Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

نموذج غشاء المشيمية المشيمية (CAM) كأداة لدراسة زراعة أنسجة المبيض

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/64867
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Gynecology Research Unit, Institut de Recherche Expérimentale et Clinique, Université Catholique de Louvain, 2Gynecology Department, Cliniques Universitaires Saint-Luc

Summary

هنا ، نصف بروتوكولا لتطوير نموذج تطعيم الأغشية المشيمية (CAM) لأنسجة المبيض البشرية ونوضح فعالية التقنية ، والإطار الزمني لإعادة التوعي بالكسب غير المشروع ، وصلاحية الأنسجة عبر فترة تطعيم مدتها 6 أيام.

Abstract

يعد حفظ أنسجة المبيض بالتبريد وزرعها استراتيجية فعالة للحفاظ على الخصوبة ولكن لها عيبا رئيسيا واحدا ، وهو فقدان البصيلات الهائل الذي يحدث بعد فترة وجيزة من إعادة الزرع بسبب تنشيط الجريب غير الطبيعي والموت. القوارض هي نماذج مرجعية للتحقيق في تنشيط الجريب ، لكن التكلفة والوقت والاعتبارات الأخلاقية أصبحت باهظة بشكل متزايد ، مما يدفع إلى تطوير البدائل. يعد نموذج الغشاء المشيمي المشيمي (CAM) جذابا بشكل خاص ، كونه غير مكلف ويحافظ على نقص المناعة الطبيعي حتى اليوم 17 بعد الإخصاب ، مما يجعله مثاليا لدراسة التطعيم الأجنبي قصير المدى لأنسجة المبيض البشري. كما أن الطب التكميلي والبديل شديد الأوعية الدموية وقد استخدم على نطاق واسع كنموذج لاستكشاف تكوين الأوعية. وهذا يمنحها ميزة ملحوظة على النماذج في المختبر ويسمح بالتحقيق في الآليات التي تؤثر على عملية فقدان الجريب المبكرة بعد التطعيم. يهدف البروتوكول الموضح هنا إلى وصف تطوير نموذج التطعيم بالأشعة السينية للطب التكميلي والبديل لأنسجة المبيض البشري ، مع رؤى محددة حول فعالية التقنية ، والإطار الزمني لإعادة توعية الكسب غير المشروع ، وصلاحية الأنسجة عبر فترة تطعيم مدتها 6 أيام.

Introduction

ازداد الطلب على الحفاظ على الخصوبة لمؤشرات الأورام والحميدة ، وكذلك الأسباب الاجتماعية ، بشكل كبير خلال العقود الأخيرة. ومع ذلك ، فإن العلاجات المختلفة المستخدمة لعلاج الأمراض الخبيثة وغير الخبيثة شديدة السمية للغدد التناسلية ويمكن أن تؤدي إلى قصور المبيض المبكر علاجي المنشأ ، مما يؤدي في النهاية إلى العقم1. تشمل التقنيات الراسخة للحفاظ على الخصوبة حفظ الأجنة بالتبريد ، وتزجيج البويضات غير الناضجة أو الناضجة ، والحفظ بالتبريد لأنسجة المبيض2،3،4. تجميد أنسجة المبيض هو الخيار الوحيد المتاح للحفاظ على الخصوبة لدى الفتيات قبل سن البلوغ أو النساء اللائي يحتجن إلى علاج فوري للسرطان. تحدث استعادة وظيفة الغدد الصماء بعد زرع أنسجة المبيض في أكثر من 95٪ من الأشخاص ، مع معدلات ولادة حية تتراوح من 18٪ إلى 42٪ 5،6،7،8،9.

على الرغم من أن زرع أنسجة المبيض المجمدة المذابة قد أثبت نجاحه ، لا يزال هناك مجال للتحسين. في الواقع ، عندما يتم زرع شظايا المبيض القشرية دون مفاغرة الأوعية الدموية ، فإنها تعاني من فترة نقص الأكسجة التي تحدث خلالها إعادة التوعيالكسب غير المشروع 10،11،12. استخدمت الغالبية العظمى من الدراسات التي تبحث في زراعة أنسجة المبيض البشري نموذج التطعيم بالخارج ، حيث يتم زرع أنسجة المبيض للفئران التي تعاني من نقص المناعة. تستغرق إعادة التوعي الكاملة للطعوم الخارجية حوالي 10 أيام ، حيث تساهم كل من الأوعية المضيفة وأوعية الكسب غير المشروع في تكوين الأوعية الوظيفية12،13،14. يتم فقدان حوالي 50٪ -90٪ من احتياطي الجريب خلال نافذة نقص الأكسجين هذه قبل الانتهاء من إعادة توعية الكسب غير المشروع10،15،16. وقد اقترح بقوة أن هذا الفقدان الهائل للجريب يحدث من خلال كل من موت الجريب المباشر ، كما يتضح من انخفاض أعداد البصيلات المطلقة المتبقية بعد التطعيم ، وتنشيط نمو الجريب البدائي ، كما يتضح من التغيرات في نسب الجريب نحو زيادة معدلات نمو البصيلات17,18.

ومن المثير للاهتمام ، أن الأعمال البحثية السابقة باستخدام أنسجة المبيض الحيوانية المختلفة المطعمة بغشاء المشيمية الذكورية (CAM) ، والتي لها دستور يحاكي موقع التطعيم النموذجي للبريتوني ، قد أبلغت عن تثبيط تنشيط الجريب التلقائي ، مع بقاء احتياطي الجريب البدائي سليما لمدة تصل إلى 10 أيام19،20،21،22. أثبت فريقنا سابقا أن تطعيم أنسجة المبيض البشري المذابة المجمدة بالطب التكميلي والبديل يشكل نهجا موثوقا به للتحقيق في زراعة أنسجة المبيض البشري في مراحلها الإقفاريةالأولى 23 وأظهر مؤخرا أن طريقة التطعيم هذه كانت قادرة على مواجهة تنشيط الجريب24.

