Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Модель хориоаллантоисной мембраны (CAM) цыплят как инструмент для изучения трансплантации ткани яичника

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/64867
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Gynecology Research Unit, Institut de Recherche Expérimentale et Clinique, Université Catholique de Louvain, 2Gynecology Department, Cliniques Universitaires Saint-Luc

Summary

В данной статье мы опишем протокол разработки модели ксенотрансплантации хориоаллантоисной мембраны (CAM) цыпленка для ткани яичников человека и продемонстрируем эффективность метода, сроки реваскуляризации трансплантата и жизнеспособность ткани в течение 6-дневного периода трансплантации.

Abstract

Криоконсервация и трансплантация ткани яичника является эффективной стратегией для сохранения фертильности, но имеет один существенный недостаток, а именно массивную потерю фолликулов, происходящую вскоре после реимплантации из-за аномальной активации и гибели фолликула. Грызуны являются эталонными моделями для исследования активации фолликулов, но стоимость, время и этические соображения становятся все более непомерно высокими, что стимулирует разработку альтернатив. Модель хориоаллантоисной мембраны (CAM) цыплят особенно привлекательна, поскольку она недорогая и поддерживает естественный иммунодефицит до 17-го дня после оплодотворения, что делает ее идеальной для изучения краткосрочной ксенотрансплантации ткани яичников человека. CAM также сильно васкуляризирован и широко используется в качестве модели для изучения ангиогенеза. Это дает ему заметное преимущество по сравнению с моделями in vitro и позволяет исследовать механизмы, влияющие на ранний процесс потери фолликулов после трансплантации. Протокол, изложенный в настоящем документе, направлен на описание разработки модели ксенотрансплантации CAM для ткани яичников человека с конкретным пониманием эффективности метода, временных рамок реваскуляризации трансплантата и жизнеспособности тканей в течение 6-дневного периода трансплантации.

Introduction

Спрос на сохранение фертильности по онкологическим и доброкачественным показаниям, а также по социальным причинам резко возрос за последние десятилетия. Однако различные методы лечения, используемые для лечения злокачественных и доброкачественных заболеваний, очень токсичны для половых желез и могут привести к ятрогенной преждевременной недостаточности яичников, что в конечном итоге приводит к бесплодию1. Общепринятые методы сохранения фертильности включают криоконсервацию эмбрионов, витрификацию незрелых или зрелых ооцитов и криоконсервацию ткани яичников 2,3,4. Замораживание тканей яичников является единственным доступным вариантом сохранения фертильности у девочек препубертатного возраста или женщин, которым требуется немедленная терапия рака. Восстановление эндокринной функции после трансплантации ткани яичников происходит более чем у 95% пациентов, при этом частота живорождения колеблется от 18% до 42%5,6,7,8,9.

Несмотря на то, что трансплантация замороженно-размороженной ткани яичников оказалась успешной, все еще есть возможности для улучшения. Действительно, поскольку фрагменты коры яичников трансплантируются без сосудистого анастомоза, они переживают период гипоксии, во время которого происходит реваскуляризация трансплантата 10,11,12. В подавляющем большинстве исследований, изучающих трансплантацию ткани яичников человека, использовалась модель ксенотрансплантации, при которой ткань яичника трансплантируется мышам с иммунодефицитом. Полная реваскуляризация ксенотрансплантатов занимает около 10 дней, при этом сосуды хозяина и трансплантата способствуют формированию функциональных сосудов 12,13,14. Около 50%-90% фолликулярного резерва теряется в течение этого гипоксического окна до завершения реваскуляризации трансплантата 10,15,16. Было высказано предположение, что эта массивная потеря фолликулов происходит как за счет прямой гибели фолликулов, о чем свидетельствует уменьшение абсолютного числа фолликулов, оставшихся после трансплантации, так и за активацию роста примордиального фолликула, на что указывают изменения в пропорциях фолликулов в сторону увеличения скорости роста фолликулов17,18.

Интересно, что в предыдущих исследованиях с использованием различных тканей яичников животных, привитых к хориоаллантоисной мембране цыплят (CAM), конституция которой имитирует типичное место пересадки брюшины, сообщалось об ингибировании спонтанной активации фолликула, при этом первичный резерв фолликула остается нетронутым до 10 дней 19,20,21,22. Наша команда ранее продемонстрировала, что трансплантация замороженно-размороженной ткани яичников человека в CAM представляет собой надежный подход к исследованию трансплантации ткани яичников человека на ее первых ишемических стадиях23, и недавно показала, что этот метод трансплантации способен противодействовать активации фолликулов24.

Модель CAM особенно привлекательна не только потому, что яйцеклетки намного дешевле, чем у мышей, но и из-за высокой васкуляризированной природы CAM, что позволяет тщательно изучить связь между активацией фолликулов и реваскуляризацией трансплантата яичников. Птичья система, действительно, является одним из наиболее распространенных и разносторонних способов изучения ангиогенеза25. Развитие эмбриона цыпленка (ЭД) занимает 21 день до вылупления, а КАМ формируется в течение первых 4-5 дней путем слияния аллантоиса и хориона26. Примечательно, что эмбрион цыпленка является естественным иммунодефицитным хозяином до 17-го дня ЭД, поэтому эксперименты по ксенотрансплантации можно проводить без какого-либо риска отторжения трансплантата27,28. Более того, модельный подход CAM не вызывает каких-либо этических или юридических проблем с точки зрения европейского законодательства29, что делает его привлекательной альтернативой другим моделям на животных. Что касается условий разведения, то эмбрионы цыплят нуждаются только в инкубаторе, установленном при температуре 37 °C и относительной влажности воздуха 40%-60%. Эти ограниченные требования к экспериментам значительно снижают затраты на исследования по сравнению с использованием мышей с иммунодефицитом.

Протокол, представленный в настоящем документе, направлен на описание разработки модели ксенотрансплантации CAM для ткани яичников человека и дает конкретное представление об эффективности метода, временных рамках реваскуляризации трансплантата и жизнеспособности тканей в течение 6-дневного периода трансплантации. Этот протокол может представлять большой интерес для изучения механизмов ранней потери фолликулов после трансплантации и изучения влияния нескольких агентов (факторов роста, гормонов и т.д.) на это явление.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Использование человеческих тканей было одобрено Институциональным наблюдательным советом Католического университета Лувена. Пациентки дали письменное информированное согласие на использование тканей яичников в исследовательских целях.

1. Заказ яйцеклеток 0-го дня, которые с высокой вероятностью будут эмбриональными

  1. Найдите сертифицированного поставщика белых яиц породы Леггорн, отобранного Ломаном, который сообщает о высоком уровне эмбриональных яиц, что в первую очередь зависит от возраста цыплят.

2. Подготовка яиц к инкубации

  1. До прибытия яиц соберите и уравновесите инкубатор для яиц до 37 °C при относительной влажности воздуха 40%-60%. Следите за температурой и влажностью воздуха, вставив в инкубатор термометр и гигрометр. Убедитесь, что крышка инкубатора оснащена стеклянным окном, позволяющим проверять внутренние параметры инкубатора, не открывая его (Рисунок 1).
  2. Получив яйца 0-го дня от отобранных Ломаном цыплят породы белый леггорн от сертифицированного поставщика яиц лабораторного качества, очистите поверхность скорлупы увлажненной бумагой и немедленно высушите их.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку мембрана яичной скорлупы пористая, для очистки поверхностей яиц и контроля влажности внутри инкубатора можно использовать автоклавную воду, чтобы свести к минимуму риск загрязнения.
  3. Пометьте яйца маркером (например, дату и номер яйца).
  4. Инкубируйте яйца заостренным концом вниз и поворачивайте их, чтобы позволить CAM развиваться. Вручную поворачивайте яйца на 180° два-три раза в день или используйте автоматический ротатор.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы убедиться, что яйца действительно вращаются, скорлупа яйца может быть помечена буквами «X» и «O» на двух противоположных боковых сторонах с помощью карандаша или маркера. Стеклянное окошко в крышке инкубатора позволяет проверить вращение яиц, не открывая устройство.

3. Вскрытие яичной скорлупы на 3-й день ЭД

ПРИМЕЧАНИЕ: На 3-й день ЭД в яичной скорлупе делается прямоугольное окошко.

  1. Подготовьте ламинарный вытяжной шкаф для работы в стерильных условиях. Поместите следующие инструменты под колпак и продезинфицируйте их в 70% этаноле (если они еще не стерилизована):
    -Стойка для яиц
    -Яичная свеча или фокусный источник холодного света
    -Маркер
    -Стерильный прямой штифт
    -Стерильная игла 19 G
    -5 мл стерильный шприц
    -Пильный диск со спиральной спиралью
    -Стерильные щипцы
    -Скотч
  2. Переложите одно яйцо из инкубатора на решетку для яиц, расположенную под колпаком, и выключите ротатор яиц.
  3. В темноте определите воздушный карман яйца, приложив яичный свечник (или очаговый источник холодного света) к яичной скорлупе. Воздушный карман локализуется на тупом конце яйца. Используйте маркер, чтобы точно определить центр воздушного кармана на яичной скорлупе.
  4. Включите свет. Сделайте небольшое отверстие в яичной скорлупе, где оно отмечается, аккуратно вращая стерильную прямую булавку. Обычно достаточно крошечного отверстия диаметром около 1 мм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не протолкнуть булавку до упора в яйцо. Если это произошло, выбросьте яйцо.
  5. Подсоедините стерильную иглу 19 G к стерильному шприцу объемом 5 мл.
  6. В темноте найдите желточный мешок с помощью яичной свечи (или очагового источника холодного света) и проколите яйцо через отверстие, сделанное на шаге 3.4, стерильной иглой 19 G, расположенной под углом 45° ко дну яйца; Будьте очень осторожны, чтобы не нарушить желточный мешок. Отсосите 1,5-2 мл белка, чтобы отделить CAM от оболочки, а затем закройте отверстие куском клейкой ленты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если желточный мешок поврежден во время аспирации, отсасываемая жидкость в шприце будет желтого цвета, а не прозрачной (белок). Если это произошло, замените иглу и шприц. Если всасывается относительно большое количество яичного желтка, это может поставить под угрозу жизнеспособность эмбриона.
  7. Включите свет. Положите яйцо горизонтально, а маркером нарисуйте маркером прямоугольное окошко размером 1 см х 1,5 см. Не делайте окно больше обычной ширины стандартной клейкой ленты.
  8. Подержите яйцо в одной руке, и аккуратно пропилите ранее нарисованное окошко в яичной скорлупе с помощью пильного диска. Следите за тем, чтобы оболочка не трескалась и не разрезалась до вдавленного CAM. Регулярно дуйте, чтобы удалить пыль и мусор из скорлупы.
  9. Просуньте стерильные щипцы под прямоугольный кусок пиленой оболочки и ловко возьмитесь за него, чтобы аккуратно снять, не повредив CAM. Кроме того, откажитесь от белой мембраны внешней оболочки, чтобы иметь возможность видеть эмбрион и его CAM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если на CAM попадет пыль или мусор из яичной скорлупы, их можно удалить стерильными щипцами, соблюдая осторожность, чтобы не порвать CAM.
  10. Идентификация жизнеспособных эмбриональных яйцеклеток. Их можно различить по прозрачному белку и сосудистому кольцу вокруг эмбриона, где иногда можно обнаружить бьющееся сердце даже на этой стадии (3-й день ЭД). Отбракуйте неоплодотворенные или мертвые эмбрионы.
  11. Наклейте скотч на только что созданное окно, чтобы избежать обезвоживания. Обязательно загните один конец на себя для удобства снятия.
  12. Поместите яйцо обратно в инкубатор открытым окошком вверх и лентой не касаясь CAM. Используйте сложенный лист бумаги или часть решетки для яиц, чтобы яйцо не скатывалось. Убедитесь, что вращающийся лоток выключен.
  13. Повторите шаги 3.2-3.12, чтобы открыть оставшиеся яйца.

4. Пересадка замороженно-размороженной ткани яичника человека в КАМ

ПРИМЕЧАНИЕ: Трансплантация в КАМ в идеале должна быть начата между 7-10 днями ЭД.

  1. Разморозьте криоконсервированные полоски кортикальной коры яичников под ламинарным колпаком в соответствии с протоколом, описанным в другом месте30.
  2. Разрежьте кортикальные полоски на три фрагмента размером 4 мм х 2 мм х 1 мм. Используйте один кусочек в качестве непривитого контроля, а два других для ксенотрансплантации в течение 1 дня или 6 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если имеется достаточное количество ткани, работайте в двух экземплярах.
  3. Переложите одно яйцо из инкубатора на стойку для яиц, расположенную под колпаком, окном вверх.
  4. Снимите ленту с окна и убедитесь, что эмбрион жизнеспособен. На этой стадии жизнеспособные эмбрионы имеют обширную сосудистую сеть, прозрачный белок, видимое сердцебиение и некоторое движение эмбриона.
  5. Подготовьте место пересадки, осторожно травмировав небольшой участок КАМ, положив полоску стерильной линзовой бумаги, экстрагированной эфиром, на поверхность эпителия и немедленно удалив ее.
    ПРИМЕЧАНИЕ: CAM является непроницаемым барьером, если мембрана не была травмирована удалением верхней перидермальной части двойного эпителиального слоя, оставив базальный слой нетронутым. Эта методика также усиливает процесс реваскуляризации, активизируя заживление ран. Если стерильная бумага для линз, извлеченная из эфира, остается на CAM-приемнике слишком долго, мембрана может прилипнуть к бумаге и порваться. Если это произошло, выбросьте яйцо.
  6. Возьмите одну замороженно-размороженную полоску коры яичника (4 мм x 2 мм x 1 мм) микрохирургическими щипцами и поместите ее на травмированный КАМ медуллярной стороной к CAM. Трансплантат по одному кусочку ткани на яйцо.
  7. Закройте окно скотчем, и аккуратно верните яйцо в инкубатор. Убедитесь, что отверстие скорлупы находится вертикально и яйцо надежно закреплено.
  8. Повторите шаги 4.1-4.7 для пересадки всех оставшихся тканей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Имплантаты следует проверять каждый день трансплантации, чтобы оценить жизнеспособность эмбриона и отслеживать изменения в сосудистой системе.

5. Забор графтов

ПРИМЕЧАНИЕ: Ксенотрансплантаты должны быть собраны не позднее 17-го дня ЭД, так как иммунная система эмбриона становится зрелой и компетентной с 18-го дня.

  1. Поместите яйцо на решетку и увеличьте окно в скорлупе, чтобы обеспечить лучшую визуализацию трансплантата и облегчить манипуляции.
  2. Оцените трансплантат макроскопически и обратите особое внимание на сосудистую реакцию КАМ на трансплантат. Делайте цифровые фотографии или видео для записи.
  3. Захватите ткань или окружающую CAM-ткань щипцами и с помощью ножниц или скальпеля осторожно иссеките трансплантат из CAM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трансплантаты покрываются вторым слоем CAM примерно на 3-й день после прививки и в конечном итоге инкапсулируются. Они также могли переместиться внутрь яйца к 6-му дню, что в некоторых случаях затрудняет их извлечение.
  4. Анализируйте иссеченные ткани любым методом, подходящим для данного эксперимента. В настоящем исследовании кусочки ткани фиксировали в параформальдегиде, погружали в парафин и окрашивали гематоксилином и эозином в соответствии с этапами, описанными ниже:
    1. Зафиксируйте фрагменты в 4%-ном параформальдегиде на 24 ч и заделайте их в парафин с помощью автоматического устройства для заделки, выполнив действия, указанные в таблице 1.
    2. Оставьте залитые парафином блоки на ночь при температуре 4°C, а затем нарежьте их микротомом на срезы толщиной 5 мкм.
    3. Разложите срезы тканей на предметном стекле, помещенном на горячую плиту (30 °C), и оставьте их сохнуть на 2 часа, а затем на 24 часа в духовке при 37 °C.
    4. После этого окрасьте предметные стекла гематоксилином и эозином в соответствии с протоколом, описанным в другом месте31. Затем оцифруйте образцы с помощью сканера слайдов и проанализируйте их с помощью программного обеспечения для анализа изображений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Выживаемость цыплятых эмбрионов
Выживаемость эмбрионов от окна (3-й день ЭД) до трансплантации ткани яичника (7-й день ЭД) составила 79% (33/42). Поскольку процент эмбриональных яиц 0-го дня неизвестен, были заказаны дополнительные яйца 0-го дня от отобранных Ломаном белых кур породы Леггорн, чтобы обеспечить достаточное количество эмбриональных яиц для прививки. В общей сложности для трансплантации было использовано 23 жизнеспособных яйцеклетки на 7-й день, одна из которых погибла в течение первых 24 ч, в результате чего общая выживаемость эмбрионов после трансплантации составила 96% (22/23).

Макроскопический вид трансплантатов
Через 1 день после трансплантации трансплантаты выглядели жизнеспособными в 100% (10 из 10) случаев и уже, по крайней мере, частично прилегали к CAM, демонстрируя спицевый рисунок кровеносных сосудов, необходимых для их васкуляризации (рис. 2A, B). Через 6 дней после пересадки все имплантаты все еще были прикреплены (рис. 2C), за исключением двух, которые не прикреплялись к CAM. Они приобрели некротический вид и были исключены из дальнейшего анализа (рис. 3), в результате чего выживаемость трансплантированных тканей составила 83% (10/12) через 6 дней. В целом, оценка жизнеспособности протезов яичников человека показала общую выживаемость тканей 91% (20/22) независимо от дня приживления (табл. 2).

Примерно на 3-й день после трансплантации было обнаружено, что трансплантаты были покрыты вторым слоем CAM, и они в конечном итоге инкапсулировались, что привело к еще лучшей васкуляризации трансплантата (Рисунок 2C). В целом, 80% трансплантатов также проникли в яйцеклетку (рис. 2D), что в некоторых случаях затрудняло их извлечение на 6-й день.

Микроскопическая оценка трансплантатов
В общей сложности 30 замороженно-размороженных фрагментов яичников человека, полученных от пяти разных пациенток, были проанализированы и зафиксированы в 4% параформальдегиде на 0-й, 1-й или 6-й день трансплантации, погружены в парафин и последовательно разрезаны на срезы по 5 мкм для гистологической оценки (рис. 4).

Для оценки выживаемости фолликулов яичников фолликулы подсчитывали в 12 случайных срезах, окрашенных гематоксилином и эозином, в каждый момент времени и на одну пациентку. Для анализа принимали во внимание только морфологически нормальные фолликулы с видимым ооцитом32. Здоровые фолликулы наблюдались во все моменты времени (рис. 4B-D). Выживаемость фолликулов рассчитывали путем определения остаточной плотности фолликулов (количество фолликулов/мм3) после пересадки и нормализации ее до плотности фолликулов в контрольной группе без трансплантата (считают 100%). Плотность фолликулов после трансплантации имела тенденцию к снижению, но не настолько, чтобы достичь статистической значимости (р > 0,8) (табл. 2). Аналогичным образом, показатели выживаемости фолликулов сохранялись в течение периода трансплантации, составляя 95% ± 19% в 1-й день и 83% ± 27% в 6-й день (p > 0,5).

Процесс реваскуляризации был дополнительно исследован путем обнаружения эритроцитов птиц в сосудах из ксенотрансплантированной ткани яичника. Эритроциты птиц легко различимы, так как они имеют ядро (рис. 4A,C,D). Удивительно, но мы смогли наблюдать птичьи эритроциты в сосудах яичников в 30% имплантатов уже через 1 день после трансплантации и во всех имплантатах к 6-му дню, демонстрируя очень быструю реваскуляризацию (табл. 2).

Figure 1
Рисунок 1: Инкубатор для яиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Макроскопический аспект жизнеспособных имплантатов. (А) День прививки 0. (B) Имплантаты на 1-й день, при этом КАМ показывает спицевый узор кровеносных сосудов по направлению к ткани яичника. (C) Имплантаты, инкапсулированные CAM на 6-й день, что приводит к еще лучшей васкуляризации трансплантата. (D) Трансплантат, проникающий в яйцеклетку. Стрелки указывают на пересаженную ткань яичника. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Макроскопический аспект некротических имплантатов. (А) Здоровая ткань яичника на 0-й день после трансплантации. (B) Некротический аспект имплантата через 6 дней. Стрелки указывают на ткань яичника. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Микроскопический вид имплантатов. Окрашенные гематоксилином и эозином участки имплантатов, пересаженные на (A,B) 1 день и на (C,D) 6 дней. Наконечники стрелок указывают на птичьи эритроциты, перфузирующие сосуды яичников после (A) 1 дня и (C, D) 6 дней трансплантации. Стрелками показаны здоровые примордиальные фолликулы в имплантатах, привитых на (B) 1 день и (C,D) 6 дней. Масштабная линейка: 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Стремянка Ванны Время
Вторая фиксация 1 ванна с формалином 10% 2 ч
Обезвоживание 7 ванн с метанолом 7x 1 ч
Осветление 3 ванны с толуолом 3x 1 ч
Пропитка 3 жидкие парафиновые ванны (60°C) 15 мин – 30 мин – 30 мин

Таблица 1: Этапы заделки парафина.

Непривитые Черенкование день 1 Черенкование день 6 P-значение
Макроскопический аспект трансплантатов
Выживаемость тканей - 100% (10/10) 83% (10/12) /
Микроскопический вид трансплантатов
Плотность фолликулов (н/мм3) 848 ± 272 817 ± 370 684 ± 236 стр > 0,8
Выживаемость фолликулов 100% 95% ± 19% 83% ± 27% p > 0,5
Птичьи эритроциты, присутствующие в имплантатах 0% (0/10) 30% (3/10) 100% (10/10) /

Таблица 2: Результаты. Статистический анализ проводился с использованием одностороннего метода ANOVA, с последующей коррекцией по методу Сидака. Результаты выражаются в виде среднего значения ± стандартного отклонения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Самая сложная часть протокола, описанного здесь, - это проделывание небольшого отверстия, необходимого для аспирации белка, чтобы отделить CAM от яичной скорлупы перед созданием окна. Слишком сильное давление может привести к чрезмерному проникновению или даже к растрескиванию и разрушению яйцеклетки, что приведет к необратимому повреждению CAM и ее сосудов. Чтобы свести к минимуму ошибки при первоначальных попытках отделить CAM, настоятельно рекомендуется практиковаться в проделывании небольших отверстий в скорлупе неоплодотворенных яиц, купленных в продуктовых магазинах, с помощью прямого штифта. Кроме того, учитывая естественную вариабельность фертильности в разных партиях, а также тот факт, что не все эмбрионы выживают после процедуры, рекомендуется получение дополнительных яйцеклеток от поставщика яйцеклеток. Для достижения оптимальных показателей выживаемости эмбрионов и хорошо развитой CAM, яйца необходимо инкубировать в идеальных условиях. В случае низкой жизнеспособности могут быть виноваты разные аспекты, требующие изучения. Следует связаться с поставщиком яйцеклеток, так как жизнеспособность эмбрионов от поставщика может быть просто ниже на данный момент времени. Низкая жизнеспособность яиц также может быть связана с неточными или неподходящими настройками инкубатора, которые могут поставить под угрозу разработку CAM. Использование независимого гигрометра и термометра может обеспечить точность и стабильность настроек, но подробные инструкции по устранению неполадок должны быть предоставлены производителем. Наконец, было также высказано предположение, что слишком частая проверка трансплантированных яйцеклеток может привести к колебаниям температуры и влажности, что может иметь пагубные последствия для трансплантированныхэмбрионов.

В настоящем протоколе окно яичной скорлупы проводили на 3-й день ЭД путем аспирации около 2 мл белка из эмбриона для отделения КАМ от скорлупы, что, в свою очередь, позволило создать окно без повреждения КАМ. Выживаемость эмбрионов через 4 дня составила 79%, что соответствует предыдущим исследованиям34,35. Сообщалось и о других методах, с разной степенью успеха. Одной из альтернатив является извлечение CAM из оболочки путем присасывания к воздушному мешку, как правило, примерно на 7-10 день ЭД. Этот метод не требует прокола яйцеклетки33,36. Исследований, сообщающих о выживаемости эмбрионов с использованием последнего метода, в литературе немного, при этом одна группа сообщила о выживаемости эмбрионовдо 90%. Другим вариантом, который следует рассмотреть, является культивирование эмбрионов цыплят без скорлупы, также известное как культура ex ovo. Удаление яичной скорлупы обеспечивает неограниченный доступ к эмбриону, тем самым облегчая манипуляции с эмбрионами и хирургическое вмешательство, а также позволяя использовать методы визуализации с высоким разрешением для экспериментов в реальных условиях, такие как флуоресцентная микроскопия и микрокомпьютерная топография37,38. Для проведения культивирования ex ovo эмбрион, включая его внеэмбриональные оболочки, переносится в специальную культуральную изоляцию между 2-м и 4-м днем ЭД. Тем не менее, этот метод является очень инвазивным, эмбрионы обычно умирают около 12-го дня, и менее 18% из них доживают до 15-го дня38,39.

Во время экспериментов по ксенотрансплантации, описанных в этой статье, имплантаты яичников человека были пересажены на CAM, которые были мягко травмированы, путем наложения небольшой полоски стерильной бумаги для линз, извлеченной из эфира, на поверхность эпителия и ее немедленного удаления. В целом, показатели выживаемости эмбрионов были отличными и достигали 96% в период трансплантации, что согласуется с предыдущими исследованиями по трансплантации фрагментов ткани яичников в КАМ23,40. Кроме того, было показано, что этот подход увеличивает скорость адгезии трансплантата и улучшает последующее установление неоваскуляризации, при этом ангиогенез, вероятно, индуцируется начальным процессом заживления раны23. Действительно, было обнаружено, что ксенотрансплантация ткани яичников крысы в грануляционную ткань для заживления ран мышей улучшает васкуляризацию трансплантата41. Аналогичным образом, у первого живорождения, зарегистрированного после ортотопической трансплантации криоконсервированной ткани яичников человека, Donnez et al. создали перитонеальное окно и коагулировали его края за 7 дней до имплантации, чтобы стимулировать ангиогенез и неоваскуляризацию в месте трансплантации42.

Что касается гистологической оценки трансплантированной ткани яичников человека, показатели выживаемости фолликулов были обнадеживающими: более 80% фолликулов оставались нетронутыми после 6 дней трансплантации. Интересно, что показатели выживаемости фолликулов, о которых сообщается в литературе, после трансплантации замороженно-размороженной ткани яичников человека в брюшину мышей с иммунодефицитом составляют всего около 30%10,14,18,43,44, что намного ниже, чем в настоящем исследовании. Наши выводы об улучшении выживаемости фолликулов после трансплантации ткани яичников человека в КАМ подтверждают наши недавно опубликованные данные, в которых мы демонстрируем, что КАМ ингибирует активацию фолликулов и апоптоз24. Более того, кровеносные сосуды птиц смогли проникнуть в имплантаты, о чем свидетельствует наличие птичьих эритроцитов уже через 1 день после трансплантации. В целом, эти результаты показывают, что CAM-подход является подходящей моделью для дальнейшего изучения трансплантации ткани яичников человека, поскольку он поддерживает выживание ткани.

Основным недостатком CAM-модели является ограниченный срок, в течение которого возможно проведение прививки. Действительно, трансплантация может быть выполнена не ранее 7-го дня ЭД, как только КАМ достаточно разовьется, до 17-го дня, до того, как эмбрионы цыплят приобретут иммунокомпетентность и вылупятся. Несмотря на короткую продолжительность трансплантации, CAM-модель по-прежнему является полезным инструментом для изучения трансплантации тканей яичников человека на первых стадиях ишемии. Эту модель также можно использовать для проверки воздействия проангиогенных факторов, защитных антиоксидантов, цитокинов, гормонов, связанных с ростом и репродуктивной функцией, и факторов, контролирующих активацию фолликулов в трансплантированной ткани яичников человека, и все это в экспериментальных условиях, которые можнолегко контролировать.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы благодарят Миру Гринюк, бакалавра, за рецензирование на английском языке статьи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agani hypodermic needle, 19 G Terumo Europe AN*1950R1 19 G needle to aspirate albumen
Terumo syringe, 5 mL concentric Luer lock Terumo Europe SS*05LE1 5-mL sterile syringe
Caseviewer v2.2 3DHISTECH Image analysis software
Diethyl ether Merck Chemicals 603-022-00-4 Sterile ether to traumatize the CAM
Eosin Y aqueous solution 0.5% Merck 1098441000 Staining solution
Formaldehyde 4% aqueous solution buffered (Formalin 10%) VWR 97139010 Formaldehyde used for tissue fixation
Fridge Liebherr 7081260 Fridge at 4 °C used for paraffin-embedding
Heating plate Schott SLK2 Hot plate used to dry the slides
Incubator Thermo Forma Scientific 3111 10365156 Oven used for slide incubation
Leica CLS 150 XE microscope cold light source Leica CLS 150 XE Focal cold light source to candle the eggs
Lens cleaning tissue, grade 541 VWR 111-5003 Tissue to soak in sterile ether to traumatize the CAM
Mayer's hematoxylin MERCK 1092491000 Staining solution
Methanol VWR 20847307 Methanol
Microtome ThermoScientific-MICROM HM325-2 Microtome
Pannoramic P250 Flash III 3DHISTECH / Slide scanner at 20x magnification
Paraformaldehyde  Merck 1,04,00,51,000 Paraffin-embedding solution
Paraplast Plus R Sigma P3683-1KG Paraffin
Petri dish, 60x15 mm, sterile Greiner 628161 Sterile petri dish
Pin holder Fine Science Tools 26016-12 Pin holder
Polyhatch Brinsea CP01F Egg incubator with automatic rotator
Scroll saw blade, 132 mm Sencys / Saw blade to create a window in the eggshell
Stainless steel insert pins Fine Science Tools 26007-02 Straight pin to make a hole in the eggshell
Steril-Helios  Angelantoni Industrie ST-00275400000 Laminar flow hood
Superfrost Plus bords rodés 90° VWR 631-9483 Glass slides 
Tissue-Tek VIP 6Al Sakura 60320417-0711 VID6E3-1 Automatic embedding device
Titanium forceps Fine Science Tools 11602-16 Forceps for eggshell removal and ovarian tissue manipulation
Toluene, pa VWR 28701364 Paraffin-embedding solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue and oocyte cryopreservation prior to iatrogenic premature ovarian insufficiency. Best Practice & Research Clinical Obstetrics & Gynaecology. 81, 119-133 (2022).
  2. Dolmans, M. -M., Hossay, C., Nguyen, T. Y. T., Poirot, C. Fertility preservation: How to preserve ovarian function in children, adolescents and adults. Journal of Clinical Medicine. 10 (22), 5247 (2021).
  3. Donnez, J., Dolmans, M. -M. Fertility preservation in women. New England Journal of Medicine. 377 (17), 1657-1665 (2017).
  4. Donnez, J., Dolmans, M. -M. Fertility preservation in women. Nature Reviews Endocrinology. 9 (12), 735-749 (2013).
  5. Dolmans, M. -M., et al. Transplantation of cryopreserved ovarian tissue in a series of 285 women: a review of five leading European centers. Fertility and Sterility. 115 (5), 1102-1115 (2021).
  6. Shapira, M., Dolmans, M. -M., Silber, S., Meirow, D. Evaluation of ovarian tissue transplantation: results from three clinical centers. Fertility and Sterility. 114 (2), 388-397 (2020).
  7. Jensen, A. K., et al. Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark. Human Reproduction. 30 (12), 2838-2845 (2015).
  8. Vander Ven, H., et al. Ninety-five orthotopic transplantations in 74 women of ovarian tissue after cytotoxic treatment in a fertility preservation network: Tissue activity, pregnancy and delivery rates. Human Reproduction. 31 (9), 2031-2041 (2016).
  9. Diaz-Garcia, C., et al. Oocyte vitrification versus ovarian cortex transplantation in fertility preservation for adult women undergoing gonadotoxic treatments: A prospective cohort study. Fertility and Sterility. 109 (3), 478-485 (2018).
  10. Nisolle, M., Casanas-Roux, F., Qu, J., Motta, P., Donnez, J. Histologic and ultrastructural evaluation of fresh and frozen-thawed human ovarian xenografts in nude mice. Fertility and Sterility. 74 (1), 122-129 (2000).
  11. Van Eyck, A. -S., et al. Electron paramagnetic resonance as a tool to evaluate human ovarian tissue reoxygenation after xenografting. Fertility and Sterility. 92 (1), 374-381 (2009).
  12. Van Eyck, A. -S., et al. Both host and graft vessels contribute to revascularization of xenografted human ovarian tissue in a murine model. Fertility and Sterility. 93 (5), 1676-1685 (2010).
  13. Hossay, C., et al. Can frozen-thawed human ovary withstand refreezing-rethawing in the form of cortical strips. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (12), 3077-3087 (2020).
  14. Manavella, D. D., et al. Two-step transplantation with adipose tissue-derived stem cells increases follicle survival by enhancing vascularization in xenografted frozen-thawed human ovarian tissue. Human Reproduction. 33 (6), 1107-1116 (2018).
  15. Rahimi, G., et al. Re-vascularisation in human ovarian tissue after conventional freezing or vitrification and xenotransplantation. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 149 (1), 63-67 (2010).
  16. Cacciottola, L., Manavella, D. D., Amorim, C. A., Donnez, J., Dolmans, M. -M. In vivo characterization of metabolic activity and oxidative stress in grafted human ovarian tissue using microdialysis. Fertility and Sterility. 110 (3), 534-544 (2018).
  17. Gavish, Z., et al. Follicle activation is a significant and immediate cause of follicle loss after ovarian tissue transplantation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 35 (1), 61-69 (2018).
  18. Masciangelo, R., Hossay, C., Donnez, J., Dolmans, M. -M. Does the Akt pathway play a role in follicle activation after grafting of human ovarian tissue. Reproductive BioMedicine Online. 39 (2), 196-198 (2019).
  19. Fortune, J. E., Cushman, R. A., Wahl, C. M., Kito, S. The primordial to primary follicle transition. Molecular and Cellular Endocrinology. (1-2), 53-60 (2000).
  20. Cushman, R. A. Bovine ovarian cortical pieces grafted to chick embryonic membranes: A model for studies on the activation of primordial follicles. Human Reproduction. 17 (1), 48-54 (2002).
  21. Gigli, I., Cushman, R. A., Wahl, C. M., Fortune, J. E. Evidence for a role for anti-Müllerian hormone in the suppression of follicle activation in mouse ovaries and bovine ovarian cortex grafted beneath the chick chorioallantoic membrane. Molecular Reproduction and Development. 71 (4), 480-488 (2005).
  22. Qureshi, A. I., et al. Testosterone selectively increases primary follicles in ovarian cortex grafted onto embryonic chick membranes: relevance to polycystic ovaries. Reproduction. 136 (2), 187-194 (2008).
  23. Martinez-Madrid, B., et al. Chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) model: A useful tool to study short-term transplantation of cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 91 (1), 285-292 (2009).
  24. Hossay, C., et al. Follicle outcomes in human ovarian tissue: Effect of freezing, culture, and grafting. Fertility and Sterility. 119 (1), 135-145 (2023).
  25. Ribatti, D. The Chick Embryo Chorioallantoic Membrane in the Study of Angiogenesis and Metastasis. , Springer. Dordrecht, the Netherlands. (2010).
  26. Pawlikowska, P., et al. Exploitation of the chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) as a platform for anti-metastatic drug testing. Scientific Reports. 10 (1), 16876 (2020).
  27. Davison, T. F. The immunologists' debt to the chicken. British Poultry Science. 44 (1), 6-21 (2003).
  28. Schilling, M. A., et al. Transcriptional innate immune response of the developing chicken embryo to Newcastle disease virus infection. Frontiers in Genetics. 9, 61 (2018).
  29. Directives originating from the EU. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes (Text with EEA relevance). The National Archives. , Available from: https://www.legislation.gov.uk/eudr/2010/63/contents (2010).
  30. Dolmans, M. -M., et al. A review of 15 years of ovarian tissue bank activities. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (3), 305-314 (2013).
  31. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), 4986 (2008).
  32. Anderson, R. A., McLaughlin, M., Wallace, W. H. B., Albertini, D. F., Telfer, E. E. The immature human ovary shows loss of abnormal follicles and increasing follicle developmental competence through childhood and adolescence. Human Reproduction. 29 (1), 97-106 (2014).
  33. Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the chicken chorioallantoic membrane in vivo model to study gynecological and urological cancers. Journal of Visualized Experiments. (155), e60651 (2020).
  34. Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13 (8), 9959-9970 (2012).
  35. Sys, G. M. L., et al. The In ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. Journal of Visualized Experiments. (77), e50522 (2013).
  36. Li, M., et al. The in ovo chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an efficient xenograft model of hepatocellular carcinoma. Journal of Visualized Experiments. (104), e52411 (2015).
  37. Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
  38. Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications. Journal of Visualized Experiments. (44), e2154 (2010).
  39. Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts. Stem Cells International. 2013, 960958 (2013).
  40. Beck, K., Singh, J., Dar, M. A., Anzar, M. Short-term culture of adult bovine ovarian tissues: chorioallantoic membrane (CAM) vs. traditional in vitro culture systems. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 21 (2018).
  41. Israely, T., Nevo, N., Harmelin, A., Neeman, M., Tsafriri, A. Reducing ischaemic damage in rodent ovarian xenografts transplanted into granulation tissue. Human Reproduction. 21 (6), 1368-1379 (2006).
  42. Donnez, J., et al. Livebirth after orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue. The Lancet. 364 (9443), 1405-1410 (2004).
  43. Dolmans, M. -M., et al. Short-term transplantation of isolated human ovarian follicles and cortical tissue into nude mice. Reproduction. 134 (2), 253-262 (2007).
  44. Baird, D. T., Webb, R., Campbell, B. K., Harkness, L. M., Gosden, R. G. Long-term ovarian function in sheep after ovariectomy and transplantation of autografts stored at −196 C. Endocrinology. 140 (1), 462-471 (1999).
  45. Ribatti, D., Vacca, A., Roncali, L., Dammacco, F. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for in vivo research on anti-angiogenesis. Current Pharmaceutical Biotechnology. 1 (1), 73-82 (2000).

Tags

Биология выпуск 196 Активация фолликулов Потеря фолликулов Криоконсервация Трансплантация Модели грызунов Альтернативы Экономичность Экономия времени Этические соображения Ксенотрансплантация Ткань яичников человека Иммунодефицит Ангиогенез Процесс потери фолликулов после трансплантации Модель ксенотрансплантации CAM Сроки реваскуляризации Жизнеспособность тканей
Модель хориоаллантоисной мембраны (CAM) цыплят как инструмент для изучения трансплантации ткани яичника
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hossay, C., Cacciottola, L.,… More

Hossay, C., Cacciottola, L., Storder, S., Van Kerk, O., Dolmans, M. M. The Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Model as a Tool to Study Ovarian Tissue Transplantation. J. Vis. Exp. (196), e64867, doi:10.3791/64867 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter