Summary
Complexe genetische circuits zijn tijdrovend om te ontwerpen, testen en optimaliseren. Om dit proces te vergemakkelijken, worden zoogdiercellen getransfecteerd op een manier die het testen van meerdere stoichiometrieën van circuitcomponenten in een enkele put mogelijk maakt. Dit protocol beschrijft de stappen voor experimentele planning, transfectie en data-analyse.
Abstract
Genetische circuits van zoogdieren hebben het potentieel aangetoond om een breed scala aan ziektetoestanden te detecteren en te behandelen, maar optimalisatie van de niveaus van circuitcomponenten blijft uitdagend en arbeidsintensief. Om dit proces te versnellen, ontwikkelde ons lab polytransfectie, een high-throughput uitbreiding van traditionele zoogdiertransfectie. Bij polytransfectie voert elke cel in de getransfecteerde populatie in wezen een ander experiment uit, waarbij het gedrag van het circuit op verschillende DNA-kopienummers wordt getest en gebruikers een groot aantal stoichiometrieën in een eenpotreactie kunnen analyseren. Tot nu toe zijn polytransfecties aangetoond die de verhoudingen van driecomponentencircuits in een enkele put van cellen optimaliseren; In principe kan dezelfde methode worden gebruikt voor de ontwikkeling van nog grotere circuits. Polytransfectieresultaten kunnen eenvoudig worden toegepast om optimale verhoudingen van DNA tot co-transfect te vinden voor transiënte circuits of om expressieniveaus te kiezen voor circuitcomponenten voor het genereren van stabiele cellijnen.
Hier demonstreren we het gebruik van polytransfectie om een driecomponentencircuit te optimaliseren. Het protocol begint met experimentele ontwerpprincipes en legt uit hoe polytransfectie voortbouwt op traditionele co-transfectiemethoden. Vervolgens wordt polytransfectie van cellen uitgevoerd en enkele dagen later gevolgd door flowcytometrie. Ten slotte worden de gegevens geanalyseerd door segmenten van de single-cell flowcytometriegegevens te onderzoeken die overeenkomen met subsets van cellen met bepaalde componentverhoudingen. In het lab is polytransfectie gebruikt om celclassificaties, feedback- en feedforwardcontrollers, bistabiele motieven en nog veel meer te optimaliseren. Deze eenvoudige maar krachtige methode versnelt ontwerpcycli voor complexe genetische circuits in zoogdiercellen.
Introduction
Het gebied van de synthetische biologie van zoogdieren heeft zich snel ontwikkeld, van het ontwikkelen van eenvoudige zintuiglijke en responsonderdelen in gekweekte cellijnen tot de optimalisatie van complexe netwerken van genen om echte uitdagingen in diagnostiek en therapieën aan te pakken1. Deze geavanceerde circuits zijn in staat om biologische inputs te detecteren, van microRNA-profielen tot cytokines tot geneesmiddelen met kleine moleculen, en het implementeren van logische verwerkingscircuits, waaronder transistors, banddoorlaatfilters, tuimelschakelaars en oscillatoren. Ze hebben ook veelbelovende resultaten laten zien in diermodellen van ziekten zoals kanker, artritis, diabetes en nog veel meer 1,2,3,4,5. Naarmate de complexiteit van een circuit groeit, wordt het optimaliseren van de niveaus van elk van de componenten echter steeds uitdagender.
Een bijzonder nuttig type genetisch circuit is een celclassificatie, die kan worden geprogrammeerd om cellulaire toestanden te detecteren en erop te reageren. Selectieve productie van eiwit- of RNA-outputs in specifieke cellulaire toestanden is een krachtig hulpmiddel om differentiatie van cellen en organoïden te begeleiden en te programmeren, zieke cellen en / of ongewenste celtypen te identificeren en te vernietigen en de functie van therapeutische cellen te reguleren 1,2,3,4,5 . Het creëren van circuits in zoogdiercellen die celtoestanden van meerdere cellulaire RNA- en / of eiwitsoorten nauwkeurig kunnen classificeren, is echter zeer uitdagend geweest.
Een van de meest tijdrovende stappen van het ontwikkelen van een celclassificatiecircuit is het optimaliseren van de relatieve expressieniveaus van individuele componentgenen, zoals sensoren en verwerkingsfactoren, binnen het circuit. Om circuitoptimalisatie te versnellen en de bouw van meer geavanceerde circuits mogelijk te maken, heeft recent werk wiskundige modellering van celclassificatiecircuits en hun componenten gebruikt om optimale samenstellingen en topologieën te voorspellen 6,7. Hoewel dit tot nu toe krachtige resultaten heeft opgeleverd, wordt wiskundige analyse beperkt door de noodzaak om het input-outputgedrag van componentgenen in het circuit systematisch te karakteriseren, wat tijdrovend is. Verder kunnen een groot aantal contextafhankelijke problemen opduiken in complexe genetische circuits, waardoor het gedrag van een volledig circuit voorspellingen op basis van individuele onderdeelkarakteriseringentart 8,9.
Om sneller complexe zoogdiercircuits zoals celtoestandclassificatoren te ontwikkelen en te testen, ontwikkelde ons lab een techniek genaamd polytransfectie10, een evolutie van plasmide co-transfectieprotocollen. Bij co-transfectie worden meerdere plasmide-DNA-soorten samen met een positief geladen lipide- of polymeerreagens gecomplexeerd en vervolgens op een gecorreleerde manier aan cellen afgeleverd (figuur 1A). Bij polytransfectie worden plasmiden afzonderlijk gecomplexeerd met het reagens, zodat het DNA van elk transfectiecomplex op een gedecorreleerde manier aan cellen wordt afgeleverd (figuur 1B). Met behulp van deze methode worden cellen binnen de getransfecteerde populatie blootgesteld aan talrijke combinaties van verhoudingen van twee of meer DNA-ladingen die verschillende circuitcomponenten dragen.
Om de verhoudingen van circuitcomponenten te meten die aan elke cel worden geleverd, bevat elk transfectiecomplex binnen een polytransfectie een constitutief tot expressie gebrachte fluorescerende reporter die dient als een proxy voor cellulaire opname van het complex. Filler-DNA dat geen elementen bevat die actief zijn in een zoogdiercel, wordt gebruikt om de relatieve hoeveelheid van de fluorescerende reporter en circuitcomponenten af te stemmen die aan een cel worden geleverd in een enkel transfectiecomplex en wordt in meer detail besproken in de discussie. Een voorbeeld van filler-DNA dat in het Weiss-lab wordt gebruikt, is een plasmide met een terminatorsequentie, maar geen promotor, coderende sequentie, enz. Cellen met verschillende verhoudingen van circuitcomponenten kunnen vervolgens worden vergeleken om optimale verhoudingen voor de gencircuitfunctie te vinden. Dit levert op zijn beurt nuttige voorspellingen op voor het kiezen van promotors en andere circuitelementen om optimale genexpressieniveaus te bereiken bij het combineren van circuitcomponenten in een enkele vector voor genetische integratie (bijvoorbeeld een lentivirus, transposon of landingsplatform). Dus in plaats van verhoudingen tussen circuitcomponenten te kiezen op basis van intuïtie of via een tijdrovend proces van vallen en opstaan, evalueert polytransfectie een breed scala aan stoichiometrieën tussen genetische delen in een eenpotreactie.
In ons lab heeft polytransfectie de optimalisatie van vele genetische circuits mogelijk gemaakt, waaronder celclassificaties, feedback- en feedforward-controllers en bistabiele motieven. Deze eenvoudige maar krachtige methode versnelt de ontwerpcycli voor complexe genetische circuits in zoogdiercellen aanzienlijk. Polytransfectie is sindsdien gebruikt om verschillende genetische circuits te karakteriseren om hun multidimensionale input-output overdrachtsfuncties met hoge resolutie10 te onthullen, een alternatieve circuittopologie voor celstatusclassificatie 11 te optimaliseren en verschillende gepubliceerde12,13 en lopende projecten te versnellen.
Hier beschrijven en verbeelden we de workflow voor het gebruik van polytransfectie om een genetisch circuit snel te optimaliseren (figuur 2). Het protocol laat zien hoe hoogwaardige polytransfectiegegevens kunnen worden gegenereerd en verschillende veelvoorkomende fouten in het polytransfectieprotocol en de gegevensanalyse kunnen worden vermeden (figuur 3). Vervolgens wordt gedemonstreerd hoe polytransfectie kan worden gebruikt om eenvoudige circuitcomponenten te karakteriseren en, in het proces, polytransfectieresultaten te benchmarken tegen co-transfectie (figuur 4). Ten slotte tonen de resultaten van polytransfectie optimalisatie van het kankerclassificatiecircuit (figuur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Tabel 1 en tabel 2 dienen als belangrijke referenties voor dit protocol. Tabel 1 toont reagenschaling voor reacties en tabel 2 toont dna-ratio-rekenkunde voor een voorbeeld polytransfectie beschreven in het protocol (bovenste helft) en voor een mogelijk vervolgexperiment (onderste helft).
1. Cellen voorbereiden op transfectie
- Zorg ervoor dat de kweek van menselijke embryonale niercellen (HEK293) 60% -80% confluent is voordat het protocol wordt gestart. Om dit te doen, zaai 1 x 106 cellen in een 100 mm x 15 mm weefselkweek petrischaal 2 dagen eerder, en incubeer bij 37 °C met 5% CO2.
OPMERKING: Hoewel ons protocol zich richt op HEK293-cellen, kunnen andere celtypen worden vervangen. - Bereid de media en cellen voor op transfecties zoals hieronder beschreven.
- Verwarm ten minste 20 ml van een oplossing van dulbecco's gemodificeerd arendmedium (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% niet-essentiële aminozuren (NEAA; zie materiaaltabel) voor tot 37 °C. Verwarm ook minstens 2,4 ml trypsine en 2,4 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tot 37 °C. Voorwarm gereduceerd serum medium tot ~16 °C.
OPMERKING: Alle weefselkweekwerkzaamheden moeten met zorg worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast.
- Verwarm ten minste 20 ml van een oplossing van dulbecco's gemodificeerd arendmedium (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% niet-essentiële aminozuren (NEAA; zie materiaaltabel) voor tot 37 °C. Verwarm ook minstens 2,4 ml trypsine en 2,4 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tot 37 °C. Voorwarm gereduceerd serum medium tot ~16 °C.
- Resuspendie van de cellen in de DMEM-oplossing zoals hieronder beschreven.
- Zuig en verwijder de huidige media. Breng 2 ml PBS aan op de HEK293-celcultuur om de cellen te wassen. Zuig de PBS op en verwijder deze.
- Breng 2 ml trypsine aan op de HEK293-celcultuur. Plaats de petrischaal in een couveuse bij 37 °C gedurende 3 minuten of totdat de cellen zich niet meer aan de schaal hechten. Breng de schaal terug naar de bioveiligheidskast en verdun de celoplossing door 8 ml DMEM-oplossing in de plaat te doseren.
- Meng de oplossing door meerdere keren zachtjes op en neer te pipetteren. Zuig alle media op en plaats deze in een conische buis van 15 ml.
- Centrifugeer de cellen op 300 x g gedurende 3 minuten om ze te pelleteren. Zuig de media op (zorg ervoor dat de cellen niet worden opgezogen) en gooi het weg. Resuspendeer de cellen in 5 ml DMEM-oplossing en meng door voorzichtig op en neer te pipetteren.
- Schat de huidige celconcentratie met behulp van een geautomatiseerde celteller (vermeld in de materiaaltabel). Zaai zes putjes (in dit voorbeeld) in een 24-well plaat met 1 x 105 cellen (voor een zaaidichtheid van 50.000 cellen/cm2).
- Voeg de DMEM-oplossing tot 500 μL toe (voeg eerst DMEM-oplossing toe aan de putjes) en label vervolgens één put per behandeling als volgt: geen kleurcontrole, mKO2-controle, TagBFP-controle, NeonGreen-controle, alle kleurcontrole en polytransfectie 1. TagBFP, mKO2 en NeonGreen controleputten zijn enkele kleurcontroles voor alle fluorescerende eiwitten die zijn opgenomen in de polytransfectie.
2. Transfectie uitvoeren
- Bereid buisjes voor elk DNA-aggregaat voor. Zet 1,5 ml microcentrifugebuizen opzij en label de buizen als: geen kleurcontrole, mKO2-controle, TagBFP-controle, NeonGreen-controle, alle kleurcontrole, polytransfectiemix 1 en polytransfectiemix 2.
- Voeg 36 μL gereduceerd serummedium toe aan de no color control, mKO2 control, TagBFP control, NeonGreen control en alle color control tubes. Voeg 18 μL gereduceerd serummedium toe aan elk van de polytransfectiemix 1 en polytransfectiemix 2 buisjes.
OPMERKING: De plasmideconcentraties worden verondersteld 150 ng/μl te zijn. - Voeg 600 ng vulplasmide toe aan de controlebuis zonder kleur. Voeg 300 ng mKO2 en 300 ng vulplasmide toe aan de mKO2-kleurcontrolebuis. Voeg 300 ng TagBFP en 300 ng vulplasmide toe aan de TagBFP-kleurcontrolebuis.
- Voeg 300 ng constitutief NeonGreen plasmide en 300 ng vulplasmide toe aan de NeonGreen kleurcontrolebuis. Voeg 100 ng elk van mKO2, TagBFP en constitutieve NeonGreen, evenals 300 ng vulplasmide toe aan de controlebuis voor alle kleuren.
- Voeg 150 ng mKO2 toe aan de polytransfectiemix 1 buis. Voeg 75 ng reporter NeonGreen plasmide en 75 ng vulplasmide toe aan de polytransfectiemix 1 buis.
- Voeg 150 ng TagBFP toe aan de polytransfectiemix 2 buis. Voeg 75 ng L7ae-plasmide en 75 ng vulplasmide toe aan de polytransfectiemix 2-buis.
- Voeg 36 μL gereduceerd serummedium toe aan de no color control, mKO2 control, TagBFP control, NeonGreen control en alle color control tubes. Voeg 18 μL gereduceerd serummedium toe aan elk van de polytransfectiemix 1 en polytransfectiemix 2 buisjes.
- Maak de transfectiemastermix in een microcentrifugebuis van 1,5 ml door 216 μl gereduceerd serummedium te combineren met 9,48 μl transfectiereagens (zie tabel 1 voor reagensverhoudingen en reactieschaling). Meng goed door op en neer te pipetteren en zet apart.
- Voeg 1,58 μL enhancer-reagens toe aan elk van de no color control, single color control en alle kleurcontrolebuizen. Voeg 79 μL enhancer-reagens toe aan elk van de polytransfectiemengbuizen. Meng elke tube afzonderlijk door krachtig te pipetteren.
- Voeg de transfectiemastermix toe aan elke buis die DNA bevat.
- Voeg 37,58 μL transfectiemastermix toe aan elk van de no color control, single color control en alle color control tubes. Meng elke tube afzonderlijk door krachtig te pipetteren.
- Voeg 18,79 μL transfectiemastermix toe aan elk van de polytransfectiemengbuizen. Meng elke tube afzonderlijk door krachtig te pipetteren.
- Doseer de transfectiemengsels in de putten.
- Pipetteer 65,97 μL van elke transfectiemix voor de besturingselementen geen kleur, één kleur en alle kleuren in de overeenkomstige putjes.
- Pipetteer 32,98 μL van de polytransfectiemeng 1 in de polytransfectieput en draai de plaat snel maar voorzichtig in een strak figuur-achtpatroon langs een plat oppervlak om de complexen effectief te verdelen. Vervolgens pipet 32,98 μL van de polytransfectiemenging 2 in dezelfde polytransfectieput en draai de plaat op dezelfde manier.
- Plaats de plaat in een incubator bij 37 °C, met 5% CO2 en zonder schudden, gedurende een periode van 48 uur.
OPMERKING: Om de levensvatbaarheid van de cel te vergroten, kunnen de celmedia elke 6 uur na transfectie worden vervangen (hoewel dit niet altijd nodig is, en met HEK293-cellen en zijn derivaten, moet men voorzichtig zijn om de cellen niet los te maken van de plaat bij het veranderen van de media).
| Reagens | Aantal | Schalen | ||||
| Gereduceerd serummedium voor DNA-mengsel | 36 μL per besturingsbuis, 18 μL per polytransfectiebuis | 0,05 μL gereduceerd serummedium/ng DNA per buis, met 10-20% extra volume om rekening te houden met pipetteren | ||||
| DNA | 300-600 ng per buis | |||||
| P3000 | 1,58 μL per besturingsbuis, 0,79 μL per polytransfectiebuis | 0,0022 μL P3000/ng DNA per buis, met 10-20% extra | ||||
| Gereduceerd serummedium voor Lipo master mix | 36 μL per besturingsbuis, 18 μL per polytransfectiebuis | 0,05 μL gereduceerd serum medium/ng totaal DNA, met 10-20% extra volume om rekening te houden met pipetteren | ||||
| Transfectie en enhancer reagens | 1,58 μL per besturingsbuis, 0,79 μL per polytransfectiebuis | 0,0022 μL Lipofectamine 3000/ng DNA, met 10-20% extra | ||||
Tabel 1: Reagenschaling voor transfecties. De tabel geeft de juiste verhouding aan van het op te nemen reagens voor de DNA-hoeveelheid in een enkel putje. Dit kan worden gebruikt om reacties effectief te schalen en mastermixen te vormen. De hoeveelheden reagens zijn geschaald tot een overschot van 20%.
3. Cellen voorbereiden op flowcytometrie
- Verwarm ten minste 4,2 ml DMEM-oplossing voor tot 37 °C. Verwarm ten minste 4,2 ml trypsine en 4,2 ml PBS voor tot 37 °C. Houd de fluorescentie-geactiveerde celsorteeroplossing (FACS) op 4 °C totdat deze klaar is voor gebruik.
- Resuspendie van de cellen in de FACS-bufferoplossing (PBS aangevuld met 1% BSA, 5 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur [EDTA] en 0,1% natriumazide [NaN3], om klontering te verminderen; zie materiaaltabel) zoals hieronder beschreven.
- Zuig en verwijder de huidige media in elke put. Doseer 5 ml PBS in elke put om de cellen te wassen. Zuig de PBS op en verwijder deze.
- Doseer 5 ml trypsine in elk putje. Plaats de plaat in een incubator bij 37 °C gedurende 3 minuten, of totdat de cellen zich niet meer aan de schaal hechten. Breng de plaat terug naar de bioveiligheidskast en verdun de celoplossingen door 5 ml DMEM-oplossing in elk putje te doseren.
- Meng voor elk putje de oplossing door meerdere keren zachtjes op en neer te pipetteren. Zuig voor elk putje alle media op en plaats het in een conische buis van 15 ml.
- Centrifugeer de cellen op 300 x g gedurende 3 minuten om ze te pelleteren. Zuig de media op, zorg ervoor dat de cellen niet worden geaspireerd en weggegooid. In elke buis, resuspendeerde de cellen in 5 ml FACS-bufferoplossing, mengen door zachtjes op en neer te pipetteren.
- Laat elke celsuspensieoplossing door een zeef gaan (om klonten te verwijderen) in afzonderlijke kegelvormige buizen voor flowcytometrie. Houd deze buizen niet langer dan 1 uur op ijs en voer zo snel mogelijk flowcytometrie uit.
4. Uitvoeren van flowcytometrie
OPMERKING: Het bedienen van een flowcytometer vereist een goede training en kennis van de noodzakelijke taken. Aangezien software en apparatuur kunnen variëren en gebruikers in het algemeen moeten worden getraind, verwijst deze sectie naar specifieke bewerkingen die nuttig zijn om uit te voeren.
- Onderzoek eerst de cellen die zijn getransfecteerd met de vulplasmidecontrole (geen kleurcontrole) om te selecteren op celkenmerken en afwijkingen (inclusief aggregaten, puin, enz.) te voorkomen. Hoewel er veel combinaties van parameters zijn om cellen te onderscheiden, gebruikt u de volgende drie algemene opties als een goede manier om onderscheidende kenmerken te visualiseren.
- Kijk naar het zijverstrooiingsgebied (log of lineaire schaal per voorkeur/celtype) versus het voorwaartse spreidingsgebied (lineaire schaal).
- Kijk naar de zijspreidingshoogte (logschaal) versus de zijspreidingsbreedte (lineaire schaal).
- Kijk naar de voorwaartse spreidingsbreedte (lineaire schaal) versus de voorwaartse spreidingshoogte (lineaire schaal).
- Kijk vervolgens naar de besturingselementen voor één kleur. Gebruik de all color control om de instrumentspanningen af te stemmen, zodat de signalen van elk fluorescerend eiwit worden genormaliseerd tot equivalente willekeurige eenheden (a.u.) van fluorescentie. Voer vervolgens de enkele kleurregelaars uit voor elk fluorescerend eiwit, die worden gebruikt om de compensatiematrix in te stellen, waardoor doorbloedingscorrectie mogelijk is.
OPMERKING: Idealiter zou het volledige dynamische bereik van de fluorescentiewaarden zichtbaar moeten zijn. Verdere normalisatie van fluorescerende eiwitsignalen kan worden gedaan via conversie naar gestandaardiseerde eenheden (bijv. Moleculen van equivalent fluoresceïne [MEFLs; zie Beal et al.15]). Om MEFL-conversie tijdens de analyse mogelijk te maken, voert u regenboogkalibratieparels uit. Een dergelijke kalibratie is ook nuttig voor het verminderen van instrument-tot-instrument en dagelijkse signaalvariatie16. - Voer de polytransfectiemonsterbuis uit.
OPMERKING: Waar mogelijk wordt aanbevolen om 1.000 x 10 ^ (^ = mengsels) cellen uit te voeren, omdat hogerdimensionale polytransfecties tijdens de analyse in meer bakken moeten worden onderverdeeld en elke bak voldoende cellen nodig heeft (idealiter >10) om statistisch significante vergelijkingen te maken.
5. Uitvoeren van post-experiment analyse
- Gebruik in eerste instantie gegevens van de bedieningselementen (en, indien van toepassing, de kralen) om nauwkeurige resultaten te garanderen. Gebruik een van de beschikbare softwaretools om live cell gating (met behulp van poorten zoals hierboven beschreven), compensatie en autofluorescentiecorrectie uit te voeren.
OPMERKING: We gebruiken meestal aangepaste MATLAB-code (bijv. https://github.com/jonesr18/MATLAB_Flow_Analysis of Cytoflow17), die zowel een grafische gebruikersinterface als een python-bibliotheek heeft die geschikt is voor de voorbewerkingsfase en voor polytransfectieanalyse.
| Methode | Complex | ng Fluorescerende Marker | ng L7ae (fractie) | ng Reporter (fractie) | ng Filler DNA (fractie) | Totaal (ng) |
| Polytransfectie 1 | 600 | |||||
| → | 1 | 150 | 75 (½) | 75 (½) | 300 | |
| → | 2 | 150 | 75 (½) | 75 (½) | 300 | |
| Polytransfectie 2 | 600 | |||||
| → | 1 | 150 | 25 (1/6) | 125 (5/6) | 300 | |
| → | 2 | 150 | 125 (5/6) | 25(1/6) | 300 |
Tabel 2: DNA-hoeveelheden voor polytransfectie aangetoond in het protocol, en een voorbeeld vervolgexperiment met afgestemde plasmideverhoudingen. De bovenste helft van de tabel toont de samenstelling van plasmiden die worden gebruikt in een eenvoudig polytransfectie-experiment. De onderste helft toont de samenstelling van een bijgewerkt experiment dat de plasmideverhoudingen aanpast om een hypothetische concentratieruimte beter te subsamplen, waarbij de genexpressiemodulator een meer optimale 1: 5-verhouding heeft ten opzichte van zijn reporter, wat meer getransfecteerde cellen oplevert om rond deze verhouding te bemonsteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In figuur 1 vergelijken we co-transfectie met polytransfectie. In een co-transfectie worden alle plasmiden in dezelfde transfectiemix afgeleverd, wat resulteert in een hoge correlatie tussen de hoeveelheid van elk plasmide die een enkele cel ontvangt (figuur 1A). Hoewel het aantal totale plasmiden dat aan elke cel wordt geleverd aanzienlijk varieert, is de fluorescentie van de twee reporter-eiwitten in de individuele cellen in de populatie goed gecorreleerd, wat aangeeft dat de twee plasmiden samen worden afgeleverd in een vrij constante verhouding. Getransfecteerde cellen kunnen weinig of veel complexen opnemen, maar omdat elk complex gecorreleerde hoeveelheden van elk plasmide heeft, onderzoekt de co-transfectie slechts een klein diagonaal gebied van de concentratieruimte tussen de twee plasmiden. In een polytransfectie daarentegen worden plasmiden geleverd in meerdere transfectiecomplexen, wat resulteert in gedecorreleerde afgifte van plasmiden in verschillende transfectiemengsels (figuur 1B). Getransfecteerde cellen nemen verschillende combinaties van de complexen op, wat resulteert in cellen die verschillende doseringen plasmiden bevatten van geen van beide, één of beide complexen.
Figuur 2 toont een representatieve polytransfectieworkflow. Over het algemeen bestaat een polytransfectie-experiment uit de volgende stappen: het probleem definiëren, de transfectiemixen maken, de cellen incuberen, flowcytometrie en analyse. Er is ook een optionele stap om de polytransfectie te herhalen met geoptimaliseerde onderdeelverhoudingen als de initiële polytransfectieresultaten niet in staat zijn om de optimale onderdeelverhoudingen nauwkeurig te beperken. Deze stappen staan beschreven in het protocol.
In figuur 3 worden enkele voorbeelden gegeven van goed uitgevoerde co- en polytransfecties en veelvoorkomende fouten. Figuur 3A toont een goed uitgevoerde co-transfectie met een nauwe correlatie tussen TagBFP en eYFP-tot expressie brengende plasmiden die gelijktijdig werden afgeleverd. De co-transfectie in figuur 3B vertoont daarentegen een slechte correlatie tussen deze twee plasmiden. In de getoonde figuur is de slechte correlatie te wijten aan het toevoegen van enhanceragens aan het gereduceerde serummedium voordat de plasmiden werden toegevoegd. Een dergelijke slechte correlatie in de experimenten kan ook te wijten zijn aan verschillende promotors die de expressie van de fluorescerende eiwitten stimuleren, slechte menging tijdens het maken van transfectiemixen of het complex laten incuberen voor een te kort of te lang interval.
Figuur 3C toont een goed uitgevoerde polytransfectie, met een goede dekking van de tweedimensionale ruimte en een goede compensatie van eventuele spectrale doorbloedingen tussen fluorescerende eiwitten. Figuur 3D toont polytransfectiegegevens met een laag aantal levende cellen, die moeilijk onder te verdelen zijn in voldoende bakken met een voldoende aantal cellen in elke bak voor analyse. Om dit probleem te verbeteren, moet de beginnende celpopulatie in goede gezondheid verkeren en niet overwoekerd zijn, en de experimentele toxiciteit verminderen door een ander transfectiereagens te gebruiken en / of transfecteren met minder totaal DNA. Figuur 3E toont een polytransfectie waarbij de transfectie-efficiëntie slecht was, wat opnieuw resulteerde in een schaarse dekking van de tweedimensionale ruimte voor analyse. In dit geval is het aantal cellen dat morfologie gating passeert hoog, maar de cellen brengen geen fluorescerende eiwitten tot expressie. Om de efficiëntie te verbeteren, moet de keuze van het transfectie-reagens worden geoptimaliseerd en moet het protocol van de fabrikant op de voet worden gevolgd. Elk transfectiemengsel moet een equivalente hoeveelheid DNA-massa bevatten, zodat de cellen een ongeveer gelijke kans hebben om elk type complex te ontvangen, en elk transfectiemengsel moet worden gemaakt in overeenstemming met de instructies van de kit. Verschillende transfectiekits zijn optimaal voor verschillende celtypen; De kit die de beste efficiëntie geeft in het celtype van interesse moet worden gebruikt. Ten slotte zijn sommige celtypen moeilijk te transfecteren, ongeacht de gebruikte kit. In deze gevallen moet een groter aantal cellen worden getransfecteerd en zoveel mogelijk worden verzameld tijdens flowcytometrie om ervoor te zorgen dat een voldoende aantal cellen wordt geanalyseerd. Figuur 3F toont polytransfectiegegevens waarbij een van de fluorescerende eiwitmarkers duidelijk spectrale doorbloeding in een ander fluorescerend eiwit laat zien. Afzonderlijke kleurcontroles moeten altijd worden uitgevoerd voor alle fluorescerende eiwitten in het systeem en worden gebruikt om een compensatiematrix te genereren die voorafgaand aan de analyse op alle polytransfecties moet worden toegepast.
Wanneer men voor het eerst polytransfectie-experimenten uitvoert (in het algemeen of voor een nieuw experimenteel systeem), moet men benchmarking uitvoeren met standaard co-transfectie. Een benadering is om de input-output transferfunctie voor belangrijke systeemonderdelen individueel te meten met behulp van zowel co-transfectie (via tuning DNA-doseringen) als poly-transfectie.
In figuur 4 tonen we benchmarking van de translationele repressor L7Ae, hier aangepast van de oorspronkelijke polytransfectiepublicatie10. L7Ae is een RNA-bindend eiwit dat RNA kink-turn (KT) motieven herkent20; wanneer twee KT's (2xKT) in het 5' onvertaalde gebied (UTR) van een mRNA worden geplaatst, kan downstream open reading frame (ORF) translatie effectief worden onderdrukt door L7Ae21. L7Ae is eerder gebruikt om RNA-gebaseerde celtype classificatoren21 en andere RNA-gebaseerde circuits22 te bouwen. Om L7Ae te testen door standaard co-transfectie, kan men de verhoudingen van de plasmiden die coderen voor L7Ae en zijn doelreporter afstemmen binnen verschillende transfectiemixen (figuur 4A en tabel 3). Voor polytransfectie moet men onafhankelijk constitutieve L7Ae en bijbehorende 2xKT-reporter leveren in afzonderlijke transfectiemengsels, zodat een breed scala aan plasmideverhoudingen aan de cellen wordt geleverd (figuur 4B). Na het uitvoeren van transfectie en flowcytometrie kan data-analyse worden uitgevoerd. Om de gegevens vergelijkbaar te maken, kan men de individuele co-transfectieresultaten in een enkele dataset verzamelen en vervolgens een vergelijkbare multidimensionale binning uitvoeren als de polytransfectiegegevens (figuur 4C, D). Bij vergelijking van de dosis-responscurven van L7Ae die de outputreporter onderdrukken, kan worden gezien dat het mediane uitgangsniveau per bin zeer vergelijkbaar is tussen de co-transfectie- en polytransfectiegegevens (figuur 4E-G).
Over het algemeen hebben we gezien dat polytransfectiegegevens goed correleren met co-transfectiegegevens over brede DNA-verhoudingen, met minder precisie bij zeer scheve DNA-doseringsverhoudingen (deels als gevolg van lagere celdekking in bakken voor polytransfectie-experimenten, vooral voor delen die zeer sterk actief zijn bij lage plasmidedoseringen). Om de meetnauwkeurigheid voor dergelijke gevoelige onderdelen te verbeteren, kan hun expressieniveau worden verlaagd met een zwakkere promotor, upstream open leesframes18 of microRNA silencing-mediated fine-tuners (miSFITs)19.
Figuur 5 toont een succesvolle toepassing van polytransfectie voor optimalisatie van een celtypeclassificatie, opnieuw aangepast van Gam et al10. De classifier is een relatief eenvoudig ontwerp dat een output produceert als reactie op expressie van miR-21-5p, een miRNA dat overexpressie heeft in veel tumorcellen23. Bij afwezigheid van miR-21 wordt classificatoroutput onderdrukt door een bacterieel afgeleide transcriptionele repressor, BM3R124, waarvan eerder werd aangetoond dat de aanpassing werkt in zoogdiercellen25. Wanneer miR-21 aanwezig is, bindt het vier doellocaties die in zowel de 3' als de 5' UTR's van BM3R1 zijn geplaatst, waardoor de expressie wordt neergehaald en daardoor outputtranscriptie mogelijk wordt (figuur 5A). Om dit systeem te optimaliseren, werden de drie circuitcomponenten geleverd in afzonderlijke transfectiemixen: (1) BM3R1 (met miR-21-doellocaties), (2) outputreporter (mKO2) en (3) Gal4-VP16, die transcriptie van de uitgang activeert (tabel 4). Merk op dat de uitvoerpromotor werkt op de logica (Gal4-VP16) en niet op BM3R1, die de uitvoer onderdrukt, zelfs in de aanwezigheid van Gal4-VP1625. Elk onderdeel codeert voor een transfectiemarker, respectievelijk TagBFP, mNeonGreen en iRFP720, op hetzelfde plasmide om de relatieve DNA-dosering van elk complex aan te geven. Over het algemeen zou een verhoogde Gal4-VP16-expressie de mKO2-output van de reporter moeten verhogen, terwijl een verhoogde BM3R1-expressie zou moeten resulteren in een lagere mKO2-output. Omdat BM3R1 wordt neergehaald door miR-21-5p, zou de outputexpressie hoger moeten zijn in HeLa-cellen, die hogere niveaus van miR-21-5p hebben en dus minder BM3R1 tot expressie brengen dan in HEK-cellen.
Na polytransfectie in zowel HEK293- als HeLa-cellen verkregen we een 3D-verdeling van verschillende plasmideverhoudingen (figuur 5B-HEK-cellen). Gam et al.10 subsampleden deze verdeling in verschillende verhoudingen door cellen binnen een bepaalde Euclidische afstand van een belangenverhouding te beschouwen; Deze afstand moet breed genoeg zijn om voldoende cellen te bevatten om statistisch significante resultaten van de analyse mogelijk te maken, maar smal genoeg om onnodige ruis te voorkomen door een te brede reeks componentverhoudingen van de drie delen op te nemen. Gam et al.10 gebruikten vervolgens een optimalisatiealgoritme om de verhouding van onderdelen te identificeren die de classificatienauwkeurigheid voor co-transfectie maximaliseerden (d.w.z. getransfecteerde HeLa-cellen zijn positief voor outputexpressie, terwijl getransfecteerde HEK-cellen dat niet zijn). De optimale verhouding van de onderdelen bleek 10,9:1,5:1 te zijn: Gal4-VP16:output:BM3R1; cellen die zijn gesubsampled rond de optimale verhouding binnen de gehele polytransfectieruimte zijn weergegeven in figuur 5C. Deze subsampling voorspelde dat, bij deze verhouding, het co-getransfecteerde circuit een specificiteit van 91%, 62% gevoeligheid en 77% nauwkeurigheid heeft bij het classificeren van HEK293 versus HeLa-cellen (figuur 5D). Co-transfectie met plasmideverhoudingen die op dit optimum waren ingesteld, leverde nog betere resultaten op: 99% specificiteit, 68% sensitiviteit en 84% nauwkeurigheid10. Verder leidden de verhoudingen de implementatie van een single-plasmide-versie van het circuit, met relatieve expressie afgestemd door gebruik te maken van verschillende afgeknotte promotors en upstream ORF's (uORF's), wat een circuit opleverde met 91% specificiteit, 90% gevoeligheid en 90% nauwkeurigheid10. Polytransfectie is dus een krachtig hulpmiddel om het ontwerp van celclassificaties en gencircuits in bredere zin te begeleiden.
Figuur 1: Vergelijking van co-transfectie en poly-transfectie. (A,B) Overzicht en vergelijking van plasmideafgifte met co-transfectie van twee plasmiden en polytransfectie van twee plasmiden. Voor elke transfectiemethode toont het meest linkse diagram de vorming van transfectiecomplexen tussen negatief geladen DNA en positief geladen lipiden. In deze voorbeelden codeert elk gekleurd plasmide (blauw en rood) voor de expressie van een ander fluorescerend eiwit. Het middelste diagram toont voorbeelden van plasmideafgifte aan cellen en ook een schema voor de verwachte verdelingen in een histogram of spreidingsdiagram. De kleurintensiteit op het histogram komt overeen met fluorescentie van de overeenkomstige plasmidekleur. Het meest rechtse diagram toont echte gegevens van cellen die met elke gegeven methode zijn getransfecteerd. (A) Bij een co-transfectie met twee verschillende plasmiden worden beide plasmiden met elkaar gemengd voordat transfectiereagens wordt toegevoegd, wat resulteert in een sterk gecorreleerde verpakking van de twee plasmidesoorten. In werkelijke co-transfectiegegevens vertonen cellen gecorreleerde afgifte van beide plasmiden (rechts). (B) In een polytransfectie wordt elke set co-geleverde plasmiden die overeenkomen met een circuitdeel en een transfectiemarker afzonderlijk gemengd met het transfectiereagens, wat resulteert in complexen die alleen die plasmiden bevatten (links). In werkelijke polytransfectiegegevens verkennen cellen een breed scala aan concentratieruimte met veel verschillende plasmide-stoichiometrieën die tegelijkertijd worden onderzocht (rechts). Dit cijfer is gewijzigd van10. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Polytransfectieworkflow. Stap 1: Definieer het probleem. Begin met een systeem met meerdere onderdelen waarvan de ideale verhouding tussen onderdelen onbekend is, en kies een beginverhouding tussen onderdelen. Stap 2: Maak de transfectiemixen. Elke transfectiemix bevat een circuitcomponent en een fluorescerende transfectiemarker. De hoeveelheid circuitdeel die aan een cel wordt geleverd, correleert met de fluorescentie van de marker. Stap 3: Incubeer de cellen. In een typische workflow incuberen we cellen gedurende 48 uur tussen transfectie en flowcytometrie. Stap 4: Flowcytometrie. Voer de juiste besturingselementen uit, zoals beschreven in het protocol, en voer vervolgens de voorbeelden uit. Stap 5: Analyse.Gebruik de transfectiemarkeringen om de cellen in de prullenbak te gooien op basis van de hoeveelheid of verhoudingen van de delen die de cel heeft ontvangen. Gebruik de uitgangseiwitten om de prestaties van het circuit te meten. Zoek de bakken/verhoudingen van onderdelen die de circuitprestaties optimaliseren. Stap 6: Herhaal dit met geoptimaliseerde onderdeelverhoudingen (optioneel). Als de optimale bakken/verhoudingen zeer scheve verhoudingen hebben, kan het zijn dat de polytransfectie van de pilot de optimale onderdeelverhoudingen niet precies beperkt. Herhaal de polytransfectie met afgestemde deelverhoudingen, zodat een cel die een gelijke hoeveelheid van elke transfectiemix ontving, nu een bijna optimale verhouding van delen ontvangt, zoals bepaald door de vorige ronde. Dit cijfer is gewijzigd van10. De afbeelding van een incubator werd gebruikt van Servier Medical Art en de afbeelding van een cytometer van BioRender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve positieve en negatieve polytransfectieresultaten . (A) Goed uitgevoerde co-transfectie van twee fluorescerende verslaggevers, die een nauwe correlatie vertonen. Een totaal van 20.000 cellen worden zowel hier als in (B) ter vergelijking uitgezet. Het is een goed idee om een vergelijkbare kleine proef co-transfectie van twee fluorescerende reporters uit te voeren voordat u een polytransfectie-experiment start, om ervoor te zorgen dat plasmiden goed gecorreleerd zijn binnen transfectiemengsels. (B) Luidruchtigere co-transfectie: plasmiden zijn niet goed gecorreleerd binnen elk transfectiemengsel, waardoor fluorescerende markers in een polytransfectie een slechte marker van plasmideverhoudingen kunnen zijn. (C) Goed uitgevoerde polytransfectieresultaten die een goed celgetal, transfectie-efficiëntie en compensatie laten zien. (D) Laag aantal levende cellen, waardoor subbemonstering in bakken met statistisch significante aantallen cellen niet mogelijk is. (E) Slechte transfectie-efficiëntie, waardoor subbemonstering in bakken met statistisch significante aantallen cellen niet mogelijk is. (F) Gebrek aan passende compensatie, waardoor fluorescentiegegevens een slechte proxy zijn voor de hoeveelheid fluorescerend eiwit in het systeem. Gebruik besturingselementen voor één kleur om een ideale lineaire compensatiematrix te bepalen en pas deze toe op de gegevens voordat deze verder wordt verwerkt. Alle kleurregelaars worden ook aanbevolen, afhankelijk van de softwarekeuze. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Benchmarking van polytransfectie tegen co-transfectie. (A) In een co-transfectie kan in elke experimentele put één verhouding van translationele repressor L7Ae tot fluorescerende reporterplasmiden worden getest. (B) Bij polytransfectie kunnen veel verhoudingen van L7Ae tot verslaggevers in dezelfde put worden getest. Zie tabel 3 voor details over de polytransfectieplasmidemengsels. (C,D) Binning workflow voor het benchmarken van poly-transfectie tegen meerdere co-transfecties. Een totaal van 10 biexponentieel verdeelde bakken werden toegewezen voor elke transfectiemarkerdimensie, die de niveaus van elk van de twee plasmiden benaderen. Hier worden bakken getoond die verschillende niveaus van plasmide # 2 aangeven. Binning werd uitgevoerd op zowel een gecolleerde set van 11 co-transfectiemonsters verspreid over verschillende plasmideverhoudingen (C) als gegevens van een enkele polytransfectie, bestaande uit ongeveer 500.000 cellen elk (D). Kleuren komen overeen met sets bakken die worden gedefinieerd door gen 2 (TagBFP) niveaus. (E-G) Benchmarking van polytransfectie tegen co-transfectie voor een representatief circuit. Mediane outputfluorescentie werd geëvalueerd voor de cellen in elke bin en vergeleken tussen methoden voor het representatieve systeem, L7Ae translationele repressie. (E) Constructies voor het meten van L7Ae-activiteit. mKO2-fluorescentie dient als een schatting voor de levering van L7Ae (gen # 1), terwijl TagBFP-fluorescentie dient als een schatting voor de levering van de gereguleerde mNeonGreen-output (gen # 2). (F) Multidimensionale titratiecurven voor L7Ae. Elke regel vertegenwoordigt de set bins op één niveau van TagBFP, zoals aangegeven in (C) en (D). Ononderbroken lijnen geven polytransfectiegegevens aan, terwijl onderbroken lijnen co-transfectiegegevens aangeven. Op elk binned-niveau van reporterplasmide neemt de reporteroutput af naarmate L7Ae toeneemt. (G) Visuele vergelijking tussen co-transfectie en polytransfectie voor het L7Ae-systeem. Elk punt vertegenwoordigt de gemeten output in overeenkomstige bakken voor polytransfectie- en cotransfectiemetingen, waarbij meer equivalente waarden dichter bij de rode 1:1-lijn liggen. Over het algemeen zijn de waargenomen verschillen tussen polytransfectie- en co-transfectie-afgeleid laag, wat vertrouwen geeft in de betrouwbaarheid van de polytransfectiemethode. Dit cijfer is gewijzigd van10. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Data-analyse voor polytransfectie. Bij polytransfectie kunnen cellen worden gegroepeerd in bakken of plakjes voor analyse. Figuur 4 toont een vorm van analyse waarbij de cellen in plakjes worden gesneden die overeenkomen met niveaus van een systeemcomponent, zoals reporter plasmideniveau, wat nuttig kan zijn voor het aanpassen van modellen en het begrijpen van doseringsreacties. Een andere nuttige strategie is om circuitprestaties te analyseren bij verschillende verhoudingen van circuitcomponenten. (A) Diagram van een classificatorcircuit voor optimalisatie. Niveaus van TagBFP, NeonGreen en iRFP720 komen overeen met niveaus van respectievelijk BM3R1, output mKO2 en Gal4-VP16. Zie tabel 4 voor nadere bijzonderheden over de polytransfectieplasmidemengsels. (B) Experimentele opstelling van polytransfectiemengsels. (C) Flowcytometriegegevens verzameld uit polytransfectie met het circuit in (A). De niveaus van elk van de drie reporter fluorescerende eiwitten als gevolg van circuit poly-transfectie in HEK-cellen, tonen het brede scala aan circuitcomponentverhoudingen die aanwezig zijn in de gegevens. Vergelijkbare resultaten werden verkregen uit circuittransfectie in zowel HEK- als HeLa-cellen. D) Subsampling polytransfectie in een bepaalde verhouding. Om de gegevens te analyseren, hebben we een groot aantal verhoudingen tussen circuitcomponenten gescand en de prestaties van de classificator bij elke verhouding bepaald. Als voorbeeld tonen we hier een bepaalde verhouding die goede prestaties liet zien (Gal4-VP16 = 435 ng DNA, reporter = 60 ng en BM3R1 = 40 ng). Uitgezet in blauw is de overeenkomstige verhouding van de fluorescerende markers voor de drie verschillende circuitcomponenten. Vervolgens hebben we de gegevens gesubsampled door alleen punten binnen een bepaalde Euclidische afstand van het fluorescentietraject te beschouwen. We subsampleden cellen op hetzelfde traject van zowel HEK- als HeLa-transfecties. (E) Vergelijking van circuitprestaties op hetzelfde traject in HEK- en HeLa-cellen. Door statistieken zoals gevoeligheid, specificiteit en nauwkeurigheid van classificatie over vele verhoudingen te vergelijken, kunnen componentverhoudingen worden geoptimaliseerd om een ideaal genetisch circuit te genereren. Dit cijfer is gewijzigd van10. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Complex | ng L7Ae plasmide | ng Reporter plasmide | OptiMEM (μL) | P3000 (μL) | Lipo 3000 (μL) |
| 1 | 250 | 75 | 1.5 | 1.5 | |
| 2 | 250 | 75 | 1.5 | 1.5 |
Tabel 3: Transfectiemengsels overeenkomstig figuur 4. HEK293-cellen werden poly-getransfecteerd met deze transfectiemengsels in één put van een 24-putplaat.
| Complex | ng BM3R1 plasmide | ng Gal4-VP16 plasmide | ng Reporter plasmide | OptiMEM (μL) | P3000 (μL) | Lipo 3000 (μL) |
| 1 | 900 | 75 | 1.5 | 1.5 | ||
| 2 | 900 | 75 | 1.5 | 1.5 | ||
| 3 | 900 | 75 | 1.5 | 1.5 |
Tabel 4: Transfectiemengsels overeenkomstig figuur 5. HEK293- en HeLa-cellen werden elk poly-getransfecteerd met deze transfectiemengsels in één put, elk van een 6-putplaat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rapid prototyping-methoden zoals computerondersteund ontwerp (CAD), breadboarden en 3D-printen hebben een revolutie teweeggebracht in mechanische, elektrische en civieltechnische disciplines. Het vermogen om snel door vele mogelijke oplossingen voor een bepaalde uitdaging te zoeken, versnelt de vooruitgang in een veld aanzienlijk. Wij geloven dat polytransfectie een analoge technologie is voor biologische engineering, die snelle prototyping van genetische circuits mogelijk maakt. Bovendien vereisen andere rapid prototyping-technologieën hands-on sequentiële iteratie van meerdere mogelijke oplossingen, terwijl polytransfectie in staat is om veel oplossingen tegelijkertijd te verkennen. Polytransfectie maakt het mogelijk om een groot aantal combinaties van genetische circuitcomponentverhoudingen in één put te testen en is gebruikt om verschillende gepubliceerde genetische circuits te optimaliseren10,11,13. Het experimentele protocol is een eenvoudige uitbreiding van standaard co-transfectie, waardoor veel zoogdiercelonderzoekers eenvoudig kunnen worden overgenomen. Over het algemeen wordt een zeer nauwe overeenkomst tussen polytransfectie- en co-transfectieresultaten gezien10 (een voorbeeld is figuur 4). Polytransectie kan dus worden gebruikt in de meeste gevallen waarin plasmideverhoudingen worden getitreerd binnen co-transfectiemengsels en outputs worden gemeten op het niveau van één cel.
De complexiteit en schaal van polytransfectie nemen toe met de complexiteit van genetische circuits om te optimaliseren. Naarmate het aantal te analyseren dimensies toeneemt, nemen de combinatorische verhoudingen van verschillende delen en het aantal cellen dat nodig is voor hun analyse exponentieel toe. Om bijvoorbeeld de classificator in figuur 5 te optimaliseren, werden cellen getransfecteerd in een 6-well plaatformaat en werden gegevens verzameld over ten minste 1,5 miljoen levende cellen. We hebben ook een classifier geoptimaliseerd met een extra circuitcomponent 10, waardoor transfectie op een plaatschaal van10 cm en de verzameling van miljoenen cellen nodig is. Op die schaal en hoger is DNA-productie tijdrovend en zijn transfectiereagentia duur. Dat gezegd hebbende, polytransfectie gebruikt ordes van grootte minder cellen, DNA en transfectiereagentia dan het testen van een vergelijkbaar aantal circuitcomponentverhoudingscombinaties in individuele putten. Bovendien wordt een aanzienlijke hoeveelheid tijd bespaard door ordes van grootte minder transfectiemengsels te maken.
Polytransfectie maakt geavanceerde analysemethoden voor flowcytometriegegevens mogelijk. De twee belangrijkste benaderingen zijn (1) binningcellen volgens de expressie van elke transfectiemarker en (2) het extraheren van cellen in gedefinieerde verhoudingen van transfectiemarkers, waardoor co-transfectie wordt gesimuleerd. De eerste selecteert cellen met een specifieke combinatie van DNA-dosering voor elk complex (en dus elk deel), wat input-output overdrachtsfuncties oplevert. De laatste selecteert cellen met een specifieke verhouding van DNA-doseringen voor elk deel, waarbij co-transfectie wordt gesimuleerd bij een dergelijke verhouding van plasmide DNA-massa's. Het uitzetten van het expressieniveau van circuituitgangsreporter(s) in de subsampled selecties geeft een maat voor de output op de gedefinieerde niveaus of verhoudingen van inputs. Voor circuitoptimalisatie kan men de best presterende bins / ratio's identificeren zoals gedefinieerd door het doel van het circuit - in het geval van celclassificaties zijn dit de bins / ratio's waarbij het circuit AAN staat in het doelceltype en UIT in niet-doelceltypen. Bij het kiezen van een bakgrootte moet men rekening houden met het vereiste precisieniveau en het aantal cellen per bak. Kleinere bakken richten zich nauwkeuriger op de ideale combinatie van circuitcomponenten, maar als een bak te weinig cellen heeft, kan dit ongewenste ruis in de metingen introduceren.
Toekomstige verbeteringen in computationele analyse van polytransfectiegegevens kunnen optimalisatie vergemakkelijken, zelfs met een lage celdekking per bak / verhouding. Momenteel sluiten we gegevens uit van bakken met minder dan een ingestelde drempel van cellen (bijvoorbeeld 10) om te luidruchtige metingen te voorkomen. In combinatie met herhaalde metingen maakt dit nauwkeurigere en nauwkeurigere berekeningen mogelijk van dosis-responscurven, classificatornauwkeurigheden en andere metrieken die per bak zijn gedefinieerd. Elke cel in polytransfectie kan echter worden beschouwd als een onafhankelijk experiment, waarbij met een fijne resolutie de circuituitgang(en) op een nauwkeurig niveau van ingangen worden gemeten. Met dit in gedachten kunnen mechanistische en fenotypische modellen van dosisresponsen en circuitoptimalisaties direct passen bij de verdeling van genexpressie van elke marker en verslaggever, in plaats van hun versnipperde samenvattingsstatistieken10. Dit maakt robuustere metingen mogelijk en maakt gebruik van de vele individuele gegevenspunten die per experiment worden verzameld. Dergelijke modelleringsbenaderingen kunnen daardoor voorspellende circuitkarakterisering en -optimalisatie opleveren, zelfs met schaars bemonsterde hoogdimensionale polytransfecties. Verder kunnen machine learning-methoden zoals responsoppervlakmethodologie en willekeurige bosregressie worden gebruikt om relatief schaarse, hoogdimensionale gegevens te analyseren10.
Een alternatieve benadering van steeds grotere polytransfecties is het sequentieel optimaliseren van circuits met behulp van hiërarchieën van polytransfecties. In deze benadering wordt ten eerste polytransfectie gebruikt om een module te optimaliseren die bestaat uit een subset van genetische componenten binnen een groter circuit. Vervolgens worden deze geoptimaliseerde modules geleverd als afzonderlijke polytransfectiemengsels, waardoor men de optimale verhouding / dosering van elke circuitmodule kan vinden. Deze aanpak maakt gebruik van een aanzienlijk lager aantal cellen, DNA en transfectiereagentia. Groepen componenten zijn echter niet noodzakelijkerwijs modulair ten opzichte van andere componenten, en dus kan een optimale verhouding van componenten in een module die afzonderlijk wordt gemeten, suboptimaal zijn binnen de grotere circuitcontext8.
Polytransfectiemethoden worden ook beperkt door de laser/filterconfiguratie van de flowcytometer die wordt gebruikt om gegevens te verzamelen. Naast de gemeten fluorescerende uitgangen bevat elke transfectiemix een fluorescerende eiwitmarker. Het is dus van cruciaal belang om fluorescerende eiwitten te selecteren die goed kunnen worden gecompenseerd op de cytometer. We analyseerden eerder systematisch de doorbloeding van een panel van 22 fluorescerende eiwitten op een cytometer met vijf laserstromen (de BD LSRFortessa) en ontdekten dat de set Sirius, TagBFP, mNeonGreen, mKO2 en iRFP720 samen kon worden gebruikt en goed kon worden gecompenseerd zonder significante problemen10. De optimalisatie van grotere circuits kan echter geavanceerde cytometriemethoden vereisen, zoals spectrale cytometrie om fluorescerende eiwitten te scheiden met meer overlappende spectra, die ons laboratorium momenteel optimaliseert met maximaal acht fluorescerende eiwitten. Databases zoals de fluorescerende eiwitdatabase (https://www.fpbase.org) zijn nuttig voor het selecteren van fluorescerende eiwitten met een bepaalde spectrale overlap. Dit proces kan echter worden bemoeilijkt door verschillende factoren, waarvan sommige specifiek zijn voor bepaalde cytometers. Het gebruik van bepaalde rode eiwitten zoals tdTomato kan bijvoorbeeld alleen in bepaalde laser- / filterconfiguraties leiden tot ongewenste doorbloeding in blauwe kanalen10. Bovendien hebben verschillende verrode eiwitten niet-lineaire relaties aangetoond tussen DNA-dosering en fluorescentie-output10, waardoor hun gebruik als effectieve markers voor DNA-dosering wordt verminderd.
Voor consistentie tussen experimenten die worden uitgevoerd met verschillende aantallen complexen (één, twee, drie, enz.), Is het nuttig om dezelfde fractionele hoeveelheid plasmide per transfectiemix te gebruiken. Als men bijvoorbeeld een systeem met drie genen test met elk gen gecodeerd in een van de drie plasmiden (A, B en C), kan men de circuitplasmiden co-transfecteren in een verhouding van 1: 1: 1, samen met een gelijke verhouding van een plasmide dat codeert voor een transfectiemarker. Dit zou elk plasmide een kwart van de totale massa van het mengsel maken, en dus ongeveer een kwart van de massa van elk transfectiecomplex dat wordt gevormd. Bij poly-transfectie van A, B en C in afzonderlijke complexen met hun eigen verslaggevers, in plaats van de plasmiden 1:1 te mengen met reporters of hun totale DNA-massa te behouden, is het consistenter om elk plasmide op een kwart van de massa van elk complex te houden, waarbij filler-DNA de resterende massa inneemt (zie tabel 5 voor voorbeelden). Dit komt omdat de verdeling van genexpressie tussen getransfecteerde cellen minder afhangt van de totale massa DNA die in de complexen wordt afgeleverd, en meer van de fractionele hoeveelheid DNA in elk complex10. Als andere verhoudingen dan 1:1:1 gewenst zijn, bereken dan de overeenkomstige fracties van de totale DNA-massa in de transfectiemix voor elk deel. Tabel 5 [onder] toont bijvoorbeeld een verhouding van 1:1:4.
| Methode | Complex | ng A (fractie) | ng B (fractie) | ng C (fractie) | ng Reporter (fractie) | ng Filler DNA (fractie) | Totaal (ng) |
| Co-transfectie | 1 | 150 (¼) | 150 (¼) | 150 (¼) | 150 (¼) | 0 (0) | 600 |
| Polytransfectie | 600 | ||||||
| → | 1 | 50 (¼) | 50 (¼) | 100 (½) | 200 | ||
| → | 2 | 50 (¼) | 50 (¼) | 100 (½) | 200 | ||
| → | 3 | 50 (¼) | 50 (¼) | 100 (½) | 200 | ||
| Co-transfectie | 1 | 75 (⅛) | 75 (⅛) | 300 (½) | 150 (¼) | 0 (0) | 600 |
| Polytransfectie | 600 | ||||||
| → | 1 | 25 (⅛) | 50 (¼) | 125 (⅝) | 200 | ||
| → | 2 | 25 (⅛) | 50 (¼) | 125 (⅝) | 200 | ||
| → | 3 | 100 (½) | 50 (¼) | 50 (¼) | 200 |
Tabel 5: Voorbeelden van het gebruik van filler-DNA voor consistentie tussen co- en polytransfectie-experimenten. Hier worden twee generieke voorbeelden getoond van het co-transfecteren van drie plasmiden met dezelfde hoeveelheid filler-DNA. In het bovenste voorbeeld hebben de plasmiden allemaal gelijke massa's. In het onderste voorbeeld wordt één plasmide met een hogere massa afgeleverd in vergelijking met de andere. De fractie van het totale DNA dat in een co-transfectiecomplex zou worden gebruikt, wordt getransmuteerd naar polytransfectiecomplexen, waarbij de resterende hoeveelheid DNA (tot de totale hoeveelheid voor elk complex, die vast en gelijk is aan complexen) wordt gevormd met vul-DNA.
Het algemene doel van filler-DNA is om vergelijkbare doseringen plasmiden per cel te behouden, ongeacht het aantal unieke transfectiemengsels. Als een ruwe benadering van dit principe, vermindert het scheiden van drie plasmiden in drie mengsels met behoud van dezelfde DNA-massa van elk (en de juiste verhouding van transfectiereagens) het percentage cellen dat een bepaald complex ontvangt met een derde in vergelijking met een enkele mix die alle drie plasmiden bevat. Elke getransfecteerde cel krijgt vervolgens echter een ~ 3x hogere gendosering. Het verminderen van de relatieve hoeveelheid van de plasmiden alleen zonder vul-DNA is dus onvoldoende om consistente plasmidedoseringen te behouden, omdat dit eenvoudigweg de transfectie-efficiëntie vermindert zonder de onderliggende expressieverdeling tussen de getransfecteerde cellente veranderen 10. Aan de andere kant maakt filler-DNA het mogelijk om de DNA-dosering aan te passen zonder de algehele transfectie-efficiëntie te beïnvloeden (hoewel detecteerbare getransfecteerde cellen kunnen afnemen als gevolg van een lager signaal)10. Volgens de ruwe benadering hierboven, het verminderen van de fractie van DNA in de poly-transfectiemengsels tot een derde en het toevoegen van vul-DNA handhaaft de relatieve gendoseringen in vergelijking met de oorspronkelijke co-transfectie. Filler DNA zorgt daarom voor een efficiënte en nauwkeurige vorming van transfectiecomplexen.