نموذج الطب التكميلي والبديل جذاب بشكل خاص ليس فقط لأن البيض أرخص بكثير من الفئران ولكن أيضا بسبب الطبيعة الوعائية للغاية للطب التكميلي والبديل ، مما يسمح بالتدقيق في العلاقة بين تنشيط الجريب وإعادة توعية طعم المبيض. يعد نظام الطيور ، في الواقع ، أحد أكثر الطرق شيوعا وتنوعا لدراسة تكوين الأوعيةالدموية 25. يستغرق تطور جنين الفرخ (ED) 21 يوما حتى الفقس ، ويتم تشكيل الطب التكميلي والبديل خلال أول 4-5 أيام من خلال اندماج الألانتوا والمشيمية26. والجدير بالذكر أن جنين الفرخ هو مضيف يعاني من نقص المناعة بشكل طبيعي حتى اليوم 17 من الضعف الجنسي ، لذلك يمكن إجراء تجارب التطعيم بالأجانب دون أي خطر من رفض الكسب غير المشروع27,28. علاوة على ذلك ، لا يثير نهج نموذج الطب التكميلي والبديل أي مخاوف أخلاقية أو قانونية فيما يتعلق بالقانون الأوروبي29 ، مما يجعله بديلا جذابا للنماذج الحيوانية الأخرى. فيما يتعلق بظروف التكاثر ، تحتاج أجنة الكتاكيت فقط إلى حاضنة عند 37 درجة مئوية مع رطوبة هواء نسبية تتراوح بين 40٪ و 60٪. تقلل متطلبات التجارب المحدودة هذه بشكل كبير من تكاليف البحث مقارنة باستخدام الفئران التي تعاني من نقص المناعة.

يهدف البروتوكول المقدم هنا إلى وصف تطوير نموذج التطعيم الخارجي للطب التكميلي والبديل لأنسجة المبيض البشري وتقديم رؤى محددة حول فعالية التقنية ، والإطار الزمني لإعادة توعية الكسب غير المشروع ، وصلاحية الأنسجة على مدى فترة تطعيم مدتها 6 أيام. يمكن أن يكون هذا البروتوكول ذا أهمية كبيرة للتحقيق في الآليات الكامنة وراء فقدان الجريب المبكر بعد التطعيم ودراسة تأثير العديد من العوامل (عوامل النمو ، الهرمونات ، إلخ) على هذه الظاهرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على استخدام الأنسجة البشرية من قبل مجلس المراجعة المؤسسية للجامعة الكاثوليكية في لوفان. أعطى المرضى موافقتهم الخطية المستنيرة على استخدام أنسجة المبيض لأغراض البحث.

1. طلب يوم 0 بويضات من المحتمل جدا أن تكون جنينية

  1. ابحث عن مورد بيض Leghorn أبيض معتمد من Lohman تم اختياره في المختبر والذي يبلغ عن معدلات عالية من البيض الجنيني ، والذي يعتمد بشكل أساسي على عمر الكتاكيت.

2. تحضير البيض للحضانة

  1. قبل وصول البيض ، قم بتجميع وموازنة حاضنة البيض إلى 37 درجة مئوية في رطوبة هواء نسبية 40٪ -60٪. راقب درجة الحرارة ورطوبة الهواء عن طريق إدخال مقياس حرارة ومقياس رطوبة في الحاضنة. تأكد من أن غطاء الحاضنة مزود بنافذة زجاجية للسماح بفحص المعلمات الداخلية للحاضنة دون الحاجة إلى فتحها (الشكل 1).
  2. بعد استلام اليوم 0 بيضة من فراخ Leghorn البيضاء المختارة من Lohman من مورد بيض معتمد من الدرجة المختبرية ، قم بتنظيف سطح الأصداف بورق مرطب وتجفيفها على الفور.
    ملاحظة: نظرا لأن غشاء قشر البيض مسامي ، يمكن استخدام الماء المعقم لتنظيف أسطح البيض والتحكم في الرطوبة داخل الحاضنة لتقليل مخاطر التلوث.
  3. قم بتسمية البيض باستخدام علامة (على سبيل المثال ، التاريخ ورقم البيضة).
  4. احتضان البيض مع توجيه الطرف المدبب لأسفل ، وقم بتدويره للسماح ل CAM بالتطور. قم بتدوير البيض يدويا بمقدار 180 درجة مرتين إلى ثلاث مرات يوميا أو استخدم دوارا تلقائيا.
    ملاحظة: من أجل ضمان تدوير البيض بالفعل ، يمكن تمييز قشر البيض ب "X" و "O" على الجانبين الجانبيين المتعارضين باستخدام قلم رصاص أو علامة. تسمح النافذة الزجاجية الموجودة في غطاء الحاضنة بالتحقق من دوران البيض دون فتح الجهاز.

3. فتح قشر البيض في اليوم الثالث من الضعف الجنسي

ملاحظة: يتم عمل نافذة مستطيلة في قشر البيض في اليوم 3 من الضعف الجنسي.

  1. تحضير غطاء التدفق الصفحي من أجل العمل في ظروف معقمة. ضع الأدوات التالية تحت الغطاء ، وقم بتطهيرها بنسبة 70٪ من الإيثانول (إن لم تكن معقمة بالفعل):
    - رف البيض
    - شمعة البيض أو مصدر الضوء البارد البؤري
    -علامه
    - دبوس مستقيم معقم
    - إبرة معقمة 19 جرام
    -5 مل حقنة معقمة
    - شفرة منشار التمرير
    -ملقط معقم
    -شريط لاصق
  2. انقل بيضة واحدة من الحاضنة إلى رف البيض الموضوع تحت الغطاء ، وأوقف تشغيل دوار البيض.
  3. في الظلام ، حدد الجيب الهوائي للبيضة عن طريق وضع شمعة البيض (أو مصدر الضوء البارد البؤري) مقابل قشر البيض. الجيب الهوائي موضعي في النهاية الحادة للبيضة. استخدم علامة لتحديد مركز الجيب الهوائي على قشر البيض.
  4. أشعل الأضواء. اصنع ثقبا صغيرا في قشر البيض حيث يتم تمييزه بتدوير دبوس مستقيم معقم برفق. عادة ما تكون الفتحة الصغيرة التي يبلغ قطرها حوالي 1 مم كافية.
    ملاحظة: احرص على عدم دفع الدبوس بالكامل عبر البيضة. إذا حدث هذا ، تخلص من البيضة.
  5. قم بتوصيل إبرة معقمة 19 جم بحقنة معقمة سعة 5 مل.
  6. في الظلام ، حدد موقع كيس الصفار باستخدام شمعة البيض (أو مصدر الضوء البارد البؤري) ، وثقب البيضة من خلال الفتحة المصنوعة في الخطوة 3.4 بإبرة معقمة 19 جم بزاوية 45 درجة باتجاه قاع البيضة ؛ احرص بشدة على عدم تعطيل كيس الصفار. نضح ما بين 1.5-2 مل من الزلال لفصل CAM عن القشرة ، ثم أغلق الفتحة بقطعة من الشريط اللاصق.
    ملاحظة: إذا تعطل كيس الصفار أثناء الشفط ، فسيكون السائل المستنشق في المحقنة أصفر اللون وليس شفافا (زلالي). إذا حدث هذا ، استبدل الإبرة والمحقنة. إذا تم امتصاص كمية كبيرة نسبيا من صفار البيض ، فقد يعرض ذلك صلاحية الجنين للخطر.
  7. أشعل الأضواء. ضع البيضة أفقيا ، وارسم نافذة مستطيلة بقياس 1 سم × 1.5 سم بعلامة. لا تجعل النافذة أكبر من العرض المعتاد للشريط اللاصق القياسي.
  8. امسك البيضة بيد واحدة ، وشاهد برفق النافذة المرسومة مسبقا في قشر البيض باستخدام شفرة منشار التمرير. تأكد من أن القشرة لا تتشقق ولا تقطع وصولا إلى CAM المكتئب. انفخ بانتظام لإزالة غبار القشرة والحطام.
  9. حرك ملقط معقم تحت القطعة المستطيلة من القشرة المنشورة ، وأمسكها ببراعة لإزالتها بشكل نظيف دون إتلاف CAM. بالإضافة إلى ذلك ، تخلص من غشاء الغلاف الخارجي الأبيض لتتمكن من رؤية الجنين والطب التكميلي والبديل الخاص به.
    ملاحظة: إذا سقط بعض غبار قشر البيض أو الحطام على CAM ، فيمكن إزالته باستخدام ملقط معقم ، مع الحرص الشديد على عدم تمزيق CAM.
  10. تحديد البويضات الجنينية القابلة للحياة. يمكن تمييزها من خلال زلالها الواضح والحلقة الوعائية حول الجنين ، حيث قد يتم اكتشاف قلب ينبض في بعض الأحيان حتى في هذه المرحلة (اليوم 3 من الضعف الجنسي). تخلص من الأجنة غير المخصبة أو الميتة.
  11. ضع شريطا لاصقا فوق النافذة التي تم إنشاؤها حديثا لتجنب الجفاف. تأكد من طي أحد طرفيه على نفسه لسهولة الإزالة.
  12. ضع البيضة مرة أخرى في الحاضنة مع توجيه النافذة المفتوحة لأعلى وعدم لمس الشريط للكاميرا CAM. استخدم قطعة مطوية من الورق أو جزءا من رف البيض لمنع البيضة من التدحرج. تأكد من إيقاف تشغيل الدرج الدوار.
  13. كرر الخطوات 3.2-3.12 لفتح البيض المتبقي.

4. تطعيم أنسجة المبيض البشري المجمدة المذابة في الطب التكميلي والبديل

ملاحظة: يجب أن تبدأ عملية الزرع في الطب التكميلي والبديل بشكل مثالي بين الأيام 7-10 من الضعف الجنسي.

  1. قم بإذابة شرائط المبيض القشرية المحفوظة بالتبريد تحت غطاء التدفق الصفحي باتباع البروتوكول الموصوف في مكان آخر30.
  2. قطع الشرائط القشرية إلى ثلاث أجزاء من 4 مم × 2 مم × 1 مم. استخدم قطعة واحدة كعنصر تحكم غير مطعمة والقطعتان الأخريان لتطعيم الأجانب لمدة 1 يوم أو 6 أيام.
    ملاحظة: في حالة توفر أنسجة كافية ، اعمل في نسختين.
  3. انقل بيضة واحدة من الحاضنة إلى رف البيض الموجود أسفل الغطاء ، مع توجيه النافذة لأعلى.
  4. قشر الشريط من النافذة ، وتأكد من أن الجنين قابل للحياة. في هذه المرحلة ، تتميز الأجنة القابلة للحياة بأوعية وعائية واسعة النطاق ، وزلال واضح ، ونبضات قلب مرئية ، وبعض حركة الجنين.
  5. قم بإعداد موقع التطعيم عن طريق صدمة منطقة صغيرة من الطب التكميلي والبديل برفق عن طريق وضع شريط 1 سم2 من ورق العدسة المعقم المستخرج من الأثير على السطح الظهاري وإزالته على الفور.
    ملاحظة: التكميلي والبديل هو حاجز لا يمكن اختراقه ما لم يكن الغشاء قد تعرض لصدمة بسبب إزالة الجزء العلوي حول الجلد من الطبقة الظهارية المزدوجة ، تاركا الطبقة القاعدية سليمة. تعمل هذه التقنية أيضا على تعزيز عملية إعادة التوعي عن طريق تنشيط التئام الجروح. إذا بقي ورق العدسة المعقم المستخرج من الأثير على CAM لفترة طويلة جدا ، فقد يلتصق الغشاء بورق العدسة ويتمزق. إذا حدث هذا ، تخلص من البيضة.
  6. أمسك شريطا قشريا مبيض مجمدا مذاب (4 مم × 2 مم × 1 مم) باستخدام ملقط جراحي مجهري ، وضعه على الطب التكميلي والبديل المصاب بالصدمة مع الجانب النخاعي ضد CAM. تطعيم قطعة مناديل واحدة لكل بيضة.
  7. غطي النافذة بشريط لاصق ، وأعد البويضة بعناية إلى الحاضنة. تأكد من أن فتحة قشر البيض في وضع مستقيم وأن البيضة آمنة.
  8. كرر الخطوات 4.1-4.7 لتطعيم جميع الأنسجة المتبقية.
    ملاحظة: يجب فحص الغرسات في كل يوم تطعيم لتقييم صلاحية الجنين ومراقبة التغيرات في الأوعية الدموية.

