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Biology

डिम्बग्रंथि ऊतक प्रत्यारोपण का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण के रूप में चिक Chorioallantoic झिल्ली (सीएएम) मॉडल

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/64867
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Gynecology Research Unit, Institut de Recherche Expérimentale et Clinique, Université Catholique de Louvain, 2Gynecology Department, Cliniques Universitaires Saint-Luc

Summary

यहाँ, हम मानव डिम्बग्रंथि ऊतक के लिए एक लड़की chorioallantoic झिल्ली (सीएएम) xenografting मॉडल विकसित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन और तकनीक की प्रभावशीलता का प्रदर्शन, भ्रष्टाचार पुनरोद्धार समय सीमा, और एक 6 दिन ग्राफ्टिंग अवधि भर में ऊतक व्यवहार्यता.

Abstract

डिम्बग्रंथि ऊतक क्रायोप्रेज़र्वेशन और प्रत्यारोपण प्रजनन क्षमता को संरक्षित करने के लिए एक प्रभावी रणनीति है, लेकिन इसमें एक बड़ी खामी है, अर्थात् असामान्य कूप सक्रियण और मृत्यु के कारण पुनर्रोपण के तुरंत बाद होने वाली बड़े पैमाने पर कूप हानि। कृंतक कूप सक्रियण की जांच के लिए बेंचमार्क मॉडल हैं, लेकिन लागत, समय और नैतिक विचार तेजी से निषेधात्मक होते जा रहे हैं, इस प्रकार विकल्पों के विकास को चला रहे हैं। चिक कोरियोएलेंटोइक मेम्ब्रेन (सीएएम) मॉडल विशेष रूप से आकर्षक है, सस्ती है और 17 दिन के बाद तक प्राकृतिक इम्यूनोडेफिशिएंसी को बनाए रखता है, जिससे मानव डिम्बग्रंथि ऊतक के अल्पकालिक ज़ेनोग्राफ्टिंग का अध्ययन करना आदर्श हो जाता है। सीएएम भी अत्यधिक संवहनी है और व्यापक रूप से एंजियोजेनेसिस का पता लगाने के लिए एक मॉडल के रूप में उपयोग किया गया है। यह यह इन विट्रो मॉडल में एक उल्लेखनीय लाभ देता है और प्रारंभिक पोस्ट-ग्राफ्टिंग कूप हानि प्रक्रिया को प्रभावित करने वाले तंत्र की जांच की अनुमति देता है। इस के साथ साथ उल्लिखित प्रोटोकॉल मानव डिम्बग्रंथि ऊतक के लिए एक सीएएम xenografting मॉडल के विकास का वर्णन करना है, तकनीक की प्रभावशीलता में विशिष्ट अंतर्दृष्टि के साथ, भ्रष्टाचार revascularization समय सीमा, और एक 6 दिन ग्राफ्टिंग अवधि भर में ऊतक व्यवहार्यता.

Introduction

ऑन्कोलॉजिकल और सौम्य संकेतों के साथ-साथ सामाजिक कारणों से प्रजनन संरक्षण की मांग हाल के दशकों में नाटकीय रूप से बढ़ी है। हालांकि, घातक और गैर-घातक बीमारियों को ठीक करने के लिए उपयोग किए जाने वाले विभिन्न उपचार गोनाड्स के लिए अत्यधिक विषाक्त होते हैं और इसके परिणामस्वरूप आईट्रोजेनिक समयपूर्व डिम्बग्रंथि अपर्याप्तता हो सकती है, जिससे अंततः बांझपनहो सकता है। प्रजनन संरक्षण के लिए स्थापित तकनीकों में भ्रूण क्रायोप्रिजर्वेशन, अपरिपक्व या परिपक्व oocyte विट्रीफिकेशन, और डिम्बग्रंथि ऊतक क्रायोप्रेज़र्वेशन 2,3,4शामिल हैं। डिम्बग्रंथि ऊतक ठंड प्रीप्यूबर्टल लड़कियों या महिलाओं में प्रजनन क्षमता को संरक्षित करने के लिए एकमात्र उपलब्ध विकल्प है जिन्हें तत्काल कैंसर चिकित्सा की आवश्यकता होती है। डिम्बग्रंथि ऊतक प्रत्यारोपण के बाद अंतःस्रावी समारोह की बहाली 95% से अधिक विषयों में होती है, जिसमें जीवित जन्म दर 18% से 42% तक होती है5,6,7,8,9.

हालांकि जमे हुए-पिघले डिम्बग्रंथि ऊतक का प्रत्यारोपण सफल साबित हुआ है, फिर भी सुधार की गुंजाइश है। दरअसल, डिम्बग्रंथि cortical टुकड़े संवहनी anastomosis के बिना प्रत्यारोपित कर रहे हैं के रूप में, वे हाइपोक्सिया की अवधि का अनुभव जिसके दौरान भ्रष्टाचार revascularizationजगह लेता है 10,11,12. मानव डिम्बग्रंथि ऊतक प्रत्यारोपण की जांच करने वाले अधिकांश अध्ययनों ने एक ज़ेनोग्राफ्टिंग मॉडल का उपयोग किया है, जिसमें डिम्बग्रंथि ऊतक को इम्यूनोडेफिशिएंसी चूहों में प्रत्यारोपित किया जाता है। ज़ेनोग्राफ्ट्स के पूर्ण पुनरोद्धार में लगभग 10 दिन लगते हैं, जिसमें मेजबान और ग्राफ्ट दोनों जहाजों कार्यात्मक जहाजों 12,13,14के गठन में योगदान करते हैं। कूप रिजर्व के आसपास 50% -90% भ्रष्टाचार पुनरोद्धार10,15,16 के पूरा होने से पहले इस हाइपोक्सिक खिड़की के दौरान खो जाता है. यह दृढ़ता से सुझाव दिया गया है कि यह बड़े पैमाने पर कूप हानि दोनों प्रत्यक्ष कूप मृत्यु के माध्यम से होती है, जैसा कि ग्राफ्टिंग के बाद छोड़ी गई पूर्ण कूप संख्या में कमी और प्राइमर्डियल कूप विकास की सक्रियता से प्रदर्शित होता है, जैसा कि बढ़ते रोम17,18 की बढ़ी हुई दरों की ओर कूप अनुपात में परिवर्तन से संकेत मिलता है।

दिलचस्प बात यह है कि चिक कोरियोएलेंटोइक झिल्ली (सीएएम) के लिए ग्राफ्ट किए गए विभिन्न पशु डिम्बग्रंथि ऊतकों का उपयोग करके पिछले शोध कार्य, जिसमें पेरिटोनियम की विशिष्ट ग्राफ्टिंग साइट की नकल करने वाला संविधान है, ने सहज कूप सक्रियण के निषेध की सूचना दी है, जिसमें प्राइमर्डियल कूप रिजर्व 10 दिनों तक बरकरार रहता है 19,20,21,22. हमारी टीम पहले सीएएम के लिए जमे हुए पिघले मानव डिम्बग्रंथि ऊतक के ग्राफ्टिंग अपने पहले इस्कीमिक चरणों23 में मानव डिम्बग्रंथि ऊतक प्रत्यारोपण की जांच के लिए एक विश्वसनीय दृष्टिकोण का गठन किया है कि प्रदर्शन किया और हाल ही में इस ग्राफ्टिंग विधि कूप सक्रियण24 का मुकाबला करने में सक्षम था कि पता चला.

सीएएम मॉडल विशेष रूप से न केवल इसलिए अपील कर रहा है क्योंकि अंडे चूहों की तुलना में बहुत सस्ता हैं, बल्कि सीएएम की अत्यधिक संवहनी प्रकृति के कारण भी, कूप सक्रियण और डिम्बग्रंथि भ्रष्टाचार पुनरोद्धार के बीच संबंध की जांच की अनुमति देता है। एवियन प्रणाली, वास्तव में, एंजियोजेनेसिस25 का अध्ययन करने के सबसे आम और बहुमुखी तरीकों में से एक है। चिक भ्रूण विकास (ईडी) को हैचिंग तक 21 दिन लगते हैं, और सीएएम पहले 4-5 दिनों के भीतर एलेंटोइस और कोरियोन26 के संलयन के माध्यम से बनता है। विशेष रूप से, चूजा भ्रूण ईडी के दिन 17 तक एक स्वाभाविक रूप से immunodeficiency मेजबान है, तो xenografting प्रयोगों भ्रष्टाचार अस्वीकृति27,28 के किसी भी जोखिम के बिना किया जा सकता है. इसके अलावा, सीएएम मॉडल दृष्टिकोण यूरोपीय कानून29 के संदर्भ में किसी भी नैतिक या कानूनी चिंताओं को नहीं उठाता है, जिससे यह अन्य पशु मॉडल के लिए एक आकर्षक विकल्प बन जाता है। प्रजनन की स्थिति के संबंध में, चूजे भ्रूण को केवल 40% -60% की सापेक्ष वायु आर्द्रता के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट इनक्यूबेटर की आवश्यकता होती है। ये सीमित प्रयोग आवश्यकताएं इम्यूनोडेफिशिएंसी चूहों के उपयोग की तुलना में अनुसंधान लागत को काफी कम करती हैं।

इस के साथ प्रस्तुत प्रोटोकॉल मानव डिम्बग्रंथि ऊतक के लिए एक सीएएम xenografting मॉडल के विकास का वर्णन और तकनीक की प्रभावशीलता में विशिष्ट अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए करना है, भ्रष्टाचार revascularization के समय सीमा, और एक 6 दिन ग्राफ्टिंग अवधि से अधिक ऊतक व्यवहार्यता. यह प्रोटोकॉल प्रारंभिक पोस्ट-ग्राफ्टिंग कूप हानि के पीछे तंत्र की जांच करने और इस घटना पर कई एजेंटों (विकास कारक, हार्मोन, आदि) के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए बहुत रुचि का हो सकता है।

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Protocol

मानव ऊतक के उपयोग को कैथोलिक विश्वविद्यालय लौवेन के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था। रोगियों ने अनुसंधान उद्देश्यों के लिए अपने डिम्बग्रंथि ऊतक के उपयोग के लिए अपनी लिखित सूचित सहमति दी।

1. दिन 0 अंडे का आदेश देना जो भ्रूण होने की अत्यधिक संभावना है

  1. एक प्रमाणित प्रयोगशाला-ग्रेड लोहमैन-चयनित सफेद लेगॉर्न अंडे आपूर्तिकर्ता का पता लगाएं जो भ्रूण के अंडे की उच्च दर की रिपोर्ट करता है, जो मुख्य रूप से चूजों की उम्र पर निर्भर है।

2. इनक्यूबेशन के लिए अंडे तैयार करना

  1. अंडे के आने से पहले, अंडे इनक्यूबेटर को 40% -60% सापेक्ष वायु आर्द्रता में 37 डिग्री सेल्सियस तक इकट्ठा और संतुलित करें। इनक्यूबेटर में थर्मामीटर और हाइग्रोमीटर डालकर तापमान और हवा की आर्द्रता की निगरानी करें। सुनिश्चित करें कि इनक्यूबेटर का ढक्कन एक कांच की खिड़की से सुसज्जित है ताकि इनक्यूबेटर के आंतरिक मापदंडों को खोलने के बिना इसे खोलने की अनुमति मिल सके (चित्र 1)।
  2. एक प्रमाणित प्रयोगशाला-ग्रेड अंडे आपूर्तिकर्ता से लोहमैन-चयनित सफेद लेगॉर्न चूजों से दिन 0 अंडे प्राप्त करने के बाद, गोले की सतह को आर्द्र कागज से साफ करें, और उन्हें तुरंत सुखाएं।
    नोट: चूंकि अंडे के छिलके की झिल्ली झरझरा है, इसलिए संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए अंडे की सतहों को साफ करने और इनक्यूबेटर के भीतर आर्द्रता को नियंत्रित करने के लिए आटोक्लेव्ड पानी का उपयोग किया जा सकता है।
  3. एक मार्कर (जैसे, तारीख और अंडे की संख्या) का उपयोग करके अंडों को लेबल करें।
  4. अंडे को नुकीले सिरे से नीचे की ओर रखते हुए इनक्यूबेट करें, और सीएएम को विकसित करने की अनुमति देने के लिए उन्हें घुमाएं। अंडे को मैन्युअल रूप से प्रति दिन दो से तीन बार 180° घुमाएं या स्वचालित रोटेटर का उपयोग करें।
    नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कि अंडे वास्तव में घुमाए जा रहे हैं, अंडे के छिलके को पेंसिल या मार्कर का उपयोग करके दो विरोधी पार्श्व पक्षों पर "X" और "O" के साथ चिह्नित किया जा सकता है। इनक्यूबेटर के ढक्कन में कांच की खिड़की डिवाइस को खोले बिना अंडे के रोटेशन की जांच करने की अनुमति देती है।

3. ईडी के तीसरे दिन अंडे का छिलका खोलना

नोट: ईडी के दिन 3 पर अंडे के छिलके में एक आयताकार खिड़की बनाई जाती है।

  1. बाँझ परिस्थितियों में काम करने के लिए लामिना का प्रवाह हुड तैयार करें। हुड के नीचे निम्नलिखित उपकरणों रखें, और उन्हें 70% इथेनॉल में कीटाणुरहित (यदि पहले से निष्फल नहीं है):
    -एग रैक
    -एग कैंडलर या फोकल कोल्ड लाइट सोर्स
    -मार्कर
    -बाँझ सीधे पिन
    -बाँझ 19 जी सुई
    -5 एमएल बाँझ सिरिंज
    -स्क्रॉल देखा ब्लेड
    -बाँझ संदंश
    -चिपकने वाला टेप
  2. इनक्यूबेटर से एक अंडे को हुड के नीचे रखे अंडे के रैक में स्थानांतरित करें, और अंडे के रोटेटर को बंद कर दें।
  3. अंधेरे में, अंडे के कैंडलर (या फोकल कोल्ड लाइट सोर्स) को अंडे के छिलके के खिलाफ रखकर अंडे की एयर पॉकेट की पहचान करें। हवा की जेब अंडे के कुंद अंत में स्थानीयकृत है। अंडे के छिलके पर हवा की जेब के केंद्र को इंगित करने के लिए एक मार्कर का उपयोग करें।
  4. लाइट चालू करें। अंडे के छिलके में एक छोटा सा छेद बनाएं जहां इसे धीरे से एक बाँझ सीधे पिन को घुमाकर चिह्नित किया जाता है। लगभग 1 मिमी व्यास का एक छोटा उद्घाटन आमतौर पर पर्याप्त होता है।
    नोट: सावधान रहें कि पिन को अंडे के माध्यम से सभी तरह से धक्का न दें। यदि ऐसा होता है, तो अंडे को त्याग दें।
  5. एक बाँझ 19 जी सुई को एक बाँझ 5 एमएल सिरिंज से कनेक्ट करें।
  6. अंधेरे में, अंडे के कैंडलर (या फोकल कोल्ड लाइट स्रोत) का उपयोग करके जर्दी थैली का पता लगाएं, और अंडे के नीचे की ओर 45 डिग्री पर बाँझ 19 जी सुई के साथ चरण 3.4 में किए गए छेद के माध्यम से अंडे को पंचर करें; जर्दी थैली को बाधित न करने के लिए बहुत सावधानी बरतें। खोल से सीएएम को अलग करने के लिए एल्बमेन के 1.5-2 एमएल के बीच महाप्राण करें, और फिर चिपकने वाला टेप के एक टुकड़े के साथ छेद को बंद करें।
    नोट: यदि जर्दी थैली आकांक्षा के दौरान बाधित होती है, तो सिरिंज में एस्पिरेटेड तरल पारदर्शी (एल्ब्यूमेन) के बजाय पीले रंग का होगा। यदि ऐसा होता है, तो सुई और सिरिंज को बदलें। यदि अंडे की जर्दी की अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा चूसा जाता है, तो यह भ्रूण की व्यवहार्यता को खतरे में डाल सकता है।
  7. लाइट चालू करें। अंडे को क्षैतिज रूप से रखें, और एक मार्कर के साथ 1 सेमी x 1.5 सेमी मापने वाली एक आयताकार खिड़की खींचें। खिड़की को मानक चिपकने वाली टेप की सामान्य चौड़ाई से बड़ा न बनाएं।
  8. अंडे को एक हाथ में पकड़ें, और धीरे से स्क्रॉल आरा ब्लेड का उपयोग करके अंडे के छिलके में पहले से खींची गई खिड़की को देखें। सुनिश्चित करें कि खोल दरार नहीं करता है और उदास सीएएम के लिए सभी तरह से कटौती नहीं करता है। खोल धूल और मलबे को हटाने के लिए नियमित रूप से उड़ाएं।
  9. देखा खोल के आयताकार टुकड़े के नीचे बाँझ संदंश स्लाइड, और चतुराई से समझ सीएएम को नुकसान पहुँचाए बिना सफाई से इसे दूर करने के लिए. इसके अतिरिक्त, भ्रूण और उसके सीएएम को देखने में सक्षम होने के लिए सफेद बाहरी आवरण झिल्ली को त्यागें।
    नोट: कुछ अंडे के छिलके की धूल या मलबे सीएएम पर गिर जाता है, तो इसे बाँझ संदंश का उपयोग करके हटाया जा सकता है, सीएएम को फाड़ने के लिए बहुत सावधान नहीं किया जा रहा है।
  10. व्यवहार्य भ्रूण अंडे की पहचान करें। वे अपने स्पष्ट एल्ब्यूमेन और भ्रूण के चारों ओर संवहनी अंगूठी से समझ में आते हैं, जहां कभी-कभी इस स्तर (ईडी के दिन 3) में भी धड़कते दिल का पता लगाया जा सकता है। गैर-निषेचित या मृत भ्रूण त्यागें।
  11. निर्जलीकरण से बचने के लिए नई बनाई गई खिड़की पर चिपकने वाला टेप रखें। हटाने में आसानी के लिए एक छोर को अपने ऊपर मोड़ना सुनिश्चित करें।
  12. अंडे को इनक्यूबेटर में वापस रखें, जिसमें खुली खिड़की ऊपर की ओर हो और टेप सीएएम को न छू रहा हो। अंडे को लुढ़कने से रोकने के लिए कागज के मुड़े हुए टुकड़े या अंडे की रैक के हिस्से का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि घूमने वाली ट्रे बंद है।
  13. शेष अंडे खोलने के लिए चरण 3.2-3.12 दोहराएं।

4. सीएएम के लिए जमे हुए पिघले मानव डिम्बग्रंथि ऊतक ग्राफ्टिंग

नोट: सीएएम में प्रत्यारोपण आदर्श रूप से ईडी के 7-10 दिनों के बीच शुरू किया जाना चाहिए।

  1. पिघलना क्रायोप्रेज़्ड डिम्बग्रंथि कॉर्टिकल स्ट्रिप्स लामिना का प्रवाह हुड के तहत प्रोटोकॉल कहीं औरवर्णित 30.
  2. कॉर्टिकल स्ट्रिप्स को 4 मिमी x 2 मिमी x 1 मिमी के तीन टुकड़ों में काटें। एक गैर grafted नियंत्रण के रूप में एक टुकड़ा और 1 दिन या 6 दिनों के लिए xenografting के लिए अन्य दो का प्रयोग करें.
    नोट: यदि पर्याप्त ऊतक उपलब्ध है, तो डुप्लिकेट में काम करें।
  3. इनक्यूबेटर से एक अंडे को हुड के नीचे स्थित अंडे की रैक में स्थानांतरित करें, जिसमें खिड़की ऊपर की ओर हो।
  4. खिड़की से टेप छीलें, और सुनिश्चित करें कि भ्रूण व्यवहार्य है। इस स्तर पर, व्यवहार्य भ्रूण में व्यापक वाहिका, एक स्पष्ट एल्ब्यूमेन, एक दृश्य दिल की धड़कन और कुछ भ्रूण आंदोलन होते हैं।
  5. धीरे उपकला सतह पर बाँझ ईथर निकाले लेंस कागज की एक 1 सेमी2 पट्टी बिछाने और इसे तुरंत हटाने के द्वारा सीएएम के एक छोटे से क्षेत्र आघात द्वारा grafting साइट तैयार करें.
    नोट: सीएएम एक अभेद्य बाधा है जब तक कि झिल्ली को डबल उपकला परत के ऊपरी पेरिडर्मल भाग को हटाने से आघात नहीं किया गया है, जिससे बेसल परत बरकरार है। यह तकनीक घाव भरने को सक्रिय करके पुनरोद्धार प्रक्रिया को भी बढ़ाती है। यदि बाँझ ईथर-निकाले गए लेंस पेपर सीएएम पर बहुत लंबे समय तक रहता है, तो झिल्ली लेंस पेपर का पालन कर सकती है और फाड़ सकती है। यदि ऐसा होता है, तो अंडे को त्याग दें।
  6. माइक्रोसर्जिकल संदंश के साथ एक जमे हुए पिघले हुए डिम्बग्रंथि कॉर्टिकल पट्टी (4 मिमी x 2 मिमी x 1 मिमी) को समझें, और सीएएम के खिलाफ मज्जा पक्ष के साथ दर्दनाक सीएएम पर रखें। प्रति अंडे एक ऊतक टुकड़ा ग्राफ्ट।
  7. चिपकने वाली टेप के साथ खिड़की को कवर करें, और ध्यान से अंडे को इनक्यूबेटर में लौटाएं। सुनिश्चित करें कि अंडे का छिलका सीधा बैठा है और अंडा सुरक्षित है।
  8. सभी शेष ऊतकों के ग्राफ्टिंग के लिए चरण 4.1-4.7 दोहराएं।
    नोट: भ्रूण व्यवहार्यता का आकलन करने और वाहिका में परिवर्तन की निगरानी करने के लिए प्रत्यारोपण प्रत्येक ग्राफ्टिंग दिन पर जाँच की जानी चाहिए।

5. ग्राफ्ट की कटाई

नोट: Xenografts ईडी के दिन 17 द्वारा नवीनतम पर काटा जाना चाहिए, क्योंकि भ्रूण की प्रतिरक्षा प्रणाली परिपक्व और दिन 18 से सक्षम हो जाता है.

