Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) -modellen som et verktøy for å studere eggstokkvevstransplantasjon

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/64867
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Gynecology Research Unit, Institut de Recherche Expérimentale et Clinique, Université Catholique de Louvain, 2Gynecology Department, Cliniques Universitaires Saint-Luc

Summary

Her beskriver vi en protokoll for å utvikle en chick chorioallantoic membran (CAM) xenograftingmodell for humant eggstokkvev og demonstrere effektiviteten av teknikken, tidsrammen for transplantatrevaskularisering og vevets levedyktighet over en 6-dagers podeperiode.

Abstract

Kryopreservering og transplantasjon av eggstokkvev er en effektiv strategi for å bevare fruktbarheten, men har en stor ulempe, nemlig massivt follikeltap som oppstår kort tid etter tilbaketransplantasjon på grunn av unormal follikelaktivering og død. Gnagere er referansemodeller for å undersøke follikelaktivering, men kostnadene, tiden og etiske hensyn blir stadig mer uoverkommelige, og driver dermed utviklingen av alternativer. Chick chorioallantoic membran (CAM) -modellen er spesielt attraktiv, er billig og opprettholder naturlig immundefekt opp til dag 17 postfertilisering, noe som gjør den ideell til å studere kortsiktig xenografting av humant eggstokkvev. CAM er også svært vaskularisert og har blitt mye brukt som en modell for å utforske angiogenese. Dette gir den en bemerkelsesverdig fordel i forhold til in vitro-modeller og tillater undersøkelse av mekanismer som påvirker den tidlige follikeltapsprosessen etter poding. Protokollen som er skissert her, tar sikte på å beskrive utviklingen av en CAM-xenograftingmodell for humant eggstokkvev, med spesifikk innsikt i effektiviteten av teknikken, tidsrammen for transplantatrevaskularisering og vevets levedyktighet over en 6-dagers podeperiode.

Introduction

Etterspørselen etter fertilitetsbevaring for onkologiske og godartede indikasjoner, samt sosiale årsaker, har økt dramatisk de siste tiårene. Imidlertid er ulike behandlinger som brukes til å kurere ondartede og ikke-ondartede sykdommer svært giftige for gonadene og kan resultere i iatrogen prematur ovarieinsuffisiens, noe som til slutt fører til infertilitet1. Etablerte teknikker for fruktbarhetsbevaring inkluderer embryokryopreservering, umoden eller moden oocyttvitrifikasjon og kryopreservering av eggstokkvev 2,3,4. Nedfrysing av eggstokkvev er det eneste tilgjengelige alternativet for å bevare fruktbarheten hos prepubertale jenter eller kvinner som trenger umiddelbar kreftbehandling. Restaureringen av endokrin funksjon etter eggstokkvevstransplantasjon forekommer hos over 95% av individene, med levende fødselsrater fra 18% til 42%5,6,7,8,9.

Selv om transplantasjonen av frossen-tint eggstokkvev har vist seg vellykket, er det fortsatt rom for forbedring. Faktisk, ettersom ovariekortikale fragmenter transplanteres uten vaskulær anastomose, opplever de en periode med hypoksi hvor transplantatrevaskularisering finner sted 10,11,12. De aller fleste studier som undersøker human eggstokkvevstransplantasjon har brukt en xenograftingmodell, der eggstokkvev transplanteres til immundefekte mus. Den komplette revaskulariseringen av xenotransplantatene tar rundt 10 dager, med både verts- og graftkarene som bidrar til dannelsen av funksjonelle kar 12,13,14. Rundt 50%-90% av follikkelreserven går tapt i løpet av dette hypoksiske vinduet før fullføring av transplantatrevaskularisering 10,15,16. Det har blitt sterkt foreslått at dette massive follikkeltapet oppstår gjennom både direkte follikeldød, som demonstrert ved en reduksjon i de absolutte follikkeltallene som er igjen etter podning, og aktiveringen av primordial follikelvekst, som indikert ved endringer i follikelproporsjoner mot økte mengder voksende follikler17,18.

Interessant nok har tidligere forskningsarbeider ved bruk av forskjellige animalske eggstokkvev podet til chick chorioallantoic membran (CAM), som har en konstitusjon som etterligner det typiske podestedet i bukhinnen, rapportert inhiberingen av spontan follikelaktivering, med den primordiale follikelreserven som forblir intakt i opptil 10 dager 19,20,21,22. Vårt team har tidligere vist at poding av frossen-tint humant eggstokkvev til alternativ behandling utgjorde en pålitelig tilnærming for å undersøke human ovarievevstransplantasjon i sine første iskemiske stadier23 og viste nylig at denne podemetoden var i stand til å motvirke follikelaktivering24.

CAM-modellen er spesielt tiltalende, ikke bare fordi egg er mye billigere enn mus, men også på grunn av den svært vaskulariserte naturen til CAM, noe som tillater gransking av sammenhengen mellom follikelaktivering og revaskularisering av eggstokktransplantat. Fuglesystemet er faktisk en av de vanligste og mest allsidige måtene å studere angiogenese25. Chick embryo development (ED) tar 21 dager til klekking, og CAM dannes i løpet av de første 4-5 dagene gjennom fusjon av allantois og chorion26. Spesielt er kyllingembryoet en naturlig immundefekt vert til dag 17 av ED, slik at xenopodingseksperimenter kan utføres uten risiko for transplantatavstøtning27,28. Videre reiser CAM-modelltilnærmingen ingen etiske eller juridiske problemer i forhold til europeisk lov29, noe som gjør den til et attraktivt alternativ til andre dyremodeller. Når det gjelder avlsforhold, trenger kyllingembryoer bare et inkubatorsett ved 37 °C med en relativ luftfuktighet på 40%-60%. Disse begrensede eksperimentkravene reduserer forskningskostnadene betydelig sammenlignet med bruk av immundefekte mus.

Protokollen som presenteres her tar sikte på å beskrive utviklingen av en CAM xenografting modell for humant eggstokkvev og gi spesifikk innsikt i effektiviteten av teknikken, tidsrammen for transplantat revaskularisering, og vevets levedyktighet over en 6 dagers poding periode. Denne protokollen kan være av stor interesse for å undersøke mekanismene bak tidlig follikkeltap etter transplantasjon og studere virkningen av flere midler (vekstfaktorer, hormoner, etc.) på dette fenomenet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bruken av menneskelig vev ble godkjent av Institutional Review Board ved det katolske universitetet i Louvain. Pasientene ga skriftlig informert samtykke til bruk av eggstokkvev til forskningsformål.

1. Bestilling av dag 0 egg som høyst sannsynlig vil bli embryonert

  1. Finn en sertifisert laboratorie-grade Lohman-valgt hvit leghorn egg leverandør som rapporterer høye nivåer av embryonerte egg, som hovedsakelig er avhengig av alderen på kyllingene.

2. Forbereder eggene til inkubering

  1. Før eggene kommer, monter og balanserer egginkubatoren til 37 ° C i 40% -60% relativ luftfuktighet. Overvåk temperatur og luftfuktighet ved å sette inn et termometer og hygrometer i inkubatoren. Sørg for at lokket på inkubatoren er utstyrt med et glassvindu for å kunne kontrollere inkubatorens interne parametere uten å måtte åpne den (figur 1).
  2. Etter å ha mottatt dagen 0 egg fra Lohman-utvalgte hvite leghornkyllinger fra en sertifisert laboratoriekvalitets eggleverandør, rengjør overflaten av skallene med fuktet papir og tørk dem umiddelbart.
    MERK: Siden eggeskallmembranen er porøs, kan autoklavert vann brukes til å rengjøre eggoverflater og kontrollere fuktighet i inkubatoren for å minimere forurensningsrisiko.
  3. Merk eggene med en markør (f.eks. dato og eggnummer).
  4. Inkuber eggene med den spisse enden vendt ned, og roter dem slik at CAM kan utvikle seg. Roter eggene manuelt 180° to til tre ganger per dag, eller bruk en automatisk rotator.
    MERK: For å sikre at eggene faktisk roteres, kan eggeskallet merkes med en "X" og "O" på de to motsatte sidesidene ved hjelp av en blyant eller markør. Glassvinduet i lokket på inkubatoren gjør det mulig å kontrollere eggets rotasjon uten å åpne enheten.

3. Åpne eggeskallet på dag 3 av ED

MERK: Et rektangulært vindu er laget i eggeskallet på dag 3 av ED.

  1. Forbered den laminære strømningshetten for å fungere under sterile forhold. Plasser følgende instrumenter under hetten, og desinfiser dem i 70% etanol (hvis ikke allerede sterilisert):
    -Eggestativ
    -Eggelys eller brennvidde kaldt lyskilde
    -Markør
    -Steril rett stift
    -Steril 19 G kanyle
    -5 ml steril sprøyte
    -Rullesagblad
    -Steril tang
    -Selvklebende tape
  2. Overfør ett egg fra inkubatoren til eggstativet plassert under hetten, og slå av eggrotatoren.
  3. I mørket, identifiser luftlommen på egget ved å plassere egglyseren (eller fokal kald lyskilde) mot eggeskallet. Luftlommen er lokalisert i den stumpe enden av egget. Bruk en markør for å finne midten av luftlommen på eggeskallet.
  4. Slå på lysene. Lag et lite hull i eggeskallet der det er markert ved å forsiktig rotere en steril rett pinne. En liten åpning på rundt 1 mm i diameter er vanligvis tilstrekkelig.
    MERK: Vær forsiktig så du ikke skyver tappen helt gjennom egget. Hvis dette skjer, kast egget.
  5. Koble en steril 19 G kanyle til en steril 5 ml sprøyte.
  6. I mørket, finn eggeplommesekken ved hjelp av egglysstearinlyset (eller fokal kald lyskilde), og punkter egget gjennom hullet laget i trinn 3.4 med den sterile 19 G nålen vinklet 45 ° mot bunnen av egget; Vær forsiktig så du ikke forstyrrer eggeplommesekken. Aspirer mellom 1,5-2 ml albumen for å løsne CAM fra skallet, og lukk deretter hullet med et stykke tape.
    MERK: Hvis eggeplommesekken blir forstyrret under aspirasjon, vil den aspirerte væsken i sprøyten være gulfarget i stedet for gjennomsiktig (albumen). Hvis dette skjer, skift kanylen og sprøyten ut. Hvis en relativt stor mengde eggeplomme suges opp, kan det skade embryoets levedyktighet.
  7. Slå på lysene. Legg egget horisontalt, og tegn et rektangulært vindu som måler 1 cm x 1,5 cm med en markør. Ikke gjør vinduet større enn vanlig bredde på standard tape.
  8. Hold egget i den ene hånden, og så forsiktig det tidligere tegnede vinduet inn i eggeskallet ved hjelp av et rullesagblad. Pass på at skallet ikke sprekker og ikke kutt helt ned til den deprimerte CAM. Blås regelmessig for å fjerne skallstøv og rusk.
  9. Skyv steril tang under det rektangulære stykket av saget skall, og grip forsiktig for å fjerne det rent uten å skade CAM. I tillegg kaster du den hvite ytre skallmembranen for å kunne se embryoet og dets CAM.
    MERK: Hvis noe eggeskallstøv eller rusk faller på CAM-en, kan den fjernes ved hjelp av steril tang, og vær veldig forsiktig så du ikke CAM.
  10. Identifiser levedyktige embryonerte egg. De er merkbare ved deres klare albumen og vaskulær ring rundt embryoet, hvor et bankende hjerte noen ganger kan oppdages selv på dette stadiet (dag 3 av ED). Kast bort ikke-befruktede eller døde embryoer.
  11. Plasser tape over det nyopprettede vinduet for å unngå dehydrering. Pass på å brette den ene enden over seg selv for enkel fjerning.
  12. Sett egget tilbake i inkubatoren med det åpne vinduet vendt opp og båndet berører ikke CAM. Bruk et brettet stykke papir eller en del av eggestativet for å stoppe egget fra å rulle. Forsikre deg om at det roterende brettet er av.
  13. Gjenta trinn 3.2-3.12 for å åpne de resterende eggene.

4. Poding frosset-tint humant eggstokkvev til CAM

MERK: Transplantasjon til alternativ behandling bør ideelt sett initieres mellom dag 7-10 av ED.

  1. Tine kryopreserverte kortikale strimler av eggstokkene under hetten for laminær flyt etter protokollen beskrevet andre steder30.
  2. Klipp de kortikale stripene i tre fragmenter på 4 mm x 2 mm x 1 mm. Bruk ett stykke som en ikke-podet kontroll og de to andre for xenografting i 1 dag eller 6 dager.
    MERK: Hvis nok vev er tilgjengelig, arbeid i duplikat.
  3. Overfør ett egg fra inkubatoren til eggstativet plassert under hetten, med vinduet vendt oppover.
  4. Skrell båndet av vinduet, og sørg for at embryoet er levedyktig. På dette stadiet har levedyktige embryoer omfattende vaskulatur, et klart albumen, et synlig hjerteslag og litt embryobevegelse.
  5. Forbered podestedet ved forsiktig å traumatisere et lite område av CAM ved å legge en 1 cm2 stripe sterilt eterekstrahert linsepapir på epiteloverflaten og fjerne det umiddelbart.
    MERK: CAM er en ugjennomtrengelig barriere med mindre membranen har blitt traumatisert ved fjerning av den øvre peridermale delen av det doble epitellaget, slik at basallaget er intakt. Denne teknikken forbedrer også revaskulariseringsprosessen ved å aktivere sårheling. Hvis det sterile eterekstraherte linsepapiret forblir på CAM for lenge, kan membranen feste seg til linsepapiret og rive. Hvis dette skjer, kast egget.
  6. Ta tak i en frossen-tint ovarial kortikal stripe (4 mm x 2 mm x 1 mm) med mikrokirurgisk tang, og legg den på den traumatiserte CAM med medullærsiden mot CAM. Pod ett vevstykke per egg.
  7. Dekk vinduet med tape, og legg egget forsiktig tilbake til inkubatoren. Sørg for at eggeskallåpningen sitter oppreist og egget er sikkert.
  8. Gjenta trinn 4.1-4.7 for podning av alle gjenværende vev.
    MERK: Implantatene bør kontrolleres på hver podedag for å vurdere embryoets levedyktighet og overvåke endringer i vaskulaturen.

5. Høsting av transplantatene

MERK: Xenotransplantater bør høstes senest innen dag 17 av ED, siden immunsystemet til embryoet blir modent og kompetent fra dag 18.

  1. Legg egget på en rist, og forstørr vinduet i eggeskallet for å muliggjøre bedre graftvisualisering og enklere manipulering.
  2. Evaluer transplantatet makroskopisk, og vær spesielt oppmerksom på den vaskulære reaksjonen av alternativ behandling mot transplantatet. Ta digitale bilder eller videoer for ordens skyld.
  3. Ta tak i vevet eller den omkringliggende CAM med tang, og bruk saks eller en skalpell for å skjære ut transplantatet fra CAM forsiktig.
    MERK: Transplantatene blir dekket med et andre lag med alternativ behandling rundt dag 3 av poding og blir til slutt innkapslet. De kan også ha beveget seg inne i egget etter dag 6, noe som gjør det vanskelig å hente dem i noen tilfeller.
  4. Analyser det utskårne vevet ved hjelp av en hvilken som helst metode som passer for det gitte eksperimentet. I denne studien ble vevstykker festet i paraformaldehyd, parafininnebygd og farget med hematoksylin og eosin ved å følge trinnene som er skissert nedenfor:
    1. Fest fragmentene i 4 % paraformaldehyd i 24 timer, og legg dem inn i parafin ved hjelp av en automatisk innebyggingsanordning med trinnene nevnt i tabell 1.
    2. La de parafininnebygde blokkene ligge over natten ved 4 °C før du skjærer dem i 5 μm tykke seksjoner med en mikrotom.
    3. Fordel vevsdelene på et glassglass plassert på en kokeplate (30 °C), og la dem tørke i 2 timer, etterfulgt av 24 timer i en ovn ved 37 °C.
    4. Etterpå flekker du lysbildene med hematoksylin og eosin etter en protokoll beskrevet andre steder31. Deretter digitaliserer du prøvene ved hjelp av en lysbildeskanner, og analyserer dem ved hjelp av en bildeanalyseprogramvare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Overlevelse av kyllingembryo
Embryooverlevelsen fra vindusdannelse (dag 3 av ED) til transplantasjon av eggstokkvev (dag 7 av ED) var 79 % (33/42). Siden prosentandelen av embryonerte dag 0-egg er ukjent, ble supernumerary dag 0 egg fra Lohman-utvalgte hvite leghornkyllinger bestilt for å sikre at tilstrekkelige embryonerte egg ville være tilgjengelige for poding. Totalt 23 levedyktige dag 7 egg ble brukt til poding, hvorav ett døde i løpet av de første 24 timene, noe som resulterte i en total embryooverlevelse på 96% etter transplantasjon (22/23).

Makroskopisk aspekt av transplantatene
Etter 1 dag med poding så transplantatene levedyktige ut i 100% (10/10) av tilfellene og var allerede i det minste delvis festet til CAM, og viste et hjuleikemønster av blodkar som trengs for vaskularisering (figur 2A, B). Etter 6 dager med poding var alle implantatene fortsatt festet (figur 2C), bortsett fra to som ikke festet seg til CAM. De fikk et nekrotisk utseende og ble ekskludert fra videre analyse (figur 3), noe som resulterte i en transplantert vevsoverlevelse på 83 % (10/12) etter 6 dager. Alt i alt viste levedyktighetsvurderingen av humane eggstokktransplantater en samlet vevsoverlevelse på 91 % (20/22), uavhengig av podedag (tab 2).

Rundt dag 3 etter transplantasjonen ble transplantatene funnet å være dekket med et andre lag med CAM, og de ble til slutt innkapslet, noe som førte til enda bedre transplantatvaskularisering (figur 2C). Totalt sett hadde 80% av transplantasjonene også penetrert egget (figur 2D), noe som i noen tilfeller gjorde det vanskelig å hente dem på dag 6.

Mikroskopisk vurdering av transplantatene
Totalt 30 frossen-tinte humane ovariefragmenter fra fem forskjellige pasienter ble analysert og fiksert i 4% paraformaldehyd på podedag 0, dag 1 eller dag 6, innebygd i parafin og serielt kuttet i 5 μm seksjoner for histologisk evaluering (figur 4).

For å vurdere overlevelsen av ovariefollikkel ble follikler talt i 12 tilfeldige hematoksylin- og eosinfargede seksjoner per tidspunkt og per pasient. Kun morfologisk normale follikler med synlig oocytt ble tatt i betraktning for analyse32. Friske follikler ble observert ved alle tidspunkter (figur 4B-D). Follikkeloverlevelsen ble beregnet ved å bestemme gjenværende follikkeltetthet (antall follikler/mm3) etter poding og normalisere den til follikkeltettheten hos ikke-transplanterte kontroller (betraktet som 100 %). Follikkeltettheten hadde en tendens til å avta etter transplantasjon, men ikke nok til å nå statistisk signifikans (p > 0,8) (tab 2). Tilsvarende ble follikkeloverlevelsen opprettholdt i transplantasjonsperioden, og stod på 95 % ± 19 % på dag 1 og 83 % ± 27 % på dag 6 (p > 0,5).

Revaskulariseringsprosessen ble videre undersøkt ved påvisning av aviære røde blodlegemer i kar fra xenografert eggstokkvev. Aviær erytrocytter er lett å skjelne siden de er kjerneformet (figur 4A, C, D). Overraskende nok var vi i stand til å observere aviær erytrocytter i eggstokkkar i 30% av implantatene etter bare 1 dag med transplantasjon og i alle implantatene ved dag 6, som viste svært rask revaskularisering (tabell 2).

Figure 1
Figur 1: Eggrugemaskin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Makroskopisk aspekt ved levedyktige implantater. (A) Poding dag 0. (B) Implantater på dag 1, med CAM som viser et hjul-eikemønster av blodkar mot eggstokkvevet. (C) Implantater innkapslet av CAM på dag 6, noe som fører til enda bedre transplantatvaskularisering. (D) Graft penetrerer egget. Pilene peker på det podede eggstokkvevet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Makroskopisk aspekt ved nekrotiske implantater. (A) Sunt utseende eggstokkvev på dag 0 av podning. (B) Nekrotisk aspekt av implantatet 6 dager senere. Pilene peker på eggstokkvevet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Mikroskopisk aspekt ved implantater. Hematoksylin og eosinfargede seksjoner av implantater podet i (A,B) 1 dag og i (C,D) 6 dager. Pilspissene peker på røde blodlegemer som perfuserer eggstokkkarene etter (A) 1 dag og (C,D) 6 dager med podning. Pilene indikerer friske primordiale follikler i implantater podet i (B) 1 dag og (C,D) 6 dager. Skala bar: 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Trinn Bad Tid
Andre fiksering 1 Formalin 10% bad 2 timer
Dehydrering 7 metanolbad 7x 1 time
Avklaring 3 toluen bad 3x 1 time
Impregnering 3 flytende parafinbad (60 °C) 15 min – 30 min – 30 min

Tabell 1: Trinn for innebygging av parafin.

Ikke-podet Poding dag 1 Poding dag 6 P-verdi
Makroskopisk aspekt av transplantater
Overlevelse av vev - 100% (10/10) 83% (10/12) /
Mikroskopisk aspekt av transplantater
Follikkeltetthet (n/mm3) 848 ± 272 817 ± 370 684 ± 236 p > 0,8
Follikkel overlevelse rate 100% 95% ± 19% 83% ± 27% p > 0,5
Aviær røde blodlegemer tilstede i implantater 0% (0/10) 30% (3/10) 100% (10/10) /

Tabell 2: Resultater. Statistisk analyse utført ved hjelp av enveis ANOVA, etterfulgt av Sidia-korreksjon. Resultatene uttrykkes som gjennomsnitt ± standardavvik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den mest utfordrende delen av protokollen beskrevet her er å lage det lille hullet som kreves for å aspirere albumen for å løsne CAM fra eggeskallet før du lager et vindu. Bruk av for mye trykk kan føre til overpenetrasjon eller kan til og med sprekke og ødelegge egget, noe som forårsaker ugjenkallelig skade på CAM og dens vaskulatur. For å holde feil til et minimum under første forsøk på å skille CAM, anbefales det sterkt å øve på å lage små hull i eggeskallet av ikke-befruktede, dagligvarekjøpte egg ved hjelp av en rett pinne. Videre, gitt den naturlige variasjonen av fruktbarhet på tvers av batcher, sammen med det faktum at ikke alle embryoer overlever prosedyren, anbefales det å skaffe supernumerære egg fra eggleverandøren. For å oppnå optimal embryooverlevelse og en velutviklet alternativ behandling, må eggene ruges under ideelle forhold. Ved lav levedyktighet kan ulike aspekter ha skylden og må undersøkes. Eggleverandøren bør kontaktes, da levedyktigheten til embryoer fra leverandøren ganske enkelt kan være lavere på dette tidspunktet. Lav egglevedyktighet kan også skyldes unøyaktige eller upassende inkubatorinnstillinger, noe som kan kompromittere CAM-utviklingen. Bruken av et uavhengig hygrometer og termometer kan sikre at innstillingene er nøyaktige og stabile, men detaljerte feilsøkingsinstruksjoner bør gis av produsenten. Endelig har det også blitt foreslått at kontroll av transplanterte egg for ofte kan resultere i temperatur- og fuktighetssvingninger, noe som kan ha skadelige effekter på de podede embryoene33.

I den nåværende protokollen ble vinduet av eggeskallet utført på dag 3 av ED ved å aspirere rundt 2 ml albumen fra embryoet for å løsne CAM fra skallet, noe som igjen tillot opprettelsen av et vindu uten å skade CAM. Embryooverlevelsen 4 dager senere var 79%, i samsvar med tidligere studier34,35. Andre metoder har blitt rapportert, med varierende grad av suksess. Et alternativ er å prise CAM vekk fra skallet ved å påføre sug på luftsekken, vanligvis rundt dag 7-10 av ED. Denne metoden krever ikke at egget punkteres33,36. Studier som rapporterer embryooverlevelse ved hjelp av sistnevnte teknikk er få og langt mellom i litteraturen, med ett lag som rapporterer opptil 90% av embryooverlevelse36. Et annet alternativ å vurdere er skallløs kyllingembryokultur, også kjent som ex ovo-kultur. Fjerning av eggeskallet gir ubegrenset tilgang til embryoet, og letter dermed embryomanipulering og kirurgi og tillater også bruk av høyoppløselige bildebehandlingsteknikker for levende eksperimenter, for eksempel fluorescensmikroskopi og mikrocomputertopografi37,38. For å gjennomføre ex ovo kultur, blir embryoet, inkludert dets ekstraembryonale membraner, overført til en spesifikk kulturinneslutning mellom dag 2 og dag 4 av ED. Imidlertid er denne teknikken svært invasiv, med embryoer som vanligvis dør rundt dag 12 og færre enn 18% av dem overlever til dag 1538,39.

Under xenopodingsforsøkene som er rapportert her, ble humane eggstokkimplantater podet til CAMs som hadde blitt forsiktig traumatisert ved å påføre en liten stripe sterilt eterekstrahert linsepapir på overflaten av epitelet og fjerne det umiddelbart. Samlet sett var embryooverlevelsesraten utmerket og nådde 96% i podeperioden, noe som stemmer overens med tidligere studier som involverte transplantasjon av eggstokkvevfragmenter til CAMs23,40. Videre har denne tilnærmingen vist seg å øke transplantatadhesjonshastigheten og forbedre den påfølgende etableringen av neovaskularisering, med angiogenese sannsynligvis indusert av den første sårhelingsprosessen23. Faktisk ble xenografting av eggstokkvev fra rotter til murine sårhelende granulasjonsvev funnet å forbedre transplantatvaskularisering41. På samme måte, i den første levende fødselen rapportert etter ortotopisk transplantasjon av kryopreservert humant eggstokkvev, opprettet Donnez et al. et peritonealt vindu og koagulerte marginene 7 dager før implantasjon for å stimulere angiogenese og neovaskularisering i transplantasjonsstedet42.

Med hensyn til histologisk vurdering av podet humant ovarievev var follikkeloverlevelsen oppmuntrende, med mer enn 80 % av folliklene fortsatt intakte etter 6 dager med poding. Interessant nok er follikeloverlevelsesratene rapportert i litteraturen etter transplantasjon av humant frosset-tint eggstokkvev til bukhinnen av immundefekte mus bare rundt 30%10,14,18,43,44, noe som er mye lavere enn i denne studien. Våre funn av forbedret follikkeloverlevelse etter poding av humant eggstokkvev til alternativ behandling bekrefter våre nylig publiserte data, der vi demonstrerer at alternativ behandling hemmer follikkelaktivering og apoptose24. Videre var aviære blodkar i stand til å trenge inn i implantatene, som demonstrert ved tilstedeværelsen av aviær erytrocytter etter bare 1 dag med transplantasjon. Alt i alt viser disse resultatene at CAM-tilnærmingen er en egnet modell for videre undersøkelse av transplantasjon av humant eggstokkvev, siden det støtter vevets overlevelse.

Den største ulempen med CAM-modellen er den begrensede perioden poding er mulig. Faktisk kan transplantasjon utføres tidligst på dag 7 av ED, så snart CAM har utviklet seg tilstrekkelig, til dag 17, før kyllingembryoene får immunkompetanse og klekkes. Til tross for den korte transplantasjonsvarigheten er CAM-modellen fortsatt et nyttig verktøy for å studere human eggstokkvevstransplantasjon i sine første iskemiske stadier. Man kan også bruke denne modellen til å teste virkningen av proangiogene faktorer, beskyttende antioksidantmidler, cytokiner, vekst- og reproduksjonsrelaterte hormoner, og faktorer som kontrollerer follikelaktivering i podet humant eggstokkvev, alt under eksperimentelle forhold som lett kan kontrolleres25,45.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Mira Hryniuk, BA, for å gjennomgå det engelske språket i artikkelen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agani hypodermic needle, 19 G Terumo Europe AN*1950R1 19 G needle to aspirate albumen
Terumo syringe, 5 mL concentric Luer lock Terumo Europe SS*05LE1 5-mL sterile syringe
Caseviewer v2.2 3DHISTECH Image analysis software
Diethyl ether Merck Chemicals 603-022-00-4 Sterile ether to traumatize the CAM
Eosin Y aqueous solution 0.5% Merck 1098441000 Staining solution
Formaldehyde 4% aqueous solution buffered (Formalin 10%) VWR 97139010 Formaldehyde used for tissue fixation
Fridge Liebherr 7081260 Fridge at 4 °C used for paraffin-embedding
Heating plate Schott SLK2 Hot plate used to dry the slides
Incubator Thermo Forma Scientific 3111 10365156 Oven used for slide incubation
Leica CLS 150 XE microscope cold light source Leica CLS 150 XE Focal cold light source to candle the eggs
Lens cleaning tissue, grade 541 VWR 111-5003 Tissue to soak in sterile ether to traumatize the CAM
Mayer's hematoxylin MERCK 1092491000 Staining solution
Methanol VWR 20847307 Methanol
Microtome ThermoScientific-MICROM HM325-2 Microtome
Pannoramic P250 Flash III 3DHISTECH / Slide scanner at 20x magnification
Paraformaldehyde  Merck 1,04,00,51,000 Paraffin-embedding solution
Paraplast Plus R Sigma P3683-1KG Paraffin
Petri dish, 60x15 mm, sterile Greiner 628161 Sterile petri dish
Pin holder Fine Science Tools 26016-12 Pin holder
Polyhatch Brinsea CP01F Egg incubator with automatic rotator
Scroll saw blade, 132 mm Sencys / Saw blade to create a window in the eggshell
Stainless steel insert pins Fine Science Tools 26007-02 Straight pin to make a hole in the eggshell
Steril-Helios  Angelantoni Industrie ST-00275400000 Laminar flow hood
Superfrost Plus bords rodés 90° VWR 631-9483 Glass slides 
Tissue-Tek VIP 6Al Sakura 60320417-0711 VID6E3-1 Automatic embedding device
Titanium forceps Fine Science Tools 11602-16 Forceps for eggshell removal and ovarian tissue manipulation
Toluene, pa VWR 28701364 Paraffin-embedding solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue and oocyte cryopreservation prior to iatrogenic premature ovarian insufficiency. Best Practice & Research Clinical Obstetrics & Gynaecology. 81, 119-133 (2022).
  2. Dolmans, M. -M., Hossay, C., Nguyen, T. Y. T., Poirot, C. Fertility preservation: How to preserve ovarian function in children, adolescents and adults. Journal of Clinical Medicine. 10 (22), 5247 (2021).
  3. Donnez, J., Dolmans, M. -M. Fertility preservation in women. New England Journal of Medicine. 377 (17), 1657-1665 (2017).
  4. Donnez, J., Dolmans, M. -M. Fertility preservation in women. Nature Reviews Endocrinology. 9 (12), 735-749 (2013).
  5. Dolmans, M. -M., et al. Transplantation of cryopreserved ovarian tissue in a series of 285 women: a review of five leading European centers. Fertility and Sterility. 115 (5), 1102-1115 (2021).
  6. Shapira, M., Dolmans, M. -M., Silber, S., Meirow, D. Evaluation of ovarian tissue transplantation: results from three clinical centers. Fertility and Sterility. 114 (2), 388-397 (2020).
  7. Jensen, A. K., et al. Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark. Human Reproduction. 30 (12), 2838-2845 (2015).
  8. Vander Ven, H., et al. Ninety-five orthotopic transplantations in 74 women of ovarian tissue after cytotoxic treatment in a fertility preservation network: Tissue activity, pregnancy and delivery rates. Human Reproduction. 31 (9), 2031-2041 (2016).
  9. Diaz-Garcia, C., et al. Oocyte vitrification versus ovarian cortex transplantation in fertility preservation for adult women undergoing gonadotoxic treatments: A prospective cohort study. Fertility and Sterility. 109 (3), 478-485 (2018).
  10. Nisolle, M., Casanas-Roux, F., Qu, J., Motta, P., Donnez, J. Histologic and ultrastructural evaluation of fresh and frozen-thawed human ovarian xenografts in nude mice. Fertility and Sterility. 74 (1), 122-129 (2000).
  11. Van Eyck, A. -S., et al. Electron paramagnetic resonance as a tool to evaluate human ovarian tissue reoxygenation after xenografting. Fertility and Sterility. 92 (1), 374-381 (2009).
  12. Van Eyck, A. -S., et al. Both host and graft vessels contribute to revascularization of xenografted human ovarian tissue in a murine model. Fertility and Sterility. 93 (5), 1676-1685 (2010).
  13. Hossay, C., et al. Can frozen-thawed human ovary withstand refreezing-rethawing in the form of cortical strips. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (12), 3077-3087 (2020).
  14. Manavella, D. D., et al. Two-step transplantation with adipose tissue-derived stem cells increases follicle survival by enhancing vascularization in xenografted frozen-thawed human ovarian tissue. Human Reproduction. 33 (6), 1107-1116 (2018).
  15. Rahimi, G., et al. Re-vascularisation in human ovarian tissue after conventional freezing or vitrification and xenotransplantation. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 149 (1), 63-67 (2010).
  16. Cacciottola, L., Manavella, D. D., Amorim, C. A., Donnez, J., Dolmans, M. -M. In vivo characterization of metabolic activity and oxidative stress in grafted human ovarian tissue using microdialysis. Fertility and Sterility. 110 (3), 534-544 (2018).
  17. Gavish, Z., et al. Follicle activation is a significant and immediate cause of follicle loss after ovarian tissue transplantation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 35 (1), 61-69 (2018).
  18. Masciangelo, R., Hossay, C., Donnez, J., Dolmans, M. -M. Does the Akt pathway play a role in follicle activation after grafting of human ovarian tissue. Reproductive BioMedicine Online. 39 (2), 196-198 (2019).
  19. Fortune, J. E., Cushman, R. A., Wahl, C. M., Kito, S. The primordial to primary follicle transition. Molecular and Cellular Endocrinology. (1-2), 53-60 (2000).
  20. Cushman, R. A. Bovine ovarian cortical pieces grafted to chick embryonic membranes: A model for studies on the activation of primordial follicles. Human Reproduction. 17 (1), 48-54 (2002).
  21. Gigli, I., Cushman, R. A., Wahl, C. M., Fortune, J. E. Evidence for a role for anti-Müllerian hormone in the suppression of follicle activation in mouse ovaries and bovine ovarian cortex grafted beneath the chick chorioallantoic membrane. Molecular Reproduction and Development. 71 (4), 480-488 (2005).
  22. Qureshi, A. I., et al. Testosterone selectively increases primary follicles in ovarian cortex grafted onto embryonic chick membranes: relevance to polycystic ovaries. Reproduction. 136 (2), 187-194 (2008).
  23. Martinez-Madrid, B., et al. Chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) model: A useful tool to study short-term transplantation of cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 91 (1), 285-292 (2009).
  24. Hossay, C., et al. Follicle outcomes in human ovarian tissue: Effect of freezing, culture, and grafting. Fertility and Sterility. 119 (1), 135-145 (2023).
  25. Ribatti, D. The Chick Embryo Chorioallantoic Membrane in the Study of Angiogenesis and Metastasis. , Springer. Dordrecht, the Netherlands. (2010).
  26. Pawlikowska, P., et al. Exploitation of the chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) as a platform for anti-metastatic drug testing. Scientific Reports. 10 (1), 16876 (2020).
  27. Davison, T. F. The immunologists' debt to the chicken. British Poultry Science. 44 (1), 6-21 (2003).
  28. Schilling, M. A., et al. Transcriptional innate immune response of the developing chicken embryo to Newcastle disease virus infection. Frontiers in Genetics. 9, 61 (2018).
  29. Directives originating from the EU. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes (Text with EEA relevance). The National Archives. , Available from: https://www.legislation.gov.uk/eudr/2010/63/contents (2010).
  30. Dolmans, M. -M., et al. A review of 15 years of ovarian tissue bank activities. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (3), 305-314 (2013).
  31. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), 4986 (2008).
  32. Anderson, R. A., McLaughlin, M., Wallace, W. H. B., Albertini, D. F., Telfer, E. E. The immature human ovary shows loss of abnormal follicles and increasing follicle developmental competence through childhood and adolescence. Human Reproduction. 29 (1), 97-106 (2014).
  33. Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the chicken chorioallantoic membrane in vivo model to study gynecological and urological cancers. Journal of Visualized Experiments. (155), e60651 (2020).
  34. Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13 (8), 9959-9970 (2012).
  35. Sys, G. M. L., et al. The In ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. Journal of Visualized Experiments. (77), e50522 (2013).
  36. Li, M., et al. The in ovo chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an efficient xenograft model of hepatocellular carcinoma. Journal of Visualized Experiments. (104), e52411 (2015).
  37. Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
  38. Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications. Journal of Visualized Experiments. (44), e2154 (2010).
  39. Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts. Stem Cells International. 2013, 960958 (2013).
  40. Beck, K., Singh, J., Dar, M. A., Anzar, M. Short-term culture of adult bovine ovarian tissues: chorioallantoic membrane (CAM) vs. traditional in vitro culture systems. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 21 (2018).
  41. Israely, T., Nevo, N., Harmelin, A., Neeman, M., Tsafriri, A. Reducing ischaemic damage in rodent ovarian xenografts transplanted into granulation tissue. Human Reproduction. 21 (6), 1368-1379 (2006).
  42. Donnez, J., et al. Livebirth after orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue. The Lancet. 364 (9443), 1405-1410 (2004).
  43. Dolmans, M. -M., et al. Short-term transplantation of isolated human ovarian follicles and cortical tissue into nude mice. Reproduction. 134 (2), 253-262 (2007).
  44. Baird, D. T., Webb, R., Campbell, B. K., Harkness, L. M., Gosden, R. G. Long-term ovarian function in sheep after ovariectomy and transplantation of autografts stored at −196 C. Endocrinology. 140 (1), 462-471 (1999).
  45. Ribatti, D., Vacca, A., Roncali, L., Dammacco, F. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for in vivo research on anti-angiogenesis. Current Pharmaceutical Biotechnology. 1 (1), 73-82 (2000).

Tags

Biologi utgave 196 follikkelaktivering follikkeltap kryopreservering transplantasjon gnagermodeller alternativer kostnadseffektive tidsbesparende etiske hensyn xenografting humant eggstokkvev immunsvikt angiogenese follikeltapsprosess etter poding CAM xenografting-modell revaskulariseringstidsramme vevets levedyktighet
Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) -modellen som et verktøy for å studere eggstokkvevstransplantasjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hossay, C., Cacciottola, L.,… More

Hossay, C., Cacciottola, L., Storder, S., Van Kerk, O., Dolmans, M. M. The Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Model as a Tool to Study Ovarian Tissue Transplantation. J. Vis. Exp. (196), e64867, doi:10.3791/64867 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter