Summary
Här beskriver vi ett protokoll för att utveckla en chick chorioallantoic membrane (CAM) xenograftingmodell för mänsklig äggstocksvävnad och demonstrerar effektiviteten av tekniken, tidsramen för revaskularisering av transplantat och vävnadens viabilitet under en 6-dagars transplantationsperiod.
Abstract
Kryokonservering och transplantation av äggstocksvävnad är en effektiv strategi för att bevara fertiliteten men har en stor nackdel, nämligen massiv follikelförlust som inträffar kort efter reimplantation på grund av onormal follikelaktivering och död. Gnagare är referensmodeller för att undersöka follikelaktivering, men kostnaden, tiden och de etiska övervägandena blir allt mer oöverkomliga, vilket driver utvecklingen av alternativ. Kycklingens korioallantoiska membranmodell (CAM) är särskilt attraktiv, eftersom den är billig och upprätthåller naturlig immunbrist fram till dag 17 efter befruktning, vilket gör den idealisk för att studera kortvarig xenotransplantation av mänsklig äggstocksvävnad. KAM är också mycket vaskulariserat och har använts i stor utsträckning som en modell för att utforska angiogenes. Detta ger den en anmärkningsvärd fördel jämfört med in vitro-modeller och gör det möjligt att undersöka mekanismer som påverkar den tidiga follikelförlustprocessen efter transplantation. Protokollet som beskrivs här syftar till att beskriva utvecklingen av en CAM-xenograftmodell för mänsklig äggstocksvävnad, med specifika insikter om teknikens effektivitet, tidsramen för revaskularisering av transplantat och vävnadens livskraft under en 6-dagars transplantationsperiod.
Introduction
Efterfrågan på fertilitetsbevarande åtgärder för onkologiska och godartade indikationer, liksom sociala skäl, har ökat dramatiskt under de senaste decennierna. Olika behandlingar som används för att bota maligna och icke-maligna sjukdomar är dock mycket giftiga för könskörtlarna och kan resultera i iatrogen för tidig äggstocksinsufficiens, vilket i slutändan leder till infertilitet1. Etablerade tekniker för fertilitetsbevarande inkluderar kryokonservering av embryon, omogen eller mogen oocytvitrifikation och kryokonserveringav äggstocksvävnad 2,3,4. Frysning av äggstocksvävnad är det enda tillgängliga alternativet för att bevara fertiliteten hos prepubertala flickor eller kvinnor som behöver omedelbar cancerbehandling. Återställandet av endokrin funktion efter äggstocksvävnadstransplantation sker hos över 95 % av försökspersonerna, med levande födslar som sträcker sig från 18 % till 42 %5,6,7,8,9.
Även om transplantation av fryst tinad äggstocksvävnad har visat sig vara framgångsrik, finns det fortfarande utrymme för förbättringar. Faktum är att när äggstockskortikala fragment transplanteras utan vaskulär anastomos, upplever de en period av hypoxi under vilken transplantatrevaskularisering äger rum 10,11,12. De allra flesta studier som undersökt transplantation av äggstocksvävnad från människa har använt en xenotransplantationsmodell, där äggstocksvävnad transplanteras till möss med immunbrist. Den fullständiga revaskulariseringen av xenotransplantaten tar cirka 10 dagar, där både värd- och transplantatkärlen bidrar till bildandet av funktionella kärl 12,13,14. Cirka 50%-90% av follikelreserven förloras under detta hypoxiska fönster innan transplantatrevaskulariseringen 10,15,16 är avslutad. Det har starkt föreslagits att denna massiva follikelförlust sker genom både direkt follikeldöd, vilket visas av en minskning av det absoluta antalet folliklar som finns kvar efter transplantation, och aktivering av primordial follikeltillväxt, vilket indikeras av förändringar i follikelproportioner mot ökad hastighet av växande folliklar17,18.
Intressant nog har tidigare forskningsarbeten med olika djuräggstocksvävnader transplanterade till kycklingkorioallantoiskt membran (CAM), som har en konstitution som efterliknar det typiska ympstället i bukhinnan, rapporterat hämning av spontan follikelaktivering, med den ursprungliga follikelreserven intakt i upp till 10 dagar 19,20,21,22. Vårt team har tidigare visat att transplantation av fryst tinad mänsklig äggstocksvävnad till KAM utgjorde ett tillförlitligt tillvägagångssätt för att undersöka transplantation av mänsklig äggstocksvävnad i dess första ischemiska stadier23 och visade nyligen att denna transplantationsmetod kunde motverka follikelaktivering24.
CAM-modellen är särskilt tilltalande, inte bara för att ägg är mycket billigare än möss utan också på grund av den mycket vaskulariserade karaktären hos KAM, vilket möjliggör granskning av sambandet mellan follikelaktivering och revaskularisering av äggstockstransplantat. Fågelsystemet är verkligen ett av de vanligaste och mest mångsidiga sätten att studera angiogenes25. Kycklingembryoutveckling (ED) tar 21 dagar tills kläckning, och CAM bildas inom de första 4-5 dagarna genom sammansmältning av allantois och korion26. Noterbart är att kycklingembryot är en värd med naturligt immunbrist fram till dag 17 av ED, så xenotransplantationsexperiment kan utföras utan risk för transplantatavstötning27,28. CAM-modellen ger inte heller upphov till några etiska eller rättsliga problem när det gäller EU-lagstiftning29, vilket gör den till ett attraktivt alternativ till andra djurmodeller. När det gäller fortplantningsförhållanden behöver kycklingembryon endast en inkubator inställd på 37 °C med en relativ luftfuktighet på 40–60 %. Dessa begränsade försökskrav minskar forskningskostnaderna avsevärt jämfört med användning av möss med immunbrist.
Protokollet som presenteras här syftar till att beskriva utvecklingen av en CAM-xenograftmodell för mänsklig äggstocksvävnad och ge specifika insikter om teknikens effektivitet, tidsramen för transplantatrevaskularisering och vävnadens livskraft under en 6-dagars transplantationsperiod. Detta protokoll kan vara av stort intresse för att undersöka mekanismerna bakom tidig follikelförlust efter transplantation och studera effekten av flera medel (tillväxtfaktorer, hormoner, etc.) på detta fenomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Användningen av mänsklig vävnad godkändes av Institutional Review Board vid det katolska universitetet i Louvain. Patienterna gav sitt skriftliga informerade samtycke till att deras äggstocksvävnad användes för forskningsändamål.
1. Beställning av ägg dag 0 som med stor sannolikhet kommer att embryoneras
- Hitta en certifierad leverantör av vita Leghorn-ägg av laboratoriekvalitet som är utvald av Lohman och som rapporterar höga nivåer av embryonerade ägg, vilket främst beror på kycklingarnas ålder.
2. Förberedelse av äggen för ruvning
- Innan äggen anländer, montera och jämvikt ägginkubatorn till 37 °C i 40%-60% relativ luftfuktighet. Övervaka temperaturen och luftfuktigheten genom att sätta in en termometer och hygrometer i inkubatorn. Se till att inkubatorns lock är försett med ett glasfönster så att du kan kontrollera inkubatorns interna parametrar utan att behöva öppna den (Figur 1).
- Efter att ha fått dag 0-ägg från Lohman-utvalda vita Leghorn-kycklingar från en certifierad äggleverantör av laboratoriekvalitet, rengör ytan på skalen med fuktat papper och torka dem omedelbart.
OBS: Eftersom äggskalsmembranet är poröst kan autoklaverat vatten användas för att rengöra äggytor och kontrollera luftfuktigheten i inkubatorn för att minimera kontamineringsriskerna. - Märk äggen med en markör (t.ex. datum och äggnummer).
- Ruva äggen med den spetsiga änden nedåt och rotera dem så att CAM kan utvecklas. Rotera äggen manuellt 180° två till tre gånger per dag eller använd en automatisk rotator.
OBS: För att säkerställa att äggen verkligen roteras kan äggskalet markeras med ett "X" och "O" på de två motsatta sidosidorna med hjälp av en penna eller markör. Glasfönstret i locket på inkubatorn gör att man kan kontrollera äggens rotation utan att öppna enheten.
3. Öppna äggskalet på dag 3 av ED
OBS: Ett rektangulärt fönster görs i äggskalet på dag 3 av ED.
- Förbered huven med laminärt flöde för att fungera under sterila förhållanden. Placera följande instrument under huven och desinficera dem i 70 % etanol (om de inte redan är steriliserade):
-Ägghylla
-Äggljus eller fokal kall ljuskälla
-Markör
-Steril rak stift
-Steril 19 g nål
-5 ml steril spruta
-Rullsågblad
-Steril pincett
-Tejp - Överför ett ägg från inkubatorn till äggstället som är placerat under huven och stäng av äggrotatorn.
- I mörkret, identifiera äggets luftficka genom att placera äggljuskällan (eller fokal kall ljuskälla) mot äggskalet. Luftfickan är lokaliserad i den trubbiga änden av ägget. Använd en markör för att peka ut mitten av luftfickan på äggskalet.
- Tänd lamporna. Gör ett litet hål i äggskalet där det markeras genom att försiktigt vrida en steril rak nål. En liten öppning på cirka 1 mm i diameter är vanligtvis tillräcklig.
OBS: Var försiktig så att du inte trycker stiftet hela vägen genom ägget. Om detta händer, kassera ägget. - Anslut en steril 19 G nål till en steril 5 ml spruta.
- I mörker, lokalisera gulesäcken med hjälp av äggljuskällan (eller fokal kall ljuskälla) och punktera ägget genom hålet i steg 3.4 med den sterila 19 G-nålen vinklad i 45° mot äggets botten; Var mycket försiktig så att du inte stör gulesäcken. Aspirera mellan 1,5-2 ml äggvita för att lossa CAM från skalet och stäng sedan hålet med en bit tejp.
OBS: Om gulesäcken störs under aspirationen kommer den aspirerade vätskan i sprutan att vara gulfärgad snarare än genomskinlig (äggvita). Om detta händer, byt ut nålen och sprutan. Om en relativt stor mängd äggula sugs upp kan det äventyra embryots livskraft. - Tänd lamporna. Placera ägget horisontellt och rita ett rektangulärt fönster på 1 cm x 1,5 cm med en tuschpenna. Gör inte fönstret större än den vanliga bredden på vanlig tejp.
- Håll ägget i ena handen och såga försiktigt in det tidigare ritade fönstret i äggskalet med hjälp av ett rullsågblad. Se till att skalet inte spricker och skär inte hela vägen ner till den nedtryckta CAM. Blås regelbundet för att ta bort skaldamm och skräp.
- Skjut in den sterila pincetten under den rektangulära biten av det sågade skalet och ta tag i den för att ta bort den rent utan att skada CAM. Kassera dessutom det vita yttre skalmembranet för att kunna se embryot och dess CAM.
OBS: Om lite äggskalsdamm eller skräp faller på CAM, kan det tas bort med en steril pincett, var mycket försiktig så att du inte river CAM. - Identifiera livsdugliga embryonerade ägg. De kan urskiljas genom sin tydliga äggvita och kärlringen runt embryot, där ett slående hjärta ibland kan upptäckas även i detta skede (dag 3 av ED). Kassera obefruktade eller döda embryon.
- Placera tejp över det nyskapade fönstret för att undvika uttorkning. Var noga med att vika ena änden över sig själv för att underlätta borttagningen.
- Sätt tillbaka ägget i inkubatorn med det öppnade fönstret uppåt och tejpen inte vidrör CAM. Använd ett vikt papper eller en del av äggstället för att stoppa ägget från att rulla. Se till att den roterande brickan är avstängd.
- Upprepa steg 3.2-3.12 för att öppna de återstående äggen.
4. Ympning av fryst tinad mänsklig äggstocksvävnad till KAM
OBS: Transplantation till KAM bör helst initieras mellan dag 7-10 av ED.
- Tina kryokonserverade äggstockskortikala remsor under huven med laminärt flöde enligt protokollet som beskrivs på andra ställen30.
- Skär de kortikala remsorna i tre fragment på 4 mm x 2 mm x 1 mm. Använd en bit som en icke-ympad kontroll och de andra två för xenotransplantation i 1 dag eller 6 dagar.
OBS: Om tillräckligt med vävnad finns tillgänglig, arbeta i duplikat. - Överför ett ägg från inkubatorn till äggstället som är placerat under huven, med fönstret uppåt.
- Dra av tejpen från fönstret och se till att embryot är livsdugligt. I detta skede har livsdugliga embryon omfattande vaskulatur, en tydlig äggvita, en synlig hjärtrytm och viss embryorörelse.
- Förbered ympningsstället genom att försiktigt traumatisera ett litet område av CAM genom att lägga en 1 cm2 remsa sterilt eterextraherat linspapper på epitelytan och ta bort det omedelbart.
OBS: CAM är en ogenomtränglig barriär om inte membranet har traumatiserats genom avlägsnandet av den övre peridermala delen av det dubbla epitelskiktet, vilket lämnar basalskiktet intakt. Denna teknik förbättrar också revaskulariseringsprocessen genom att aktivera sårläkning. Om det sterila eterextraherade linspappret sitter kvar på CAM för länge kan membranet fastna på linspapperet och gå sönder. Om detta händer, kassera ägget. - Ta tag i en fryst tinad äggstockskortikal remsa (4 mm x 2 mm x 1 mm) med en mikrokirurgisk pincett och placera den på den traumatiserade KAM med den medullära sidan mot KAM. Transplantera en vävnadsbit per ägg.
- Täck fönstret med tejp och lägg försiktigt tillbaka ägget i inkubatorn. Se till att äggskalsöppningen sitter upprätt och att ägget sitter fast.
- Upprepa steg 4.1-4.7 för ympning av alla återstående vävnader.
OBS: Implantaten bör kontrolleras varje transplantationsdag för att bedöma embryots livsduglighet och övervaka förändringar i kärlen.
5. Skörda transplantaten
OBS: Xenotransplantat bör skördas senast på dag 17 av ED, eftersom embryots immunsystem blir moget och kompetent från dag 18.
- Placera ägget på ett galler och förstora fönstret i äggskalet för att möjliggöra bättre graftvisualisering och enklare hantering.
- Utvärdera transplantatet makroskopiskt och var särskilt uppmärksam på den vaskulära reaktionen av KAM mot transplantatet. Ta digitala fotografier eller videor för inspelning.
- Ta tag i vävnaden eller den omgivande KAM med en pincett och använd en sax eller en skalpell för att försiktigt ta bort transplantatet från KAM-modulen.
OBS: Transplantaten täcks med ett andra lager av CAM runt dag 3 av ympningen och blir så småningom inkapslade. De kan också ha flyttat in i ägget på dag 6, vilket gör det svårt att hämta dem i vissa fall. - Analysera de utskurna vävnaderna med en metod som är lämplig för det givna experimentet. I den aktuella studien fixerades vävnadsbitar i paraformaldehyd, paraffininbäddade och färgade med hematoxylin och eosin enligt stegen nedan:
- Fixera fragmenten i 4 % paraformaldehyd i 24 timmar och bädda in dem i paraffin med hjälp av en automatisk inbäddningsanordning med de steg som nämns i tabell 1.
- Låt de paraffininbäddade blocken stå över natten vid 4 °C innan du skär dem i 5 μm tjocka sektioner med en mikrotom.
- Sprid ut vävnadsdelarna på en glasskiva på en varm platta (30 °C) och låt dem torka i 2 timmar, följt av 24 timmar i en ugn vid 37 °C.
- Färga sedan objektglasen med hematoxylin och eosin enligt ett protokoll som beskrivs på annan plats31. Digitalisera sedan proverna med hjälp av en diabildsskanner och analysera dem med hjälp av ett bildanalysprogram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Överlevnadsgrad för kycklingembryon
Embryoöverlevnaden från fönstertransplantation (dag 3 av ED) till transplantation av äggstocksvävnad (dag 7 av ED) var 79 % (33/42). Eftersom andelen embryonerade dag 0-ägg är okänd, beställdes övertaliga dag 0-ägg från Lohman-selekterade vita Leghorn-kycklingar för att säkerställa att tillräckligt med embryonerade ägg skulle finnas tillgängliga för ympning. Totalt 23 livsdugliga dag 7-ägg användes för transplantation, varav ett dog under de första 24 timmarna, vilket resulterade i en total embryoöverlevnad på 96 % efter transplantation (22/23).
Makroskopisk aspekt av transplantaten
Efter 1 dags transplantation såg transplantaten livskraftiga ut i 100 % (10/10) av fallen och var redan åtminstone delvis vidhäftande till CAM, vilket visade ett hjulekermönster av blodkärl som behövs för deras vaskularisering (Figur 2A,B). Efter 6 dagars transplantation var alla implantat fortfarande vidhäftande (Figur 2C), förutom två som inte fäste vid CAM. De fick ett nekrotiskt utseende och uteslöts från vidare analys (Figur 3), vilket resulterade i en transplanterad vävnadsöverlevnad på 83 % (10/12) efter 6 dagar. Sammantaget visade viabilitetsbedömningen av de mänskliga äggstockstransplantaten en total vävnadsöverlevnad på 91 % (20/22), oavsett transplantationsdag (tabell 2).
Runt dag 3 efter transplantationen visade det sig att transplantaten var täckta med ett andra lager av KAM, och de blev så småningom inkapslade, vilket ledde till ännu bättre transplantatvaskularisering (Figur 2C). Sammantaget hade 80 % av transplantationerna också penetrerat ägget (Figur 2D), vilket i vissa fall gjorde det svårt att få ut dem på dag 6.
Mikroskopisk bedömning av transplantaten
Totalt 30 frystinade humana äggstocksfragment erhållna från fem olika patienter analyserades och fixerades i 4 % paraformaldehyd på ympningsdag 0, dag 1 eller dag 6, inbäddade i paraffin, och seriellt skurna i 5 μm sektioner för histologisk utvärdering (Figur 4).
För att bedöma överlevnadsgraden för äggstocksfolliklar räknades folliklarna i 12 slumpmässiga hematoxylin- och eosinfärgade snitt per tidpunkt och per patient. Endast morfologiskt normala folliklar med en synlig oocyt beaktades för analys32. Friska folliklar observerades vid alla tidpunkter (Figur 4B-D). Follikelöverlevnaden beräknades genom att bestämma den återstående follikeltätheten (antal folliklar/mm3) efter transplantation och normalisera den till follikeltätheten hos icke-transplanterade kontroller (100 %). Follikeltätheten tenderade att minska efter transplantation, men inte tillräckligt för att nå statistisk signifikans (p > 0,8) (tabell 2). På samma sätt bibehölls follikelöverlevnaden under transplantationsperioden och låg på 95 % ± 19 % dag 1 och 83 % ± 27 % dag 6 (p > 0,5).
Revaskulariseringsprocessen undersöktes ytterligare genom detektion av fågelröda blodkroppar i kärl från den xenotransplanterade äggstocksvävnaden. Erytrocyter hos fåglar är lätta att urskilja eftersom de är kärnförsedda (figur 4A,C,D). Överraskande nog kunde vi observera aviära erytrocyter i äggstockskärl i 30 % av implantaten efter bara 1 dag av transplantation och i alla implantat vid dag 6, som uppvisade mycket snabb revaskularisering (tabell 2).
Figur 1: Ägginkubator. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Makroskopisk aspekt av livsdugliga implantat. (A) Ympningsdag 0. (B) Implantat på dag 1, där KAM visar ett hjulekermönster av blodkärl mot äggstocksvävnaden. (C) Implantat inkapslade av KAM på dag 6, vilket leder till ännu bättre transplantatvaskularisering. D) Transplantat som penetrerar ägget. Pilarna pekar mot den transplanterade äggstocksvävnaden. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Makroskopisk aspekt av nekrotiska implantat. (A) Äggstocksvävnad som ser frisk ut på dag 0 av transplantationen. (B) Nekrotisk aspekt av implantatet 6 dagar senare. Pilarna pekar mot äggstocksvävnaden. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Mikroskopisk aspekt av implantat. Hematoxylin och eosinfärgade implantat transplanterade i (A,B) 1 dag och i (C,D) 6 dagar. Pilspetsarna pekar på att de röda blodkropparna från fåglarna perfusionerar äggstockskärlen efter (A) 1 dag och (C,D) 6 dagars transplantation. Pilarna indikerar friska primordiala folliklar i implantat transplanterade i (B) 1 dag och (C,D) 6 dagar. Skalstapel: 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Trappsteg | Bad | Tid |
| Andra fixeringen | 1 Formalin 10% bad | 2 h |
| Uttorkning | 7 metanolbad | 7x 1 h |
| Klargörande | 3 toluenbad | 3x 1 h |
| Befruktning | 3 flytande paraffinbad (60 °C) | 15 min – 30 min – 30 min |
Tabell 1: Steg för inbäddning av paraffin.
| Icke-ympad | Ympning dag 1 | Ympning dag 6 | P-värde | |
| Makroskopisk aspekt av transplantat | ||||
| Överlevnadsgrad för vävnader | - | 100% (10/10) | 83% (10/12) | / |
| Mikroskopisk aspekt av transplantat | ||||
| Follikeltäthet (n/mm3) | 848 ± 272 | 817 ± 370 | 684 ± 236 | p > 0,8 |
| Överlevnadsgrad för folliklar | 100% | 95% ± 19% | 83% ± 27% | p > 0,5 |
| Röda blodkroppar från fåglar i implantat | 0% (0/10) | 30% (3/10) | 100% (10/10) | / |
Tabell 2: Resultat. Statistisk analys utförd med envägs ANOVA, följt av Sidak-korrigering. Resultaten uttrycks som medelvärde ± standardavvikelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den mest utmanande delen av protokollet som beskrivs här är att göra det lilla hål som krävs för att aspirera äggvitan för att lossa CAM från äggskalet innan man skapar ett fönster. Att applicera för mycket tryck kan resultera i överpenetration eller kan till och med spricka och förstöra ägget, vilket orsakar oåterkalleliga skador på KAM och dess kärl. För att minimera misstagen under de första försöken att separera CAM, rekommenderas det starkt att öva på att göra små hål i äggskalet på icke-befruktade, livsmedelsköpta ägg med hjälp av en rak nål. Dessutom, med tanke på den naturliga variationen i fertilitet mellan partier, tillsammans med det faktum att inte alla embryon överlever proceduren, rekommenderas att skaffa överflödiga ägg från äggleverantören. För att uppnå optimal embryoöverlevnad och en välutvecklad KAM måste äggen inkuberas under idealiska förhållanden. När det gäller låg lönsamhet kan olika aspekter vara skyldiga och behöva undersökas. Äggleverantören bör kontaktas, eftersom livsdugligheten hos embryon från leverantören helt enkelt kan vara lägre vid denna tidpunkt. Låg ägglivskraft kan också bero på felaktiga eller olämpliga inkubatorinställningar, vilket kan äventyra CAM-utvecklingen. Användningen av en oberoende hygrometer och termometer kan säkerställa att inställningarna är korrekta och stabila, men detaljerade felsökningsinstruktioner bör tillhandahållas av tillverkaren. Slutligen har det också föreslagits att kontroll av transplanterade ägg för ofta kan leda till temperatur- och luftfuktighetsfluktuationer, vilket kan ha skadliga effekter på de transplanterade embryona33.
I det nuvarande protokollet utfördes fönsterningen av äggskalet på dag 3 av ED genom att aspirera cirka 2 ml äggvita från embryot för att lossa CAM från skalet, vilket i sin tur gjorde det möjligt att skapa ett fönster utan att skada CAM. Embryoöverlevnaden 4 dagar senare var 79%, i linje med tidigare studier34,35. Andra metoder har rapporterats, med varierande grad av framgång. Ett alternativ är att bända bort CAM från skalet genom att applicera sug på luftsäcken, vanligtvis runt dag 7-10 av ED. Denna metod kräver inte att ägget punkteras33,36. Studier som rapporterar embryoöverlevnad med den senare tekniken är få och långt ifrån i litteraturen, med ett team som rapporterar upp till 90 % av embryoöverlevnaden36. Ett annat alternativ att överväga är skalfri kycklingembryokultur, även känd som ex ovo-kultur. Avlägsnande av äggskalet ger obegränsad tillgång till embryot, vilket underlättar embryomanipulation och kirurgi och möjliggör även användning av högupplösta avbildningstekniker för levande experiment, såsom fluorescensmikroskopi och mikrodatortopografi37,38. För att kunna utföra ex ovo-odling överförs embryot, inklusive dess extraembryonala membran, till en specifik odlingsinnesinneslutning mellan dag 2 och dag 4 av ED. Denna teknik är dock mycket invasiv, med embryon som vanligtvis dör runt dag 12 och färre än 18 % av dem överlever till dag 1538,39.
Under de xenotransplantationsexperiment som rapporteras här, ympades mänskliga äggstocksimplantat till CAM som hade traumatiserats försiktigt genom att applicera en liten remsa av sterilt eterextraherat linspapper på epitelets yta och ta bort det omedelbart. Sammantaget var embryoöverlevnaden utmärkt och nådde 96 % under transplantationsperioden, vilket överensstämmer med tidigare studier som involverat transplantation av äggstocksvävnadsfragment till CAM23,40. Dessutom har detta tillvägagångssätt visat sig öka transplantatvidhäftningshastigheten och förbättra den efterföljande etableringen av neovaskularisering, med angiogenes sannolikt inducerad av den initiala sårläkningsprocessen23. Faktum är att xenoympning av äggstocksvävnad från råtta till murin sårläkande granulationsvävnad visade sig förbättra transplantatvaskulariseringen41. På samma sätt, i den första levande födseln som rapporterats efter ortotopisk transplantation av kryokonserverad mänsklig äggstocksvävnad, skapade Donnez et al. ett peritonealfönster och koagulerade dess marginaler 7 dagar före implantation för att stimulera angiogenes och neovaskularisering i transplantationsstället42.
När det gäller den histologiska bedömningen av transplanterad mänsklig äggstocksvävnad var follikelöverlevnaden uppmuntrande, med mer än 80 % av folliklarna intakta efter 6 dagars transplantation. Intressant nog är follikelöverlevnaden som rapporterats i litteraturen efter transplantation av mänsklig fryst tinad äggstocksvävnad till bukhinnan hos möss med immunbrist endast cirka 30%10,14,18,43,44, vilket är mycket lägre än i den aktuella studien. Våra fynd av förbättrad follikelöverlevnad efter transplantation av mänsklig äggstocksvävnad till KAM bekräftar våra nyligen publicerade data, där vi visar att KAM hämmar follikelaktivering och apoptos24. Dessutom kunde fågelblodkärl tränga in i implantaten, vilket visades av närvaron av aviära erytrocyter efter bara 1 dags transplantation. Sammantaget visar dessa resultat att CAM-metoden är en lämplig modell för att ytterligare granska transplantation av mänsklig äggstocksvävnad, eftersom den stödjer vävnadens överlevnad.
Den största nackdelen med CAM-modellen är den begränsade period under vilken ympning är möjlig. Transplantation kan utföras tidigast på dag 7 av ED, så snart KAM har utvecklats tillräckligt, fram till dag 17, innan kycklingembryona förvärvar immunkompetens och kläcks. Trots den korta transplantationstiden är CAM-modellen fortfarande ett användbart verktyg för att studera transplantation av mänsklig äggstocksvävnad i dess första ischemiska stadier. Man kan också använda denna modell för att testa effekten av proangiogena faktorer, skyddande antioxidanter, cytokiner, tillväxt- och reproduktionsrelaterade hormoner och faktorer som styr follikelaktivering i transplanterad mänsklig äggstocksvävnad, allt under experimentella förhållanden som lätt kan kontrolleras25,45.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Mira Hryniuk, BA, för att ha granskat det engelska språket i artikeln.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agani hypodermic needle, 19 G | Terumo Europe | AN*1950R1 | 19 G needle to aspirate albumen |
| Terumo syringe, 5 mL concentric Luer lock | Terumo Europe | SS*05LE1 | 5-mL sterile syringe |
| Caseviewer v2.2 | 3DHISTECH | Image analysis software | |
| Diethyl ether | Merck Chemicals | 603-022-00-4 | Sterile ether to traumatize the CAM |
| Eosin Y aqueous solution 0.5% | Merck | 1098441000 | Staining solution |
| Formaldehyde 4% aqueous solution buffered (Formalin 10%) | VWR | 97139010 | Formaldehyde used for tissue fixation |
| Fridge | Liebherr | 7081260 | Fridge at 4 °C used for paraffin-embedding |
| Heating plate | Schott | SLK2 | Hot plate used to dry the slides |
| Incubator | Thermo Forma Scientific 3111 | 10365156 | Oven used for slide incubation |
| Leica CLS 150 XE microscope cold light source | Leica | CLS 150 XE | Focal cold light source to candle the eggs |
| Lens cleaning tissue, grade 541 | VWR | 111-5003 | Tissue to soak in sterile ether to traumatize the CAM |
| Mayer's hematoxylin | MERCK | 1092491000 | Staining solution |
| Methanol | VWR | 20847307 | Methanol |
| Microtome | ThermoScientific-MICROM | HM325-2 | Microtome |
| Pannoramic P250 Flash III | 3DHISTECH | / | Slide scanner at 20x magnification |
| Paraformaldehyde | Merck | 1,04,00,51,000 | Paraffin-embedding solution |
| Paraplast Plus R | Sigma | P3683-1KG | Paraffin |
| Petri dish, 60x15 mm, sterile | Greiner | 628161 | Sterile petri dish |
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Pin holder |
| Polyhatch | Brinsea | CP01F | Egg incubator with automatic rotator |
| Scroll saw blade, 132 mm | Sencys | / | Saw blade to create a window in the eggshell |
| Stainless steel insert pins | Fine Science Tools | 26007-02 | Straight pin to make a hole in the eggshell |
| Steril-Helios | Angelantoni Industrie | ST-00275400000 | Laminar flow hood |
| Superfrost Plus bords rodés 90° | VWR | 631-9483 | Glass slides |
| Tissue-Tek VIP 6Al | Sakura | 60320417-0711 VID6E3-1 | Automatic embedding device |
| Titanium forceps | Fine Science Tools | 11602-16 | Forceps for eggshell removal and ovarian tissue manipulation |
| Toluene, pa | VWR | 28701364 | Paraffin-embedding solution |
References
- Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue and oocyte cryopreservation prior to iatrogenic premature ovarian insufficiency. Best Practice & Research Clinical Obstetrics & Gynaecology. 81, 119-133 (2022).
- Dolmans, M. -M., Hossay, C., Nguyen, T. Y. T., Poirot, C. Fertility preservation: How to preserve ovarian function in children, adolescents and adults. Journal of Clinical Medicine. 10 (22), 5247 (2021).
- Donnez, J., Dolmans, M. -M.
- Donnez, J., Dolmans, M. -M.
- Dolmans, M. -M., et al. Transplantation of cryopreserved ovarian tissue in a series of 285 women: a review of five leading European centers. Fertility and Sterility. 115 (5), 1102-1115 (2021).
- Shapira, M., Dolmans, M. -M., Silber, S., Meirow, D. Evaluation of ovarian tissue transplantation: results from three clinical centers. Fertility and Sterility. 114 (2), 388-397 (2020).
- Jensen, A. K., et al. Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark. Human Reproduction. 30 (12), 2838-2845 (2015).
- Vander Ven, H., et al. Ninety-five orthotopic transplantations in 74 women of ovarian tissue after cytotoxic treatment in a fertility preservation network: Tissue activity, pregnancy and delivery rates. Human Reproduction. 31 (9), 2031-2041 (2016).
- Diaz-Garcia, C., et al. Oocyte vitrification versus ovarian cortex transplantation in fertility preservation for adult women undergoing gonadotoxic treatments: A prospective cohort study. Fertility and Sterility. 109 (3), 478-485 (2018).
- Nisolle, M., Casanas-Roux, F., Qu, J., Motta, P., Donnez, J. Histologic and ultrastructural evaluation of fresh and frozen-thawed human ovarian xenografts in nude mice. Fertility and Sterility. 74 (1), 122-129 (2000).
- Van Eyck, A. -S., et al. Electron paramagnetic resonance as a tool to evaluate human ovarian tissue reoxygenation after xenografting. Fertility and Sterility. 92 (1), 374-381 (2009).
- Van Eyck, A. -S., et al. Both host and graft vessels contribute to revascularization of xenografted human ovarian tissue in a murine model. Fertility and Sterility. 93 (5), 1676-1685 (2010).
- Hossay, C., et al. Can frozen-thawed human ovary withstand refreezing-rethawing in the form of cortical strips. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (12), 3077-3087 (2020).
- Manavella, D. D., et al. Two-step transplantation with adipose tissue-derived stem cells increases follicle survival by enhancing vascularization in xenografted frozen-thawed human ovarian tissue. Human Reproduction. 33 (6), 1107-1116 (2018).
- Rahimi, G., et al. Re-vascularisation in human ovarian tissue after conventional freezing or vitrification and xenotransplantation. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 149 (1), 63-67 (2010).
- Cacciottola, L., Manavella, D. D., Amorim, C. A., Donnez, J., Dolmans, M. -M. In vivo characterization of metabolic activity and oxidative stress in grafted human ovarian tissue using microdialysis. Fertility and Sterility. 110 (3), 534-544 (2018).
- Gavish, Z., et al. Follicle activation is a significant and immediate cause of follicle loss after ovarian tissue transplantation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 35 (1), 61-69 (2018).
- Masciangelo, R., Hossay, C., Donnez, J., Dolmans, M. -M. Does the Akt pathway play a role in follicle activation after grafting of human ovarian tissue. Reproductive BioMedicine Online. 39 (2), 196-198 (2019).
- Fortune, J. E., Cushman, R. A., Wahl, C. M., Kito, S. The primordial to primary follicle transition. Molecular and Cellular Endocrinology. (1-2), 53-60 (2000).
- Cushman, R. A. Bovine ovarian cortical pieces grafted to chick embryonic membranes: A model for studies on the activation of primordial follicles. Human Reproduction. 17 (1), 48-54 (2002).
- Gigli, I., Cushman, R. A., Wahl, C. M., Fortune, J. E. Evidence for a role for anti-Müllerian hormone in the suppression of follicle activation in mouse ovaries and bovine ovarian cortex grafted beneath the chick chorioallantoic membrane. Molecular Reproduction and Development. 71 (4), 480-488 (2005).
- Qureshi, A. I., et al. Testosterone selectively increases primary follicles in ovarian cortex grafted onto embryonic chick membranes: relevance to polycystic ovaries. Reproduction. 136 (2), 187-194 (2008).
- Martinez-Madrid, B., et al. Chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) model: A useful tool to study short-term transplantation of cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 91 (1), 285-292 (2009).
- Hossay, C., et al. Follicle outcomes in human ovarian tissue: Effect of freezing, culture, and grafting. Fertility and Sterility. 119 (1), 135-145 (2023).
- Ribatti, D. The Chick Embryo Chorioallantoic Membrane in the Study of Angiogenesis and Metastasis. , Springer. Dordrecht, the Netherlands. (2010).
- Pawlikowska, P., et al. Exploitation of the chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) as a platform for anti-metastatic drug testing. Scientific Reports. 10 (1), 16876 (2020).
- Davison, T. F. The immunologists' debt to the chicken. British Poultry Science. 44 (1), 6-21 (2003).
- Schilling, M. A., et al. Transcriptional innate immune response of the developing chicken embryo to Newcastle disease virus infection. Frontiers in Genetics. 9, 61 (2018).
- Directives originating from the EU. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes (Text with EEA relevance). The National Archives. , Available from: https://www.legislation.gov.uk/eudr/2010/63/contents (2010).
- Dolmans, M. -M., et al. A review of 15 years of ovarian tissue bank activities. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (3), 305-314 (2013).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), 4986 (2008).
- Anderson, R. A., McLaughlin, M., Wallace, W. H. B., Albertini, D. F., Telfer, E. E. The immature human ovary shows loss of abnormal follicles and increasing follicle developmental competence through childhood and adolescence. Human Reproduction. 29 (1), 97-106 (2014).
- Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the chicken chorioallantoic membrane in vivo model to study gynecological and urological cancers. Journal of Visualized Experiments. (155), e60651 (2020).
- Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13 (8), 9959-9970 (2012).
- Sys, G. M. L., et al. The In ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. Journal of Visualized Experiments. (77), e50522 (2013).
- Li, M., et al. The in ovo chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an efficient xenograft model of hepatocellular carcinoma. Journal of Visualized Experiments. (104), e52411 (2015).
- Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
- Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications. Journal of Visualized Experiments. (44), e2154 (2010).
- Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts. Stem Cells International. 2013, 960958 (2013).
- Beck, K., Singh, J., Dar, M. A., Anzar, M. Short-term culture of adult bovine ovarian tissues: chorioallantoic membrane (CAM) vs. traditional in vitro culture systems. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 21 (2018).
- Israely, T., Nevo, N., Harmelin, A., Neeman, M., Tsafriri, A. Reducing ischaemic damage in rodent ovarian xenografts transplanted into granulation tissue. Human Reproduction. 21 (6), 1368-1379 (2006).
- Donnez, J., et al. Livebirth after orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue. The Lancet. 364 (9443), 1405-1410 (2004).
- Dolmans, M. -M., et al. Short-term transplantation of isolated human ovarian follicles and cortical tissue into nude mice. Reproduction. 134 (2), 253-262 (2007).
- Baird, D. T., Webb, R., Campbell, B. K., Harkness, L. M., Gosden, R. G. Long-term ovarian function in sheep after ovariectomy and transplantation of autografts stored at −196 C. Endocrinology. 140 (1), 462-471 (1999).
- Ribatti, D., Vacca, A., Roncali, L., Dammacco, F. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for in vivo research on anti-angiogenesis. Current Pharmaceutical Biotechnology. 1 (1), 73-82 (2000).
