (μL) |
| 1 | 900 | 75 | 1.5 | 1.5 | ||
| 2 | 900 | 75 | 1.5 | 1.5 | ||
| 3 | 900 | 75 | 1.5 | 1.5 |
Tabell 4: Transfektionsblandningar motsvarande figur 5. HEK293- och HeLa-celler polytransfekterades var och en med dessa transfektionsblandningar i en brunn vardera av en 6-brunnsplatta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Snabba prototypmetoder som datorstödd design (CAD), breadboarding och 3D-utskrift har revolutionerat mekaniska, elektriska och civilingenjörsdiscipliner. Möjligheten att snabbt söka igenom många möjliga lösningar på en given utmaning påskyndar kraftigt framstegen inom ett område. Vi tror att polytransfektion är en analog teknik för bioteknik, vilket möjliggör snabb prototypning av genetiska kretsar. Dessutom kräver andra snabba prototyptekniker praktisk sekventiell iteration av flera möjliga lösningar, medan polytransfektion kan utforska många lösningar samtidigt. Polytransfektion gör det möjligt att testa ett stort antal kombinationer av genetiska kretskomponentförhållanden i en enda brunn och har använts för att optimera flera publicerade genetiska kretsar10,11,13. Det experimentella protokollet är en enkel förlängning av standard co-transfektion, vilket möjliggör enkel adoption av många däggdjurscellforskare. I allmänhet ses en mycket nära överensstämmelse mellan polytransfektions- och samtransfektionsresultat10 (ett exempel är figur 4). Således kan polytransfektion användas i de flesta fall där plasmidförhållanden titreras inom samtransfektionsblandningar och utgångar mäts på encellsnivå.
Komplexiteten och omfattningen av polytransfektion ökar med komplexiteten hos genetiska kretsar för att optimera. När antalet dimensioner som ska analyseras ökar ökar de kombinatoriska förhållandena mellan olika delar och antalet celler som behövs för deras analys exponentiellt. Till exempel, för att optimera klassificeraren i figur 5, transfekterades celler i ett 6-brunnsplattformat och data samlades in på minst 1,5 miljoner levande celler. Vi har också optimerat en klassificerare med en extra kretskomponent 10, vilket kräver transfektion på en10 cm plattskala och insamling av miljontals celler. I den skalan och högre är DNA-produktion tidskrävande och transfektionsreagens är dyra. Med detta sagt använder polytransfektion storleksordningar mindre celler, DNA och transfektionsreagens än att testa ett jämförbart antal kombinationer av kretskomponentförhållande i enskilda brunnar. Dessutom sparas en avsevärd tid genom att göra storleksordningar färre transfektionsblandningar.
Polytransfektion möjliggör avancerade analysmetoder för flödescytometridata. De två huvudsakliga tillvägagångssätten är (1) binning av celler enligt uttrycket av varje transfektionsmarkör och (2) extraktion av celler vid definierade förhållanden av transfektionsmarkörer, vilket simulerar samtransfektion. Den förstnämnda väljer celler med en specifik kombination av DNA-dosering för varje komplex (och därmed varje del), vilket ger input-output-överföringsfunktioner. Den senare väljer celler vid ett specifikt förhållande av DNA-doser för varje del, vilket simulerar samtransfektion vid ett sådant förhållande av plasmid-DNA-massor. Genom att plotta uttrycksnivån för kretsutgångsrapportörer i delurvalen får man ett mått på utdata vid de definierade nivåerna eller förhållandena för ingångar. För kretsoptimering kan man identifiera de bäst presterande facken / förhållandena som definieras av kretsens syfte - när det gäller cellklassificerare är dessa fack / förhållanden där kretsen är PÅ i målcelltypen och AV i icke-målcelltyper. När man väljer en fackstorlek bör man ta hänsyn till den precisionsnivå som krävs, liksom antalet celler per fack. Mindre fack fokuserar mer exakt på den perfekta kombinationen av kretskomponenter, men om en behållare har för få celler kan den införa oönskat brus i mätningarna.
