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Biology

Modelo de membrana corioalantóide de pintinhos (CAM) como ferramenta para o estudo do transplante de tecido ovariano

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/64867
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Gynecology Research Unit, Institut de Recherche Expérimentale et Clinique, Université Catholique de Louvain, 2Gynecology Department, Cliniques Universitaires Saint-Luc

Summary

Aqui, descrevemos um protocolo para o desenvolvimento de um modelo de xenoenxertia de membrana corioalantóica (CAM) para tecido ovariano humano e demonstramos a eficácia da técnica, o tempo de revascularização do enxerto e a viabilidade tecidual ao longo de um período de enxertia de 6 dias.

Abstract

A criopreservação e o transplante de tecido ovariano são uma estratégia eficaz para preservar a fertilidade, mas têm uma grande desvantagem, a perda maciça de folículos que ocorre logo após o reimplante devido à ativação anormal dos folículos e morte. Os roedores são modelos de referência para investigar a ativação dos folículos, mas o custo, o tempo e as considerações éticas estão se tornando cada vez mais proibitivos, impulsionando o desenvolvimento de alternativas. O modelo de membrana corioalantóide de pintinhos (CAM) é particularmente atraente, sendo barato e mantendo a imunodeficiência natural até o 17º dia pós-fertilização, tornando-o ideal para o estudo de xenoenxertia de curto prazo de tecido ovariano humano. A MAC também é altamente vascularizada e tem sido amplamente utilizada como modelo para explorar a angiogênese. Isso lhe confere uma notável vantagem sobre os modelos in vitro e permite a investigação dos mecanismos que afetam o processo de perda precoce dos folículos pós-enxerto. O protocolo aqui descrito visa descrever o desenvolvimento de um modelo de xenoenxertia CAM para tecido ovariano humano, com conhecimentos específicos sobre a eficácia da técnica, o período de revascularização do enxerto e a viabilidade tecidual ao longo de um período de enxertia de 6 dias.

Introduction

A demanda pela preservação da fertilidade por indicações oncológicas e benignas, bem como razões sociais, aumentou dramaticamente nas últimas décadas. No entanto, vários tratamentos utilizados para curar doenças malignas e não malignas são altamente tóxicos para as gônadas e podem resultar em insuficiência ovariana prematura iatrogênica, levando à infertilidade1. Técnicas estabelecidas para preservação da fertilidade incluem criopreservação de embriões, vitrificação de oócitos imaturos ou maduros e criopreservação de tecido ovariano 2,3,4. O congelamento do tecido ovariano é a única opção disponível para preservar a fertilidade em meninas pré-púberes ou mulheres que necessitam de terapia imediata contra o câncer. A restauração da função endócrina após o transplante de tecido ovariano ocorre em mais de 95% das pacientes, com taxas de nascidos vivos variando de 18% a 42%5,6,7,8,9.

Embora o transplante de tecido ovariano congelado descongelado tenha se mostrado bem-sucedido, ainda há espaço para melhorias. De fato, à medida que fragmentos da cortical ovariana são transplantados sem anastomose vascular, eles experimentam um período de hipóxia durante o qual ocorre a revascularização do enxerto10,11,12. A grande maioria dos estudos que investigam o transplante de tecido ovariano humano tem utilizado um modelo de xenoenxerto, no qual o tecido ovariano é transplantado para camundongos imunodeficientes. A revascularização completa dos xenoenxertos leva em torno de 10 dias, com os vasos do hospedeiro e do enxerto contribuindo para a formação de vasos funcionais12,13,14. Cerca de 50%-90% da reserva folicular é perdida durante essa janela hipóxica antes da conclusão da revascularização do enxerto 10,15,16. Tem sido fortemente sugerido que essa perda maciça de folículos ocorre tanto pela morte direta dos folículos, demonstrada pela diminuição do número absoluto de folículos deixados após a enxertia, quanto pela ativação do crescimento dos folículos primordiais, como indicado pelas mudanças nas proporções dos folículos em direção ao aumento das taxas de folículos em crescimento17,18.

Curiosamente, trabalhos anteriores utilizando vários tecidos ovarianos de animais enxertados na membrana corioalantóide (CAM) de pintinhos, que tem constituição mimetizando o local típico de enxertia do peritônio, relataram a inibição da ativação espontânea dos folículos, com a reserva primordial do folículo permanecendo intacta por até 10 dias 19,20,21,22 . Nossa equipe demonstrou anteriormente que o enxerto de tecido ovariano humano congelado descongelado para CAM constituiu uma abordagem confiável para investigar o transplante de tecido ovariano humano em seus primeiros estágios isquêmicos23 e, recentemente, mostrou que esse método de enxertia foi capaz de neutralizar a ativação folicular24.

O modelo CAM é especialmente atraente não só porque os óvulos são muito mais baratos do que os camundongos, mas também devido à natureza altamente vascularizada das MAC, permitindo examinar a associação entre ativação de folículos e revascularização do enxerto ovariano. O sistema aviário é, de fato, uma das formas mais comuns e versáteis de estudar a angiogênese25. O desenvolvimento embrionário (DE) de pintinhos leva 21 dias até a eclosão, e a CAM é formada nos primeiros 4-5 dias através da fusão do alantois e córion26. Notadamente, o embrião de pintinho é um hospedeiro naturalmente imunodeficiente até o 17º dia de DE, de modo que experimentos de xenoenxertia podem ser realizados sem qualquer risco de rejeição do enxerto27,28. Além disso, a abordagem do modelo CAM não suscita quaisquer preocupações éticas ou jurídicas em termos do direito europeu29, tornando-se uma alternativa atractiva a outros modelos animais. No que diz respeito às condições de reprodução, os embriões de pintinhos necessitam apenas de uma incubadora fixada a 37 °C com uma humidade relativa do ar de 40%-60%. Esses requisitos limitados de experimentação reduzem significativamente os custos da pesquisa em comparação com o uso de camundongos imunodeficientes.

O protocolo aqui apresentado tem como objetivo descrever o desenvolvimento de um modelo de xenoenxertia CAM para tecido ovariano humano e fornecer informações específicas sobre a eficácia da técnica, o período de tempo de revascularização do enxerto e a viabilidade tecidual ao longo de um período de enxertia de 6 dias. Este protocolo pode ser de grande interesse para investigar os mecanismos por trás da perda precoce de folículos pós-enxertia e estudar o impacto de vários agentes (fatores de crescimento, hormônios, etc.) sobre este fenômeno.

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Protocol

O uso de tecido humano foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Católica de Lovaia. As pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido para o uso do tecido ovariano para fins de pesquisa.

1. Ordenar o dia 0 ovos que são altamente prováveis de serem embrionados

  1. Encontre um fornecedor certificado de ovos Leghorn brancos selecionados em laboratório Lohman que relata altas taxas de ovos embrionados, o que depende principalmente da idade dos pintinhos.

2. Preparação dos ovos para incubação

  1. Antes da chegada dos ovos, montar e equilibrar a incubadora de ovos a 37 °C em 40%-60% de umidade relativa do ar. Monitore a temperatura e a umidade do ar inserindo um termômetro e higrômetro na incubadora. Certifique-se de que a tampa da incubadora esteja equipada com uma janela de vidro que permita verificar os parâmetros internos da incubadora sem ter que abri-la (Figura 1).
  2. Tendo recebido o dia 0 ovos de pintos brancos Leghorn selecionados por Lohman de um fornecedor certificado de ovos de nível laboratorial, limpe a superfície das cascas com papel umidificado e seque-as imediatamente.
    OBS: Como a membrana da casca do ovo é porosa, a água autoclavada pode ser usada para limpar a superfície dos ovos e controlar a umidade dentro da incubadora, a fim de minimizar os riscos de contaminação.
  3. Rotule os ovos usando um marcador (por exemplo, data e número do ovo).
  4. Incube os ovos com a extremidade pontiaguda virada para baixo e gire-os para permitir que o CAM se desenvolva. Gire manualmente os ovos em 180° duas a três vezes por dia ou use um rotador automático.
    NOTA: A fim de garantir que os ovos estão realmente sendo girados, a casca do ovo pode ser marcada com um "X" e "O" nos dois lados laterais opostos usando um lápis ou marcador. A janela de vidro na tampa da incubadora permite verificar a rotação dos ovos sem abrir o dispositivo.

3. Abertura da casca do ovo no dia 3 da DE

NOTA: Uma janela retangular é feita na casca do ovo no dia 3 de ED.

  1. Prepare a capela de fluxo laminar para trabalhar em condições estéreis. Coloque os seguintes instrumentos sob o capô e desinfete-os em etanol 70% (se ainda não estiverem esterilizados):
    -Prateleira de ovos
    -Vela de ovo ou fonte de luz fria focal
    -Marcador
    -Pino reto estéril
    -Agulha estéril 19 G
    -5 ml de seringa estéril
    -Lâmina de serra de rolagem
    -Pinça estéril
    -Fita adesiva
  2. Transfira um ovo da incubadora para a prateleira de ovos colocada sob o capô e desligue o rotador de ovos.
  3. No escuro, identifique a bolsa de ar do ovo colocando a vela do ovo (ou fonte de luz fria focal) contra a casca do ovo. A bolsa de ar está localizada na extremidade romba do ovo. Use um marcador para identificar o centro da bolsa de ar na casca do ovo.
  4. Acenda as luzes. Faça um pequeno orifício na casca do ovo onde ele é marcado girando suavemente um pino reto estéril. Uma pequena abertura de cerca de 1 mm de diâmetro é geralmente suficiente.
    NOTA: Tenha cuidado para não empurrar o pino até o ovo. Se isso acontecer, descarte o ovo.
  5. Conecte uma agulha estéril de 19 G a uma seringa estéril de 5 mL.
  6. No escuro, localize o saco vitelínico usando o veleiro de ovo (ou fonte focal de luz fria) e puncione o ovo através do orifício feito na etapa 3.4 com a agulha estéril de 19 G angulada a 45° em direção ao fundo do ovo; tome muito cuidado para não atrapalhar o saco vitelino. Aspirar entre 1,5-2 mL de albumina para desprender a CAM da concha e, em seguida, fechar o orifício com um pedaço de fita adesiva.
    NOTA: Se o saco vitelínico for interrompido durante a aspiração, o líquido aspirado na seringa será de cor amarela em vez de transparente (albumina). Se isso acontecer, substitua a agulha e a seringa. Se uma quantidade relativamente grande de gema de ovo é sugada, isso pode comprometer a viabilidade do embrião.
  7. Acenda as luzes. Coloque o ovo horizontalmente e desenhe uma janela retangular medindo 1 cm x 1,5 cm com um marcador. Não torne a janela maior do que a largura habitual da fita adesiva padrão.
  8. Segure o ovo em uma das mãos e gentilmente viu a janela previamente desenhada na casca do ovo usando uma lâmina de serra de rolagem. Certifique-se de que a casca não racha e não corte até o CAM deprimido. Sopre regularmente para remover o pó da casca e detritos.
  9. Deslize pinças estéreis sob a peça retangular da concha serrada e segure habilmente para removê-la de forma limpa sem danificar o CAM. Além disso, descarte a membrana da casca externa branca para poder ver o embrião e seu CAM.
    OBS: Caso algum pó ou detrito de casca de ovo caia sobre o CAM, este poderá ser retirado com pinça estéril, tomando muito cuidado para não rasgar o CAM.
  10. Identificar óvulos embrionados viáveis. Eles são discerníveis por sua albumina clara e o anel vascular ao redor do embrião, onde um coração batendo às vezes pode ser detectado mesmo nesta fase (dia 3 de ED). Descarte embriões não fertilizados ou mortos.
  11. Coloque fita adesiva sobre a janela recém-criada para evitar a desidratação. Certifique-se de dobrar uma extremidade sobre si mesma para facilitar a remoção.
  12. Coloque o ovo de volta na incubadora com a janela aberta virada para cima e a fita não tocando no CAM. Use um pedaço de papel dobrado ou parte da prateleira de ovos para impedir que o ovo role. Verifique se a bandeja giratória está desligada.
  13. Repita os passos 3.2-3.12 para abrir os ovos restantes.

4. Enxertia de tecido ovariano humano congelado descongelado na CAM

NOTA: O transplante para a CAM deve idealmente ser iniciado entre os dias 7-10 de DE.

  1. Descongelar tiras corticais ovarianas criopreservadas sob a capela de fluxo laminar seguindo o protocolo descrito anteriormente30.
  2. Cortar as tiras corticais em três fragmentos de 4 mm x 2 mm x 1 mm. Utilizar uma peça como controle não enxertado e as outras duas para xenoenxertia por 1 dia ou 6 dias.
    NOTA: Se houver tecido suficiente disponível, trabalhe em duplicata.
  3. Transfira um ovo da incubadora para a prateleira de ovos posicionada sob o capô, com a janela voltada para cima.
  4. Retire a fita da janela e garanta que o embrião seja viável. Nesta fase, os embriões viáveis apresentam extensa vasculatura, albumina clara, batimento cardíaco visível e algum movimento embrionário.
  5. Prepare o local de enxerto traumatizando suavemente uma pequena área da CAM, colocando uma tira de 1 cm2 de papel de lente estéril extraído com éter na superfície epitelial e removendo-a imediatamente.
    NOTA: A CAM é uma barreira impenetrável a menos que a membrana tenha sido traumatizada pela remoção da parte peridérmica superior da dupla camada epitelial, deixando a camada basal intacta. Essa técnica também potencializa o processo de revascularização, ativando a cicatrização de feridas. Se o papel da lente extraído com éter estéril permanecer no CAM por muito tempo, a membrana pode aderir ao papel da lente e rasgar. Se isso acontecer, descarte o ovo.
  6. Segurar uma tira cortical ovariana congelada descongelada (4 mm x 2 mm x 1 mm) com pinça microcirúrgica e colocá-la na MAC traumatizada com a face medular contra a MAC. Enxertar um pedaço de tecido por ovo.
  7. Cubra a janela com fita adesiva e devolva cuidadosamente o ovo à incubadora. Certifique-se de que a abertura da casca do ovo fique na vertical e o ovo esteja seguro.
  8. Repetir os passos 4.1-4.7 para a enxertia de todos os tecidos restantes.
    OBS: Os implantes devem ser verificados a cada dia de enxertia para avaliar a viabilidade embrionária e monitorar as alterações na vasculatura.

5. Retirada dos enxertos

NOTA: Os xenoenxertos devem ser colhidos o mais tardar até o dia 17 de DE, uma vez que o sistema imunológico do embrião torna-se maduro e competente a partir do dia 18.

  1. Coloque o ovo em uma prateleira e amplie a janela na casca do ovo para permitir uma melhor visualização do enxerto e facilitar a manipulação.
  2. Avaliar macroscopicamente o enxerto e prestar especial atenção à reação vascular da CAM em relação ao enxerto. Tire fotografias ou vídeos digitais para registro.
  3. Segure o tecido ou a CAM circundante com pinça e use uma tesoura ou um bisturi para excisar o enxerto da CAM cuidadosamente.
    NOTA: Os enxertos ficam cobertos com uma segunda camada de CAM por volta do 3º dia de enxertia e eventualmente se tornam encapsulados. Eles também podem ter se movido dentro do ovo no dia 6, dificultando a recuperação em alguns casos.
  4. Analisar os tecidos excisados por qualquer método apropriado para o experimento dado. No presente estudo, os pedaços de tecido foram fixados em paraformaldeído, incluídos em parafina e corados com hematoxilina e eosina, seguindo os passos descritos a seguir:
    1. Fixar os fragmentos em paraformaldeído a 4% por 24 h e incorporá-los em parafina utilizando um dispositivo de incorporação automática com os passos mencionados na Tabela 1.
    2. Deixe os blocos embebidos em parafina durante a noite a 4°C antes de cortá-los em seções de 5 μm de espessura com um micrótomo.
    3. Espalhe os cortes de tecido em uma lâmina de vidro colocada em uma placa quente (30 °C) e deixe-os secar por 2 h, seguido de 24 h em um forno a 37 °C.
    4. Em seguida, corar as lâminas com hematoxilina e eosina, seguindo protocolo descrito nestedocumento 31. Posteriormente, digitalize as amostras usando um scanner de lâminas e analise-as usando um software de análise de imagens.

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Representative Results

Taxas de sobrevivência de embriões de pintinhos
A taxa de sobrevivência do embrião desde o janelamento (dia 3 de DE) até o enxerto de tecido ovariano (dia 7 de DE) foi de 79% (33/42). Uma vez que a porcentagem de ovos embrionados do dia 0 é desconhecida, ovos supranumerários do dia 0 de galinhas brancas Leghorn selecionadas por Lohman foram encomendados para garantir que ovos embrionados suficientes estivessem disponíveis para enxertia. Um total de 23 ovos viáveis do dia 7 foram usados para enxertia, um dos quais pereceu durante as primeiras 24 h, resultando em uma taxa de sobrevivência global do embrião de 96% após o transplante (22/23).

Aspecto macroscópico dos enxertos
Após 1 dia de enxertia, os enxertos mostravam-se viáveis em 100% (10/10) dos casos e já estavam pelo menos parcialmente aderentes ao MAC, mostrando um padrão wheel-spoke dos vasos sanguíneos necessários para sua vascularização (Figura 2A,B). Após 6 dias da enxertia, todos os implantes ainda estavam aderidos (Figura 2C), com exceção de dois que não se fixaram ao MAC. Assumiram aspecto necrótico e foram excluídos de análises posteriores (Figura 3), resultando em uma taxa de sobrevida do tecido enxertado de 83% (10/12) após 6 dias. Em suma, a avaliação da viabilidade dos enxertos ovarianos humanos revelou uma taxa de sobrevida tecidual global de 91% (20/22), independentemente do dia da enxertia (Tabela 2).

Por volta do 3º dia pós-transplante, os enxertos foram recobertos por uma segunda camada de MAC e acabaram se tornando encapsulados, levando a uma vascularização ainda melhor do enxerto (Figura 2C). No geral, 80% dos transplantes também penetraram no óvulo (Figura 2D), em alguns casos dificultando sua recuperação no 6º dia.

Avaliação microscópica dos enxertos
Um total de 30 fragmentos de ovário humano congelados e descongelados, obtidos de cinco pacientes diferentes, foram analisados e fixados em paraformaldeído a 4% no dia 0, dia 1 ou 6 da enxertia, incluídos em parafina e cortados em cortes de 5 μm para avaliação histológica (Figura 4).

Para avaliar as taxas de sobrevida dos folículos ovarianos, os folículos foram contados em 12 cortes aleatórios corados pela hematoxilina e eosina por momento e por paciente. Apenas folículos morfologicamente normais com ovócito visível foram considerados para análise32. Folículos hígidos foram observados em todos os momentos (Figura 4B-D). As taxas de sobrevivência dos folículos foram calculadas determinando-se a densidade do folículo remanescente (número de folículos/mm3) após a enxertia e normalizando-a para a densidade do folículo nos controles não enxertados (considerada 100%). A densidade de folículos tendeu a diminuir após o transplante, mas não o suficiente para atingir significância estatística (p > 0,8) (Tabela 2). Da mesma forma, as taxas de sobrevivência dos folículos mantiveram-se durante o período de enxertia, situando-se em 95% ± 19% no dia 1 e 83% ± 27% no dia 6 (p > 0,5).

O processo de revascularização foi investigado pela detecção de hemácias aviárias em vasos do tecido ovariano xenoenxertado. Os eritrócitos aviários são facilmente discerníveis, pois são nucleados (Figura 4A,C,D). Surpreendentemente, pudemos observar eritrócitos aviários nos vasos ovarianos em 30% dos implantes após apenas 1 dia do transplante e em todos os implantes até o 6º dia, exibindo revascularização muito rápida (Tabela 2).

Figure 1
Figura 1: Incubadora de ovos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Aspecto macroscópico dos implantes viáveis. (A) Enxertia: dia 0. (B) Implantes no dia 1, com a CAM mostrando um padrão de raios roda dos vasos sanguíneos em direção ao tecido ovariano. (C) Implantes encapsulados por CAM no 6º dia, levando a uma vascularização ainda melhor do enxerto. (D) Enxerto penetrando no ovo. As setas apontam para o tecido ovariano enxertado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Aspecto macroscópico dos implantes necróticos. (A) Tecido ovariano de aparência saudável no dia 0 da enxertia. (B) Aspecto necrótico do implante 6 dias após. As setas apontam para o tecido ovariano. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Aspecto microscópico dos implantes. Cortes corados pela hematoxilina e eosina dos implantes enxertados por (A,B) 1 dia e por (C,D) 6 dias. As pontas das setas apontam para hemácias aviárias perfundindo os vasos ovarianos após (A) 1 dia e (C,D) 6 dias de enxertia. As setas indicam folículos primordiais de aparência saudável em implantes enxertados por (B) 1 dia e (C,D) 6 dias. Barra de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Passos Banhos Hora
Segunda fixação 1 Formalina 10% banho 2 h
Desidratação 7 banhos de metanol 7x 1 h
Esclarecimento 3 banhos de tolueno 3x 1 h
Impregnação 3 banhos líquidos de parafina (60°C) 15 min – 30 min – 30 min

Tabela 1: Etapas de incorporação da parafina.

Não enxertado Enxerto dia 1 Enxertia dia 6 Valor de p
Aspecto macroscópico dos enxertos
Taxa de sobrevivência tecidual - 100% (10/10) 83% (10/12) /
Aspecto microscópico dos enxertos
Densidade do folículo (n/mm3) 848 ± 272 817 ± 370 684 ± 236 p > 0,8
Taxa de sobrevivência dos folículos 100% 95% ± 19% 83% ± 27% p > 0,5
Hemácias aviárias presentes nos implantes 0% (0/10) 30% (3/10) 100% (10/10) /

Tabela 2: Resultados. Análise estatística realizada por ANOVA one-way, seguida de correção de Sidak. Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão.

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Discussion

A parte mais desafiadora do protocolo descrito aqui é fazer o pequeno orifício necessário para aspirar a albumina a fim de desprender a CAM da casca do ovo antes de criar uma janela. Aplicar muita pressão pode resultar em superpenetração ou até mesmo rachar e destruir o ovo, causando danos irrevogáveis à CAM e sua vasculatura. Para minimizar os erros durante as tentativas iniciais de separar o CAM, é altamente recomendável praticar fazer pequenos buracos na casca do ovo de ovos não fertilizados comprados em supermercado usando um alfinete reto. Além disso, dada a variabilidade natural da fertilidade entre lotes, juntamente com o fato de que nem todos os embriões sobrevivem ao procedimento, recomenda-se a obtenção de óvulos supranumerários do fornecedor de óvulos. Para alcançar taxas ideais de sobrevivência embrionária e uma CAM bem desenvolvida, os ovos precisam ser incubados em condições ideais. No caso de baixa viabilidade, diferentes aspectos podem ser culpados e precisam ser investigados. O fornecedor de óvulos deve ser contactado, uma vez que a viabilidade dos embriões do fornecedor pode ser simplesmente menor neste momento. A baixa viabilidade dos ovos também pode ser devida a configurações imprecisas ou inadequadas da incubadora, o que pode comprometer o desenvolvimento das CAM. O uso de um higrômetro e termômetro independentes pode garantir que as configurações sejam precisas e estáveis, mas instruções detalhadas de solução de problemas devem ser fornecidas pelo fabricante. Finalmente, também tem sido sugerido que o controle dos óvulos transplantados com muita frequência pode resultar em flutuações de temperatura e umidade, o que poderia ter efeitos deletérios sobre os embriões enxertados33.

No presente protocolo, a janelamento da casca do ovo foi realizada no 3º dia de FE aspirando-se cerca de 2 mL de albumina do embrião para desprender a CAM da casca, o que, por sua vez, permitiu a criação de uma janela sem danificar a MAC. A taxa de sobrevivência embrionária após 4 dias foi de 79%, compatível com estudos prévios34,35. Outros métodos têm sido relatados, com graus variados de sucesso. Uma alternativa é afastar a CAM da casca aplicando sucção no saco aéreo, tipicamente por volta do dia 7-10 de DE. Este método dispensa a punção do óvulo33,36. Estudos relatando taxas de sobrevivência embrionária usando esta última técnica são poucos e distantes na literatura, com uma equipe relatando até 90% de sobrevivência embrionária36. Outra opção a ser considerada é a cultura de embriões de pintinhos sem casca, também conhecida como cultura ex ovo. A remoção da casca do ovo proporciona acesso irrestrito ao embrião, facilitando a manipulação e cirurgia do embrião e também permitindo o uso de técnicas de imagem de alta resolução para experimentos vivos, como microscopia de fluorescência e topografia microcomputadorizada37,38. A fim de realizar a cultura ex ovo, o embrião, incluindo suas membranas extraembrionárias, é transferido para uma contenção de cultura específica entre o dia 2 e o dia 4 de DE. No entanto, essa técnica é altamente invasiva, com embriões geralmente morrendo por volta do 12º dia e menos de 18% deles sobrevivendo até o 15º dia38,39.

Durante os experimentos de xenoenxertia aqui relatados, implantes ovarianos humanos foram enxertados em CAMs que haviam sido suavemente traumatizados pela aplicação de uma pequena tira de papel de lente extraído de éter estéril na superfície do epitélio e retirando-o imediatamente. No geral, as taxas de sobrevivência embrionária foram excelentes e chegaram a 96% durante o período de enxertia, o que está de acordo com estudos anteriores envolvendo o transplante de fragmentos de tecido ovariano para MACCs23,40. Além disso, essa abordagem demonstrou aumentar as taxas de adesão do enxerto e melhorar o estabelecimento subsequente da neovascularização, com angiogênese provavelmente induzida pelo processo inicial de cicatrizaçãoda ferida 23. De fato, xenoenxertando tecido ovariano de rato para tecido de granulação murino foi encontrado para melhorar a vascularização do enxerto41. Da mesma forma, no primeiro nascido vivo relatado após transplante ortotópico de tecido ovariano humano criopreservado, Donnez e col. criaram uma janela peritoneal e coagularam suas margens 7 dias antes do implante para estimular a angiogênese e a neovascularização no local do transplante42.

Em relação à avaliação histológica do tecido ovariano humano enxertado, as taxas de sobrevida dos folículos foram animadoras, com mais de 80% dos folículos permanecendo intactos após 6 dias da enxertia. Curiosamente, as taxas de sobrevida folicular relatadas na literatura após o transplante de tecido ovariano humano congelado descongelado para o peritônio de camundongos imunodeficientes são de apenas cerca de 30%10,14,18,43,44, o que é muito menor do que no presente estudo. Nossos achados de maior sobrevida folicular após a enxertia de tecido ovariano humano para CAM corroboram nossos dados publicados recentemente, nos quais demonstramos que a CAM inibe a ativação folicular e aapoptose24. Além disso, os vasos sanguíneos aviários foram capazes de penetrar nos implantes, como demonstrado pela presença de eritrócitos aviários após apenas 1 dia do transplante. Em suma, esses resultados demonstram que a abordagem CAM é um modelo adequado para examinar ainda mais o transplante de tecido ovariano humano, uma vez que suporta a sobrevivência do tecido.

A principal desvantagem do modelo CAM é o período limitado durante o qual a enxertia é possível. De fato, o transplante pode ser realizado o mais cedo no 7º dia de DE, assim que a CAM tiver se desenvolvido suficientemente, até o 17º dia, antes que os embriões de pintinhos adquiram imunocompetência e eclodam. Apesar da curta duração da enxertia, o modelo CAM ainda é uma ferramenta útil para o estudo do transplante de tecido ovariano humano em seus primeiros estágios isquêmicos. Pode-se também utilizar esse modelo para testar o impacto de fatores pró-angiogênicos, agentes antioxidantes protetores, citocinas, hormônios relacionados ao crescimento e à reprodução e fatores que controlam a ativação folicular em tecido ovariano humano enxertado, tudo em condições experimentais que podem ser facilmente controladas25,45.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Os autores agradecem a Mira Hryniuk, BA, pela revisão da língua inglesa do artigo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agani hypodermic needle, 19 G Terumo Europe AN*1950R1 19 G needle to aspirate albumen
Terumo syringe, 5 mL concentric Luer lock Terumo Europe SS*05LE1 5-mL sterile syringe
Caseviewer v2.2 3DHISTECH Image analysis software
Diethyl ether Merck Chemicals 603-022-00-4 Sterile ether to traumatize the CAM
Eosin Y aqueous solution 0.5% Merck 1098441000 Staining solution
Formaldehyde 4% aqueous solution buffered (Formalin 10%) VWR 97139010 Formaldehyde used for tissue fixation
Fridge Liebherr 7081260 Fridge at 4 °C used for paraffin-embedding
Heating plate Schott SLK2 Hot plate used to dry the slides
Incubator Thermo Forma Scientific 3111 10365156 Oven used for slide incubation
Leica CLS 150 XE microscope cold light source Leica CLS 150 XE Focal cold light source to candle the eggs
Lens cleaning tissue, grade 541 VWR 111-5003 Tissue to soak in sterile ether to traumatize the CAM
Mayer's hematoxylin MERCK 1092491000 Staining solution
Methanol VWR 20847307 Methanol
Microtome ThermoScientific-MICROM HM325-2 Microtome
Pannoramic P250 Flash III 3DHISTECH / Slide scanner at 20x magnification
Paraformaldehyde  Merck 1,04,00,51,000 Paraffin-embedding solution
Paraplast Plus R Sigma P3683-1KG Paraffin
Petri dish, 60x15 mm, sterile Greiner 628161 Sterile petri dish
Pin holder Fine Science Tools 26016-12 Pin holder
Polyhatch Brinsea CP01F Egg incubator with automatic rotator
Scroll saw blade, 132 mm Sencys / Saw blade to create a window in the eggshell
Stainless steel insert pins Fine Science Tools 26007-02 Straight pin to make a hole in the eggshell
Steril-Helios  Angelantoni Industrie ST-00275400000 Laminar flow hood
Superfrost Plus bords rodés 90° VWR 631-9483 Glass slides 
Tissue-Tek VIP 6Al Sakura 60320417-0711 VID6E3-1 Automatic embedding device
Titanium forceps Fine Science Tools 11602-16 Forceps for eggshell removal and ovarian tissue manipulation
Toluene, pa VWR 28701364 Paraffin-embedding solution

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References

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Biologia Edição 196 Ativação de Folículos Perda de Folículos Criopreservação Transplante Modelos de Roedores Alternativas Custo-efetivo Economia de Tempo Considerações Éticas Xenoenxerto Tecido Ovariano Humano Imunodeficiência Angiogênese Processo de Perda de Folículo Pós-Enxerto Modelo de Xenoenxertia CAM Tempo de Revascularização Viabilidade Tecidual
Modelo de membrana corioalantóide de pintinhos (CAM) como ferramenta para o estudo do transplante de tecido ovariano
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Hossay, C., Cacciottola, L., Storder, S., Van Kerk, O., Dolmans, M. M. The Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Model as a Tool to Study Ovarian Tissue Transplantation. J. Vis. Exp. (196), e64867, doi:10.3791/64867 (2023).

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