5. حصاد الطعوم

ملاحظة: يجب حصاد الطعوم الخارجية على أبعد تقدير بحلول اليوم 17 من الضعف الجنسي ، حيث يصبح الجهاز المناعي للجنين ناضجا ومختصا من اليوم 18.

  1. ضع البيضة على رف ، وقم بتكبير النافذة في قشر البيض للسماح بتصور أفضل للكسب غير المشروع والتلاعب بسهولة.
  2. تقييم الكسب غير المشروع مجهريا ، وإيلاء اهتمام خاص لرد فعل الأوعية الدموية من CAM تجاه الكسب غير المشروع. التقط صورا رقمية أو مقاطع فيديو للتسجيل.
  3. أمسك الأنسجة أو الطب التكميلي والبديل المحيط بالملقط ، واستخدم مقصا أو مشرطا لاستئصال الكسب غير المشروع من الطب التكميلي والبديل بعناية.
    ملاحظة: تصبح الطعوم مغطاة بطبقة ثانية من الطب التكميلي والبديل في حوالي اليوم 3 من التطعيم وتصبح مغلفة في النهاية. ربما تكون قد انتقلت أيضا داخل البويضة بحلول اليوم 6 ، مما يجعل من الصعب استعادتها في بعض الحالات.
  4. تحليل الأنسجة المستأصلة بأي طريقة مناسبة للتجربة المحددة. في هذه الدراسة ، تم تثبيت قطع الأنسجة في بارافورمالدهيد ، مغروس بالبارافين وملطخة بالهيماتوكسيلين والإيوزين باتباع الخطوات الموضحة أدناه:
    1. ثبت الشظايا في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 24 ساعة ، وقم بتضمينها في البارافين باستخدام جهاز تضمين أوتوماتيكي بالخطوات المذكورة في الجدول 1.
    2. اترك الكتل المغروسة بالبارافين طوال الليل عند 4 درجات مئوية قبل تقطيعها إلى أقسام بسمك 5 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم.
    3. انشر أقسام المناديل على شريحة زجاجية موضوعة على طبق ساخن (30 درجة مئوية) ، واتركها لتجف لمدة 2 ساعة ، تليها 24 ساعة في فرن على حرارة 37 درجة مئوية.
    4. بعد ذلك ، قم بتلطيخ الشرائح بالهيماتوكسيلين ويوزين باتباع بروتوكول موصوف في مكان آخر31. بعد ذلك ، قم برقمنة العينات باستخدام ماسح ضوئي للشرائح ، وقم بتحليلها باستخدام برنامج تحليل الصور.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

معدلات بقاء جنين الفرخ
كان معدل بقاء الجنين من النوافذ (اليوم 3 من الضعف الجنسي) إلى تطعيم أنسجة المبيض (اليوم 7 من الضعف الجنسي) 79٪ (33/42). نظرا لأن النسبة المئوية للبيض الجنيني في اليوم 0 غير معروفة ، فقد تم طلب عدد زائد من البيض في اليوم 0 من دجاج ليغورن الأبيض المختار من قبل لومان لضمان توفر بيض جنيني كاف للتطعيم. تم استخدام ما مجموعه 23 بيضة قابلة للحياة في اليوم 7 للتطعيم ، ماتت إحداها خلال ال 24 ساعة الأولى ، مما أدى إلى معدل بقاء الجنين الإجمالي بنسبة 96٪ بعد الزرع (22/23).

الجانب العياني من الطعوم
بعد يوم واحد من التطعيم ، بدت الطعوم قابلة للحياة في 100٪ (10/10) من الحالات وكانت بالفعل ملتصقة جزئيا على الأقل ب CAM ، مما يدل على نمط من الأوعية الدموية اللازمة لأوعية الأوعية الدموية (الشكل 2 أ ، ب). بعد 6 أيام من التطعيم ، كانت جميع الغرسات لا تزال ملتصقة (الشكل 2C) ، باستثناء اثنتين لم تلتصق ب CAM. اتخذوا مظهرا نخريا وتم استبعادهم من مزيد من التحليل (الشكل 3) ، مما أدى إلى معدل بقاء الأنسجة المطعمة بنسبة 83٪ (10/12) بعد 6 أيام. بشكل عام ، كشف تقييم صلاحية ترقيع المبيض البشري عن معدل بقاء إجمالي للأنسجة بنسبة 91٪ (20/22) ، بغض النظر عن يوم التطعيم (الجدول 2).

في حوالي اليوم 3 بعد الزرع ، تم العثور على الطعوم مغطاة بطبقة ثانية من CAM ، وأصبحت مغلفة في النهاية ، مما أدى إلى تحسين الأوعية الدموية للكسب غير المشروع (الشكل 2C). بشكل عام ، اخترقت 80٪ من عمليات الزرع البويضة أيضا (الشكل 2 د) ، وفي بعض الحالات جعلت من الصعب استعادتها في اليوم 6.

التقييم المجهري للطعوم
تم تحليل ما مجموعه 30 شظية مبيض بشري مجمدة تم الحصول عليها من خمسة مرضى مختلفين وتثبيتها في 4٪ بارافورمالدهيد في يوم التطعيم 0 أو اليوم 1 أو اليوم 6 ، مدمجة في البارافين ، وتقطيعها بشكل متسلسل إلى أقسام 5 ميكرومتر للتقييم النسيجي (الشكل 4).

من أجل تقييم معدلات بقاء جريب المبيض ، تم حساب البصيلات في 12 قسما عشوائيا من الهيماتوكسيلين والإيوزين لكل نقطة زمنية ولكل مريض. تم أخذ البصيلات الطبيعية شكليا فقط مع بويضة مرئية في الاعتبار للتحليل32. لوحظت بصيلات صحية في جميع النقاط الزمنية (الشكل 4B-D). تم حساب معدلات بقاء الجريب من خلال تحديد كثافة الجريب المتبقية (عدد البصيلات / مم3) بعد تطعيمها وتطبيعها إلى كثافة الجريب في الضوابط غير المطعمة (تعتبر 100٪). تميل كثافة الجريب إلى الانخفاض بعد الزرع ، ولكن ليس بما يكفي للوصول إلى دلالة إحصائية (ص > 0.8) (الجدول 2). وبالمثل ، تم الحفاظ على معدلات بقاء الجريب خلال فترة التطعيم ، حيث بلغت 95٪ ± 19٪ في اليوم الأول و 83٪ ± 27٪ في اليوم 6 (ص > 0.5).

تم إجراء مزيد من التحقيق في عملية إعادة التوعي من خلال الكشف عن خلايا الدم الحمراء للطيور في أوعية من أنسجة المبيض المطعمة بالخارج. يمكن تمييز كريات الدم الحمراء للطيور بسهولة لأنها نواة (الشكل 4A ، C ، D). والمثير للدهشة أننا تمكنا من مراقبة كريات الدم الحمراء للطيور في أوعية المبيض في 30٪ من الغرسات بعد يوم واحد فقط من الزرع وفي جميع الغرسات بحلول اليوم 6 ، مما يدل على إعادة توعية سريعة جدا (الجدول 2).

Figure 1
الشكل 1: حاضنة البيض. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: الجانب العياني للغرسات القابلة للحياة. (أ) يوم التطعيم 0. (ب) الغرسات في اليوم 1، حيث يظهر الطب التكميلي والبديل نمطا من الأوعية الدموية ذات العجلة في اتجاه نسيج المبيض. (ج) الغرسات المغلفة بواسطة الطب التكميلي والبديل في اليوم 6 ، مما يؤدي إلى تحسين الأوعية الدموية للطعم غير المشروع. د: الكسب غير المشروع الذي يخترق البويضة. تشير الأسهم إلى أنسجة المبيض المطعمة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الجانب العياني للغرسات الميتة. (أ) أنسجة مبيض صحية المظهر في اليوم 0 من التطعيم. ب: الجانب الناخر للزرع بعد 6 أيام. تشير الأسهم إلى أنسجة المبيض. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: الجانب المجهري للزرع. تم تطعيم أقسام الهيماتوكسيلين والإيوزين الملطخة بالغرسات لمدة (أ ، ب) 1 يوم و (ج ، د) 6 أيام. تشير رؤوس الأسهم إلى خلايا الدم الحمراء للطيور التي تتسرب من أوعية المبيض بعد (A) 1 يوم و (C ، D) 6 أيام من التطعيم. تشير الأسهم إلى بصيلات بدائية ذات مظهر صحي في الغرسات المطعمة لمدة (B) 1 يوم و (C ، D) 6 أيام. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الخطوات الحمامات الوقت
التثبيت الثاني 1 حمام فورمالين 10٪ 2 ساعة
تجفاف 7 حمامات ميثانول 7x 1 ساعة
توضيح 3 حمامات التولوين 3x 1 ساعة
الحمل 3 حمامات بارافين سائلة (60 درجة مئوية) 15 دقيقة – 30 دقيقة – 30 دقيقة

الجدول 1: خطوات تضمين البارافين.

غير مطعمة تطعيم اليوم 1 تطعيم اليوم 6 القيمة الاحتمالية
الجانب العياني من الطعوم
معدل بقاء الأنسجة - 100% (10/10) 83% (10/12) /
الجانب المجهري للطعوم
كثافة الجريب (ن / مم3) 848 ± 272 817 ± 370 684 ± 236 ص > 0.8
معدل بقاء الجريب 100% 95٪ ± 19٪ 83٪ ± 27٪ ص > 0.5
خلايا الدم الحمراء للطيور الموجودة في الغرسات 0% (0/10) 30% (3/10) 100% (10/10) /

الجدول 2: النتائج. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه ، يليه تصحيح Sidak. يتم التعبير عن النتائج كمتوسط ± الانحراف المعياري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الجزء الأكثر تحديا في البروتوكول الموصوف هنا هو عمل الثقب الصغير المطلوب لاستنشاق الزلال من أجل فصل CAM عن قشر البيض قبل إنشاء نافذة. يمكن أن يؤدي الضغط المفرط إلى الإفراط في الاختراق أو قد يؤدي إلى تكسير البويضة وتدميرها ، مما يتسبب في تلف لا رجعة فيه للطب التكميلي والبديل والأوعية الدموية. لتقليل الأخطاء إلى الحد الأدنى أثناء المحاولات الأولية لفصل CAM ، ينصح بشدة بالتدرب على عمل ثقوب صغيرة في قشر البيض غير المخصب الذي يتم شراؤه من البقالة باستخدام دبوس مستقيم. علاوة على ذلك ، نظرا للتباين الطبيعي للخصوبة عبر الدفعات ، إلى جانب حقيقة أن جميع الأجنة لا تنجو من الإجراء ، يوصى بالحصول على بويضات زائدة من مورد البيض. من أجل تحقيق معدلات بقاء الجنين المثلى والطب التكميلي والبديل المتطور ، يجب تحضين البيض في ظروف مثالية. في حالة انخفاض الجدوى ، قد تكون الجوانب المختلفة هي المسؤولة وتحتاج إلى التحقيق. يجب الاتصال بمورد البيض ، لأن صلاحية الأجنة من المورد قد تكون ببساطة أقل في هذه المرحلة الزمنية. قد يكون انخفاض صلاحية البيض أيضا بسبب إعدادات الحاضنة غير الدقيقة أو غير المناسبة ، مما قد يضر بتطوير الطب التكميلي والبديل. يمكن أن يضمن استخدام مقياس الرطوبة ومقياس الحرارة المستقل أن الإعدادات دقيقة ومستقرة ، ولكن يجب توفير تعليمات مفصلة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها من قبل الشركة المصنعة. أخيرا ، تم اقتراح أيضا أن فحص البويضات المزروعة في كثير من الأحيان قد يؤدي إلى تقلبات في درجة الحرارة والرطوبة ، مما قد يكون له آثار ضارة على الأجنة المطعمة33.

في البروتوكول الحالي ، تم إجراء نافذة قشر البيض في اليوم 3 من الضعف الجنسي عن طريق استنشاق حوالي 2 مل من الزلال من الجنين لفصل CAM عن القشرة ، والتي بدورها سمحت بإنشاء نافذة دون إتلاف CAM. كان معدل بقاء الجنين بعد 4 أيام 79٪ ، بما يتفق مع الدراسات السابقة 34,35. تم الإبلاغ عن طرق أخرى ، بدرجات متفاوتة من النجاح. أحد البدائل هو إبعاد الطب التكميلي والبديل عن القشرة عن طريق تطبيق الشفط على كيس الهواء ، عادة في حوالي اليوم 7-10 من الضعف الجنسي. لا تتطلب هذه الطريقة ثقب البويضة33,36. الدراسات التي تشير إلى معدلات بقاء الجنين باستخدام التقنية الأخيرة قليلة ومتباعدة في الأدبيات ، حيث أبلغ فريق واحد عن ما يصل إلى 90٪ من بقاء الجنين36. خيار آخر يجب مراعاته هو زراعة أجنة الفرخ الخالية من القشرة ، والمعروفة أيضا باسم ثقافة البويضات السابقة. توفر إزالة قشر البيض وصولا غير مقيد إلى الجنين ، مما يسهل معالجة الأجنة والجراحة ويسمح أيضا باستخدام تقنيات التصوير عالية الدقة للتجارب الحية ، مثل الفحص المجهري الفلوري والتضاريس الدقيقة37,38. من أجل إجراء زراعة خارج البويضات ، يتم نقل الجنين ، بما في ذلك أغشيته خارج الجنين ، إلى احتواء مزرعة محددة بين اليوم 2 واليوم 4 من الضعف الجنسي. ومع ذلك ، فإن هذه التقنية شديدة التوغل ، حيث تموت الأجنة عادة في اليوم 12 تقريبا وأقل من 18٪ منها على قيد الحياة حتى اليوم 1538,39.

خلال تجارب التطعيم بالأجانب المذكورة هنا ، تم تطعيم غرسات المبيض البشري ب CAMs التي تعرضت لصدمة بلطف عن طريق وضع شريط صغير من ورق العدسة المعقم المستخرج من الأثير على سطح الظهارة وإزالته على الفور. بشكل عام ، كانت معدلات بقاء الجنين ممتازة ووصلت إلى 96٪ خلال فترة التطعيم ، وهو ما يتوافق مع الدراسات السابقة التي تضمنت زرع شظايا أنسجة المبيض إلى23،40 الطب التكميلي والمثل. علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن هذا النهج يزيد من معدلات التصاق الكسب غير المشروع ويعزز الإنشاء اللاحق للأوعية الدموية الجديدة ، مع احتمال حدوث تولد الأوعية بسبب عملية التئام الجروح الأولية23. في الواقع ، تم العثور على أنسجة مبيض الفئران xenografting إلى أنسجة التئام الجروح الفئران لتحسين الأوعية الدموية الكسب غير المشروع41. وبالمثل ، في أول ولادة حية تم الإبلاغ عنها بعد زرع تقويم العظام لأنسجة المبيض البشري المحفوظة بالتبريد ، أنشأ Donnez et al. نافذة بريتونية وتخثر هوامشها قبل 7 أيام من الزرع لتحفيز تكوين الأوعية والأوعية الدموية الجديدة في موقع الزرع42.

فيما يتعلق بالتقييم النسيجي لأنسجة المبيض البشري المطعمة ، كانت معدلات بقاء الجريب مشجعة ، حيث بقيت أكثر من 80٪ من البصيلات سليمة بعد 6 أيام من التطعيم. ومن المثير للاهتمام ، أن معدلات بقاء الجريب المبلغ عنها في الأدبيات بعد زرع أنسجة المبيض البشرية المجمدة المذابة إلى الصفاق للفئران التي تعاني من نقص المناعة هي فقط حوالي 30٪ 10،14،18،43،44 ، وهو أقل بكثير مما كانت عليه في الدراسة الحالية. تؤكد النتائج التي توصلنا إليها حول تعزيز بقاء الجريب بعد تطعيم أنسجة المبيض البشري في الطب التكميلي والبديل بياناتنا المنشورة مؤخرا ، والتي نوضح فيها أن الطب التكميلي والبديل يمنع تنشيط الجريب وموت الخلايا المبرمج24. علاوة على ذلك ، كانت الأوعية الدموية للطيور قادرة على اختراق الغرسات ، كما يتضح من وجود كريات الدم الحمراء للطيور بعد يوم 1 فقط من الزرع. بشكل عام ، توضح هذه النتائج أن نهج الطب التكميلي والبديل هو نموذج مناسب لمزيد من التدقيق في زرع أنسجة المبيض البشري ، لأنه يدعم بقاء الأنسجة.

العيب الرئيسي لنموذج CAM هو الفترة المحدودة التي يمكن خلالها التطعيم. في الواقع ، يمكن إجراء عملية الزرع في أقرب وقت ممكن في اليوم 7 من الضعف الجنسي ، بمجرد تطور الطب التكميلي والبديل بشكل كاف ، حتى اليوم 17 ، قبل أن تكتسب أجنة الفرخ الكفاءة المناعية وتفقس. على الرغم من قصر مدة التطعيم ، لا يزال نموذج الطب التكميلي والبديل أداة مفيدة لدراسة زراعة أنسجة المبيض البشري في مراحلها الإقفارية الأولى. يمكن للمرء أيضا استخدام هذا النموذج لاختبار تأثير العوامل الوعائية ، والعوامل المضادة للأكسدة الوقائية ، والسيتوكينات ، والهرمونات المرتبطة بالنمو والتكاثر ، والعوامل التي تتحكم في تنشيط الجريب في أنسجة المبيض البشري المطعمة ، كل ذلك في ظل ظروف تجريبية يمكن التحكم فيها بسهولة25,45.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون ميرا هرينيوك ، بكالوريوس ، لمراجعة اللغة الإنجليزية للمقال.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agani hypodermic needle, 19 G Terumo Europe AN*1950R1 19 G needle to aspirate albumen
Terumo syringe, 5 mL concentric Luer lock Terumo Europe SS*05LE1 5-mL sterile syringe
Caseviewer v2.2 3DHISTECH Image analysis software
Diethyl ether Merck Chemicals 603-022-00-4 Sterile ether to traumatize the CAM
Eosin Y aqueous solution 0.5% Merck 1098441000 Staining solution
Formaldehyde 4% aqueous solution buffered (Formalin 10%) VWR 97139010 Formaldehyde used for tissue fixation
Fridge Liebherr 7081260 Fridge at 4 °C used for paraffin-embedding
Heating plate Schott SLK2 Hot plate used to dry the slides
Incubator Thermo Forma Scientific 3111 10365156 Oven used for slide incubation
Leica CLS 150 XE microscope cold light source Leica CLS 150 XE Focal cold light source to candle the eggs
Lens cleaning tissue, grade 541 VWR 111-5003 Tissue to soak in sterile ether to traumatize the CAM
Mayer's hematoxylin MERCK 1092491000 Staining solution
Methanol VWR 20847307 Methanol
Microtome ThermoScientific-MICROM HM325-2 Microtome
Pannoramic P250 Flash III 3DHISTECH / Slide scanner at 20x magnification
Paraformaldehyde  Merck 1,04,00,51,000 Paraffin-embedding solution
Paraplast Plus R Sigma P3683-1KG Paraffin
Petri dish, 60x15 mm, sterile Greiner 628161 Sterile petri dish
Pin holder Fine Science Tools 26016-12 Pin holder
Polyhatch Brinsea CP01F Egg incubator with automatic rotator
Scroll saw blade, 132 mm Sencys / Saw blade to create a window in the eggshell
Stainless steel insert pins Fine Science Tools 26007-02 Straight pin to make a hole in the eggshell
Steril-Helios  Angelantoni Industrie ST-00275400000 Laminar flow hood
Superfrost Plus bords rodés 90° VWR 631-9483 Glass slides 
Tissue-Tek VIP 6Al Sakura 60320417-0711 VID6E3-1 Automatic embedding device
Titanium forceps Fine Science Tools 11602-16 Forceps for eggshell removal and ovarian tissue manipulation
Toluene, pa VWR 28701364 Paraffin-embedding solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue and oocyte cryopreservation prior to iatrogenic premature ovarian insufficiency. Best Practice & Research Clinical Obstetrics & Gynaecology. 81, 119-133 (2022).
  2. Dolmans, M. -M., Hossay, C., Nguyen, T. Y. T., Poirot, C. Fertility preservation: How to preserve ovarian function in children, adolescents and adults. Journal of Clinical Medicine. 10 (22), 5247 (2021).
  3. Donnez, J., Dolmans, M. -M. Fertility preservation in women. New England Journal of Medicine. 377 (17), 1657-1665 (2017).
  4. Donnez, J., Dolmans, M. -M. Fertility preservation in women. Nature Reviews Endocrinology. 9 (12), 735-749 (2013).
  5. Dolmans, M. -M., et al. Transplantation of cryopreserved ovarian tissue in a series of 285 women: a review of five leading European centers. Fertility and Sterility. 115 (5), 1102-1115 (2021).
  6. Shapira, M., Dolmans, M. -M., Silber, S., Meirow, D. Evaluation of ovarian tissue transplantation: results from three clinical centers. Fertility and Sterility. 114 (2), 388-397 (2020).
  7. Jensen, A. K., et al. Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark. Human Reproduction. 30 (12), 2838-2845 (2015).
  8. Vander Ven, H., et al. Ninety-five orthotopic transplantations in 74 women of ovarian tissue after cytotoxic treatment in a fertility preservation network: Tissue activity, pregnancy and delivery rates. Human Reproduction. 31 (9), 2031-2041 (2016).
  9. Diaz-Garcia, C., et al. Oocyte vitrification versus ovarian cortex transplantation in fertility preservation for adult women undergoing gonadotoxic treatments: A prospective cohort study. Fertility and Sterility. 109 (3), 478-485 (2018).
  10. Nisolle, M., Casanas-Roux, F., Qu, J., Motta, P., Donnez, J. Histologic and ultrastructural evaluation of fresh and frozen-thawed human ovarian xenografts in nude mice. Fertility and Sterility. 74 (1), 122-129 (2000).
  11. Van Eyck, A. -S., et al. Electron paramagnetic resonance as a tool to evaluate human ovarian tissue reoxygenation after xenografting. Fertility and Sterility. 92 (1), 374-381 (2009).
  12. Van Eyck, A. -S., et al. Both host and graft vessels contribute to revascularization of xenografted human ovarian tissue in a murine model. Fertility and Sterility. 93 (5), 1676-1685 (2010).
  13. Hossay, C., et al. Can frozen-thawed human ovary withstand refreezing-rethawing in the form of cortical strips. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (12), 3077-3087 (2020).
  14. Manavella, D. D., et al. Two-step transplantation with adipose tissue-derived stem cells increases follicle survival by enhancing vascularization in xenografted frozen-thawed human ovarian tissue. Human Reproduction. 33 (6), 1107-1116 (2018).
  15. Rahimi, G., et al. Re-vascularisation in human ovarian tissue after conventional freezing or vitrification and xenotransplantation. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 149 (1), 63-67 (2010).
  16. Cacciottola, L., Manavella, D. D., Amorim, C. A., Donnez, J., Dolmans, M. -M. In vivo characterization of metabolic activity and oxidative stress in grafted human ovarian tissue using microdialysis. Fertility and Sterility. 110 (3), 534-544 (2018).
  17. Gavish, Z., et al. Follicle activation is a significant and immediate cause of follicle loss after ovarian tissue transplantation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 35 (1), 61-69 (2018).
  18. Masciangelo, R., Hossay, C., Donnez, J., Dolmans, M. -M. Does the Akt pathway play a role in follicle activation after grafting of human ovarian tissue. Reproductive BioMedicine Online. 39 (2), 196-198 (2019).
  19. Fortune, J. E., Cushman, R. A., Wahl, C. M., Kito, S. The primordial to primary follicle transition. Molecular and Cellular Endocrinology. (1-2), 53-60 (2000).
  20. Cushman, R. A. Bovine ovarian cortical pieces grafted to chick embryonic membranes: A model for studies on the activation of primordial follicles. Human Reproduction. 17 (1), 48-54 (2002).
  21. Gigli, I., Cushman, R. A., Wahl, C. M., Fortune, J. E. Evidence for a role for anti-Müllerian hormone in the suppression of follicle activation in mouse ovaries and bovine ovarian cortex grafted beneath the chick chorioallantoic membrane. Molecular Reproduction and Development. 71 (4), 480-488 (2005).
  22. Qureshi, A. I., et al. Testosterone selectively increases primary follicles in ovarian cortex grafted onto embryonic chick membranes: relevance to polycystic ovaries. Reproduction. 136 (2), 187-194 (2008).
  23. Martinez-Madrid, B., et al. Chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) model: A useful tool to study short-term transplantation of cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 91 (1), 285-292 (2009).
  24. Hossay, C., et al. Follicle outcomes in human ovarian tissue: Effect of freezing, culture, and grafting. Fertility and Sterility. 119 (1), 135-145 (2023).
  25. Ribatti, D. The Chick Embryo Chorioallantoic Membrane in the Study of Angiogenesis and Metastasis. , Springer. Dordrecht, the Netherlands. (2010).
  26. Pawlikowska, P., et al. Exploitation of the chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) as a platform for anti-metastatic drug testing. Scientific Reports. 10 (1), 16876 (2020).
  27. Davison, T. F. The immunologists' debt to the chicken. British Poultry Science. 44 (1), 6-21 (2003).
  28. Schilling, M. A., et al. Transcriptional innate immune response of the developing chicken embryo to Newcastle disease virus infection. Frontiers in Genetics. 9, 61 (2018).
  29. Directives originating from the EU. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes (Text with EEA relevance). The National Archives. , Available from: https://www.legislation.gov.uk/eudr/2010/63/contents (2010).
  30. Dolmans, M. -M., et al. A review of 15 years of ovarian tissue bank activities. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (3), 305-314 (2013).
  31. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), 4986 (2008).
  32. Anderson, R. A., McLaughlin, M., Wallace, W. H. B., Albertini, D. F., Telfer, E. E. The immature human ovary shows loss of abnormal follicles and increasing follicle developmental competence through childhood and adolescence. Human Reproduction. 29 (1), 97-106 (2014).
  33. Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the chicken chorioallantoic membrane in vivo model to study gynecological and urological cancers. Journal of Visualized Experiments. (155), e60651 (2020).
  34. Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13 (8), 9959-9970 (2012).
  35. Sys, G. M. L., et al. The In ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. Journal of Visualized Experiments. (77), e50522 (2013).
  36. Li, M., et al. The in ovo chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an efficient xenograft model of hepatocellular carcinoma. Journal of Visualized Experiments. (104), e52411 (2015).
  37. Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
  38. Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications. Journal of Visualized Experiments. (44), e2154 (2010).
  39. Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts. Stem Cells International. 2013, 960958 (2013).
  40. Beck, K., Singh, J., Dar, M. A., Anzar, M. Short-term culture of adult bovine ovarian tissues: chorioallantoic membrane (CAM) vs. traditional in vitro culture systems. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 21 (2018).
  41. Israely, T., Nevo, N., Harmelin, A., Neeman, M., Tsafriri, A. Reducing ischaemic damage in rodent ovarian xenografts transplanted into granulation tissue. Human Reproduction. 21 (6), 1368-1379 (2006).
  42. Donnez, J., et al. Livebirth after orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue. The Lancet. 364 (9443), 1405-1410 (2004).
  43. Dolmans, M. -M., et al. Short-term transplantation of isolated human ovarian follicles and cortical tissue into nude mice. Reproduction. 134 (2), 253-262 (2007).
  44. Baird, D. T., Webb, R., Campbell, B. K., Harkness, L. M., Gosden, R. G. Long-term ovarian function in sheep after ovariectomy and transplantation of autografts stored at −196 C. Endocrinology. 140 (1), 462-471 (1999).
  45. Ribatti, D., Vacca, A., Roncali, L., Dammacco, F. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for in vivo research on anti-angiogenesis. Current Pharmaceutical Biotechnology. 1 (1), 73-82 (2000).

Tags

علم الأحياء ، العدد 196 ، تنشيط الجريب ، فقدان الجريب ، الحفظ بالتبريد ، الزرع ، نماذج القوارض ، البدائل ، فعالة من حيث التكلفة ، موفرة للوقت ، اعتبارات أخلاقية ، تطعيم الأجانب ، أنسجة المبيض البشري ، نقص المناعة ، تكوين الأوعية ، عملية فقدان الجريب بعد التطعيم ، نموذج التطعيم الخارجي للطب التكميلي والبديل ، الإطار الزمني لإعادة التوعي ، صلاحية الأنسجة
نموذج غشاء المشيمية المشيمية (CAM) كأداة لدراسة زراعة أنسجة المبيض
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hossay, C., Cacciottola, L.,… More

Hossay, C., Cacciottola, L., Storder, S., Van Kerk, O., Dolmans, M. M. The Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Model as a Tool to Study Ovarian Tissue Transplantation. J. Vis. Exp. (196), e64867, doi:10.3791/64867 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter