Summary
Hier beschrijven we een protocol voor het ontwikkelen van een xenotransplantatiemodel voor kuikenchorioallantoïsch membraan (CAM) voor menselijk eierstokweefsel en demonstreren we de effectiviteit van de techniek, het tijdsbestek voor revascularisatie van het transplantaat en de levensvatbaarheid van het weefsel gedurende een transplantatieperiode van 6 dagen.
Abstract
Cryopreservatie en transplantatie van eierstokweefsel is een effectieve strategie voor het behoud van de vruchtbaarheid, maar heeft één groot nadeel, namelijk massaal follikelverlies dat kort na herimplantatie optreedt als gevolg van abnormale follikelactivering en overlijden. Knaagdieren zijn benchmarkmodellen voor het onderzoeken van follikelactivering, maar de kosten, tijd en ethische overwegingen worden steeds onbetaalbaarder, waardoor de ontwikkeling van alternatieven wordt gestimuleerd. Het kuikenchorioallantoïsch membraan (CAM)-model is bijzonder aantrekkelijk, omdat het goedkoop is en natuurlijke immunodeficiëntie handhaaft tot dag 17 na de bevruchting, waardoor het ideaal is om xenotransplantatie op korte termijn van menselijk eierstokweefsel te bestuderen. De CAM is ook sterk gevasculariseerd en wordt veel gebruikt als model om angiogenese te onderzoeken. Dit geeft het een opmerkelijk voordeel ten opzichte van in-vitromodellen en maakt het mogelijk om mechanismen te onderzoeken die van invloed zijn op het vroege proces van follikelverlies na transplantatie. Het hierin beschreven protocol heeft tot doel de ontwikkeling te beschrijven van een CAM-xenotransplantatiemodel voor menselijk eierstokweefsel, met specifieke inzichten in de effectiviteit van de techniek, het tijdsbestek voor revascularisatie van het transplantaat en de levensvatbaarheid van het weefsel gedurende een transplantatieperiode van 6 dagen.
Introduction
De vraag naar vruchtbaarheidsbehoud voor oncologische en goedaardige indicaties, evenals om sociale redenen, is de afgelopen decennia dramatisch toegenomen. Verschillende behandelingen die worden gebruikt om kwaadaardige en niet-kwaadaardige ziekten te genezen, zijn echter zeer giftig voor de geslachtsklieren en kunnen leiden tot iatrogene voortijdige ovariële insufficiëntie, wat uiteindelijk leidt totonvruchtbaarheid. Gevestigde technieken voor het behoud van vruchtbaarheid zijn onder meer cryopreservatie van embryo's, vitrificatie van onrijpe of rijpe eicellen en cryopreservatie van eierstokweefsel 2,3,4. Het bevriezen van eierstokweefsel is de enige beschikbare optie voor het behoud van de vruchtbaarheid bij prepuberale meisjes of vrouwen die onmiddellijke kankertherapie nodig hebben. Het herstel van de endocriene functie na transplantatie van eierstokweefsel komt voor bij meer dan 95% van de proefpersonen, met levendgeborenen variërend van 18% tot 42%5,6,7,8,9.
Hoewel de transplantatie van ingevroren-ontdooid eierstokweefsel succesvol is gebleken, is er nog ruimte voor verbetering. Inderdaad, aangezien ovariële corticale fragmenten worden getransplanteerd zonder vasculaire anastomose, ervaren ze een periode van hypoxie waarin transplantaatrevascularisatie plaatsvindt 10,11,12. De overgrote meerderheid van de onderzoeken naar transplantatie van menselijk eierstokweefsel heeft gebruik gemaakt van een xenotransplantaatmodel, waarbij eierstokweefsel wordt getransplanteerd naar immunodeficiënte muizen. De volledige revascularisatie van de xenotransplantaten duurt ongeveer 10 dagen, waarbij zowel de gastheer- als de transplantaatvaten bijdragen aan de vorming van functionele vaten 12,13,14. Ongeveer 50%-90% van de follikelreserve gaat verloren tijdens dit hypoxische venster vóór de voltooiing van de transplantaatrevascularisatie 10,15,16. Er is sterk gesuggereerd dat dit massale follikelverlies optreedt door zowel directe follikelsterfte, zoals blijkt uit een afname van het absolute aantal follikels dat overblijft na transplantatie, als de activering van primordiale follikelgroei, zoals aangegeven door veranderingen in follikelverhoudingen in de richting van verhoogde groeisnelheden van follikels17,18.
Interessant is dat eerder onderzoek met behulp van verschillende dierlijke eierstokweefsels die zijn geënt op het chorioallantoïsche membraan (CAM) van kuikens, dat een constitutie heeft die de typische entplaats van het peritoneum nabootst, de remming van spontane follikelactivering heeft gemeld, waarbij de primordiale follikelreserve tot 10 dagen intact blijft 19,20,21,22. Ons team heeft eerder aangetoond dat het enten van ingevroren-ontdooid menselijk eierstokweefsel op CAM een betrouwbare benadering vormde voor het onderzoeken van transplantatie van menselijk eierstokweefsel in de eerste ischemische stadia23 en toonde onlangs aan dat deze transplantatiemethode in staat was om follikelactivering tegen te gaan24.
Het CAM-model is vooral aantrekkelijk, niet alleen omdat eieren veel goedkoper zijn dan muizen, maar ook vanwege de sterk gevasculariseerde aard van CAM, waardoor het verband tussen follikelactivering en revascularisatie van het ovariumtransplantaat kan worden onderzocht. Het vogelsysteem is inderdaad een van de meest voorkomende en veelzijdige manieren om angiogenese te bestuderen25. De ontwikkeling van kuikenembryo's (ED) duurt 21 dagen tot het uitkomen en de CAM wordt binnen de eerste 4-5 dagen gevormd door de fusie van allantois en chorion26. Met name het kuikenembryo is een van nature immunodeficiënte gastheer tot dag 17 van ED, dus xenotransplantatie-experimenten kunnen worden uitgevoerd zonder enig risico op afstoting van het transplantaat27,28. Bovendien levert de benadering van het CAM-model geen ethische of juridische bezwaren op in termen van Europees recht29, waardoor het een aantrekkelijk alternatief is voor andere diermodellen. Wat de kweekomstandigheden betreft, hebben kuikenembryo's alleen een broedmachine nodig die is ingesteld op 37 °C met een relatieve luchtvochtigheid van 40%-60%. Deze beperkte experimenteervereisten verlagen de onderzoekskosten aanzienlijk in vergelijking met het gebruik van immunodeficiënte muizen.
Het hierin gepresenteerde protocol heeft tot doel de ontwikkeling van een CAM-xenotransplantatiemodel voor menselijk eierstokweefsel te beschrijven en specifieke inzichten te verschaffen in de effectiviteit van de techniek, het tijdsbestek van transplantaatrevascularisatie en de levensvatbaarheid van het weefsel gedurende een transplantatieperiode van 6 dagen. Dit protocol zou van groot belang kunnen zijn voor het onderzoeken van de mechanismen achter het vroege follikelverlies na transplantatie en het bestuderen van de impact van verschillende middelen (groeifactoren, hormonen, enz.) op dit fenomeen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het gebruik van menselijk weefsel werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Université Catholique de Louvain. De patiënten gaven hun schriftelijke geïnformeerde toestemming voor het gebruik van hun eierstokweefsel voor onderzoeksdoeleinden.
1. Dag 0 eieren bestellen die zeer waarschijnlijk worden belichaamd
- Zoek een gecertificeerde, door Lohman geselecteerde leverancier van witte Leghorn-eieren van laboratoriumkwaliteit die een hoog percentage bevruchte eieren rapporteert, wat voornamelijk afhankelijk is van de leeftijd van de kuikens.
2. Voorbereiden van de eieren voor incubatie
- Vóór de aankomst van de eieren de broedmachine monteren en balanceren tot 37 °C bij een relatieve luchtvochtigheid van 40%-60%. Bewaak de temperatuur en luchtvochtigheid door een thermometer en hygrometer in de incubator te steken. Zorg ervoor dat het deksel van de broedstoof is uitgerust met een glazen venster om de interne parameters van de broedmachine te kunnen controleren zonder deze te hoeven openen (Figuur 1).
- Nadat u de eieren van dag 0 hebt ontvangen van door Lohman geselecteerde witte Leghorn-kuikens van een gecertificeerde eierleverancier van laboratoriumkwaliteit, reinigt u het oppervlak van de schalen met bevochtigd papier en droogt u ze onmiddellijk.
NOTITIE: Aangezien het eierschaalmembraan poreus is, kan geautoclaveerd water worden gebruikt om eioppervlakken schoon te maken en de vochtigheid in de broedmachine te regelen om het risico op besmetting te minimaliseren. - Label de eieren met een stift (bijv. datum en einummer).
- Broed de eieren uit met het puntige uiteinde naar beneden en draai ze om de CAM te laten ontwikkelen. Draai de eieren twee tot drie keer per dag handmatig 180° of gebruik een automatische rotator.
OPMERKING: Om er zeker van te zijn dat de eieren inderdaad worden gedraaid, kan de eierschaal met een potlood of stift worden gemarkeerd met een "X" en "O" op de twee tegenoverliggende zijzijden. Het glazen venster in het deksel van de broedmachine maakt het mogelijk om de rotatie van de eieren te controleren zonder het apparaat te openen.
3. Het openen van de eierschaal op dag 3 van ED
LET OP: Op dag 3 van de ED wordt een rechthoekig venster in de eierschaal gemaakt.
- Bereid de laminaire stromingskap voor om in steriele omstandigheden te werken. Plaats de volgende instrumenten onder de motorkap en desinfecteer ze in 70% ethanol (indien nog niet gesteriliseerd):
-Eierrek
-Eierkaars of focale koude lichtbron
-Marker
-Steriele rechte pin
-Steriele naald van 19 G
-5 ml steriele spuit
-Figuurzaagblad
-Steriele pincet
-Plakband - Breng een ei over van de broedmachine naar het eierrek dat onder de motorkap is geplaatst en schakel de eierrotator uit.
- Identificeer in het donker de luchtzak van het ei door de eierkaars (of focale koude lichtbron) tegen de eierschaal te plaatsen. De luchtzak bevindt zich aan het stompe uiteinde van het ei. Gebruik een stift om het midden van de luchtzak op de eierschaal te bepalen.
- Doe de lichten aan. Maak een klein gaatje in de eierschaal waar het wordt gemarkeerd door voorzichtig een steriele rechte pin te draaien. Een kleine opening met een diameter van ongeveer 1 mm is meestal voldoende.
