Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Yumurtalık Dokusu Transplantasyonunu İncelemek İçin Bir Araç Olarak Civciv Korioallantoik Membran (CAM) Modeli

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/64867
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Gynecology Research Unit, Institut de Recherche Expérimentale et Clinique, Université Catholique de Louvain, 2Gynecology Department, Cliniques Universitaires Saint-Luc

Summary

Burada, insan yumurtalık dokusu için bir civciv koryoallantoik membran (CAM) ksenogreftleme modeli geliştirmek için bir protokol açıklıyoruz ve tekniğin etkinliğini, greft revaskülarizasyon zaman çerçevesini ve 6 günlük bir greftleme süresi boyunca doku canlılığını gösteriyoruz.

Abstract

Yumurtalık dokusu kriyoprezervasyonu ve transplantasyonu, doğurganlığı korumak için etkili bir stratejidir, ancak önemli bir dezavantajı vardır, yani anormal folikül aktivasyonu ve ölüm nedeniyle reimplantasyondan kısa bir süre sonra meydana gelen büyük folikül kaybı. Kemirgenler, folikül aktivasyonunu araştırmak için kıyaslama modelleridir, ancak maliyet, zaman ve etik hususlar giderek daha engelleyici hale gelmekte ve böylece alternatiflerin geliştirilmesini sağlamaktadır. Civciv koryoallantoik membran (CAM) modeli özellikle çekicidir, ucuzdur ve döllenmeden sonraki 17. güne kadar doğal immün yetmezliği korur, bu da insan yumurtalık dokusunun kısa süreli ksenogreftlenmesini incelemek için idealdir. TAT ayrıca oldukça vaskülarizedir ve anjiyogenezi araştırmak için bir model olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu, in vitro modellere göre dikkate değer bir avantaj sağlar ve greftleme sonrası erken folikül kaybı sürecini etkileyen mekanizmaların araştırılmasına izin verir. Burada özetlenen protokol, tekniğin etkinliği, greft revaskülarizasyon zaman çerçevesi ve 6 günlük bir greftleme süresi boyunca doku canlılığı hakkında spesifik bilgiler ile insan yumurtalık dokusu için bir CAM ksenogreftleme modelinin geliştirilmesini tanımlamayı amaçlamaktadır.

Introduction

Onkolojik ve benign endikasyonların yanı sıra sosyal nedenlerle doğurganlığın korunmasına olan talep son yıllarda önemli ölçüde artmıştır. Bununla birlikte, kötü huylu ve kötü huylu olmayan hastalıkları tedavi etmek için kullanılan çeşitli tedaviler gonadlar için oldukça toksiktir ve iyatrojenik erken yumurtalık yetmezliğine neden olabilir ve sonuçta kısırlığa yol açabilir1. Doğurganlığın korunması için yerleşik teknikler arasında embriyo kriyoprezervasyonu, olgunlaşmamış veya olgun oosit vitrifikasyonu ve yumurtalık dokusu kriyoprezervasyonuyer alır 2,3,4. Yumurtalık dokusunun dondurulması, prepubertal kızlarda veya acil kanser tedavisine ihtiyaç duyan kadınlarda doğurganlığı korumak için mevcut tek seçenektir. Yumurtalık dokusu naklini takiben endokrin fonksiyonun restorasyonu, deneklerin %95'inden fazlasında görülür ve canlı doğum oranları %18 ile %42 arasında değişir5,6,7,8,9.

Dondurulmuş-çözülmüş yumurtalık dokusunun transplantasyonunun başarılı olduğu kanıtlanmış olsa da, iyileştirme için hala yer vardır. Gerçekten de, yumurtalık kortikal fragmanları vasküler anastomoz olmadan nakledildiğinden, greft revaskülarizasyonunun gerçekleştiği bir hipoksi dönemi yaşarlar 10,11,12. İnsan yumurtalık dokusu transplantasyonunu araştıran çalışmaların büyük çoğunluğu, yumurtalık dokusunun immün yetmezliği olan farelere nakledildiği bir ksenogreftleme modeli kullanmıştır. Ksenogreftlerin tam revaskülarizasyonu yaklaşık 10 gün sürer ve hem konakçı hem de greft damarları fonksiyonel damarların oluşumuna katkıda bulunur 12,13,14. Folikül rezervinin yaklaşık %50-90'ı, greft revaskülarizasyonunun tamamlanmasından önceki bu hipoksik pencerede kaybolur 10,15,16. Bu büyük folikül kaybının, greftlemeden sonra kalan mutlak folikül sayılarındaki bir azalma ile gösterildiği gibi, hem doğrudan folikül ölümü hem de folikül oranlarındaki artan büyüme oranlarına doğru değişikliklerle gösterildiği gibi ilkel folikül büyümesinin aktivasyonu yoluyla meydana geldiği kuvvetle öne sürülmüştür17,18.

İlginç bir şekilde, peritonun tipik aşılama bölgesini taklit eden bir yapıya sahip olan civciv koryoallantoik membranına (CAM) aşılanan çeşitli hayvan yumurtalık dokularını kullanan önceki araştırma çalışmaları, spontan folikül aktivasyonunun inhibisyonunu ve primordial folikül rezervinin 10 güne kadar bozulmadan kaldığını bildirmiştir 19,20,21,22. Ekibimiz daha önce, dondurulmuş-çözülmüş insan yumurtalık dokusunun TAT'a aşılanmasının, ilk iskemik evrelerinde insan yumurtalık dokusu transplantasyonunu araştırmak için güvenilir bir yaklaşım oluşturduğunugöstermiştir 23 ve son zamanlarda bu aşılama yönteminin folikül aktivasyonuna karşı koyabildiğinigöstermiştir 24.

