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Biology

Il modello di membrana corioallantoica del pulcino (CAM) come strumento per lo studio del trapianto di tessuto ovarico

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/64867
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Gynecology Research Unit, Institut de Recherche Expérimentale et Clinique, Université Catholique de Louvain, 2Gynecology Department, Cliniques Universitaires Saint-Luc

Summary

Qui, descriviamo un protocollo per lo sviluppo di un modello di xenotrapianto di membrana corioallantoica (CAM) di pulcino per il tessuto ovarico umano e dimostriamo l'efficacia della tecnica, il tempo di rivascolarizzazione dell'innesto e la vitalità del tessuto in un periodo di innesto di 6 giorni.

Abstract

La crioconservazione e il trapianto di tessuto ovarico sono una strategia efficace per preservare la fertilità, ma presentano un grave svantaggio, vale a dire la massiccia perdita di follicoli che si verifica poco dopo il reimpianto a causa dell'attivazione anomala del follicolo e della morte. I roditori sono modelli di riferimento per studiare l'attivazione dei follicoli, ma i costi, i tempi e le considerazioni etiche stanno diventando sempre più proibitivi, guidando così lo sviluppo di alternative. Il modello di membrana corioallantoica (CAM) del pulcino è particolarmente interessante, essendo poco costoso e mantenendo l'immunodeficienza naturale fino al giorno 17 dopo la fecondazione, rendendolo ideale per studiare lo xenotrapianto a breve termine di tessuto ovarico umano. La CAM è anche altamente vascolarizzata ed è stata ampiamente utilizzata come modello per esplorare l'angiogenesi. Ciò gli conferisce un notevole vantaggio rispetto ai modelli in vitro e consente di studiare i meccanismi che influenzano il processo di perdita follicolare post-trapianto precoce. Il protocollo qui delineato mira a descrivere lo sviluppo di un modello di xenotrapianto CAM per il tessuto ovarico umano, con approfondimenti specifici sull'efficacia della tecnica, sui tempi di rivascolarizzazione dell'innesto e sulla vitalità tissutale in un periodo di innesto di 6 giorni.

Introduction

La domanda di preservazione della fertilità per indicazioni oncologiche e benigne, oltre che per motivi sociali, è aumentata notevolmente negli ultimi decenni. Tuttavia, vari trattamenti utilizzati per curare malattie maligne e non maligne sono altamente tossici per le gonadi e possono provocare insufficienza ovarica precoce iatrogena, portando infine all'infertilità1. Le tecniche consolidate per la preservazione della fertilità includono la crioconservazione degli embrioni, la vitrificazione di ovociti immaturi o maturi e la crioconservazione del tessuto ovarico 2,3,4. Il congelamento del tessuto ovarico è l'unica opzione disponibile per preservare la fertilità nelle ragazze in età prepuberale o nelle donne che richiedono una terapia oncologica immediata. Il ripristino della funzione endocrina a seguito di trapianto di tessuto ovarico si verifica in oltre il 95% dei soggetti, con tassi di natalità che vanno dal 18% al 42%5,6,7,8,9.

Sebbene il trapianto di tessuto ovarico congelato-scongelato si sia dimostrato efficace, c'è ancora spazio per miglioramenti. Infatti, quando i frammenti corticali ovarici vengono trapiantati senza anastomosi vascolare, sperimentano un periodo di ipossia durante il quale avviene la rivascolarizzazione dell'innesto 10,11,12. La stragrande maggioranza degli studi che indagano sul trapianto di tessuto ovarico umano hanno utilizzato un modello di xenotrapianto, in cui il tessuto ovarico viene trapiantato su topi immunodeficienti. La rivascolarizzazione completa degli xenotrapianti richiede circa 10 giorni, con sia l'ospite che i vasi dell'innesto che contribuiscono alla formazione di vasi funzionali 12,13,14. Circa il 50%-90% della riserva follicolare viene persa durante questa finestra ipossica prima del completamento della rivascolarizzazione dell'innesto 10,15,16. È stato fortemente suggerito che questa massiccia perdita di follicoli si verifichi sia attraverso la morte diretta del follicolo, come dimostrato da una diminuzione del numero assoluto di follicoli rimasti dopo l'innesto, sia attraverso l'attivazione della crescita del follicolo primordiale, come indicato dai cambiamenti nelle proporzioni del follicolo verso l'aumento dei tassi di follicoli in crescita17,18.

È interessante notare che precedenti lavori di ricerca che utilizzano vari tessuti ovarici animali innestati sulla membrana corioallantoica del pulcino (CAM), che ha una costituzione che imita il tipico sito di innesto del peritoneo, hanno riportato l'inibizione dell'attivazione spontanea del follicolo, con la riserva follicolare primordiale che rimane intatta fino a 10 giorni 19,20,21,22. Il nostro team ha precedentemente dimostrato che l'innesto di tessuto ovarico umano congelato-scongelato alla CAM costituiva un approccio affidabile per studiare il trapianto di tessuto ovarico umano nei suoi primi stadi ischemici23 e recentemente ha dimostrato che questo metodo di innesto era in grado di contrastare l'attivazione del follicolo24.

Il modello CAM è particolarmente interessante non solo perché gli ovuli sono molto più economici dei topi, ma anche per la natura altamente vascolarizzata della CAM, che consente di esaminare l'associazione tra l'attivazione del follicolo e la rivascolarizzazione dell'innesto ovarico. Il sistema aviario è, infatti, uno dei modi più comuni e versatili per studiare l'angiogenesi25. Lo sviluppo embrionale del pulcino (DE) richiede 21 giorni fino alla schiusa e la CAM si forma entro i primi 4-5 giorni attraverso la fusione dell'allantoide e del corion26. In particolare, l'embrione di pulcino è un ospite naturalmente immunodeficiente fino al 17° giorno di disfunzione erettile, quindi gli esperimenti di xenotrapianto possono essere eseguiti senza alcun rischio di rigetto del trapianto27,28. Inoltre, l'approccio basato su modelli CAM non solleva preoccupazioni etiche o giuridiche in termini di diritto europeo29, il che lo rende un'alternativa interessante ad altri modelli animali. Per quanto riguarda le condizioni di allevamento, gli embrioni di pulcino necessitano solo di un'incubatrice impostata a 37 °C con un'umidità relativa dell'aria del 40%-60%. Questi requisiti di sperimentazione limitati riducono significativamente i costi di ricerca rispetto all'uso di topi immunodeficienti.

Il protocollo qui presentato ha lo scopo di descrivere lo sviluppo di un modello di xenotrapianto CAM per il tessuto ovarico umano e fornire approfondimenti specifici sull'efficacia della tecnica, sui tempi di rivascolarizzazione dell'innesto e sulla vitalità tissutale per un periodo di innesto di 6 giorni. Questo protocollo potrebbe essere di grande interesse per studiare i meccanismi alla base della perdita precoce di follicoli post-trapianto e studiare l'impatto di diversi agenti (fattori di crescita, ormoni, ecc.) su questo fenomeno.

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Protocol

L'uso di tessuti umani è stato approvato dall'Institutional Review Board dell'Università Cattolica di Lovanio. Le pazienti hanno dato il loro consenso informato scritto per l'uso del loro tessuto ovarico a fini di ricerca.

1. Ordinare ovuli del giorno 0 che hanno un'alta probabilità di essere embrionati

  1. Trova un fornitore certificato di uova bianche livornesi selezionate da Lohman di grado di laboratorio che riporti alti tassi di uova embrionate, che dipendono principalmente dall'età dei pulcini.

2. Preparazione delle uova per l'incubazione

  1. Prima dell'arrivo delle uova, assemblare e bilanciare l'incubatrice a 37 °C con un'umidità relativa dell'aria del 40%-60%. Monitorare la temperatura e l'umidità dell'aria inserendo un termometro e un igrometro nell'incubatrice. Assicurarsi che il coperchio dell'incubatrice sia dotato di una finestra di vetro per consentire il controllo dei parametri interni dell'incubatrice senza doverla aprire (Figura 1).
  2. Dopo aver ricevuto le uova del giorno 0 da pulcini bianchi livornesi selezionati da Lohman da un fornitore di uova certificato di laboratorio, pulire la superficie dei gusci con carta umidificata e asciugarli immediatamente.
    NOTA: Poiché la membrana del guscio d'uovo è porosa, è possibile utilizzare acqua sterilizzata in autoclave per pulire le superfici delle uova e controllare l'umidità all'interno dell'incubatrice al fine di ridurre al minimo i rischi di contaminazione.
  3. Etichettare le uova utilizzando un pennarello (ad es. data e numero di uova).
  4. Incubare le uova con l'estremità appuntita rivolta verso il basso e ruotarle per consentire lo sviluppo della CAM. Ruotare manualmente le uova di 180° due o tre volte al giorno o utilizzare un rotatore automatico.
    NOTA: Per garantire che le uova vengano effettivamente ruotate, il guscio dell'uovo può essere contrassegnato con una "X" e una "O" sui due lati laterali opposti utilizzando una matita o un pennarello. La finestra di vetro nel coperchio dell'incubatrice consente di controllare la rotazione delle uova senza aprire il dispositivo.

3. Aprire il guscio d'uovo il giorno 3 di DE

NOTA: Una finestra rettangolare viene realizzata nel guscio d'uovo il giorno 3 di ED.

  1. Preparare la cappa a flusso laminare per lavorare in condizioni sterili. Posizionare i seguenti strumenti sotto il cofano e disinfettarli con etanolo al 70% (se non già sterilizzati):
    -Portauova
    -Candela a uovo o fonte di luce fredda focale
    -Marcatore
    -Perno dritto sterile
    -Ago sterile da 19 G
    -Siringa sterile da 5 mL
    -Lama per sega a traforo
    -Pinza sterile
    -Nastro adesivo
  2. Trasferisci un uovo dall'incubatrice al portauova posto sotto il cofano e spegni il rotatore delle uova.
  3. Al buio, identifica la sacca d'aria dell'uovo posizionando la candela dell'uovo (o la fonte di luce fredda focale) contro il guscio dell'uovo. La sacca d'aria è localizzata all'estremità smussata dell'uovo. Usa un pennarello per individuare il centro della sacca d'aria sul guscio d'uovo.
  4. Accendi le luci. Fai un piccolo foro nel guscio d'uovo dove viene segnato ruotando delicatamente uno spillo dritto sterile. Di solito è sufficiente una piccola apertura di circa 1 mm di diametro.
    NOTA: Fare attenzione a non spingere lo spillo fino in fondo attraverso l'uovo. Se ciò accade, scarta l'uovo.
  5. Collegare un ago sterile da 19 G a una siringa sterile da 5 ml.
  6. Al buio, individuare il sacco vitellino utilizzando la candela dell'uovo (o una fonte di luce fredda focale) e forare l'uovo attraverso il foro praticato al punto 3.4 con l'ago sterile da 19 G inclinato a 45° verso il fondo dell'uovo; Fare molta attenzione a non rompere il sacco vitellino. Aspirare tra 1,5-2 mL di albume per staccare il CAM dal guscio, quindi chiudere il foro con un pezzo di nastro adesivo.
    NOTA: Se il sacco vitellino viene interrotto durante l'aspirazione, il liquido aspirato nella siringa sarà di colore giallo anziché trasparente (albume). In tal caso, sostituire l'ago e la siringa. Se viene aspirata una quantità relativamente grande di tuorlo d'uovo, può mettere a repentaglio la vitalità dell'embrione.
  7. Accendi le luci. Posiziona l'uovo orizzontalmente e disegna una finestra rettangolare di 1 cm x 1,5 cm con un pennarello. Non ingrandire la finestra rispetto alla larghezza abituale del nastro adesivo standard.
  8. Tieni l'uovo in una mano e sega delicatamente la finestra precedentemente disegnata nel guscio dell'uovo usando una lama per sega a traforo. Assicurarsi che il guscio non si rompa e non tagliare fino al CAM depresso. Soffiare regolarmente per rimuovere polvere e detriti del guscio.
  9. Far scorrere la pinza sterile sotto il pezzo rettangolare del guscio segato e afferrarla abilmente per rimuoverla in modo pulito senza danneggiare il CAM. Inoltre, scartare la membrana esterna bianca per poter vedere l'embrione e la sua CAM.
    NOTA: Se un po' di polvere o detriti di guscio d'uovo cadono sul CAM, è possibile rimuoverlo utilizzando una pinza sterile, facendo molta attenzione a non strappare il CAM.
  10. Identificare gli ovuli embrionati vitali. Sono distinguibili dal loro albume chiaro e dall'anello vascolare intorno all'embrione, dove a volte può essere rilevato un battito cardiaco anche in questa fase (giorno 3 della DE). Scartare gli embrioni non fecondati o morti.
  11. Posiziona del nastro adesivo sulla finestra appena creata per evitare la disidratazione. Assicurati di piegare un'estremità su se stessa per facilitare la rimozione.
  12. Rimetti l'uovo nell'incubatrice con la finestra aperta rivolta verso l'alto e il nastro adesivo che non tocca il CAM. Usa un pezzo di carta piegato o parte della griglia per uova per evitare che l'uovo rotoli. Assicurarsi che il vassoio rotante sia spento.
  13. Ripetere i passaggi 3.2-3.12 per aprire le uova rimanenti.

4. Innesto di tessuto ovarico umano congelato-scongelato nella CAM

NOTA: Il trapianto alla CAM dovrebbe idealmente essere iniziato tra i giorni 7-10 della DE.

  1. Scongelare le strisce corticali ovariche crioconservate sotto la cappa a flusso laminare seguendo il protocollo descritto altrove30.
  2. Tagliare le strisce corticali in tre frammenti di 4 mm x 2 mm x 1 mm. Utilizzare un pezzo come controllo non innestato e gli altri due per lo xenotrapianto per 1 giorno o 6 giorni.
    NOTA: Se è disponibile una quantità sufficiente di tessuto, lavorare in duplicato.
  3. Trasferisci un uovo dall'incubatrice al portauova posizionato sotto il cofano, con la finestra rivolta verso l'alto.
  4. Stacca il nastro adesivo dalla finestra e assicurati che l'embrione sia vitale. In questa fase, gli embrioni vitali sono caratterizzati da un'ampia vascolarizzazione, un albume chiaro, un battito cardiaco visibile e un certo movimento embrionale.
  5. Preparare il sito di innesto traumatizzando delicatamente una piccola area della CAM posando una striscia di 1 cm2 di carta sterile per lenti estratta con etere sulla superficie epiteliale e rimuovendola immediatamente.
    NOTA: La CAM è una barriera impenetrabile a meno che la membrana non sia stata traumatizzata dall'asportazione della parte peridermica superiore del doppio strato epiteliale, lasciando intatto lo strato basale. Questa tecnica migliora anche il processo di rivascolarizzazione attivando la guarigione delle ferite. Se la carta sterile estratta con etere rimane troppo a lungo sulla CAM, la membrana potrebbe aderire alla carta della lente e strapparsi. Se ciò accade, scarta l'uovo.
  6. Afferrare una striscia corticale ovarica congelata e scongelata (4 mm x 2 mm x 1 mm) con una pinza microchirurgica e posizionarla sulla CAM traumatizzata con il lato midollare contro la CAM. Innestare un pezzo di tessuto per ovulo.
  7. Copri la finestra con del nastro adesivo e rimetti con cura l'uovo nell'incubatrice. Assicurati che l'apertura del guscio d'uovo sia in posizione verticale e che l'uovo sia sicuro.
  8. Ripetere i passaggi 4.1-4.7 per l'innesto di tutti i tessuti rimanenti.
    NOTA: Gli impianti devono essere controllati ogni giorno di innesto per valutare la vitalità dell'embrione e monitorare i cambiamenti nel sistema vascolare.

5. Raccolta degli innesti

NOTA: Gli xenotrapianti devono essere prelevati al più tardi entro il 17° giorno di DE, poiché il sistema immunitario dell'embrione diventa maturo e competente a partire dal 18° giorno.

  1. Posiziona l'uovo su una griglia e ingrandisci la finestra nel guscio dell'uovo per consentire una migliore visualizzazione dell'innesto e una più facile manipolazione.
  2. Valutare macroscopicamente l'innesto, e prestare particolare attenzione alla reazione vascolare della CAM nei confronti dell'innesto. Scatta fotografie o video digitali per la registrazione.
  3. Afferrare il tessuto o la CAM circostante con una pinza e utilizzare le forbici o un bisturi per asportare con attenzione l'innesto dalla CAM.
    NOTA: Gli innesti vengono ricoperti da un secondo strato di CAM intorno al 3° giorno dell'innesto e alla fine vengono incapsulati. Potrebbero anche essersi spostati all'interno dell'uovo entro il 6° giorno, rendendo difficile il loro recupero in alcuni casi.
  4. Analizzare i tessuti asportati con qualsiasi metodo appropriato per l'esperimento dato. Nel presente studio, pezzi di tessuto sono stati fissati in paraformaldeide, inclusi in paraffina e colorati con ematossilina ed eosina seguendo i passaggi descritti di seguito:
    1. Fissare i frammenti in paraformaldeide al 4% per 24 ore e incorporarli in paraffina utilizzando un dispositivo di inclusione automatica con i passaggi indicati nella Tabella 1.
    2. Lasciare i blocchi incorporati in paraffina per una notte a 4°C prima di tagliarli in sezioni spesse 5 μm con un microtomo.
    3. Stendere le sezioni di tessuto su un vetrino posto su una piastra calda (30 °C) e lasciarle asciugare per 2 ore, seguite da 24 ore in forno a 37 °C.
    4. Successivamente, colorare i vetrini con ematossilina ed eosina seguendo un protocollo descritto altrove31. Successivamente, digitalizzare i campioni utilizzando uno scanner per vetrini e analizzarli utilizzando un software di analisi delle immagini.

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Representative Results

Tassi di sopravvivenza degli embrioni di pulcino
Il tasso di sopravvivenza dell'embrione dal windowing (giorno 3 di PS) all'innesto di tessuto ovarico (giorno 7 di PS) è stato del 79% (33/42). Poiché la percentuale di uova embrionate al giorno 0 non è nota, sono state ordinate uova soprannumerarie al giorno 0 di galline bianche livornesi selezionate da Lohman per garantire che fosse disponibile un numero sufficiente di uova embrionate per l'innesto. Un totale di 23 ovuli vitali al giorno 7 sono stati utilizzati per l'innesto, uno dei quali è morto durante le prime 24 ore, con un tasso di sopravvivenza embrionale globale del 96% dopo il trapianto (22/23).

Aspetto macroscopico degli innesti
Dopo 1 giorno di innesto, gli innesti sembravano vitali nel 100% (10/10) dei casi ed erano già almeno parzialmente aderenti alla CAM, mostrando un modello a raggi di ruota dei vasi sanguigni necessari per la loro vascolarizzazione (Figura 2A,B). Dopo 6 giorni di innesto, tutti gli impianti erano ancora aderenti (Figura 2C), ad eccezione di due che non si attaccavano al CAM. Hanno assunto un aspetto necrotico e sono stati esclusi da ulteriori analisi (Figura 3), con un tasso di sopravvivenza del tessuto innestato dell'83% (10/12) dopo 6 giorni. Nel complesso, la valutazione della vitalità degli innesti ovarici umani ha rivelato un tasso di sopravvivenza tissutale globale del 91% (20/22), indipendentemente dal giorno dell'innesto (Tabella 2).

Intorno al 3° giorno dopo il trapianto, si è scoperto che gli innesti erano ricoperti da un secondo strato di CAM e alla fine si sono incapsulati, portando a una vascolarizzazione ancora migliore dell'innesto (Figura 2C). Nel complesso, l'80% dei trapianti era penetrato anche nell'ovulo (Figura 2D), in alcuni casi rendendo difficile il recupero al 6° giorno.

Valutazione microscopica degli innesti
Un totale di 30 frammenti ovarici umani congelati-scongelati ottenuti da cinque diverse pazienti sono stati analizzati e fissati in paraformaldeide al 4% il giorno 0, il giorno 1 o il giorno 6 dell'innesto, incorporati in paraffina e tagliati in serie in sezioni da 5 μm per la valutazione istologica (Figura 4).

Al fine di valutare i tassi di sopravvivenza dei follicoli ovarici, i follicoli sono stati contati in 12 sezioni casuali colorate con ematossilina ed eosina per punto temporale e per paziente. Per l'analisi sono stati presi in considerazione solo follicoli morfologicamente normali con un ovocita visibile32. I follicoli sani sono stati osservati in tutti i punti temporali (Figura 4B-D). I tassi di sopravvivenza del follicolo sono stati calcolati determinando la densità follicolare rimanente (numero di follicoli/mm3) dopo l'innesto e normalizzandola alla densità follicolare nei controlli non trapiantati (considerata al 100%). Le densità follicolari tendevano a diminuire dopo il trapianto, ma non abbastanza da raggiungere la significatività statistica (p > 0,8) (Tabella 2). Allo stesso modo, i tassi di sopravvivenza del follicolo sono stati mantenuti durante il periodo di trapianto, attestandosi al 95% ± 19% il giorno 1 e all'83% ± al 27% il giorno 6 (p > 0,5).

Il processo di rivascolarizzazione è stato ulteriormente studiato mediante l'individuazione di globuli rossi aviari nei vasi del tessuto ovarico xenotrapiantato. Gli eritrociti aviari sono facilmente distinguibili poiché sono nucleati (Figura 4A,C,D). Sorprendentemente, siamo stati in grado di osservare eritrociti aviari nei vasi ovarici nel 30% degli impianti dopo solo 1 giorno di trapianto e in tutti gli impianti entro il giorno 6, mostrando una rivascolarizzazione molto rapida (Tabella 2).

Figure 1
Figura 1: Incubatrice per uova. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Aspetto macroscopico degli impianti vitali. (A) Innesto giorno 0. (B) Impianti il giorno 1, con la CAM che mostra un modello a raggi di ruota dei vasi sanguigni verso il tessuto ovarico. (C) Impianti incapsulati mediante CAM il giorno 6, che porta a una vascolarizzazione dell'innesto ancora migliore. (D) Innesto che penetra nell'uovo. Le frecce indicano il tessuto ovarico innestato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Aspetto macroscopico degli impianti necrotici. (A) Tessuto ovarico dall'aspetto sano il giorno 0 dell'innesto. (B) Aspetto necrotico dell'impianto 6 giorni dopo. Le frecce puntano verso il tessuto ovarico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Aspetto microscopico degli impianti. Sezioni di impianti colorati con ematossilina ed eosina innestati per (A,B) 1 giorno e per (C,D) 6 giorni. Le punte di freccia indicano globuli rossi aviari che perfondono i vasi ovarici dopo (A) 1 giorno e (C,D) 6 giorni di innesto. Le frecce indicano follicoli primordiali dall'aspetto sano in impianti innestati per (B) 1 giorno e (C,D) 6 giorni. Barra graduata: 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Passi Bagni Ore
Seconda fissazione 1 bagno di formalina al 10% 2 h
Disidratazione 7 bagni di metanolo 7x 1 h
Chiarimento 3 bagni di toluene 3x 1 h
Impregnazione 3 bagni di paraffina liquida (60°C) 15 min – 30 min – 30 min

Tabella 1: Fasi di inclusione della paraffina.

Non innestato Innesto giorno 1 Innesto giorno 6 Valore P
Aspetto macroscopico degli innesti
Tasso di sopravvivenza tissutale - 100% (10/10) 83% (10/12) /
Aspetto microscopico degli innesti
Densità follicolare (n/mm3) 848 ± 272 817 ± 370 684 ± 236 p > 0,8
Tasso di sopravvivenza del follicolo 100% 95% ± 19% 83% ± 27% p > 0,5
Globuli rossi aviari presenti negli impianti 0% (0/10) 30% (3/10) 100% (10/10) /

Tabella 2: Risultati. Analisi statistica condotta utilizzando ANOVA unidirezionale, seguita da correzione di Sidak. I risultati sono espressi come media ± deviazione standard.

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Discussion

La parte più impegnativa del protocollo qui descritto è fare il piccolo foro necessario per aspirare l'albume al fine di staccare il CAM dal guscio d'uovo prima di creare una finestra. L'applicazione di una pressione eccessiva può provocare una penetrazione eccessiva o addirittura rompere e distruggere l'uovo, causando danni irreversibili alla CAM e alla sua vascolarizzazione. Per ridurre al minimo gli errori durante i tentativi iniziali di separare la CAM, si consiglia vivamente di esercitarsi a praticare piccoli fori nel guscio d'uovo di uova non fecondate e acquistate al supermercato utilizzando uno spillo dritto. Inoltre, data la naturale variabilità della fertilità tra i lotti, insieme al fatto che non tutti gli embrioni sopravvivono alla procedura, si consiglia di ottenere ovuli soprannumerari dal fornitore di ovuli. Per ottenere tassi di sopravvivenza embrionali ottimali e una CAM ben sviluppata, gli ovuli devono essere incubati in condizioni ideali. In caso di scarsa redditività, diversi aspetti possono essere da biasimare e devono essere indagati. Il fornitore di ovuli dovrebbe essere contattato, poiché la vitalità degli embrioni del fornitore potrebbe essere semplicemente inferiore in questo momento. La bassa vitalità delle uova potrebbe anche essere dovuta a impostazioni imprecise o inappropriate dell'incubatrice, che potrebbero compromettere lo sviluppo della CAM. L'uso di un igrometro e di un termometro indipendenti può garantire che le impostazioni siano accurate e stabili, ma il produttore deve fornire istruzioni dettagliate per la risoluzione dei problemi. Infine, è stato anche suggerito che controllare troppo spesso gli ovuli trapiantati può provocare fluttuazioni di temperatura e umidità, che potrebbero avere effetti deleteri sugli embrioni trapiantati33.

Nel presente protocollo, il windowing del guscio d'uovo è stato eseguito il giorno 3 della DE aspirando circa 2 mL di albume dall'embrione per staccare il CAM dal guscio, il che, a sua volta, ha permesso la creazione di una finestra senza danneggiare il CAM. Il tasso di sopravvivenza dell'embrione 4 giorni dopo era del 79%, in linea con gli studi precedenti34,35. Altri metodi sono stati segnalati, con vari gradi di successo. Un'alternativa è quella di staccare il CAM dal guscio applicando l'aspirazione alla sacca d'aria, in genere intorno al 7-10° giorno di DE. Questo metodo non richiede che l'uovo venga forato33,36. Gli studi che riportano i tassi di sopravvivenza degli embrioni utilizzando quest'ultima tecnica sono pochi e lontani tra loro in letteratura, con un team che riporta fino al 90% della sopravvivenza embrionale36. Un'altra opzione da considerare è la coltura embrionale di pulcino senza guscio, nota anche come coltura ex ovo. La rimozione del guscio d'uovo fornisce un accesso illimitato all'embrione, facilitando così la manipolazione e la chirurgia dell'embrione e consentendo anche l'uso di tecniche di imaging ad alta risoluzione per esperimenti dal vivo, come la microscopia a fluorescenza e la topografia microcomputerizzata37,38. Al fine di condurre la coltura ex ovo, l'embrione, comprese le sue membrane extraembrionali, viene trasferito in un contenimento specifico della coltura tra il giorno 2 e il giorno 4 della DE. Tuttavia, questa tecnica è altamente invasiva, con embrioni che di solito muoiono intorno al 12° giorno e meno del 18% di loro sopravvive fino al 15° giorno38,39.

Durante gli esperimenti di xenotrapianto qui riportati, impianti ovarici umani sono stati innestati su CAM che erano stati delicatamente traumatizzati applicando una piccola striscia di carta sterile estratta con etere sulla superficie dell'epitelio e rimuovendola immediatamente. Nel complesso, i tassi di sopravvivenza dell'embrione sono stati eccellenti e hanno raggiunto il 96% durante il periodo di innesto, il che è coerente con gli studi precedenti che prevedevano il trapianto di frammenti di tessuto ovarico in CAM23,40. Inoltre, è stato dimostrato che questo approccio aumenta i tassi di adesione dell'innesto e migliora la successiva instaurazione della neovascolarizzazione, con l'angiogenesi probabilmente indotta dal processo iniziale di guarigione della ferita23. In effetti, è stato riscontrato che lo xenotrapianto di tessuto ovarico di ratto in tessuto di granulazione murino per la guarigione delle ferite migliora la vascolarizzazione dell'innesto41. Allo stesso modo, nel primo parto vivo riportato dopo trapianto ortotopico di tessuto ovarico umano crioconservato, Donnez et al. hanno creato una finestra peritoneale e coagulato i suoi margini 7 giorni prima dell'impianto per stimolare l'angiogenesi e la neovascolarizzazione nel sito di trapianto42.

Per quanto riguarda la valutazione istologica del tessuto ovarico umano trapiantato, i tassi di sopravvivenza dei follicoli sono stati incoraggianti, con oltre l'80% dei follicoli rimasti intatti dopo 6 giorni dall'innesto. È interessante notare che i tassi di sopravvivenza del follicolo riportati in letteratura dopo il trapianto di tessuto ovarico umano congelato-scongelato nel peritoneo di topi immunodeficienti sono solo del 30% circa10,14,18,43,44, che è molto più basso rispetto al presente studio. I nostri risultati di una maggiore sopravvivenza del follicolo dopo l'innesto di tessuto ovarico umano nella CAM corroborano i nostri dati recentemente pubblicati, in cui dimostriamo che la CAM inibisce l'attivazione del follicolo e l'apoptosi24. Inoltre, i vasi sanguigni aviari sono stati in grado di penetrare negli impianti, come dimostrato dalla presenza di eritrociti aviari dopo solo 1 giorno dal trapianto. Nel complesso, questi risultati dimostrano che l'approccio CAM è un modello adatto per esaminare ulteriormente il trapianto di tessuto ovarico umano, poiché supporta la sopravvivenza del tessuto.

Il principale svantaggio del modello CAM è il periodo limitato durante il quale è possibile l'innesto. Infatti, il trapianto può essere eseguito non prima del 7° giorno di DE, non appena la CAM si è sviluppata a sufficienza, fino al 17° giorno, prima che gli embrioni di pulcino acquisiscano l'immunocompetenza e si schiudano. Nonostante la breve durata dell'innesto, il modello CAM è ancora uno strumento utile per studiare il trapianto di tessuto ovarico umano nelle sue prime fasi ischemiche. Si può anche utilizzare questo modello per testare l'impatto di fattori proangiogenici, agenti antiossidanti protettivi, citochine, ormoni correlati alla crescita e alla riproduzione e fattori che controllano l'attivazione del follicolo nel tessuto ovarico umano trapiantato, il tutto in condizioni sperimentali che possono essere facilmente controllate25,45.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano Mira Hryniuk, BA, per aver revisionato la lingua inglese dell'articolo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agani hypodermic needle, 19 G Terumo Europe AN*1950R1 19 G needle to aspirate albumen
Terumo syringe, 5 mL concentric Luer lock Terumo Europe SS*05LE1 5-mL sterile syringe
Caseviewer v2.2 3DHISTECH Image analysis software
Diethyl ether Merck Chemicals 603-022-00-4 Sterile ether to traumatize the CAM
Eosin Y aqueous solution 0.5% Merck 1098441000 Staining solution
Formaldehyde 4% aqueous solution buffered (Formalin 10%) VWR 97139010 Formaldehyde used for tissue fixation
Fridge Liebherr 7081260 Fridge at 4 °C used for paraffin-embedding
Heating plate Schott SLK2 Hot plate used to dry the slides
Incubator Thermo Forma Scientific 3111 10365156 Oven used for slide incubation
Leica CLS 150 XE microscope cold light source Leica CLS 150 XE Focal cold light source to candle the eggs
Lens cleaning tissue, grade 541 VWR 111-5003 Tissue to soak in sterile ether to traumatize the CAM
Mayer's hematoxylin MERCK 1092491000 Staining solution
Methanol VWR 20847307 Methanol
Microtome ThermoScientific-MICROM HM325-2 Microtome
Pannoramic P250 Flash III 3DHISTECH / Slide scanner at 20x magnification
Paraformaldehyde  Merck 1,04,00,51,000 Paraffin-embedding solution
Paraplast Plus R Sigma P3683-1KG Paraffin
Petri dish, 60x15 mm, sterile Greiner 628161 Sterile petri dish
Pin holder Fine Science Tools 26016-12 Pin holder
Polyhatch Brinsea CP01F Egg incubator with automatic rotator
Scroll saw blade, 132 mm Sencys / Saw blade to create a window in the eggshell
Stainless steel insert pins Fine Science Tools 26007-02 Straight pin to make a hole in the eggshell
Steril-Helios  Angelantoni Industrie ST-00275400000 Laminar flow hood
Superfrost Plus bords rodés 90° VWR 631-9483 Glass slides 
Tissue-Tek VIP 6Al Sakura 60320417-0711 VID6E3-1 Automatic embedding device
Titanium forceps Fine Science Tools 11602-16 Forceps for eggshell removal and ovarian tissue manipulation
Toluene, pa VWR 28701364 Paraffin-embedding solution

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References

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Il modello di membrana corioallantoica del pulcino (CAM) come strumento per lo studio del trapianto di tessuto ovarico
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Hossay, C., Cacciottola, L., Storder, S., Van Kerk, O., Dolmans, M. M. The Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Model as a Tool to Study Ovarian Tissue Transplantation. J. Vis. Exp. (196), e64867, doi:10.3791/64867 (2023).

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