LET OP: Pas op dat je de pin niet helemaal door het ei duwt. Als dit gebeurt, gooi dan het ei weg. - Sluit een steriele naald van 19 G aan op een steriele spuit van 5 ml.
- Zoek in het donker de dooierzak met behulp van de eierkaars (of focale koude lichtbron) en prik het ei door het gat dat in stap 3.4 is gemaakt met de steriele naald van 19 G onder een hoek van 45° naar de bodem van het ei; Zorg ervoor dat u de dooierzak niet verstoort. Zuig tussen 1,5-2 ml albumine op om de CAM los te maken van de schaal en sluit vervolgens het gat met een stuk plakband.
OPMERKING: Als de dooierzak tijdens het opzuigen wordt verstoord, zal de opgezogen vloeistof in de spuit geel gekleurd zijn in plaats van transparant (albumine). Als dit gebeurt, vervang dan de naald en spuit. Als er relatief veel eigeel wordt opgezogen, kan dit de levensvatbaarheid van het embryo in gevaar brengen. - Doe de lichten aan. Leg het ei horizontaal en teken met een stift een rechthoekig venster van 1 cm x 1,5 cm. Maak het raam niet groter dan de gebruikelijke breedte van standaard plakband.
- Houd het ei in één hand en zaag het eerder getekende venster voorzichtig in de eierschaal met een figuurzaagblad. Zorg ervoor dat de schaal niet barst en snijd niet helemaal tot aan de ingedrukte CAM. Blaas regelmatig om schelpstof en vuil te verwijderen.
- Schuif een steriele pincet onder het rechthoekige stuk gezaagde schaal en pak het behendig vast om het netjes te verwijderen zonder de CAM te beschadigen. Gooi bovendien het witte membraan van de buitenste schil weg om het embryo en zijn CAM te kunnen zien.
NOTITIE: Als er wat eierschaalstof of vuil op de CAM valt, kan dit worden verwijderd met een steriele pincet, waarbij u zeer voorzichtig moet zijn om de CAM niet te scheuren. - Identificeer levensvatbare bevruchte eieren. Ze zijn te herkennen aan hun heldere eiwit en de vasculaire ring rond het embryo, waar soms zelfs in dit stadium (dag 3 van ED) een kloppend hart kan worden gedetecteerd. Gooi niet-bevruchte of dode embryo's weg.
- Plak plakband over het nieuw gemaakte raam om uitdroging te voorkomen. Zorg ervoor dat u het ene uiteinde over zichzelf vouwt om het verwijderen te vergemakkelijken.
- Leg het ei terug in de broedmachine met het geopende raam naar boven gericht en de tape raakt de CAM niet. Gebruik een gevouwen stuk papier of een deel van het eierrek om te voorkomen dat het ei gaat rollen. Zorg ervoor dat de roterende lade is uitgeschakeld.
- Herhaal stap 3.2-3.12 om de resterende eieren te openen.
4. Enten van ingevroren-ontdooid menselijk eierstokweefsel op de CAM
OPMERKING: Transplantatie naar de CAM moet idealiter worden gestart tussen dag 7-10 van ED.
- Ontdooi ingevroren ovariële corticale strips onder de laminaire stroomkap volgens het elders beschreven protocol30.
- Snijd de corticale stroken in drie fragmenten van 4 mm x 2 mm x 1 mm. Gebruik één stuk als niet-geënte controle en de andere twee voor xenotransplantatie gedurende 1 dag of 6 dagen.
OPMERKING: Als er voldoende weefsel beschikbaar is, werk dan in tweevoud. - Breng een ei van de broedmachine over naar het eierrek onder de motorkap, met het raam naar boven gericht.
- Trek de tape van het raam en zorg ervoor dat het embryo levensvatbaar is. In dit stadium hebben levensvatbare embryo's een uitgebreid vaatstelsel, een helder eiwit, een zichtbare hartslag en enige beweging van het embryo.
- Bereid de entplaats voor door een klein deel van de CAM voorzichtig te traumatiseren door een strook van 1cm2 steriel ether-geëxtraheerd lenspapier op het epitheeloppervlak te leggen en dit onmiddellijk te verwijderen.
OPMERKING: De CAM is een ondoordringbare barrière, tenzij het membraan is getraumatiseerd door de verwijdering van het bovenste peridermale deel van de dubbele epitheellaag, waardoor de basale laag intact blijft. Deze techniek verbetert ook het revascularisatieproces door wondgenezing te activeren. Als het steriele, met ether geëxtraheerde lenspapier te lang op de CAM blijft zitten, kan het membraan aan het lenspapier blijven kleven en scheuren. Als dit gebeurt, gooi dan het ei weg. - Pak een bevroren-ontdooide ovariële corticale strip (4 mm x 2 mm x 1 mm) vast met een microchirurgische pincet en plaats deze op de getraumatiseerde CAM met de medullaire kant tegen de CAM. Transplanteer één stukje weefsel per ei.
- Bedek het raam met plakband en leg het ei voorzichtig terug in de broedmachine. Zorg ervoor dat de opening van de eierschaal rechtop staat en dat het ei goed vastzit.
- Herhaal stap 4.1-4.7 voor het transplanteren van alle resterende weefsels.
OPMERKING: De implantaten moeten op elke transplantatiedag worden gecontroleerd om de levensvatbaarheid van het embryo te beoordelen en veranderingen in het vaatstelsel te volgen.
5. Oogsten van de grafts
OPMERKING: Xenotransplantaten moeten uiterlijk op dag 17 van ED worden geoogst, aangezien het immuunsysteem van het embryo vanaf dag 18 volwassen en competent wordt.
- Plaats het ei op een rek en vergroot het venster in de eierschaal om een betere visualisatie van het transplantaat en eenvoudigere manipulatie mogelijk te maken.
- Evalueer het transplantaat macroscopisch en let vooral op de vasculaire reactie van de CAM op het transplantaat. Maak digitale foto's of video's voor de goede orde.
- Pak het weefsel of de omringende CAM vast met een pincet en gebruik een schaar of een scalpel om het transplantaat voorzichtig uit de CAM te verwijderen.
OPMERKING: De grafts worden rond dag 3 van het enten bedekt met een tweede laag CAM en worden uiteindelijk ingekapseld. Ze kunnen op dag 6 ook in het ei zijn verplaatst, waardoor het in sommige gevallen moeilijk is om ze terug te halen. - Analyseer de uitgesneden weefsels met behulp van een methode die geschikt is voor het gegeven experiment. In de huidige studie werden weefselstukjes gefixeerd in paraformaldehyde, ingebed in paraffine en gekleurd met hematoxyline en eosine volgens de onderstaande stappen:
- Fixeer de fragmenten gedurende 24 uur in 4 % paraformaldehyde en veranker ze in paraffine met behulp van een automatische inbedding volgens de in tabel 1 vermelde stappen.
- Laat de in paraffine ingebedde blokken een nacht bij 4°C staan voordat u ze met een microtoom in secties van 5 μm dik snijdt.
- Verdeel de weefseldelen over een glasplaatje op een hete plaat (30 °C) en laat ze 2 uur drogen, gevolgd door 24 uur in een oven op 37 °C.
- Kleurs daarna de objectglaasjes met hematoxyline en eosine volgens een elders beschreven protocol31. Digitaliseer vervolgens de monsters met behulp van een diascanner en analyseer ze met behulp van beeldanalysesoftware.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Overlevingspercentages van kuikenembryo's
Het overlevingspercentage van het embryo vanaf venstervorming (dag 3 van ED) tot transplantatie van eierstokweefsel (dag 7 van ED) was 79% (33/42). Aangezien het percentage bevruchte eieren op dag 0 onbekend is, werden overtollige eieren op dag 0 van door Lohman geselecteerde witte Leghorn-kippen besteld om ervoor te zorgen dat er voldoende bevruchte eieren beschikbaar zouden zijn om te enten. In totaal werden 23 levensvatbare eieren van dag 7 gebruikt voor enten, waarvan er één tijdens de eerste 24 uur omkwam, wat resulteerde in een totale overlevingskans van het embryo van 96% na transplantatie (22/23).
Macroscopisch aspect van de grafts
Na 1 dag enten zagen de grafts er in 100% (10/10) van de gevallen levensvatbaar uit en waren ze al op zijn minst gedeeltelijk gehecht aan de CAM, met een wielspaakpatroon van bloedvaten die nodig zijn voor hun vascularisatie (Figuur 2A,B). Na 6 dagen enten waren alle implantaten nog steeds hechtend (Figuur 2C), behalve twee die niet aan de CAM hechtten. Ze kregen een necrotisch uiterlijk en werden uitgesloten van verdere analyse (Figuur 3), wat resulteerde in een overlevingspercentage van getransplanteerd weefsel van 83% (10/12) na 6 dagen. Al met al bleek uit de levensvatbaarheidsbeoordeling van de menselijke eierstoktransplantaten dat het totale overlevingspercentage van het weefsel 91% bedroeg (20/22), ongeacht de dag van transplantatie (tabel 2).
Rond dag 3 na de transplantatie bleken de grafts bedekt te zijn met een tweede laag CAM en werden ze uiteindelijk ingekapseld, wat leidde tot een nog betere vascularisatie van het transplantaat (Figuur 2C). In totaal was 80% van de transplantaties ook het ei binnengedrongen (Figuur 2D), waardoor het in sommige gevallen moeilijk was om ze op dag 6 terug te halen.
Microscopische beoordeling van de grafts
In totaal werden 30 ingevroren-ontdooide menselijke ovariumfragmenten, verkregen van vijf verschillende patiënten, geanalyseerd en gefixeerd in 4% paraformaldehyde op entdag 0, dag 1 of dag 6, ingebed in paraffine, en serieel gesneden in secties van 5 μm voor histologische evaluatie (Figuur 4).
Om de overlevingspercentages van de ovariële follikel te beoordelen, werden follikels geteld in 12 willekeurige hematoxyline- en eosine-gekleurde secties per tijdstip en per patiënt. Alleen morfologisch normale follikels met een zichtbare eicel werden in aanmerking genomen voor analyse32. Gezonde follikels werden op alle tijdstippen waargenomen (Figuur 4B-D). De overlevingspercentages van de follikels werden berekend door de resterende follikeldichtheid (aantal follikels/mm3) na transplantatie te bepalen en deze te normaliseren naar de follikeldichtheid in niet-getransplanteerde controles (beschouwd als 100%). De follikeldichtheden hadden de neiging af te nemen na transplantatie, maar niet genoeg om statistische significantie te bereiken (p > 0,8) (Tabel 2). Evenzo werden de overlevingspercentages van de follikels gehandhaafd tijdens de transplantatieperiode, met 95% ± 19% op dag 1 en 83% ± 27% op dag 6 (p > 0,5).