  1. अंडे को एक रैक पर रखें, और बेहतर ग्राफ्ट विज़ुअलाइज़ेशन और आसान हेरफेर की अनुमति देने के लिए अंडे के छिलके में खिड़की को बड़ा करें।
  2. भ्रष्टाचार मैक्रोस्कोपिक रूप से मूल्यांकन करें, और भ्रष्टाचार के प्रति सीएएम की संवहनी प्रतिक्रिया पर विशेष ध्यान दें। रिकॉर्ड के लिए डिजिटल तस्वीरें या वीडियो लें।
  3. संदंश के साथ ऊतक या आसपास के सीएएम समझ, और कैंची या एक स्केलपेल का उपयोग करने के लिए सीएएम से भ्रष्टाचार ध्यान से आबकारी करने के लिए.
    नोट: ग्राफ्ट ग्राफ्टिंग के लगभग 3 दिन में सीएएम की दूसरी परत के साथ कवर हो जाते हैं और अंततः समझाया हो जाता है। वे 6 दिन तक अंडे के अंदर भी चले गए होंगे, जिससे कुछ मामलों में उन्हें पुनः प्राप्त करना मुश्किल हो जाता है।
  4. दिए गए प्रयोग के लिए उपयुक्त किसी भी विधि द्वारा आबकारी ऊतकों का विश्लेषण करें। वर्तमान अध्ययन में, ऊतक टुकड़े पैराफॉर्मलडिहाइड, पैराफिन-एम्बेडेड में तय किए गए थे और नीचे उल्लिखित चरणों का पालन करते हुए हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन के साथ दाग दिए गए थे:
    1. 24 घंटे के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में टुकड़े को ठीक करें, और तालिका 1में उल्लिखित चरणों के साथ एक स्वचालित एम्बेडिंग डिवाइस का उपयोग करके उन्हें पैराफिन में एम्बेड करें।
    2. पैराफिन एम्बेडेड ब्लॉक 4 पर रात भर छोड़ दें डिग्री सेल्सियस उन्हें एक microtome के साथ 5 माइक्रोन मोटी वर्गों में काटने से पहले.
    3. एक गर्म प्लेट (30 डिग्री सेल्सियस) पर रखा एक गिलास स्लाइड पर ऊतक वर्गों फैलाएं, और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में 24 घंटे के बाद उन्हें 2 घंटे के लिए सूखने के लिए छोड़ दें।
    4. बाद में, hematoxylin और eosin के साथ स्लाइड दाग एक प्रोटोकॉल कहीं और31 वर्णित निम्नलिखित. इसके बाद, स्लाइड स्कैनर का उपयोग करके नमूनों को डिजिटाइज़ करें, और एक छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके उनका विश्लेषण करें।

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Representative Results

चूजे के भ्रूण के जीवित रहने की दर
विंडोइंग (ईडी का दिन 3) से डिम्बग्रंथि ऊतक ग्राफ्टिंग (ईडी का दिन 7) तक भ्रूण की जीवित रहने की दर 79% (33/42) थी। चूंकि भ्रूण वाले दिन 0 अंडे का प्रतिशत अज्ञात है, इसलिए लोहमैन-चयनित सफेद लेगॉर्न मुर्गियों से अधिसंख्य दिन 0 अंडे का आदेश दिया गया था ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि पर्याप्त भ्रूण वाले अंडे ग्राफ्टिंग के लिए उपलब्ध होंगे। ग्राफ्टिंग के लिए कुल 23 व्यवहार्य दिन 7 अंडों का उपयोग किया गया था, जिनमें से एक पहले 24 घंटे के दौरान नष्ट हो गया, जिसके परिणामस्वरूप प्रत्यारोपण (22/23) के बाद भ्रूण की कुल जीवित रहने की दर 96% हो गई।

ग्राफ्ट का मैक्रोस्कोपिक पहलू
ग्राफ्टिंग के 1 दिन के बाद, ग्राफ्ट 100% (10/10) मामलों में व्यवहार्य दिखते थे और पहले से ही कम से कम आंशिक रूप से सीएएम का पालन करते थे, उनके संवहनीकरण के लिए आवश्यक रक्त वाहिकाओं का एक पहिया-स्पोक पैटर्न दिखा रहा था (चित्र 2ए, बी)। ग्राफ्टिंग के 6 दिनों के बाद, सभी प्रत्यारोपण अभी भी पालन (चित्रा 2 सी) थे, दो के अलावा जो सीएएम से संलग्न नहीं थे। उन्होंने एक नेक्रोटिक उपस्थिति ली और आगे के विश्लेषण (चित्रा 3) से बाहर रखा गया, जिसके परिणामस्वरूप 6 दिनों के बाद 83% (10/12) की ग्राफ्टेड ऊतक जीवित रहने की दर हुई। सब सब में, मानव डिम्बग्रंथि grafts की व्यवहार्यता मूल्यांकन 91% (20/22) की एक समग्र ऊतक जीवित रहने की दर का पता चला, ग्राफ्टिंग के दिन के बावजूद (तालिका 2).

दिन 3 के बाद प्रत्यारोपण के आसपास, grafts सीएएम की एक दूसरी परत के साथ कवर किया जा करने के लिए पाया गया, और वे अंततः encapsulated बन गया, जिससे भी बेहतर भ्रष्टाचार संवहनी (चित्रा 2C) के लिए अग्रणी. कुल मिलाकर, प्रत्यारोपण के 80% भी अंडे (चित्रा 2 डी) में प्रवेश किया था, कुछ मामलों में यह मुश्किल 6 दिन पर उन्हें पुनः प्राप्त करने के लिए कर रही है.

ग्राफ्ट का सूक्ष्म मूल्यांकन
पांच अलग-अलग रोगियों से प्राप्त कुल 30 जमे हुए मानव डिम्बग्रंथि के टुकड़ों का विश्लेषण किया गया और पैराफिन में एम्बेडेड दिन 0, दिन 1, या दिन 6 पर 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में तय किया गया, और क्रमिक रूप से हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन के लिए 5 माइक्रोन वर्गों में कटौती की गई(चित्रा 4)।

डिम्बग्रंथि कूप जीवित रहने की दर का आकलन करने के लिए, रोम को 12 यादृच्छिक हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन-दाग वाले वर्गों में प्रति समय बिंदु और प्रति रोगी में गिना गया था। एक दृश्य oocyte के साथ केवल रूपात्मक रूप से सामान्य रोम32 विश्लेषण के लिए ध्यान में रखा गया था. स्वस्थ रोम सभी समय बिंदुओं (चित्रा 4 बी-डी) पर मनाया गया। कूप जीवित रहने की दर की गणना शेष कूप घनत्व (रोम/ मिमी 3 की संख्या) का निर्धारण करके और गैर-ग्राफ्टेड नियंत्रणों (100% माना जाता है) में कूप घनत्व को सामान्य करने के बाद की गई थी। प्रत्यारोपण के बाद कूप घनत्व कम हो गया, लेकिन सांख्यिकीय महत्व (पी > 0.8) (तालिका 2) तक पहुंचने के लिए पर्याप्त नहीं है। इसी तरह, ग्राफ्टिंग अवधि के दौरान कूप जीवित रहने की दर को बनाए रखा गया था, जो दिन 1 पर 95% ± 19% और दिन 6 पर 27% ± 83% था (पी > 0.5)।

xenografted डिम्बग्रंथि ऊतक से वाहिकाओं में एवियन लाल रक्त कोशिकाओं का पता लगाने के द्वारा पुनरोद्धार प्रक्रिया की जांच की गई थी। एवियन एरिथ्रोसाइट्स आसानी से समझ में आते हैं क्योंकि वे न्यूक्लियेटेड होते हैं (चित्र 4ए, सी, डी)। हैरानी की बात है, हम प्रत्यारोपण के केवल 1 दिन के बाद प्रत्यारोपण के 30% में डिम्बग्रंथि के जहाजों में एवियन एरिथ्रोसाइट्स का निरीक्षण करने में सक्षम थे और 6 दिन तक सभी प्रत्यारोपण में, बहुत तेजी से पुनरोद्धार(तालिका 2)का प्रदर्शन करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: अंडा इनक्यूबेटर। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: व्यवहार्य प्रत्यारोपण के मैक्रोस्कोपिक पहलू। (ए) ग्राफ्टिंग दिन 0. (बी) 1 दिन पर प्रत्यारोपण, सीएएम डिम्बग्रंथि ऊतक की ओर रक्त वाहिकाओं का एक पहिया बात पैटर्न दिखा रहा है. (सी) प्रत्यारोपण 6 दिन पर सीएएम द्वारा समझाया गया, जिससे और भी बेहतर ग्राफ्ट संवहनीकरण हुआ। (डी) अंडे को भेदने वाला ग्राफ्ट। तीर ग्राफ्टेड डिम्बग्रंथि ऊतक को इंगित करते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: नेक्रोटिक प्रत्यारोपण का मैक्रोस्कोपिक पहलू। (ए) ग्राफ्टिंग के दिन 0 पर स्वस्थ दिखने वाले डिम्बग्रंथि ऊतक। (बी) प्रत्यारोपण का नेक्रोटिक पहलू 6 दिन बाद। तीर डिम्बग्रंथि ऊतक को इंगित करते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: प्रत्यारोपण का सूक्ष्म पहलू। Hematoxylin और प्रत्यारोपण के eosin-दाग वर्गों के लिए grafted (ए, बी) 1 दिन और के लिए (सी, डी) 6 दिन. एरोहेड एवियन लाल रक्त कोशिकाओं को (ए) 1 दिन और (सी, डी) ग्राफ्टिंग के 6 दिनों के बाद डिम्बग्रंथि वाहिकाओं को छिद्रित करने की ओर इशारा करते हैं। तीर (बी) 1 दिन और (सी, डी) 6 दिनों के लिए ग्राफ्ट किए गए प्रत्यारोपण में स्वस्थ दिखने वाले प्राइमर्डियल रोम का संकेत देते हैं। स्केल बार: 50 माइक्रोन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

सीढ़ी स्नान समय
दूसरा निर्धारण 1 फॉर्मेलिन 10% स्नान 2 घंटे
निर्जलीकरण 7 मेथनॉल स्नान 7x 1 घंटे
स्‍पष्‍टीकरण 3 टोल्यूनि स्नान 3x 1 घंटे
संसेचन 3 तरल पैराफिन स्नान (60 °C) 15 मिनट - 30 मिनट - 30 मिनट

तालिका 1: पैराफिन एम्बेडिंग चरण।

गैर-ग्राफ्टेड ग्राफ्टिंग दिन 1 ग्राफ्टिंग दिन 6 पी-मान
ग्राफ्ट का मैक्रोस्कोपिक पहलू
ऊतक जीवित रहने की दर - 100% (10/10) 83% (10/12) /
ग्राफ्ट का सूक्ष्म पहलू
कूप घनत्व (n/mm3) 848 ± 272 817 ± 370 684 ± 236 पी > 0.8
कूप जीवित रहने की दर 100% 95% ± 19% 83% ± 27% पी > 0.5
प्रत्यारोपण में मौजूद एवियन लाल रक्त कोशिकाएं 0% (0/10) 30% (3/10) 100% (10/10) /

तालिका 2: परिणाम. एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके किए गए सांख्यिकीय विश्लेषण, इसके बाद सिडक सुधार। परिणाम मानक विचलन ± माध्य के रूप में व्यक्त किए जाते हैं।

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Discussion

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल का सबसे चुनौतीपूर्ण हिस्सा एक खिड़की बनाने से पहले अंडे के छिलके से सीएएम को अलग करने के लिए एल्बमेन को महाप्राण करने के लिए आवश्यक छोटे छेद बना रहा है। बहुत अधिक दबाव लागू करने से ओवरपेनेट्रेशन हो सकता है या अंडे में दरार और नष्ट भी हो सकता है, जिससे सीएएम और उसके वाहिका को अपूरणीय क्षति हो सकती है। सीएएम को अलग करने के प्रारंभिक प्रयासों के दौरान गलतियों को कम से कम रखने के लिए, सीधे पिन का उपयोग करके गैर-निषेचित, किराने से खरीदे गए अंडे के अंडे के छिलके में छोटे छेद बनाने का अभ्यास करने की दृढ़ता से सलाह दी जाती है। इसके अलावा, बैचों में प्रजनन क्षमता की प्राकृतिक परिवर्तनशीलता को देखते हुए, इस तथ्य के साथ कि सभी भ्रूण प्रक्रिया से नहीं बचते हैं, अंडा आपूर्तिकर्ता से अलौकिक अंडे प्राप्त करने की सिफारिश की जाती है। इष्टतम भ्रूण जीवित रहने की दर और एक अच्छी तरह से विकसित सीएएम प्राप्त करने के लिए, अंडों को आदर्श परिस्थितियों में ऊष्मायन करने की आवश्यकता होती है। कम व्यवहार्यता के मामले में, विभिन्न पहलुओं को दोष दिया जा सकता है और जांच की आवश्यकता हो सकती है। अंडा आपूर्तिकर्ता से संपर्क किया जाना चाहिए, आपूर्तिकर्ता से भ्रूण की व्यवहार्यता बस समय में इस बिंदु पर कम हो सकता है. कम अंडे की व्यवहार्यता गलत या अनुचित इनक्यूबेटर सेटिंग्स के कारण भी हो सकती है, जो सीएएम विकास से समझौता कर सकती है। एक स्वतंत्र हाइग्रोमीटर और थर्मामीटर का उपयोग यह सुनिश्चित कर सकता है कि सेटिंग्स सटीक और स्थिर हैं, लेकिन निर्माता द्वारा विस्तृत समस्या निवारण निर्देश प्रदान किए जाने चाहिए। अंत में, यह भी सुझाव दिया गया है कि प्रत्यारोपित अंडे की जाँच भी अक्सर तापमान और आर्द्रता में उतार-चढ़ाव में परिणाम हो सकता है, जो ग्राफ्टेड भ्रूण33 पर हानिकारक प्रभाव हो सकता है.

वर्तमान प्रोटोकॉल में, अंडे के छिलके की खिड़की ईडी के दिन 3 पर भ्रूण से लगभग 2 एमएल एल्ब्यूमेन की आकांक्षा करके सीएएम को खोल से अलग करने के लिए की गई थी, जो बदले में, सीएएम को नुकसान पहुंचाए बिना एक खिड़की के निर्माण की अनुमति देती थी। 4 दिन बाद भ्रूण जीवित रहने की दर 79% थी, जो पिछले अध्ययनों34,35 के अनुरूप थी। सफलता की अलग-अलग डिग्री के साथ अन्य तरीकों की सूचना दी गई है। एक विकल्प यह है कि सीएएम को हवा की थैली में चूषण लागू करके खोल से दूर किया जाए, आमतौर पर ईडी के 7-10 दिन के आसपास। इस विधि अंडे33,36 पंचर किया जा करने की आवश्यकता नहीं है. बाद की तकनीक का उपयोग करके भ्रूण के जीवित रहने की दर की रिपोर्ट करने वाले अध्ययन साहित्य में कुछ और दूर हैं, एक टीम भ्रूण के अस्तित्व36 के 90% तक की रिपोर्ट करती है। विचार करने का एक अन्य विकल्प शेल-कम चिक भ्रूण संस्कृति है, जिसे पूर्व ओवो संस्कृति के रूप में भी जाना जाता है। अंडे का छिलका हटाने भ्रूण के लिए अप्रतिबंधित पहुँच प्रदान करता है, इस प्रकार भ्रूण हेरफेर और सर्जरी की सुविधा और भी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और microcomputed स्थलाकृति37,38 के रूप में जीवित प्रयोगों, के लिए उच्च संकल्प इमेजिंग तकनीक के उपयोग की अनुमति देता है. पूर्व ओवो संस्कृति का संचालन करने के लिए, भ्रूण, जिसमें इसके बहिर्भ्रूणीय झिल्ली शामिल हैं, को ईडी के दिन 2 और दिन 4 के बीच एक विशिष्ट संस्कृति नियंत्रण में स्थानांतरित किया जाता है। हालांकि, यह तकनीक अत्यधिक आक्रामक है, भ्रूण आमतौर पर दिन 12 के आसपास मर रहे हैं और उनमें से 18% से कम दिन 1538,39 तक जीवित रहते हैं।

यहां रिपोर्ट किए गए ज़ेनोग्राफ्टिंग प्रयोगों के दौरान, मानव डिम्बग्रंथि प्रत्यारोपण को सीएएम में ग्राफ्ट किया गया था जो उपकला की सतह पर बाँझ ईथर-निकाले गए लेंस पेपर की एक छोटी पट्टी को लागू करके और इसे तुरंत हटाकर धीरे-धीरे आघात किया गया था। कुल मिलाकर, भ्रूण जीवित रहने की दर उत्कृष्ट थे और ग्राफ्टिंग अवधि के दौरान 96% तक पहुंच गए, जो पिछले अध्ययनों के अनुरूप है जिसमें डिम्बग्रंथि ऊतक के टुकड़ों के प्रत्यारोपण को कैम23,40 में शामिल किया गया था। इसके अलावा, इस दृष्टिकोण भ्रष्टाचार आसंजन दरों को बढ़ाने और neovascularization के बाद की स्थापना को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है, angiogenesis संभावना प्रारंभिक घाव भरने की प्रक्रिया23 द्वारा प्रेरित के साथ. दरअसल, murine घाव चिकित्सा दानेदार ऊतक के लिए xenografting चूहा डिम्बग्रंथि ऊतक भ्रष्टाचार vascularization41 में सुधार करने के लिए पाया गया था. इसी तरह, क्रायोप्रेज़र्व्ड मानव डिम्बग्रंथि ऊतक के ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण के बाद रिपोर्ट किए गए पहले जीवित जन्म में, डोनेज़ एट अल ने एक पेरिटोनियल विंडो बनाई और प्रत्यारोपण स्थल42 में एंजियोजेनेसिस और नवसंवहनीकरण को उत्तेजित करने के लिए आरोपण से 7 दिन पहले अपने मार्जिन को जमा दिया।

ग्राफ्टेड मानव डिम्बग्रंथि ऊतक के हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन के संबंध में, कूप जीवित रहने की दर उत्साहजनक थी, जिसमें 80% से अधिक रोम ग्राफ्टिंग के 6 दिनों के बाद बरकरार थे। दिलचस्प बात यह है कि मानव जमे हुए-पिघले हुए डिम्बग्रंथि ऊतक के प्रत्यारोपण के बाद साहित्य में रिपोर्ट की गई कूप जीवित रहने की दर इम्यूनोडेफिशिएंसी चूहों के पेरिटोनियम में केवल 30% 10,14,18,43,44 है, जो वर्तमान अध्ययन की तुलना में बहुत कम है। सीएएम को मानव डिम्बग्रंथि ऊतक के ग्राफ्टिंग के बाद बढ़ाया कूप अस्तित्व के हमारे निष्कर्ष हमारे हाल ही में प्रकाशित आंकड़ों की पुष्टि करते हैं, जिसमें हम प्रदर्शित करते हैं कि सीएएम कूप सक्रियण और एपोप्टोसिस24 को रोकता है। इसके अलावा, एवियन रक्त वाहिकाएं प्रत्यारोपण में प्रवेश करने में सक्षम थीं, जैसा कि प्रत्यारोपण के सिर्फ 1 दिन बाद एवियन एरिथ्रोसाइट्स की उपस्थिति से प्रदर्शित होता है। सब सब में, इन परिणामों से पता चलता है कि सीएएम दृष्टिकोण आगे मानव डिम्बग्रंथि ऊतक के प्रत्यारोपण की जांच के लिए एक उपयुक्त मॉडल है, क्योंकि यह ऊतक के अस्तित्व का समर्थन करता है.

सीएएम मॉडल का प्रमुख दोष सीमित अवधि है जिसके दौरान ग्राफ्टिंग संभव है। दरअसल, ईडी के दिन 7 पर जल्द से जल्द प्रत्यारोपण किया जा सकता है, जैसे ही सीएएम पर्याप्त रूप से विकसित हो गया है, दिन 17 तक, चूजे भ्रूण प्रतिरक्षाक्षमता और हैच प्राप्त करने से पहले। कम ग्राफ्टिंग अवधि के बावजूद, सीएएम मॉडल अभी भी अपने पहले इस्केमिक चरणों में मानव डिम्बग्रंथि ऊतक प्रत्यारोपण का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है। एक भी प्रोएंजियोजेनिक कारकों के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए इस मॉडल का उपयोग कर सकते हैं, सुरक्षात्मक एंटीऑक्सीडेंट एजेंटों, साइटोकिन्स, विकास- और प्रजनन से संबंधित हार्मोन, और ग्राफ्टेड मानव डिम्बग्रंथि ऊतक में कूप सक्रियण को नियंत्रित कारकों, सभी प्रयोगात्मक शर्तों है कि आसानी से नियंत्रित किया जा सकता हैके तहत 25,45.

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखक लेख की अंग्रेजी भाषा की समीक्षा के लिए मीरा Hryniuk, बीए को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agani hypodermic needle, 19 G Terumo Europe AN*1950R1 19 G needle to aspirate albumen
Terumo syringe, 5 mL concentric Luer lock Terumo Europe SS*05LE1 5-mL sterile syringe
Caseviewer v2.2 3DHISTECH Image analysis software
Diethyl ether Merck Chemicals 603-022-00-4 Sterile ether to traumatize the CAM
Eosin Y aqueous solution 0.5% Merck 1098441000 Staining solution
Formaldehyde 4% aqueous solution buffered (Formalin 10%) VWR 97139010 Formaldehyde used for tissue fixation
Fridge Liebherr 7081260 Fridge at 4 °C used for paraffin-embedding
Heating plate Schott SLK2 Hot plate used to dry the slides
Incubator Thermo Forma Scientific 3111 10365156 Oven used for slide incubation
Leica CLS 150 XE microscope cold light source Leica CLS 150 XE Focal cold light source to candle the eggs
Lens cleaning tissue, grade 541 VWR 111-5003 Tissue to soak in sterile ether to traumatize the CAM
Mayer's hematoxylin MERCK 1092491000 Staining solution
Methanol VWR 20847307 Methanol
Microtome ThermoScientific-MICROM HM325-2 Microtome
Pannoramic P250 Flash III 3DHISTECH / Slide scanner at 20x magnification
Paraformaldehyde  Merck 1,04,00,51,000 Paraffin-embedding solution
Paraplast Plus R Sigma P3683-1KG Paraffin
Petri dish, 60x15 mm, sterile Greiner 628161 Sterile petri dish
Pin holder Fine Science Tools 26016-12 Pin holder
Polyhatch Brinsea CP01F Egg incubator with automatic rotator
Scroll saw blade, 132 mm Sencys / Saw blade to create a window in the eggshell
Stainless steel insert pins Fine Science Tools 26007-02 Straight pin to make a hole in the eggshell
Steril-Helios  Angelantoni Industrie ST-00275400000 Laminar flow hood
Superfrost Plus bords rodés 90° VWR 631-9483 Glass slides 
Tissue-Tek VIP 6Al Sakura 60320417-0711 VID6E3-1 Automatic embedding device
Titanium forceps Fine Science Tools 11602-16 Forceps for eggshell removal and ovarian tissue manipulation
Toluene, pa VWR 28701364 Paraffin-embedding solution

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References

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जीवविज्ञान अंक 196 कूप सक्रियण कूप हानि क्रायोप्रिजर्वेशन प्रत्यारोपण कृंतक मॉडल विकल्प लागत प्रभावी समय की बचत नैतिक विचार ज़ेनोग्राफ्टिंग मानव डिम्बग्रंथि ऊतक इम्यूनोडेफिशिएंसी एंजियोजेनेसिस पोस्ट-ग्राफ्टिंग कूप हानि प्रक्रिया सीएएम ज़ेनोग्राफ्टिंग मॉडल पुनरोद्धार समय सीमा ऊतक व्यवहार्यता
डिम्बग्रंथि ऊतक प्रत्यारोपण का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण के रूप में चिक Chorioallantoic झिल्ली (सीएएम) मॉडल
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Hossay, C., Cacciottola, L., Storder, S., Van Kerk, O., Dolmans, M. M. The Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Model as a Tool to Study Ovarian Tissue Transplantation. J. Vis. Exp. (196), e64867, doi:10.3791/64867 (2023).

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