Framtida förbättringar i beräkningsanalys av polytransfektionsdata kan underlätta optimering även med låg celltäckning per bin/förhållande. För närvarande utesluter vi data från lagerplatser med färre än ett angivet tröskelvärde för celler (t.ex. 10) för att undvika alltför bullriga mätningar. I kombination med upprepade mätningar möjliggör detta mer exakta och exakta beräkningar av dos-responskurvor, klassificeringskärvor och andra mätvärden som definieras per fack. Varje cell i polytransfektion kan dock betraktas som ett oberoende experiment, som mäter kretsutgångarna med en fin upplösning på en exakt ingångsnivå. Med detta i åtanke kan mekanistiska och fenotypiska modeller av dosresponser och kretsoptimeringar direkt passa till fördelningen av genuttryck från varje markör och reporter, snarare än deras binned sammanfattande statistik10. Detta möjliggör mer robusta mätningar och utnyttjar de många enskilda datapunkter som samlas in per experiment. Sådana modelleringsmetoder kan därmed ge prediktiv kretskarakterisering och optimering även med glest samplade högdimensionella polytransfektioner. Vidare kan maskininlärningsmetoder som responsytemetodik och slumpmässig skogsregression användas för att analysera relativt glesa, högdimensionella data10.
Ett alternativt tillvägagångssätt för allt större polytransfektioner är att sekventiellt optimera kretsar med hjälp av hierarkier av polytransfektioner. I detta tillvägagångssätt används först polytransfektion för att optimera en modul som består av en delmängd av genetiska komponenter inom en större krets. Sedan levereras dessa optimerade moduler som separata polytransfektionsblandningar, vilket gör det möjligt att hitta det optimala förhållandet / doseringen för varje kretsmodul. Detta tillvägagångssätt använder ett signifikant lägre antal celler, DNA och transfektionsreagens. Grupper av komponenter är dock inte nödvändigtvis modulära i förhållande till andra komponenter, och därför kan ett optimalt förhållande mellan komponentdelar i en modul mätt isolerat vara suboptimalt inom det större kretssammanhanget8.
Polytransfektionsmetoder begränsas också av laser-/filterkonfigurationen för flödescytometern som används för att samla in data. Förutom uppmätta fluorescerande utgångar innehåller varje transfektionsblandning en fluorescerande proteinmarkör. Således är det viktigt att välja fluorescerande proteiner som kan kompenseras väl på cytometern. Vi analyserade tidigare systematiskt genomblödningen av en panel med 22 fluorescerande proteiner på en femlaserflödescytometer (BD LSRFortessa) och fann att uppsättningen Sirius, TagBFP, mNeonGreen, mKO2 och iRFP720 kunde användas tillsammans och kompenseras väl utan betydande problem10. Optimeringen av större kretsar kan dock kräva avancerade cytometrimetoder, såsom spektralcytometri för att separera fluorescerande proteiner med mer överlappande spektra, vilket vårt laboratorium för närvarande optimerar med upp till åtta fluorescerande proteiner. Databaser som fluorescerande proteindatabas (https://www.fpbase.org) är användbara för att välja fluorescerande proteiner med särskild spektral överlappning. Denna process kan emellertid kompliceras av olika faktorer, av vilka några är specifika för särskilda cytometrar. Till exempel kan användningen av vissa röda proteiner som tdTomato resultera i oönskad genomblödning i blå kanaler endast i vissa laser-/filterkonfigurationer10. Dessutom har flera långröda proteiner visat icke-linjära relationer mellan DNA-dosering och fluorescensutgång10, vilket minskar deras användning som effektiva markörer för DNA-dosering.
För konsistens mellan experiment som utförs med varierande antal komplex (en, två, tre, etc.) är det användbart att använda samma fraktionerade mängd plasmid per transfektionsblandning. Om man till exempel testar ett tregensystem med varje gen kodad i en av tre plasmider (A, B och C), kan man samtransfektera kretsplasmiderna i förhållandet 1: 1: 1 tillsammans med ett lika förhållande av en plasmid som kodar för en transfektionsmarkör. Detta skulle göra varje plasmid en fjärdedel av blandningens totala massa, och därmed ungefär en fjärdedel av massan av varje transfektionskomplex som bildas. När man polytransfekterar A, B och C i separata komplex med sina egna rapportörer, istället för att blanda plasmiderna 1:1 med reportrar eller bibehålla deras totala DNA-massa, är det mer konsekvent att hålla varje plasmid på en fjärdedel av massan av varje komplex, med fyllnads-DNA som tar upp den återstående massan (se tabell 5 för exempel). Detta beror på att fördelningen av genuttryck mellan transfekterade celler beror mindre på den totala massan av DNA som levereras i komplexen och mer på den fraktionerade mängden DNA i varje komplex10. Om andra förhållanden än 1:1:1 önskas, beräkna motsvarande fraktioner av den totala DNA-massan i transfektionsblandningen för varje del. Tabell 5 [nederst] visar till exempel förhållandet 1:1:4.
| Metod | Komplex | ng A (bråkdel) | ng B (fraktion) | ng C (fraktion) | ng Reporter (bråk) | ng Filler-DNA (fraktion) | Totalt (ng) |
| Samtransfektion | 1 | 150 (¼) | 150 (¼) | 150 (¼) | 150 (¼) | 0 (0) | 600 |
| Poly-transfektion | 600 | ||||||
| → | 1 | 50 (¼) | 50 (¼) | 100 (½) | 200 | ||
| → | 2 | 50 (¼) | 50 (¼) | 100 (½) | 200 | ||
| → | 3 | 50 (¼) | 50 (¼) | 100 (½) | 200 | ||
| Samtransfektion | 1 | 75 (⅛) | 75 (⅛) | 300 (½) | 150 (¼) | 0 (0) | 600 |
| Poly-transfektion | 600 | ||||||
| → | 1 | 25 (⅛) | 50 (¼) | 125 (⅝) | 200 | ||
| → | 2 | 25 (⅛) | 50 (¼) | 125 (⅝) | 200 | ||
| → | 3 | 100 (½) | 50 (¼) | 50 (¼) | 200 |
Tabell 5: Exempel på användning av fyllnads-DNA för konsistens mellan sam- och polytransfektionsexperiment. Här visas två generiska exempel på samtransfektering av tre plasmider med samma mängd fyllnads-DNA. I det övre exemplet är plasmiderna alla lika massor. I det nedre exemplet levereras en plasmid med en högre massa jämfört med de andra. Fraktionen av totalt DNA som skulle användas i ett samtransfektionskomplex transmuteras till polytransfektionskomplex, med den återstående mängden DNA (upp till total mängd för varje komplex, som är fast och lika över komplex) konstituerad med fyllnads-DNA.
Det övergripande målet med filler-DNA är att upprätthålla liknande doser av plasmider per cell, oavsett antalet unika transfektionsblandningar. Som en grov approximation av denna princip minskar separationen av tre plasmider i tre blandningar samtidigt som samma DNA-massa av varje (och det lämpliga förhållandet mellan transfektionsreagens) procentandelen celler som tar emot ett givet komplex bibehålls med en tredjedel jämfört med en enda blandning innehållande alla tre plasmiderna. Emellertid får varje transfekterad cell därefter en ~ 3x högre gendos. Att minska den relativa mängden plasmider ensamt utan fyllnads-DNA är således otillräckligt för att upprätthålla konsekventa plasmiddoser, eftersom detta helt enkelt minskar transfektionseffektiviteten utan att ändra den underliggande fördelningen av uttryck bland de transfekterade cellerna10. Å andra sidan gör filler-DNA det möjligt att justera DNA-doseringen utan att påverka den totala transfektionseffektiviteten (även om detekterbara transfekterade celler kan minska på grund av lägre signal)10. Efter den råa approximationen ovan bibehåller reduktionen av DNA-fraktionen i polytransfektionsblandningarna till en tredjedel och tillsats av fyllnads-DNA de relativa gendoserna jämfört med den ursprungliga samtransfektionen. Filler-DNA säkerställer därför effektiv och korrekt transfektionskomplexbildning.
För att ändra uttrycksområdet för en gen av intresse som rapportören omfattar, kan bråkdelen av varje testplasmid och/eller promotorer som används för att driva genen dit ställas in i förhållande till rapportören. Om en del är stark/mycket aktiv vid låga DNA-doser kan användning av en lägre DNA-fraktion hjälpa till att centrera delens dynamiska område i mitten av fluorescensfördelningen hos rapportören i transfekterade celler. På samma sätt, för delar som är svaga / endast aktiva vid höga DNA-doser, kan det vara användbart att använda en högre fraktion. Man måste dock vara försiktig med en sådan inställning, eftersom minskning av DNA-fraktioner för mycket ökar stokasticiteten för leverans till cellerna jämfört med reporter10, och höga genuttrycksnivåer kan överbelasta cellulära genuttrycksmaskiner12,14. För att undvika stokasticitet, och i fall där varje gen levereras till celler i ett fast förhållande (t.ex. om kretsen ska genereras som en enda lenti, PiggyBac eller Landing Pad-vektor), kan det relativa uttrycket för varje gen ställas in med starkare / svagare promotorer, små uORF18 och / eller miSFIT19.
Även om protokollet beskriver en omvänd transfektionsteknik, är polytransfektion också möjlig med framåttransfektion. Vid omvänd transfektion såddas cellerna samtidigt och transfekteras; Vid framåttransfektion transfekteras cellerna ~ 24 timmar efter första plätering vid ungefär hälften av densiteten som skulle användas vid omvänd transfektion (för att möjliggöra celldelning vid transfektion). I allmänhet är omvänd transfektion effektivare men också mer giftig, och vi har märkt vissa skillnader i formen av transfektionsfördelningar baserat på reagens, transfektionstid och cellinje. Således bör den valda transfektionsmetoden optimeras för varje cellinje för att maximera antalet transfekterade celler och täckningen av det flerdimensionella koncentrationsutrymmet för plasmiddoser per cell.
Sammantaget möjliggör polytransfektion snabb optimering av däggdjurs genetiska kretsar. Många möjliga ratiometriska kombinationer av kretskomponenter kan enkelt testas i en enda brunn. Dessutom, eftersom polytransfektion innehåller mer information om nivåerna av varje del i ett system än en konventionell transfektion, har det visat sig vara mycket värdefullt för att karakterisera beteendet hos olika genetiska delar10,11,12,13. Antagandet av polytransfektion förväntas påskynda utvecklingen av nya och förbättrade genkretsar för användning i däggdjursceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
R.W. är en av grundarna av Strand Therapeutics och Replay Bio; R.W. och R.J. lämnade in ett provisoriskt patent avseende en celltypsklassificerare.
Acknowledgments
Vi vill tacka tidigare Weiss Lab-medlemmar som ledde eller bidrog till att utveckla polytransfektionsmetoden och dess tillämpning på cellklassificerare: Jeremy Gam, Bre DiAndreth och Jin Huh; andra Weiss-labbmedlemmar som har bidragit till ytterligare metodutveckling / optimering: Wenlong Xu, Lei Wang och Christian Cuba-Samaniego; Prof. Josh Leonard och gruppmedlemmar, inklusive Patrick Donahue och Hailey Edelstein, för att testa polytransfektion och ge feedback; och professor Nika Shakiba för att ha bjudit in detta manuskript och gett feedback. Vi vill också tacka National Institutes of Health [R01CA173712, R01CA207029, P50GM098792]; Nationella vetenskapsstiftelsen [1745645]; Cancer Center Support (core) Grant [P30CCA14051, delvis] från NCI och National Institutes of Health [P50GM098792] för finansiering av detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15mL Corning Falcon conical tubes | ThermoFisher Scientific | 14-959-53A | |
| 24-well petri dish | Any company of choice | (Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free) | |
| Bovine serum albumin | NEB | B9000S | |
| Centrifuge | Any company of choice | Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX2000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | |
| Cytoflow | Non-commercial software package | https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/# | |
| DMEM | VWR | 10-013-CV | Use the correct media for your cell type |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 03690-100ML | |
| Fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F4135 | |
| HEK cells | ATCC | CRL-1573 | Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently. |
| HeLa cells | ATCC | CRL-12401 | Use the relevant cell type for your experiments. |
| Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer | ThermoFisher Scientific | L3000001 | Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent |
| LSRFortessa flow cytometer | BD Biosciences | N/A | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
| Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | Any company of choice | ||
| Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985070 | reduced serum medium |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Rainbow calibration beads | Spherotech | URCP-100-2H | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Trypsin | VWR | 25-053-CI |
References
- Prochazka, L., Benenson, Y., Zandstra, P. W. Synthetic gene circuits and cellular decision-making in human pluripotent stem cells. Current Opinion in Systems Biology. 5, 93-103 (2017).
- Sayeg, M. K., et al. Rationally designed microRNA-based genetic classifiers target specific neurons in the brain. ACS Synthetic Biology. 4 (7), 788-795 (2015).
- Zhen, X., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. Multi-Input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells. Science. 333 (6047), 1307-1311 (2011).
- Nissim, L., et al. Synthetic RNA-based immunomodulatory gene circuits for cancer immunotherapy. Cell. 171 (5), 1138-1150 (2017).
- Nissim, L., Bar-Ziv, R. H. A tunable dual-promoter integrator for targeting of cancer cells. Molecular Systems Biology. 6, 444 (2010).
- Mohammadi, P., Castel, S. E., Brown, A. A., Lappalainen, T. Quantifying the regulatory effect size of cis-acting genetic variation using allelic fold change. Genome Research. 27 (11), 1872-1884 (2017).
- Prochazka, L., et al. Discrete-to-analog signal pluripotent stem cells conversion in human. BioRxiv. , (2021).
- Del Vecchio, D. Modularity, context-dependence, and insulation in engineered biological circuits. Trends in Biotechnology. 33 (2), 111-119 (2015).
- Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell. Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).
- Gam, J. J., DiAndreth, B., Jones, R. D., Huh, J., Weiss, R. A 'poly-transfection' method for rapid, one-pot characterization and optimization of genetic systems. Nucleic Acids Research. 47 (18), 106 (2019).
- Jones, R. D., et al. Robust and tunable signal processing in mammalian cells via engineered covalent modification cycles. Nature Communications. 13 (1), 1720 (2022).
- Jones, R. D., et al. An endoribonuclease-based feedforward controller for decoupling resource-limited genetic modules in mammalian cells. Nature Communications. 11 (1), 5690 (2020).
- DiAndreth, B., Wauford, N., Hu, E., Palacios, S., Weiss, R. PERSIST platform provides programmable RNA regulation using CRISPR endoRNases. Nature Communications. 13 (1), 2582 (2022).
- Frei, T., et al. Characterization and mitigation of gene expression burden in mammalian cells. Nature Communications. 11 (1), 4641 (2020).
- Beal, J., Weiss, R., Yaman, F., Adler, A., Davidsohn, N. A method for fast, high-precision characterization of synthetic biology devices. Computer Science and Artificial Intelligence Laboratory Technical Report. Massachusetts institute of technology. , Cambridge. MIT-CSAIL-TR-2012-008 (2012).
- Beal, J., et al. Meeting measurement precision requirements for effective engineering of genetic regulatory networks. ACS Synthetic Biology. 11 (3), 1196-1207 (2022).
- Teague, B. Cytoflow: A Python toolbox for flow cytometry. bioRxiv. , (2022).
- Ferreira, J. P., Overton, K. W., Wang, C. L. Tuning gene expression with synthetic upstream open reading frames). Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11284-11289 (2013).
- Michaels, Y. S., et al. Precise tuning of gene expression levels in mammalian cells. Nature Communications. 10 (1), 818 (2019).
- Saito, H., et al. Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch. Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).
- Wroblewska, L., et al. Mammalian synthetic circuits with RNA binding proteins for RNA-only delivery. Nature Biotechnology. 33 (8), 839-841 (2015).
- Wagner, T. E., et al. Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells. Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043-1050 (2018).
- Sekuklu, S. D., Donoghue, M. T. A., Spillane, C. miR-21 as a key regulator of oncogenic processes. Biochemical Society Transactions. 37, 918-925 (2009).
- Stanton, B. C., et al. Genomic mining of prokaryotic repressors for orthogonal logic gates. Nature Chemical Biology. 10 (2), 99-105 (2014).
- Stanton, B. C., et al. Systematic transfer of prokaryotic sensors and circuits to mammalian cells. ACS Synthetic Biology. 3 (12), 880-891 (2014).