Het revascularisatieproces werd verder onderzocht door de detectie van rode bloedcellen van vogels in bloedvaten van het xenogetransplanteerde eierstokweefsel. Aviaire erytrocyten zijn gemakkelijk te onderscheiden omdat ze een kern hebben (Figuur 4A,C,D). Verrassend genoeg waren we in staat om aviaire erytrocyten in eierstokvaten te observeren in 30% van de implantaten na slechts 1 dag transplantatie en in alle implantaten op dag 6, met een zeer snelle revascularisatie (tabel 2).
Figuur 1: Broedmachine. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Macroscopisch aspect van levensvatbare implantaten. (A) Enten dag 0. (B) Implantaten op dag 1, waarbij de CAM een wielspaakpatroon van bloedvaten naar het eierstokweefsel vertoont. (C) Implantaten ingekapseld door CAM op dag 6, wat leidt tot een nog betere vascularisatie van het transplantaat. (D) Transplantaat dat de eicel binnendringt. De pijlen wijzen naar het getransplanteerde eierstokweefsel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Macroscopisch aspect van necrotische implantaten. (A) Gezond ogend eierstokweefsel op dag 0 van de transplantatie. (B) Necrotisch aspect van het implantaat 6 dagen later. De pijlen wijzen naar het eierstokweefsel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Microscopisch aspect van implantaten. Hematoxyline- en eosine-gekleurde secties van implantaten geënt gedurende (A,B) 1 dag en gedurende (C,D) 6 dagen. De pijlpunten wijzen op rode bloedcellen van vogels die de eierstokvaten doorbloeden na (A) 1 dag en (C,D) 6 dagen enten. De pijlen geven gezond ogende primordiale follikels aan in implantaten die gedurende (B) 1 dag en (C,D) 6 dagen zijn geënt. Schaalbalk: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Stappen | Baden | Tijd |
| Tweede fixatie | 1 Formaline 10% bad | 2 uur |
| Dehydratie | 7 methanol baden | 7x 1 uur |
| Verduidelijking | 3 tolueen baden | 3x 1 uur |
| Bevruchting | 3 vloeibare paraffinebaden (60°C) | 15 min – 30 min – 30 min |
Tabel 1: Stappen voor het inbedden van paraffine.
| Niet-geënt | Enten dag 1 | Enten dag 6 | P-waarde | |
| Macroscopisch aspect van grafts | ||||
| Overlevingspercentage van weefsel | - | 100% (10/10) | 83% (10/12) | / |
| Microscopisch aspect van grafts | ||||
| Dichtheid van de follikels (n/mm3) | 848 ± 272 | 817 ± 370 | 684 ± 236 | p > 0,8 |
| Overlevingspercentage follikel | 100% | 95% ± 19% | 83% ± 27% | p > 0,5 |
| Aviaire rode bloedcellen aanwezig in implantaten | 0% (0/10) | 30% (3/10) | 100% (10/10) | / |
Tabel 2: Resultaten. Statistische analyse uitgevoerd met behulp van eenrichtings-ANOVA, gevolgd door Sidak-correctie. De resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het meest uitdagende deel van het hier beschreven protocol is het maken van het kleine gaatje dat nodig is om het eiwit op te zuigen om de CAM los te maken van de eierschaal voordat een venster wordt gemaakt. Te veel druk uitoefenen kan leiden tot overpenetratie of kan zelfs het ei barsten en vernietigen, waardoor onherroepelijke schade aan de CAM en zijn vasculatuur ontstaat. Om fouten tot een minimum te beperken tijdens de eerste pogingen om de CAM te scheiden, wordt sterk aangeraden om te oefenen met het maken van kleine gaatjes in de eierschaal van niet-bevruchte, in de supermarkt gekochte eieren met behulp van een rechte pin. Bovendien, gezien de natuurlijke variabiliteit van vruchtbaarheid tussen batches, samen met het feit dat niet alle embryo's de procedure overleven, wordt aanbevolen om overtollige eieren van de eileverancier te verkrijgen. Om optimale overlevingskansen van het embryo en een goed ontwikkelde CAM te bereiken, moeten de eieren onder ideale omstandigheden worden uitgebroed. In het geval van een lage levensvatbaarheid kunnen verschillende aspecten de oorzaak zijn en moeten deze worden onderzocht. Er moet contact worden opgenomen met de eicelleverancier, omdat de levensvatbaarheid van embryo's van de leverancier op dit moment gewoon lager kan zijn. Een lage levensvatbaarheid van eieren kan ook te wijten zijn aan onnauwkeurige of ongeschikte couveuse-instellingen, die de CAM-ontwikkeling in gevaar kunnen brengen. Het gebruik van een onafhankelijke hygrometer en thermometer kan ervoor zorgen dat de instellingen nauwkeurig en stabiel zijn, maar gedetailleerde instructies voor het oplossen van problemen moeten door de fabrikant worden verstrekt. Ten slotte is ook gesuggereerd dat het te vaak controleren van getransplanteerde eieren kan leiden tot temperatuur- en vochtigheidsschommelingen, wat schadelijke gevolgen kan hebben voor de getransplanteerde embryo's33.
In het huidige protocol werd het vensteren van de eierschaal uitgevoerd op dag 3 van ED door ongeveer 2 ml eiwit uit het embryo op te zuigen om de CAM los te maken van de schaal, waardoor op zijn beurt een venster kon worden gecreëerd zonder de CAM te beschadigen. Het overlevingspercentage van het embryo 4 dagen later was 79%, in overeenstemming met eerdere studies34,35. Andere methoden zijn gerapporteerd, met wisselend succes. Een alternatief is om de CAM los te wrikken van de schaal door afzuiging uit te voeren op de luchtzak, meestal rond dag 7-10 van ED. Bij deze methode hoeft het ei niet te worden doorboord 33,36. Studies die de overlevingspercentages van embryo's met behulp van de laatste techniek rapporteren, zijn zeldzaam in de literatuur, waarbij één team tot 90% van de overleving van embryo's rapporteert36. Een andere optie om te overwegen is het kweken van kuikenembryo's zonder schaal, ook wel ex ovo-cultuur genoemd. Het verwijderen van de eierschaal biedt onbeperkte toegang tot het embryo, waardoor embryomanipulatie en -chirurgie worden vergemakkelijkt en ook het gebruik van beeldvormingstechnieken met hoge resolutie voor levende experimenten mogelijk wordt, zoals fluorescentiemicroscopie en microcomputertopografie37,38. Om een ex ovo-kweek uit te voeren, wordt het embryo, inclusief de extra-embryonale membranen, tussen dag 2 en dag 4 van de ED overgebracht naar een specifieke kweekinsluiting. Deze techniek is echter zeer invasief, waarbij embryo's meestal rond dag 12 sterven en minder dan 18% van hen overleeft tot dag 1538,39.
Tijdens de xenotransplantatie-experimenten die hierin worden gerapporteerd, werden menselijke eierstokimplantaten geënt op CAM's die voorzichtig waren getraumatiseerd door een kleine strook steriel ether-geëxtraheerd lenspapier op het oppervlak van het epitheel aan te brengen en het onmiddellijk te verwijderen. Over het algemeen waren de overlevingspercentages van het embryo uitstekend en bereikten ze 96% tijdens de transplantatieperiode, wat consistent is met eerdere onderzoeken waarbij eierstokweefselfragmenten werden getransplanteerd naar CAM's23,40. Bovendien is aangetoond dat deze aanpak de hechtingssnelheid van het transplantaat verhoogt en de daaropvolgende vestiging van neovascularisatie verbetert, waarbij angiogenese waarschijnlijk wordt geïnduceerd door het initiële wondgenezingsproces23. Xenotransplantatie van eierstokweefsel van ratten naar wondgenezend granulatieweefsel van muizen bleek inderdaad de vascularisatie van het transplantaat te verbeteren41. Evenzo, bij de eerste levendgeborene die werd gemeld na orthotope transplantatie van gecryopreserveerd menselijk eierstokweefsel, creëerden Donnez et al. een peritoneaal venster en coaguleerden de randen 7 dagen vóór implantatie om angiogenese en neovascularisatie op de transplantatieplaats te stimuleren42.
Met betrekking tot de histologische beoordeling van getransplanteerd menselijk eierstokweefsel waren de overlevingspercentages van de follikels bemoedigend, waarbij meer dan 80% van de follikels intact bleef na 6 dagen enten. Interessant is dat de follikeloverlevingspercentages die in de literatuur worden gerapporteerd na de transplantatie van menselijk ingevroren-ontdooid eierstokweefsel naar het peritoneum van immunodeficiënte muizen slechts ongeveer 30%10,14,18,43,44 zijn, wat veel lager is dan in de huidige studie. Onze bevindingen van verbeterde follikeloverleving na het enten van menselijk eierstokweefsel op de CAM bevestigen onze recent gepubliceerde gegevens, waarin we aantonen dat CAM follikelactivering en apoptose remt24. Bovendien konden de bloedvaten van vogels de implantaten binnendringen, zoals blijkt uit de aanwezigheid van erytrocyten van vogels na slechts 1 dag transplantatie. Al met al tonen deze resultaten aan dat de CAM-benadering een geschikt model is om de transplantatie van menselijk eierstokweefsel verder te onderzoeken, omdat het de overleving van het weefsel ondersteunt.
Het grote nadeel van het CAM-model is de beperkte periode waarin enten mogelijk is. Transplantatie kan inderdaad op zijn vroegst op dag 7 van ED worden uitgevoerd, zodra de CAM voldoende is ontwikkeld, tot dag 17, voordat de kuikenembryo's immunocompetentie verwerven en uitkomen. Ondanks de korte duur van het transplanteren is het CAM-model nog steeds een nuttig hulpmiddel voor het bestuderen van transplantatie van menselijk ovariumweefsel in de eerste ischemische stadia. Men kan dit model ook gebruiken om de impact te testen van proangiogene factoren, beschermende antioxidanten, cytokines, groei- en voortplantingsgerelateerde hormonen en factoren die de follikelactivering in getransplanteerd menselijk eierstokweefsel regelen, allemaal onder experimentele omstandigheden die gemakkelijk kunnen worden gecontroleerd25,45.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Mira Hryniuk, BA, voor het beoordelen van de Engelse taal van het artikel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agani hypodermic needle, 19 G | Terumo Europe | AN*1950R1 | 19 G needle to aspirate albumen |
| Terumo syringe, 5 mL concentric Luer lock | Terumo Europe | SS*05LE1 | 5-mL sterile syringe |
| Caseviewer v2.2 | 3DHISTECH | Image analysis software | |
| Diethyl ether | Merck Chemicals | 603-022-00-4 | Sterile ether to traumatize the CAM |
| Eosin Y aqueous solution 0.5% | Merck | 1098441000 | Staining solution |
| Formaldehyde 4% aqueous solution buffered (Formalin 10%) | VWR | 97139010 | Formaldehyde used for tissue fixation |
| Fridge | Liebherr | 7081260 | Fridge at 4 °C used for paraffin-embedding |
| Heating plate | Schott | SLK2 | Hot plate used to dry the slides |
| Incubator | Thermo Forma Scientific 3111 | 10365156 | Oven used for slide incubation |
| Leica CLS 150 XE microscope cold light source | Leica | CLS 150 XE | Focal cold light source to candle the eggs |
| Lens cleaning tissue, grade 541 | VWR | 111-5003 | Tissue to soak in sterile ether to traumatize the CAM |
| Mayer's hematoxylin | MERCK | 1092491000 | Staining solution |
| Methanol | VWR | 20847307 | Methanol |
| Microtome | ThermoScientific-MICROM | HM325-2 | Microtome |
| Pannoramic P250 Flash III | 3DHISTECH | / | Slide scanner at 20x magnification |
| Paraformaldehyde | Merck | 1,04,00,51,000 | Paraffin-embedding solution |
| Paraplast Plus R | Sigma | P3683-1KG | Paraffin |
| Petri dish, 60x15 mm, sterile | Greiner | 628161 | Sterile petri dish |
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Pin holder |
| Polyhatch | Brinsea | CP01F | Egg incubator with automatic rotator |
| Scroll saw blade, 132 mm | Sencys | / | Saw blade to create a window in the eggshell |
| Stainless steel insert pins | Fine Science Tools | 26007-02 | Straight pin to make a hole in the eggshell |
| Steril-Helios | Angelantoni Industrie | ST-00275400000 | Laminar flow hood |
| Superfrost Plus bords rodés 90° | VWR | 631-9483 | Glass slides |
| Tissue-Tek VIP 6Al | Sakura | 60320417-0711 VID6E3-1 | Automatic embedding device |
| Titanium forceps | Fine Science Tools | 11602-16 | Forceps for eggshell removal and ovarian tissue manipulation |
| Toluene, pa | VWR | 28701364 | Paraffin-embedding solution |
References
- Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue and oocyte cryopreservation prior to iatrogenic premature ovarian insufficiency. Best Practice & Research Clinical Obstetrics & Gynaecology. 81, 119-133 (2022).
- Dolmans, M. -M., Hossay, C., Nguyen, T. Y. T., Poirot, C. Fertility preservation: How to preserve ovarian function in children, adolescents and adults. Journal of Clinical Medicine. 10 (22), 5247 (2021).
- Donnez, J., Dolmans, M. -M.
- Donnez, J., Dolmans, M. -M.
- Dolmans, M. -M., et al. Transplantation of cryopreserved ovarian tissue in a series of 285 women: a review of five leading European centers. Fertility and Sterility. 115 (5), 1102-1115 (2021).
- Shapira, M., Dolmans, M. -M., Silber, S., Meirow, D. Evaluation of ovarian tissue transplantation: results from three clinical centers. Fertility and Sterility. 114 (2), 388-397 (2020).
- Jensen, A. K., et al. Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark. Human Reproduction. 30 (12), 2838-2845 (2015).
- Vander Ven, H., et al. Ninety-five orthotopic transplantations in 74 women of ovarian tissue after cytotoxic treatment in a fertility preservation network: Tissue activity, pregnancy and delivery rates. Human Reproduction. 31 (9), 2031-2041 (2016).
- Diaz-Garcia, C., et al. Oocyte vitrification versus ovarian cortex transplantation in fertility preservation for adult women undergoing gonadotoxic treatments: A prospective cohort study. Fertility and Sterility. 109 (3), 478-485 (2018).
- Nisolle, M., Casanas-Roux, F., Qu, J., Motta, P., Donnez, J. Histologic and ultrastructural evaluation of fresh and frozen-thawed human ovarian xenografts in nude mice. Fertility and Sterility. 74 (1), 122-129 (2000).
- Van Eyck, A. -S., et al. Electron paramagnetic resonance as a tool to evaluate human ovarian tissue reoxygenation after xenografting. Fertility and Sterility. 92 (1), 374-381 (2009).
- Van Eyck, A. -S., et al. Both host and graft vessels contribute to revascularization of xenografted human ovarian tissue in a murine model. Fertility and Sterility. 93 (5), 1676-1685 (2010).
- Hossay, C., et al. Can frozen-thawed human ovary withstand refreezing-rethawing in the form of cortical strips. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (12), 3077-3087 (2020).
- Manavella, D. D., et al. Two-step transplantation with adipose tissue-derived stem cells increases follicle survival by enhancing vascularization in xenografted frozen-thawed human ovarian tissue. Human Reproduction. 33 (6), 1107-1116 (2018).
- Rahimi, G., et al. Re-vascularisation in human ovarian tissue after conventional freezing or vitrification and xenotransplantation. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 149 (1), 63-67 (2010).
- Cacciottola, L., Manavella, D. D., Amorim, C. A., Donnez, J., Dolmans, M. -M. In vivo characterization of metabolic activity and oxidative stress in grafted human ovarian tissue using microdialysis. Fertility and Sterility. 110 (3), 534-544 (2018).
- Gavish, Z., et al. Follicle activation is a significant and immediate cause of follicle loss after ovarian tissue transplantation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 35 (1), 61-69 (2018).
- Masciangelo, R., Hossay, C., Donnez, J., Dolmans, M. -M. Does the Akt pathway play a role in follicle activation after grafting of human ovarian tissue. Reproductive BioMedicine Online. 39 (2), 196-198 (2019).
- Fortune, J. E., Cushman, R. A., Wahl, C. M., Kito, S. The primordial to primary follicle transition. Molecular and Cellular Endocrinology. (1-2), 53-60 (2000).
- Cushman, R. A. Bovine ovarian cortical pieces grafted to chick embryonic membranes: A model for studies on the activation of primordial follicles. Human Reproduction. 17 (1), 48-54 (2002).
- Gigli, I., Cushman, R. A., Wahl, C. M., Fortune, J. E. Evidence for a role for anti-Müllerian hormone in the suppression of follicle activation in mouse ovaries and bovine ovarian cortex grafted beneath the chick chorioallantoic membrane. Molecular Reproduction and Development. 71 (4), 480-488 (2005).
- Qureshi, A. I., et al. Testosterone selectively increases primary follicles in ovarian cortex grafted onto embryonic chick membranes: relevance to polycystic ovaries. Reproduction. 136 (2), 187-194 (2008).
- Martinez-Madrid, B., et al. Chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) model: A useful tool to study short-term transplantation of cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 91 (1), 285-292 (2009).
- Hossay, C., et al. Follicle outcomes in human ovarian tissue: Effect of freezing, culture, and grafting. Fertility and Sterility. 119 (1), 135-145 (2023).
- Ribatti, D. The Chick Embryo Chorioallantoic Membrane in the Study of Angiogenesis and Metastasis. , Springer. Dordrecht, the Netherlands. (2010).
- Pawlikowska, P., et al. Exploitation of the chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) as a platform for anti-metastatic drug testing. Scientific Reports. 10 (1), 16876 (2020).
- Davison, T. F. The immunologists' debt to the chicken. British Poultry Science. 44 (1), 6-21 (2003).
- Schilling, M. A., et al. Transcriptional innate immune response of the developing chicken embryo to Newcastle disease virus infection. Frontiers in Genetics. 9, 61 (2018).
- Directives originating from the EU. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes (Text with EEA relevance). The National Archives. , Available from: https://www.legislation.gov.uk/eudr/2010/63/contents (2010).
- Dolmans, M. -M., et al. A review of 15 years of ovarian tissue bank activities. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (3), 305-314 (2013).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), 4986 (2008).
- Anderson, R. A., McLaughlin, M., Wallace, W. H. B., Albertini, D. F., Telfer, E. E. The immature human ovary shows loss of abnormal follicles and increasing follicle developmental competence through childhood and adolescence. Human Reproduction. 29 (1), 97-106 (2014).
- Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the chicken chorioallantoic membrane in vivo model to study gynecological and urological cancers. Journal of Visualized Experiments. (155), e60651 (2020).
- Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13 (8), 9959-9970 (2012).
- Sys, G. M. L., et al. The In ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. Journal of Visualized Experiments. (77), e50522 (2013).
- Li, M., et al. The in ovo chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an efficient xenograft model of hepatocellular carcinoma. Journal of Visualized Experiments. (104), e52411 (2015).
- Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
- Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications. Journal of Visualized Experiments. (44), e2154 (2010).
- Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts. Stem Cells International. 2013, 960958 (2013).
- Beck, K., Singh, J., Dar, M. A., Anzar, M. Short-term culture of adult bovine ovarian tissues: chorioallantoic membrane (CAM) vs. traditional in vitro culture systems. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 21 (2018).
- Israely, T., Nevo, N., Harmelin, A., Neeman, M., Tsafriri, A. Reducing ischaemic damage in rodent ovarian xenografts transplanted into granulation tissue. Human Reproduction. 21 (6), 1368-1379 (2006).
- Donnez, J., et al. Livebirth after orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue. The Lancet. 364 (9443), 1405-1410 (2004).
- Dolmans, M. -M., et al. Short-term transplantation of isolated human ovarian follicles and cortical tissue into nude mice. Reproduction. 134 (2), 253-262 (2007).
- Baird, D. T., Webb, R., Campbell, B. K., Harkness, L. M., Gosden, R. G. Long-term ovarian function in sheep after ovariectomy and transplantation of autografts stored at −196 C. Endocrinology. 140 (1), 462-471 (1999).
- Ribatti, D., Vacca, A., Roncali, L., Dammacco, F. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for in vivo research on anti-angiogenesis. Current Pharmaceutical Biotechnology. 1 (1), 73-82 (2000).