Om het expressiebereik van een interessant gen dat door de reporter wordt behandeld, te wijzigen, kan de fractie van elk testplasmide en / of promotors die worden gebruikt om het gen daar aan te drijven, worden afgestemd ten opzichte van de reporter. Als een deel sterk / zeer actief is bij lage DNA-doseringen, kan het gebruik van een lagere DNA-fractie helpen het dynamische bereik van het deel in het midden van de fluorescentieverdeling van de reporter in getransfecteerde cellen te centreren. Evenzo kan het gebruik van een hogere fractie nuttig zijn voor delen die zwak / alleen actief zijn bij hoge DNA-doseringen. Er moet echter voorzichtig worden omgegaan met een dergelijke afstemming, omdat het te veel verminderen van DNA-fracties de stochasticiteit van toediening aan de cellen verhoogt in vergelijking met de reporter10, en hoge genexpressieniveaus kunnen cellulaire genexpressiemachines overbelasten12,14. Om stochasticiteit te voorkomen, en in gevallen waarin elk gen in een vaste verhouding aan cellen wordt afgeleverd (bijvoorbeeld als het circuit moet worden gegenereerd als een enkele lenti-, PiggyBac- of Landing Pad-vector), kan de relatieve expressie van elk gen worden afgestemd met behulp van sterkere / zwakkere promotors, kleine uORFs18 en / of miSFITs19.
Hoewel het protocol een omgekeerde transfectietechniek beschrijft, is polytransfectie ook mogelijk met voorwaartse transfectie. Bij omgekeerde transfectie worden de cellen tegelijkertijd gezaaid en getransfecteerd; Bij voorwaartse transfectie worden de cellen ~ 24 uur na de eerste plating getransfecteerd met ongeveer de helft van de dichtheid die zou worden gebruikt bij omgekeerde transfectie (om celdeling mogelijk te maken tegen de tijd van transfectie). Over het algemeen is omgekeerde transfectie efficiënter, maar ook giftiger, en we hebben enkele verschillen opgemerkt in de vorm van transfectieverdelingen op basis van het reagens, de transfectietijd en de cellijn. De transfectiemethode van keuze moet dus voor elke cellijn worden geoptimaliseerd om het aantal getransfecteerde cellen en de dekking van de multidimensionale concentratieruimte van plasmidedoseringen per cel te maximaliseren.
Over het algemeen maakt polytransfectie de snelle optimalisatie van genetische circuits van zoogdieren mogelijk. Veel mogelijke ratiometrische combinaties van circuitcomponenten kunnen eenvoudig in één put worden getest. Bovendien, aangezien polytransfectie meer informatie bevat over de niveaus van elk deel in een systeem dan een conventionele transfectie, is gebleken dat het zeer waardevol is voor het karakteriseren van het gedrag van verschillende genetische delen10,11,12,13. De toepassing van polytransfectie zal naar verwachting het tempo van de ontwikkeling van nieuwe en verbeterde gencircuits voor gebruik in zoogdiercellen versnellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
R.W. is mede-oprichter van Strand Therapeutics en Replay Bio; R.W. en R.J. dienden een voorlopig patent in met betrekking tot een celtypeclassificatie.
Acknowledgments
We willen graag voormalige Weiss Lab-leden bedanken die hebben geleid of bijgedragen aan de ontwikkeling van de polytransfectiemethode en de toepassing ervan op celclassificaties: Jeremy Gam, Bre DiAndreth en Jin Huh; andere Weiss-lableden die hebben bijgedragen aan verdere ontwikkeling / optimalisatie van methoden: Wenlong Xu, Lei Wang en Christian Cuba-Samaniego; Prof. Josh Leonard en groepsleden, waaronder Patrick Donahue en Hailey Edelstein, voor het testen van polytransfectie en het geven van feedback; en Prof. Nika Shakiba voor het uitnodigen van dit manuscript en het geven van feedback. We willen ook de National Institutes of Health [R01CA173712, R01CA207029, P50GM098792] bedanken; Nationale Wetenschapsstichting [1745645]; Cancer Center Support (core) Grant [P30CCA14051, gedeeltelijk] van de NCI en National Institutes of Health [P50GM098792] voor de financiering van dit werk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15mL Corning Falcon conical tubes | ThermoFisher Scientific | 14-959-53A | |
| 24-well petri dish | Any company of choice | (Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free) | |
| Bovine serum albumin | NEB | B9000S | |
| Centrifuge | Any company of choice | Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX2000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | |
| Cytoflow | Non-commercial software package | https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/# | |
| DMEM | VWR | 10-013-CV | Use the correct media for your cell type |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 03690-100ML | |
| Fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F4135 | |
| HEK cells | ATCC | CRL-1573 | Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently. |
| HeLa cells | ATCC | CRL-12401 | Use the relevant cell type for your experiments. |
| Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer | ThermoFisher Scientific | L3000001 | Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent |
| LSRFortessa flow cytometer | BD Biosciences | N/A | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
| Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | Any company of choice | ||
| Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985070 | reduced serum medium |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Rainbow calibration beads | Spherotech | URCP-100-2H | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Trypsin | VWR | 25-053-CI |
References
- Prochazka, L., Benenson, Y., Zandstra, P. W. Synthetic gene circuits and cellular decision-making in human pluripotent stem cells. Current Opinion in Systems Biology. 5, 93-103 (2017).
- Sayeg, M. K., et al. Rationally designed microRNA-based genetic classifiers target specific neurons in the brain. ACS Synthetic Biology. 4 (7), 788-795 (2015).
- Zhen, X., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. Multi-Input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells. Science. 333 (6047), 1307-1311 (2011).
- Nissim, L., et al. Synthetic RNA-based immunomodulatory gene circuits for cancer immunotherapy. Cell. 171 (5), 1138-1150 (2017).
- Nissim, L., Bar-Ziv, R. H. A tunable dual-promoter integrator for targeting of cancer cells. Molecular Systems Biology. 6, 444 (2010).
- Mohammadi, P., Castel, S. E., Brown, A. A., Lappalainen, T. Quantifying the regulatory effect size of cis-acting genetic variation using allelic fold change. Genome Research. 27 (11), 1872-1884 (2017).
- Prochazka, L., et al. Discrete-to-analog signal pluripotent stem cells conversion in human. BioRxiv. , (2021).
- Del Vecchio, D. Modularity, context-dependence, and insulation in engineered biological circuits. Trends in Biotechnology. 33 (2), 111-119 (2015).
- Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell. Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).
- Gam, J. J., DiAndreth, B., Jones, R. D., Huh, J., Weiss, R. A 'poly-transfection' method for rapid, one-pot characterization and optimization of genetic systems. Nucleic Acids Research. 47 (18), 106 (2019).
- Jones, R. D., et al. Robust and tunable signal processing in mammalian cells via engineered covalent modification cycles. Nature Communications. 13 (1), 1720 (2022).
- Jones, R. D., et al. An endoribonuclease-based feedforward controller for decoupling resource-limited genetic modules in mammalian cells. Nature Communications. 11 (1), 5690 (2020).
- DiAndreth, B., Wauford, N., Hu, E., Palacios, S., Weiss, R. PERSIST platform provides programmable RNA regulation using CRISPR endoRNases. Nature Communications. 13 (1), 2582 (2022).
- Frei, T., et al. Characterization and mitigation of gene expression burden in mammalian cells. Nature Communications. 11 (1), 4641 (2020).
- Beal, J., Weiss, R., Yaman, F., Adler, A., Davidsohn, N. A method for fast, high-precision characterization of synthetic biology devices. Computer Science and Artificial Intelligence Laboratory Technical Report. Massachusetts institute of technology. , Cambridge. MIT-CSAIL-TR-2012-008 (2012).
- Beal, J., et al. Meeting measurement precision requirements for effective engineering of genetic regulatory networks. ACS Synthetic Biology. 11 (3), 1196-1207 (2022).
- Teague, B. Cytoflow: A Python toolbox for flow cytometry. bioRxiv. , (2022).
- Ferreira, J. P., Overton, K. W., Wang, C. L. Tuning gene expression with synthetic upstream open reading frames). Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11284-11289 (2013).
- Michaels, Y. S., et al. Precise tuning of gene expression levels in mammalian cells. Nature Communications. 10 (1), 818 (2019).
- Saito, H., et al. Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch. Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).
- Wroblewska, L., et al. Mammalian synthetic circuits with RNA binding proteins for RNA-only delivery. Nature Biotechnology. 33 (8), 839-841 (2015).
- Wagner, T. E., et al. Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells. Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043-1050 (2018).
- Sekuklu, S. D., Donoghue, M. T. A., Spillane, C. miR-21 as a key regulator of oncogenic processes. Biochemical Society Transactions. 37, 918-925 (2009).
- Stanton, B. C., et al. Genomic mining of prokaryotic repressors for orthogonal logic gates. Nature Chemical Biology. 10 (2), 99-105 (2014).
- Stanton, B. C., et al. Systematic transfer of prokaryotic sensors and circuits to mammalian cells. ACS Synthetic Biology. 3 (12), 880-891 (2014).