CAM modeli, yalnızca yumurtaların farelerden çok daha ucuz olması nedeniyle değil, aynı zamanda TAT'ın yüksek oranda vaskülarize doğası nedeniyle de folikül aktivasyonu ile yumurtalık grefti revaskülarizasyonu arasındaki ilişkinin incelenmesine izin vermesi nedeniyle özellikle çekicidir. Kuş sistemi, aslında, anjiyogenez25'i incelemenin en yaygın ve çok yönlü yollarından biridir. Civciv embriyo gelişimi (ED) yumurtadan çıkana kadar 21 gün sürer ve CAM ilk 4-5 gün içinde allantois ve koryon26'nın füzyonu yoluyla oluşur. Özellikle, civciv embriyosu, ED'nin 17. gününe kadar doğal olarak immün yetmezliği olan bir konakçıdır, bu nedenle ksenogreftleme deneyleri, herhangi bir greft reddi riski olmadan gerçekleştirilebilir27,28. Ayrıca, TAT modeli yaklaşımı, Avrupa hukuku29 açısından herhangi bir etik veya yasal kaygı uyandırmamakta, bu da onu diğer hayvan modellerine çekici bir alternatif haline getirmektedir. Üreme koşulları ile ilgili olarak, civciv embriyolarının sadece% 40 -% 60 bağıl hava nemi ile 37 ° C'ye ayarlanmış bir inkübatöre ihtiyacı vardır. Bu sınırlı deney gereksinimleri, immün yetmezliği olan farelerin kullanımına kıyasla araştırma maliyetlerini önemli ölçüde azaltır.

Burada sunulan protokol, insan yumurtalık dokusu için bir CAM ksenogreftleme modelinin geliştirilmesini tanımlamayı ve tekniğin etkinliği, greft revaskülarizasyonunun zaman çerçevesi ve 6 günlük bir greftleme süresi boyunca doku canlılığı hakkında spesifik bilgiler sağlamayı amaçlamaktadır. Bu protokol, greftleme sonrası erken folikül kaybının arkasındaki mekanizmaları araştırmak ve çeşitli ajanların (büyüme faktörleri, hormonlar, vb.) bu fenomen üzerindeki etkisini incelemek için büyük ilgi görebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

İnsan dokusunun kullanımı, Louvain Katolik Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylandı. Hastalar yumurtalık dokularının araştırma amaçlı kullanımı için yazılı bilgilendirilmiş onamlarını verdiler.

1. Embriyonlaşma olasılığı yüksek olan 0. gün yumurtalarının sipariş edilmesi

  1. Öncelikle civcivlerin yaşına bağlı olan yüksek oranda embriyonlu yumurta bildiren, laboratuvar sınıfı Lohman'ın seçtiği sertifikalı bir beyaz Leghorn yumurta tedarikçisi bulun.

2. Yumurtaların kuluçka için hazırlanması

  1. Yumurtalar gelmeden önce, yumurta kuluçka makinesini monte edin ve %40-60 bağıl hava neminde 37 °C'ye dengeleyin. İnkübatöre bir termometre ve higrometre yerleştirerek sıcaklığı ve hava nemini izleyin. İnkübatörün kapağının, inkübatörün iç parametrelerinin açılmasına gerek kalmadan kontrol edilmesine izin vermek için bir cam pencere ile donatıldığından emin olun (Şekil 1).
  2. Lohman'ın seçtiği beyaz Leghorn civcivlerinden 0. gün yumurtalarını sertifikalı bir laboratuvar sınıfı yumurta tedarikçisinden aldıktan sonra, kabukların yüzeyini nemlendirilmiş kağıtla temizleyin ve hemen kurutun.
    NOT: Yumurta kabuğu zarı gözenekli olduğundan, kontaminasyon risklerini en aza indirmek için yumurta yüzeylerini temizlemek ve kuluçka makinesi içindeki nemi kontrol etmek için otoklavlanmış su kullanılabilir.
  3. Yumurtaları bir işaretleyici kullanarak etiketleyin (örneğin, tarih ve yumurta numarası).
  4. Yumurtaları sivri uçları aşağı bakacak şekilde kuluçkaya yatırın ve CAM'nin gelişmesine izin vermek için döndürün. Yumurtaları günde iki ila üç kez manuel olarak 180° döndürün veya otomatik bir döndürücü kullanın.
    NOT: Yumurtaların gerçekten döndürüldüğünden emin olmak için, yumurta kabuğu bir kalem veya işaretleyici kullanılarak karşılıklı iki yan tarafta "X" ve "O" ile işaretlenebilir. Kuluçka makinesinin kapağındaki cam pencere, cihazı açmadan yumurtaların dönüşünü kontrol etmenizi sağlar.

3. ED'nin 3. gününde yumurta kabuğunun açılması

NOT: ED'nin 3. gününde yumurta kabuğuna dikdörtgen bir pencere yapılır.

  1. Steril koşullarda çalışmak için laminer akış başlığını hazırlayın. Aşağıdaki aletleri kaputun altına yerleştirin ve %70 etanol ile dezenfekte edin (önceden sterilize edilmemişse):
    -Yumurta rafı
    -Yumurta mumcusu veya fokal soğuk ışık kaynağı
    -Işaretleyici
    -Steril düz pim
    -Steril 19 G iğne
    -5 mL steril şırınga
    -Kaydırma testere bıçağı
    -Steril forseps
    -Yapışkan bant
  2. Bir yumurtayı kuluçka makinesinden kaputun altına yerleştirilmiş yumurta rafına aktarın ve yumurta döndürücüyü kapatın.
  3. Karanlıkta, yumurta mumunu (veya odak soğuk ışık kaynağını) yumurta kabuğuna yerleştirerek yumurtanın hava cebini belirleyin. Hava cebi, yumurtanın kör ucunda lokalizedir. Yumurta kabuğundaki hava cebinin merkezini tam olarak belirlemek için bir işaretleyici kullanın.
  4. Işıkları aç. Steril bir düz pimi hafifçe döndürerek yumurta kabuğunda işaretlendiği yerde küçük bir delik açın. Yaklaşık 1 mm çapında küçük bir açıklık genellikle yeterlidir.
    NOT: Pimi yumurtanın sonuna kadar itmemeye dikkat edin. Bu olursa, yumurtayı atın.
  5. Steril 19 G'lik bir iğneyi steril 5 mL'lik bir şırıngaya bağlayın.
  6. Karanlıkta, yumurta mumunu (veya odak soğuk ışık kaynağını) kullanarak yumurta sarısı kesesini bulun ve yumurtayı 3.4°'lik steril 19 G iğne ile yumurtanın dibine doğru 45° açıyla açılan delikten delin; Yumurta sarısı kesesini bozmamaya çok özen gösterin. CAM'yi kabuktan ayırmak için 1.5-2 mL arasında albümin aspire edin ve ardından deliği bir parça yapışkan bantla kapatın.
    NOT: Aspirasyon sırasında yolk kesesi bozulursa, şırıngadaki aspire edilen sıvı şeffaf (albümin) yerine sarı renkli olacaktır. Böyle bir durumda, iğneyi ve şırıngayı değiştirin. Nispeten büyük miktarda yumurta sarısı emilirse, embriyonun canlılığını tehlikeye atabilir.
  7. Işıkları aç. Yumurtayı yatay olarak yerleştirin ve bir işaretleyici ile 1 cm x 1,5 cm ölçülerinde dikdörtgen bir pencere çizin. Pencereyi standart yapışkan bandın normal genişliğinden daha büyük yapmayın.
  8. Yumurtayı bir elinizde tutun ve önceden çizilmiş pencereyi bir kaydırma testere bıçağı kullanarak yumurta kabuğuna nazikçe kesin. Kabuğun çatlamadığından ve bastırılmış CAM'a kadar kesmediğinden emin olun. Kabuk tozunu ve kalıntıları temizlemek için düzenli olarak üfleyin.
  9. Steril forsepsleri dikdörtgen testere kabuğu parçasının altına kaydırın ve CAM'ye zarar vermeden temiz bir şekilde çıkarmak için ustaca kavrayın. Ek olarak, embriyoyu ve CAM'sini görebilmek için beyaz dış kabuk zarını atın.
    NOT: CAM'ın üzerine bir miktar yumurta kabuğu tozu veya kalıntısı düşerse, CAM'yi yırtmamaya çok dikkat ederek steril forseps kullanılarak çıkarılabilir.
  10. Canlı embriyonlu yumurtaları tanımlayın. Berrak albüminleri ve embriyonun etrafındaki vasküler halka ile fark edilebilirler, burada bazen bu aşamada bile atan bir kalp tespit edilebilir (ED'nin 3. günü). Döllenmemiş veya ölü embriyoları atın.
  11. Dehidrasyonu önlemek için yeni oluşturulan pencerenin üzerine yapışkan bant yerleştirin. Çıkarma kolaylığı için bir ucunu kendi üzerine katladığınızdan emin olun.
  12. Yumurtayı, açılan pencere yukarı bakacak ve bant CAM'a değmeyecek şekilde kuluçka makinesine geri koyun. Yumurtanın yuvarlanmasını durdurmak için katlanmış bir kağıt parçası veya yumurta rafının bir kısmını kullanın. Döner tepsinin kapalı olduğundan emin olun.
  13. Kalan yumurtaları açmak için 3.2-3.12 adımlarını tekrarlayın.

4. Dondurulmuş-çözülmüş insan yumurtalık dokusunun CAM'a aşılanması

NOT: CAM transplantasyonu ideal olarak ED'nin 7-10. günleri arasında başlatılmalıdır.

  1. Dondurularak saklanmış yumurtalık kortikal şeritlerini, başka bir yerde açıklanan protokolü izleyerek laminer akış başlığı altında çözün30.
  2. Kortikal şeritleri 4 mm x 2 mm x 1 mm'lik üç parçaya kesin. Bir parçayı aşılanmamış kontrol olarak, diğer ikisini 1 gün veya 6 gün boyunca ksenogreftleme için kullanın.
    NOT: Yeterli doku varsa, iki kopya halinde çalışın.
  3. Kuluçka makinesinden bir yumurtayı, pencere yukarı bakacak şekilde kaputun altına yerleştirilmiş yumurta rafına aktarın.
  4. Bandı pencereden soyun ve embriyonun canlı olduğundan emin olun. Bu aşamada, canlı embriyolar geniş bir damar sistemine, berrak bir albüme, görünür bir kalp atışına ve bir miktar embriyo hareketine sahiptir.
  5. Epitel yüzeyine 1cm2'lik steril eter ekstrakte edilmiş lens kağıdı şeridi koyarak ve hemen çıkararak CAM'ın küçük bir alanını nazikçe travmatize ederek greftleme bölgesini hazırlayın.
    NOT: Membran, çift epitel tabakasının üst peridermal kısmının çıkarılmasıyla travmatize edilmedikçe ve bazal tabakayı sağlam bırakmadıkça, CAM aşılmaz bir bariyerdir. Bu teknik aynı zamanda yara iyileşmesini aktive ederek revaskülarizasyon sürecini de geliştirir. Steril eterle ekstrakte edilmiş lens kağıdı CAM üzerinde çok uzun süre kalırsa, membran lens kağıdına yapışabilir ve yırtılabilir. Bu olursa, yumurtayı atın.
  6. Dondurulmuş-çözülmüş bir yumurtalık kortikal şeridini (4 mm x 2 mm x 1 mm) mikrocerrahi forseps ile kavrayın ve medüller tarafı CAM'a karşı olacak şekilde travmatize edilmiş CAM'ın üzerine yerleştirin. Yumurta başına bir doku parçası aşılayın.
  7. Pencereyi yapışkan bantla örtün ve yumurtayı dikkatlice kuluçka makinesine geri koyun. Yumurta kabuğu açıklığının dik durduğundan ve yumurtanın sağlam olduğundan emin olun.
  8. Kalan tüm dokuların greftlenmesi için 4.1-4.7 adımlarını tekrarlayın.
    NOT: Embriyo canlılığını değerlendirmek ve damar sistemindeki değişiklikleri izlemek için implantlar her aşılama gününde kontrol edilmelidir.

5. Greftlerin toplanması

NOT: Ksenogreftler en geç ED'nin 17. gününe kadar toplanmalıdır, çünkü embriyonun bağışıklık sistemi 18. günden itibaren olgunlaşır ve yetkin hale gelir.

  1. Yumurtayı bir rafa yerleştirin ve daha iyi greft görselleştirmesi ve daha kolay manipülasyon sağlamak için yumurta kabuğundaki pencereyi genişletin.
  2. Grefti makroskopik olarak değerlendirin ve CAM'ın grefte karşı vasküler reaksiyonuna özellikle dikkat edin. Kayıt için dijital fotoğraflar veya videolar çekin.
  3. Dokuyu veya çevresindeki CAM'ı forseps ile kavrayın ve grefti CAM'den dikkatlice çıkarmak için makas veya neşter kullanın.
    NOT: Greftler, aşılamanın yaklaşık 3. gününde ikinci bir CAM tabakası ile kaplanır ve sonunda kapsüllenir. Ayrıca 6. günde yumurtanın içine girmiş olabilirler, bu da bazı durumlarda onları geri almayı zorlaştırır.
  4. Eksize edilen dokuları, verilen deney için uygun olan herhangi bir yöntemle analiz edin. Bu çalışmada, doku parçaları paraformaldehit içine sabitlendi, parafine gömüldü ve aşağıda özetlenen adımlar izlenerek hematoksilen ve eozin ile boyandı:
    1. Parçaları 24 saat boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin ve Tablo 1'de belirtilen adımlarla otomatik bir gömme cihazı kullanarak parafine gömün.
    2. Parafine gömülü blokları bir mikrotom ile 5 μm kalınlığında bölümler halinde kesmeden önce gece boyunca 4°C'de bırakın.
    3. Doku bölümlerini sıcak bir plaka (30 °C) üzerine yerleştirilmiş bir cam slayt üzerine yayın ve 2 saat, ardından 37 °C'de bir fırında 24 saat kurumaya bırakın.
    4. Daha sonra, başka bir yerde açıklanan bir protokolü izleyerek slaytları hematoksilen ve eozin ile boyayın31. Ardından, örnekleri bir slayt tarayıcı kullanarak sayısallaştırın ve bir görüntü analiz yazılımı kullanarak analiz edin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Civciv embriyosu hayatta kalma oranları
Pencerelemeden (ED'nin 3. günü) yumurtalık dokusu greftlemesine (ED'nin 7. günü) kadar embriyo sağkalım oranı% 79 (33/42) idi. Embriyonlu gün 0 yumurtalarının yüzdesi bilinmediğinden, aşılama için yeterli embriyonlu yumurtanın mevcut olmasını sağlamak için Lohman tarafından seçilen beyaz Leghorn tavuklarından alınan süper nümerik gün 0 yumurtaları sipariş edildi. Aşılama için toplam 23 canlı gün 7 yumurtası kullanıldı, bunlardan biri ilk 24 saat içinde telef oldu ve transplantasyondan sonra genel embriyo sağkalım oranı %96 oldu (22/23).

Greftlerin makroskopik görünümü
1 günlük greftlemeden sonra, greftler vakaların %100'ünde (10/10) canlı görünüyordu ve zaten en azından kısmen CAM'a yapışıktı, bu da damarlanmaları için gerekli olan kan damarlarının tekerlek kollu bir modelini gösteriyordu (Şekil 2A, B). 6 günlük greftlemeden sonra, CAM'a bağlanmayan iki implant dışında tüm implantlar hala yapışıktı (Şekil 2C). Nekrotik bir görünüm aldılar ve daha ileri analizlerden çıkarıldılar (Şekil 3), bu da 6 gün sonra% 83 (10/12) greftli doku sağkalım oranıyla sonuçlandı. Sonuç olarak, insan yumurtalık greftlerinin canlılık değerlendirmesi, greftleme gününden bağımsız olarak genel doku sağkalım oranını %91 (20/22) olarak ortaya koymuştur (Tablo 2).

Transplantasyondan sonraki 3. gün civarında, greftlerin ikinci bir CAM tabakası ile kaplandığı bulundu ve sonunda kapsüllenerek daha da iyi greft vaskülarizasyonuna yol açtı (Şekil 2C). Genel olarak, nakillerin %80'i yumurtaya da nüfuz etmişti (Şekil 2D), bazı durumlarda 6. günde onları geri almayı zorlaştırıyordu.

Greftlerin mikroskobik değerlendirilmesi
Beş farklı hastadan elde edilen toplam 30 dondurulmuş-çözülmüş insan yumurtalık fragmanı analiz edildi ve greftleme günü 0, 1 veya 6. günde %4 paraformaldehit içinde sabitlendi, parafine gömüldü ve histolojik değerlendirme için seri olarak 5 μm'lik kesitlere kesildi (Şekil 4).

Yumurtalık folikülü sağkalım oranlarını değerlendirmek için, foliküller zaman noktası ve hasta başına 12 rastgele hematoksilen ve eozin boyalı kesitte sayıldı. Analiz için sadece morfolojik olarak normal ve görünür oosit içeren foliküller dikkate alındı32. Sağlıklı foliküller tüm zaman noktalarında gözlendi (Şekil 4B-D). Folikül sağkalım oranları, greftlemeden sonra kalan folikül yoğunluğunun (folikül sayısı/mm3) belirlenmesi ve greftlenmemiş kontrollerde (%100 olarak kabul edilir) folikül yoğunluğuna normalleştirilmesiyle hesaplandı. Folikül yoğunlukları transplantasyondan sonra azalma eğilimindeydi, ancak istatistiksel anlamlılığa ulaşmak için yeterli değildi (p > 0.8) (Tablo 2). Benzer şekilde, greftleme döneminde folikül sağkalım oranları korundu, 1. günde %95 ± %19 ve 6. günde %83 ± %27 (p > 0.5).

Revaskülarizasyon süreci, ksenogreftlenmiş yumurtalık dokusundan damarlarda kuş kırmızı kan hücrelerinin saptanmasıyla daha fazla araştırıldı. Kuş eritrositleri çekirdekli oldukları için kolayca ayırt edilebilirler (Şekil 4A,C,D). Şaşırtıcı bir şekilde, transplantasyondan sadece 1 gün sonra implantların %30'unda ve 6. günde tüm implantlarda çok hızlı revaskülarizasyon sergileyen yumurtalık damarlarında kuş eritrositlerini gözlemleyebildik (Tablo 2).

Figure 1
Şekil 1: Yumurta kuluçka makinesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Canlı implantların makroskopik görünümü. (A) Aşılama günü 0. (B) 1. günde implantlar, CAM, yumurtalık dokusuna doğru tekerlek kollu bir kan damarı modeli gösterir. (C) 6. günde CAM ile kapsüllenen implantlar, daha da iyi greft vaskülarizasyonuna yol açar. (D) Yumurtaya nüfuz eden greft. Oklar aşılanmış yumurtalık dokusunu gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Nekrotik implantların makroskopik görünümü. (A) Greftlemenin 0. gününde sağlıklı görünen yumurtalık dokusu. (B) 6 gün sonra implantın nekrotik yönü. Oklar yumurtalık dokusunu gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: İmplantların mikroskobik görünümü. İmplantların hematoksilen ve eozin boyalı kesitleri (A,B) 1 gün ve (C,D) 6 gün greftlendi. Ok uçları, (A) 1 gün ve (C, D) 6 günlük greftlemeden sonra yumurtalık damarlarına perfüze eden kuş kırmızı kan hücrelerini gösterir. Oklar, (B) 1 gün ve (C, D) 6 gün boyunca greftlenen implantlarda sağlıklı görünen primordial folikülleri gösterir. Ölçek çubuğu: 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Adım -ları Banyo Saat
İkinci fiksasyon 1 Formalin% 10 banyo 2 saat
Dehidratasyon 7 metanol banyosu 7x 1 saat
Açıklama 3 toluen banyosu 3x 1 saat
Emprenye 3 sıvı parafin banyosu (60°C) 15 dk – 30 dk – 30 dk

Tablo 1: Parafin gömme adımları.

Aşısız Aşılama günü 1 Aşılama günü 6 P değeri
Greftlerin makroskopik görünümü
Doku sağkalım oranı - 100% (10/10) 83% (10/12) /
Greftlerin mikroskobik yönü
Folikül yoğunluğu (n/mm3) 848 ± 272 817 ± 370 684 ± 236 p > 0.8
Folikül sağkalım oranı 100% %95 ± %19 %83 ± %27 p > 0.5
İmplantlarda bulunan kuş kırmızı kan hücreleri 0% (0/10) 30% (3/10) 100% (10/10) /

Tablo 2: Sonuçlar. İstatistiksel analiz, tek yönlü ANOVA kullanılarak gerçekleştirilmiştir ve ardından Sidak düzeltmesi yapılmıştır. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak ifade edilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada açıklanan protokolün en zorlu kısmı, bir pencere oluşturmadan önce CAM'yi yumurta kabuğundan ayırmak için albümini aspire etmek için gereken küçük deliği yapmaktır. Çok fazla basınç uygulamak aşırı penetrasyona neden olabilir veya hatta yumurtayı çatlatabilir ve tahrip edebilir, bu da CAM ve damar sisteminde geri dönülmez hasara neden olabilir. CAM'ı ayırmaya yönelik ilk girişimler sırasında hataları minimumda tutmak için, döllenmemiş, bakkaldan satın alınan yumurtaların yumurta kabuğunda düz bir pim kullanarak küçük delikler açma alıştırması yapmanız şiddetle tavsiye edilir. Ayrıca, partiler arasında doğurganlığın doğal değişkenliği göz önüne alındığında, tüm embriyoların prosedürden sağ çıkamayacağı gerçeği göz önüne alındığında, yumurta tedarikçisinden süper nümerik yumurta alınması önerilir. Optimal embriyo sağkalım oranları ve iyi gelişmiş bir TAT elde etmek için yumurtaların ideal koşullarda inkübe edilmesi gerekir. Düşük uygulanabilirlik durumunda, farklı yönler suçlanabilir ve araştırılması gerekebilir. Yumurta tedarikçisi ile iletişime geçilmelidir, çünkü tedarikçiden gelen embriyoların canlılığı bu noktada daha düşük olabilir. Düşük yumurta canlılığı, CAM gelişimini tehlikeye atabilecek yanlış veya uygun olmayan kuluçka makinesi ayarlarından da kaynaklanabilir. Bağımsız bir higrometre ve termometrenin kullanılması, ayarların doğru ve kararlı olmasını sağlayabilir, ancak üretici tarafından ayrıntılı sorun giderme talimatları sağlanmalıdır. Son olarak, nakledilen yumurtaların çok sık kontrol edilmesinin, aşılanmış embriyolar üzerinde zararlı etkileri olabilecek sıcaklık ve nem dalgalanmalarına neden olabileceği de öne sürülmüştür33.

Mevcut protokolde, yumurta kabuğunun pencerelenmesi, ED'nin 3. gününde, TAT'yi kabuktan ayırmak için embriyodan yaklaşık 2 mL albümin aspire edilerek gerçekleştirildi ve bu da CAM'a zarar vermeden bir pencere oluşturulmasına izin verdi. 4 gün sonra embriyo sağkalım oranı, önceki çalışmalarla tutarlıolarak %79 idi 34,35. Değişen derecelerde başarı ile başka yöntemler de bildirilmiştir. Bir alternatif, tipik olarak ED'nin 7-10. günü civarında hava kesesine emme uygulayarak CAM'ı kabuktan uzaklaştırmaktır. Bu yöntem yumurtanın delinmesini gerektirmez33,36. İkinci tekniği kullanarak embriyo sağkalım oranlarını bildiren çalışmalar literatürde çok azdır ve bir ekip embriyo sağkalımının %90'ına kadarını bildirmektedir36. Göz önünde bulundurulması gereken bir diğer seçenek de ex ovo kültür olarak da bilinen kabuksuz civciv embriyo kültürüdür. Yumurta kabuğunun çıkarılması embriyoya sınırsız erişim sağlar, böylece embriyo manipülasyonunu ve ameliyatını kolaylaştırır ve ayrıca floresan mikroskobu ve mikrobilgisayarlı topografi gibi canlı deneyler için yüksek çözünürlüklü görüntüleme tekniklerinin kullanılmasına izin verir37,38. Ex ovo kültürü yürütmek için, ekstraembriyonik zarları da dahil olmak üzere embriyo, ED'nin 2. günü ile 4. günü arasında belirli bir kültür muhafazasına aktarılır. Bununla birlikte, bu teknik oldukça invazivdir, embriyolar genellikle 12. gün civarında ölür ve bunların %18'inden azı 15. güne kadar hayatta kalır38,39.

Burada bildirilen ksenogreftleme deneyleri sırasında, insan yumurtalık implantları, epitel yüzeyine küçük bir steril eter ekstrakte edilmiş lens kağıdı şeridi uygulanarak ve hemen çıkarılarak hafifçe travmatize edilmiş CAM'lere aşılandı. Genel olarak, embriyo sağkalım oranları mükemmeldi ve greftleme döneminde %96'ya ulaştı, bu da yumurtalık dokusu parçalarının CAM'lerenakledilmesini içeren önceki çalışmalarla tutarlıdır 23,40. Ayrıca, bu yaklaşımın greft adezyon oranlarını arttırdığı ve daha sonra neovaskülarizasyonun kurulmasını arttırdığı gösterilmiştir, anjiyogenez muhtemelen ilk yara iyileşme süreci tarafından indüklenmiştir23. Gerçekten de, sıçan yumurtalık dokusunun murin yara iyileştirici granülasyon dokusuna ksenogreftlenmesinin greft vaskülarizasyonunu iyileştirdiği bulunmuştur41. Benzer şekilde, dondurularak saklanmış insan yumurtalık dokusunun ortotopik transplantasyonundan sonra bildirilen ilk canlı doğumda, Donnez ve ark. transplantasyon bölgesinde anjiyogenezi ve neovaskülarizasyonu uyarmak için implantasyondan 7 gün önce bir peritoneal pencere oluşturdu ve kenarlarını pıhtılaştırdı42.

Aşılanmış insan yumurtalık dokusunun histolojik değerlendirmesi ile ilgili olarak, folikül sağkalım oranları cesaret vericiydi ve foliküllerin %80'inden fazlası 6 günlük greftlemeden sonra bozulmadan kaldı. İlginç bir şekilde, insan dondurulmuş-çözülmüş yumurtalık dokusunun immün yetmezliği olan farelerin peritonuna nakledilmesinden sonra literatürde bildirilen folikül sağkalım oranları sadece %30 civarındadır10,14,18,43,44 ve bu çalışmadan çok daha düşüktür. İnsan yumurtalık dokusunun TAT'a aşılanmasından sonra artmış folikül sağkalımına ilişkin bulgularımız, TAT'ın folikül aktivasyonunu ve apoptozu inhibe ettiğini gösterdiğimiz yakın zamanda yayınlanan verilerimizi doğrulamaktadır24. Ayrıca, kuş kan damarları, transplantasyondan sadece 1 gün sonra kuş eritrositlerinin varlığının gösterdiği gibi implantlara nüfuz edebildi. Sonuç olarak, bu sonuçlar, CAM yaklaşımının, dokunun hayatta kalmasını desteklediği için insan yumurtalık dokusunun transplantasyonunu daha fazla incelemek için uygun bir model olduğunu göstermektedir.

CAM modelinin en büyük dezavantajı, aşılamanın mümkün olduğu sınırlı süredir. Gerçekten de, transplantasyon en erken ED'nin 7. gününde, CAM yeterince gelişir gelişmez, civciv embriyoları immünokompetasyon kazanmadan ve yumurtadan çıkmadan önce 17. güne kadar gerçekleştirilebilir. Kısa greftleme süresine rağmen, CAM modeli, ilk iskemik evrelerinde insan yumurtalık dokusu transplantasyonunu incelemek için hala yararlı bir araçtır. Bu model, proanjiogenik faktörlerin, koruyucu antioksidan ajanların, sitokinlerin, büyüme ve üreme ile ilgili hormonların ve aşılanmış insan yumurtalık dokusunda folikül aktivasyonunu kontrol eden faktörlerin etkisini test etmek için de kullanılabilir, hepsi de kolayca kontrol edilebilen deneysel koşullar altında25,45.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgments

Yazarlar, makalenin İngilizce dilini gözden geçirdiği için BA'dan Mira Hryniuk'a teşekkür eder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agani hypodermic needle, 19 G Terumo Europe AN*1950R1 19 G needle to aspirate albumen
Terumo syringe, 5 mL concentric Luer lock Terumo Europe SS*05LE1 5-mL sterile syringe
Caseviewer v2.2 3DHISTECH Image analysis software
Diethyl ether Merck Chemicals 603-022-00-4 Sterile ether to traumatize the CAM
Eosin Y aqueous solution 0.5% Merck 1098441000 Staining solution
Formaldehyde 4% aqueous solution buffered (Formalin 10%) VWR 97139010 Formaldehyde used for tissue fixation
Fridge Liebherr 7081260 Fridge at 4 °C used for paraffin-embedding
Heating plate Schott SLK2 Hot plate used to dry the slides
Incubator Thermo Forma Scientific 3111 10365156 Oven used for slide incubation
Leica CLS 150 XE microscope cold light source Leica CLS 150 XE Focal cold light source to candle the eggs
Lens cleaning tissue, grade 541 VWR 111-5003 Tissue to soak in sterile ether to traumatize the CAM
Mayer's hematoxylin MERCK 1092491000 Staining solution
Methanol VWR 20847307 Methanol
Microtome ThermoScientific-MICROM HM325-2 Microtome
Pannoramic P250 Flash III 3DHISTECH / Slide scanner at 20x magnification
Paraformaldehyde  Merck 1,04,00,51,000 Paraffin-embedding solution
Paraplast Plus R Sigma P3683-1KG Paraffin
Petri dish, 60x15 mm, sterile Greiner 628161 Sterile petri dish
Pin holder Fine Science Tools 26016-12 Pin holder
Polyhatch Brinsea CP01F Egg incubator with automatic rotator
Scroll saw blade, 132 mm Sencys / Saw blade to create a window in the eggshell
Stainless steel insert pins Fine Science Tools 26007-02 Straight pin to make a hole in the eggshell
Steril-Helios  Angelantoni Industrie ST-00275400000 Laminar flow hood
Superfrost Plus bords rodés 90° VWR 631-9483 Glass slides 
Tissue-Tek VIP 6Al Sakura 60320417-0711 VID6E3-1 Automatic embedding device
Titanium forceps Fine Science Tools 11602-16 Forceps for eggshell removal and ovarian tissue manipulation
Toluene, pa VWR 28701364 Paraffin-embedding solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue and oocyte cryopreservation prior to iatrogenic premature ovarian insufficiency. Best Practice & Research Clinical Obstetrics & Gynaecology. 81, 119-133 (2022).
  2. Dolmans, M. -M., Hossay, C., Nguyen, T. Y. T., Poirot, C. Fertility preservation: How to preserve ovarian function in children, adolescents and adults. Journal of Clinical Medicine. 10 (22), 5247 (2021).
  3. Donnez, J., Dolmans, M. -M. Fertility preservation in women. New England Journal of Medicine. 377 (17), 1657-1665 (2017).
  4. Donnez, J., Dolmans, M. -M. Fertility preservation in women. Nature Reviews Endocrinology. 9 (12), 735-749 (2013).
  5. Dolmans, M. -M., et al. Transplantation of cryopreserved ovarian tissue in a series of 285 women: a review of five leading European centers. Fertility and Sterility. 115 (5), 1102-1115 (2021).
  6. Shapira, M., Dolmans, M. -M., Silber, S., Meirow, D. Evaluation of ovarian tissue transplantation: results from three clinical centers. Fertility and Sterility. 114 (2), 388-397 (2020).
  7. Jensen, A. K., et al. Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark. Human Reproduction. 30 (12), 2838-2845 (2015).
  8. Vander Ven, H., et al. Ninety-five orthotopic transplantations in 74 women of ovarian tissue after cytotoxic treatment in a fertility preservation network: Tissue activity, pregnancy and delivery rates. Human Reproduction. 31 (9), 2031-2041 (2016).
  9. Diaz-Garcia, C., et al. Oocyte vitrification versus ovarian cortex transplantation in fertility preservation for adult women undergoing gonadotoxic treatments: A prospective cohort study. Fertility and Sterility. 109 (3), 478-485 (2018).
  10. Nisolle, M., Casanas-Roux, F., Qu, J., Motta, P., Donnez, J. Histologic and ultrastructural evaluation of fresh and frozen-thawed human ovarian xenografts in nude mice. Fertility and Sterility. 74 (1), 122-129 (2000).
  11. Van Eyck, A. -S., et al. Electron paramagnetic resonance as a tool to evaluate human ovarian tissue reoxygenation after xenografting. Fertility and Sterility. 92 (1), 374-381 (2009).
  12. Van Eyck, A. -S., et al. Both host and graft vessels contribute to revascularization of xenografted human ovarian tissue in a murine model. Fertility and Sterility. 93 (5), 1676-1685 (2010).
  13. Hossay, C., et al. Can frozen-thawed human ovary withstand refreezing-rethawing in the form of cortical strips. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (12), 3077-3087 (2020).
  14. Manavella, D. D., et al. Two-step transplantation with adipose tissue-derived stem cells increases follicle survival by enhancing vascularization in xenografted frozen-thawed human ovarian tissue. Human Reproduction. 33 (6), 1107-1116 (2018).
  15. Rahimi, G., et al. Re-vascularisation in human ovarian tissue after conventional freezing or vitrification and xenotransplantation. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 149 (1), 63-67 (2010).
  16. Cacciottola, L., Manavella, D. D., Amorim, C. A., Donnez, J., Dolmans, M. -M. In vivo characterization of metabolic activity and oxidative stress in grafted human ovarian tissue using microdialysis. Fertility and Sterility. 110 (3), 534-544 (2018).
  17. Gavish, Z., et al. Follicle activation is a significant and immediate cause of follicle loss after ovarian tissue transplantation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 35 (1), 61-69 (2018).
  18. Masciangelo, R., Hossay, C., Donnez, J., Dolmans, M. -M. Does the Akt pathway play a role in follicle activation after grafting of human ovarian tissue. Reproductive BioMedicine Online. 39 (2), 196-198 (2019).
  19. Fortune, J. E., Cushman, R. A., Wahl, C. M., Kito, S. The primordial to primary follicle transition. Molecular and Cellular Endocrinology. (1-2), 53-60 (2000).
  20. Cushman, R. A. Bovine ovarian cortical pieces grafted to chick embryonic membranes: A model for studies on the activation of primordial follicles. Human Reproduction. 17 (1), 48-54 (2002).
  21. Gigli, I., Cushman, R. A., Wahl, C. M., Fortune, J. E. Evidence for a role for anti-Müllerian hormone in the suppression of follicle activation in mouse ovaries and bovine ovarian cortex grafted beneath the chick chorioallantoic membrane. Molecular Reproduction and Development. 71 (4), 480-488 (2005).
  22. Qureshi, A. I., et al. Testosterone selectively increases primary follicles in ovarian cortex grafted onto embryonic chick membranes: relevance to polycystic ovaries. Reproduction. 136 (2), 187-194 (2008).
  23. Martinez-Madrid, B., et al. Chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) model: A useful tool to study short-term transplantation of cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 91 (1), 285-292 (2009).
  24. Hossay, C., et al. Follicle outcomes in human ovarian tissue: Effect of freezing, culture, and grafting. Fertility and Sterility. 119 (1), 135-145 (2023).
  25. Ribatti, D. The Chick Embryo Chorioallantoic Membrane in the Study of Angiogenesis and Metastasis. , Springer. Dordrecht, the Netherlands. (2010).
  26. Pawlikowska, P., et al. Exploitation of the chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) as a platform for anti-metastatic drug testing. Scientific Reports. 10 (1), 16876 (2020).
  27. Davison, T. F. The immunologists' debt to the chicken. British Poultry Science. 44 (1), 6-21 (2003).
  28. Schilling, M. A., et al. Transcriptional innate immune response of the developing chicken embryo to Newcastle disease virus infection. Frontiers in Genetics. 9, 61 (2018).
  29. Directives originating from the EU. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes (Text with EEA relevance). The National Archives. , Available from: https://www.legislation.gov.uk/eudr/2010/63/contents (2010).
  30. Dolmans, M. -M., et al. A review of 15 years of ovarian tissue bank activities. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (3), 305-314 (2013).
  31. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), 4986 (2008).
  32. Anderson, R. A., McLaughlin, M., Wallace, W. H. B., Albertini, D. F., Telfer, E. E. The immature human ovary shows loss of abnormal follicles and increasing follicle developmental competence through childhood and adolescence. Human Reproduction. 29 (1), 97-106 (2014).
  33. Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the chicken chorioallantoic membrane in vivo model to study gynecological and urological cancers. Journal of Visualized Experiments. (155), e60651 (2020).
  34. Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13 (8), 9959-9970 (2012).
  35. Sys, G. M. L., et al. The In ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. Journal of Visualized Experiments. (77), e50522 (2013).
  36. Li, M., et al. The in ovo chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an efficient xenograft model of hepatocellular carcinoma. Journal of Visualized Experiments. (104), e52411 (2015).
  37. Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
  38. Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications. Journal of Visualized Experiments. (44), e2154 (2010).
  39. Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts. Stem Cells International. 2013, 960958 (2013).
  40. Beck, K., Singh, J., Dar, M. A., Anzar, M. Short-term culture of adult bovine ovarian tissues: chorioallantoic membrane (CAM) vs. traditional in vitro culture systems. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 21 (2018).
  41. Israely, T., Nevo, N., Harmelin, A., Neeman, M., Tsafriri, A. Reducing ischaemic damage in rodent ovarian xenografts transplanted into granulation tissue. Human Reproduction. 21 (6), 1368-1379 (2006).
  42. Donnez, J., et al. Livebirth after orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue. The Lancet. 364 (9443), 1405-1410 (2004).
  43. Dolmans, M. -M., et al. Short-term transplantation of isolated human ovarian follicles and cortical tissue into nude mice. Reproduction. 134 (2), 253-262 (2007).
  44. Baird, D. T., Webb, R., Campbell, B. K., Harkness, L. M., Gosden, R. G. Long-term ovarian function in sheep after ovariectomy and transplantation of autografts stored at −196 C. Endocrinology. 140 (1), 462-471 (1999).
  45. Ribatti, D., Vacca, A., Roncali, L., Dammacco, F. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for in vivo research on anti-angiogenesis. Current Pharmaceutical Biotechnology. 1 (1), 73-82 (2000).

Tags

Biyoloji Sayı 196 Folikül Aktivasyonu Folikül Kaybı Kriyoprezervasyon Transplantasyon Kemirgen Modelleri Alternatifler Uygun Maliyetli Zaman Kazandıran Etik Hususlar Ksenogreftleme İnsan Yumurtalık Dokusu İmmün Yetmezlik Anjiyogenez Greftleme Sonrası Folikül Kaybı Süreci CAM Ksenogreftleme Modeli Revaskülarizasyon Zaman Çerçevesi Doku Canlılığı
Yumurtalık Dokusu Transplantasyonunu İncelemek İçin Bir Araç Olarak Civciv Korioallantoik Membran (CAM) Modeli
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hossay, C., Cacciottola, L.,… More

Hossay, C., Cacciottola, L., Storder, S., Van Kerk, O., Dolmans, M. M. The Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Model as a Tool to Study Ovarian Tissue Transplantation. J. Vis. Exp. (196), e64867, doi:10.3791/64867 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter