Summary
在这里，我们描述了为人类卵巢组织开发鸡绒毛膜尿囊膜 （CAM） 异种移植模型的方案，并展示了该技术的有效性、移植物血运重建时间范围以及 6 天移植期间的组织活力。
Abstract
卵巢组织冷冻保存和移植是保留生育能力的有效策略，但有一个主要缺点，即由于卵泡活化异常和死亡，在重新植入后不久发生大量卵泡丢失。啮齿动物是研究卵泡活化的基准模型，但成本、时间和伦理考虑正变得越来越令人望而却步，从而推动了替代品的发展。雏鸡绒毛膜尿囊膜 （CAM） 模型特别有吸引力，价格低廉，并且在受精后第 17 天之前保持自然免疫缺陷，使其成为研究人类卵巢组织短期异种移植的理想选择。CAM 也是高度血管化的，已被广泛用作探索血管生成的模型。这使其比 体外 模型具有显着优势，并允许研究影响早期移植后卵泡丢失过程的机制。本文概述的方案旨在描述用于人类卵巢组织的 CAM 异种移植模型的开发，并具体了解该技术的有效性、移植物血运重建时间范围以及 6 天移植期间的组织活力。
Introduction
近几十年来，肿瘤学和良性适应症以及社会原因对生育力保存的需求急剧增加。然而，用于治疗恶性和非恶性疾病的各种治疗方法对性腺有剧毒，并可能导致医源性卵巢功能不全，最终导致不孕症1.成熟的生育力保存技术包括胚胎冷冻保存、未成熟或成熟的卵母细胞玻璃化和卵巢组织冷冻保存 2,3,4。卵巢组织冷冻是青春期前女孩或需要立即癌症治疗的妇女保持生育能力的唯一可用选择。卵巢组织移植后内分泌功能恢复发生在 95% 以上的受试者中，活产率从 18% 到 42%5,6,7,8,9 不等。
尽管冻融卵巢组织的移植已被证明是成功的，但仍有改进的余地。事实上，当卵巢皮质碎片在没有血管吻合的情况下移植时，它们会经历一段缺氧期，在此期间进行移植物血运重建 10,11,12。绝大多数研究人类卵巢组织移植的研究都使用了异种移植模型，其中卵巢组织被移植到免疫缺陷小鼠身上。异种移植物的完全血运重建大约需要 10 天，宿主血管和移植血管都有助于功能血管的形成 12,13,14。在移植物血运重建完成之前的缺氧窗口期间，大约 50%-90% 的卵泡储备丢失 10,15,16。强烈认为，这种大规模的卵泡丢失是通过直接卵泡死亡（如移植后剩余的绝对卵泡数量的减少）和原始卵泡生长的激活而发生的，如卵泡比例的变化对卵泡生长速率的增加所表明的那样17,18。
有趣的是，先前的研究工作使用各种动物卵巢组织移植到鸡绒毛膜尿囊膜 （CAM） 上，其结构模仿腹膜的典型移植部位，已经报道了抑制自发卵泡活化，原始卵泡储备保持完整长达 10 天 19,20,21,22.我们的团队之前证明，将冻融的人类卵巢组织移植到CAM是研究人类卵巢组织移植在其第一个缺血阶段的可靠方法23，并且最近表明这种移植方法能够抵消卵泡活化24。
CAM模型特别吸引人，不仅因为卵子比小鼠便宜得多，还因为CAM的高度血管化性质，可以仔细检查卵泡活化和卵巢移植物血运重建之间的关联。事实上，鸟类系统是研究血管生成的最常见和最通用的方法之一 25.雏鸡胚胎发育 （ED） 需要 21 天才能孵化，CAM 在前 4-5 天内通过尿囊和绒毛膜26 的融合形成。值得注意的是，在ED的第17天之前，雏鸡胚胎是天然免疫缺陷宿主，因此可以进行异种移植实验，而不会产生任何移植物排斥的风险27,28。此外，CAM模型方法在欧洲法律29方面不会引起任何伦理或法律问题，使其成为其他动物模型的有吸引力的替代方案。在育种条件方面，雏鸡胚胎只需要一个设置为37°C、相对空气湿度为40%-60%的孵化器。与使用免疫缺陷小鼠相比，这些有限的实验要求显着降低了研究成本。
本文介绍的方案旨在描述用于人类卵巢组织的 CAM 异种移植模型的开发，并就该技术的有效性、移植物血运重建的时间范围以及 6 天移植期内的组织活力提供具体见解。该方案对于研究早期移植后卵泡丢失背后的机制和研究几种药物（生长因子，激素等）对这种现象的影响可能非常有意义。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
人体组织的使用得到了鲁汶天主教大学机构审查委员会的批准。患者对将卵巢组织用于研究目的给予了书面知情同意书。
1. 订购极有可能胚胎化的第 0 天卵子
- 寻找经过认证的实验室级 Lohman 精选的白色 Leghorn 鸡蛋供应商，该供应商报告的胚胎鸡蛋率很高，这主要取决于雏鸡的年龄。
2. 准备孵化的种蛋
- 在种蛋到达之前，在40%-60%的相对空气湿度下将种蛋孵化器组装并平衡至37°C。通过将温度计和湿度计插入培养箱来监测温度和空气湿度。确保培养箱的盖子配有玻璃窗，以便检查培养箱的内部参数，而无需打开它（图1）。
- 从经过认证的实验室级鸡蛋供应商处收到来自洛曼精选的白色 Leghorn 雏鸡的第 0 天鸡蛋后，用加湿纸清洁蛋壳表面，并立即干燥。
注意：由于蛋壳膜是多孔的，因此可以使用高压灭菌水来清洁鸡蛋表面并控制孵化器内的湿度，以最大限度地降低污染风险。 - 使用记号笔（例如日期和鸡蛋编号）标记鸡蛋。
- 孵化鸡蛋时，尖头朝下，并旋转它们以使 CAM 发育。每天手动将鸡蛋旋转 180° 两到三次，或使用自动旋转器。
注意：为了确保鸡蛋确实在旋转，可以使用铅笔或记号笔在蛋壳的两个相对侧面标记“X”和“O”。孵化器盖上的玻璃窗允许人们在不打开设备的情况下检查鸡蛋的旋转。
3. 在ED的第3天打开蛋壳
注意：在ED的第3天，在蛋壳中制作了一个矩形窗口。
- 准备层流罩，以便在无菌条件下工作。将以下器械放在引擎盖下，并用 70% 乙醇（如果尚未消毒）对其进行消毒：
-鸡蛋架 （Egg rack）
-鸡蛋烛台或焦点冷光源
-标记
-无菌直针 （Sterile straight pin）
-无菌19G针头
-5 mL 无菌注射器
-涡旋锯片 （Scroll saw blade）
-无菌镊子 （Sterile sealps）
-胶带 - 将一个鸡蛋从孵化器转移到放置在引擎盖下的鸡蛋架上，然后关闭鸡蛋旋转器。
- 在黑暗中，通过将鸡蛋烛台（或焦点冷光源）靠在蛋壳上来识别鸡蛋的气囊。气穴位于鸡蛋的钝端。使用记号笔精确定位蛋壳上气穴的中心。
- 打开灯。在蛋壳上打一个小孔，轻轻旋转无菌直针进行标记。直径约 1 毫米的小开口通常就足够了。
注意： 注意不要将销钉一直推过鸡蛋。如果发生这种情况，请丢弃鸡蛋。 - 将无菌 19 G 针头连接到无菌 5 mL 注射器。
- 在黑暗中，使用鸡蛋烛台（或聚焦冷光源）找到卵黄囊，然后用无菌19G针向鸡蛋底部倾斜45°，将鸡蛋刺穿步骤3.4中制作的孔;要格外小心，不要破坏卵黄囊。吸入 1.5-2 mL 蛋白以将 CAM 从外壳上分离，然后用胶带封闭孔。
注意：如果卵黄囊在抽吸过程中被破坏，注射器中吸入的液体将是黄色而不是透明的（蛋白）。如果发生这种情况，请更换针头和注射器。如果吸食相对大量的蛋黄，可能会危及胚胎的活力。 - 打开灯。将鸡蛋水平放置，并用记号笔画一个尺寸为 1 厘米 x 1.5 厘米的矩形窗口。请勿使窗口大于标准胶带的通常宽度。
- 一只手拿着鸡蛋，用卷轴锯片轻轻地将先前绘制的窗口锯入蛋壳。确保外壳不会破裂，并且不要一直切割到凹陷的 CAM。定期吹气以清除外壳灰尘和碎屑。
- 将无菌镊子滑到锯切的矩形外壳下方，并巧妙地抓住以将其干净地取出，而不会损坏 CAM。此外，丢弃白色外壳膜，以便能够看到胚胎及其CAM。
注意： 如果一些蛋壳灰尘或碎屑掉到 CAM 上，可以使用无菌镊子将其清除，但要非常小心不要撕裂 CAM。 - 识别有活力的胚胎卵。它们可以通过透明的蛋白和胚胎周围的血管环来辨别，即使在这个阶段（ED的第3天），有时也可以检测到跳动的心脏。丢弃未受精或死亡的胚胎。
- 在新创建的窗口上贴上胶带以避免脱水。务必将一端折叠起来，以便于拆卸。
- 将鸡蛋放回孵化器中，打开的窗口朝上，胶带不接触 CAM。使用折叠的纸或部分蛋架来阻止鸡蛋滚动。确保旋转托盘已关闭。
- 重复步骤 3.2-3.12 打开剩余的鸡蛋。
4. 将冻融的人卵巢组织移植到CAM
注意：理想情况下，移植到 CAM 应在 ED 的第 7-10 天之间开始。
- 按照其他地方描述的方案在层流罩下解冻冷冻保存的卵巢皮质条30.
- 将皮质条切成 4 mm x 2 mm x 1 mm 的三个碎片。将一块用作非嫁接对照，另外两块用于异种移植 1 天或 6 天。
注意：如果有足够的组织可用，请一式两份。 - 将一个鸡蛋从孵化器转移到位于引擎盖下方的鸡蛋架上，窗户朝上。
- 从窗户上撕下胶带，并确保胚胎是可行的。在这个阶段，活胚胎具有广泛的脉管系统、透明的蛋白、可见的心跳和一些胚胎运动。
- 通过将 1 cm2 条无菌乙醚提取的晶状体纸铺在上皮表面上并立即将其取出，轻轻创伤 CAM 的一小块区域来准备移植部位。
注意：CAM 是不可穿透的屏障，除非膜因去除双上皮层的上皮周部分而受到创伤，使基底层完好无损。该技术还通过激活伤口愈合来增强血运重建过程。如果无菌乙醚提取的镜片纸在 CAM 上停留时间过长，膜可能会粘附在镜片纸上并撕裂。如果发生这种情况，请丢弃鸡蛋。 - 用显微外科镊子抓住一个冻融的卵巢皮质条带（4 mm x 2 mm x 1 mm），并将其放在受创伤的 CAM 上，髓侧靠在 CAM 上。每个卵子移植一块组织。
- 用胶带盖住窗户，小心地将鸡蛋放回孵化器。确保蛋壳开口直立且鸡蛋牢固。
- 重复步骤4.1-4.7移植所有剩余组织。
注意：应在每个移植日检查植入物，以评估胚胎活力并监测脉管系统的变化。
5. 收获嫁接
注意：异种移植物最迟应在ED的第17天收获，因为胚胎的免疫系统从第18天开始成熟并有能力。
- 将鸡蛋放在架子上，并扩大蛋壳中的窗口，以便更好地可视化移植物并更容易操作。
- 从宏观上评估移植物，并特别注意CAM对移植物的血管反应。拍摄数码照片或视频以备记录。
- 用镊子抓住组织或周围的 CAM，然后用剪刀或手术刀小心地从 CAM 上切除移植物。
注意：移植物在移植物的第 3 天左右被第二层 CAM 覆盖并最终被封装。它们也可能在第 6 天进入卵子内部，在某些情况下很难取回它们。 - 通过适合给定实验的任何方法分析切除的组织。在本研究中，按照以下步骤将组织片固定在多聚甲醛、石蜡包埋中，并用苏木精和伊红染色：
- 将片段固定在4%多聚甲醛中24小时，并按照 表1中提到的步骤使用自动包埋装置将其包埋在石蜡中。
- 将石蜡包埋的块在4°C下放置过夜，然后用切片机将它们切成5μm厚的部分。
- 将组织切片铺在放置在热板（30°C）上的载玻片上，并使其干燥2小时，然后在37°C的烤箱中24小时。
- 之后，按照其他地方描述的方案用苏木精和伊红对载玻片进行染色31.随后，使用载玻片扫描仪对样品进行数字化处理，并使用图像分析软件进行分析。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
雏鸡胚胎存活率
从窗口期（ED第3天）到卵巢组织移植（ED第7天）的胚胎存活率为79%（33/42）。由于胚胎第0天种蛋的百分比未知，因此订购了来自Lohman选择的白色Leghorn鸡的多余第0天种蛋，以确保有足够的胚胎种蛋可用于嫁接。共使用23个存活的第7天卵进行移植，其中一个在前24小时内死亡，移植后胚胎总存活率为96%（22/23）。
移植物的宏观方面
移植 1 天后，移植物在 100% （10/10） 的病例中看起来可行，并且已经至少部分粘附在 CAM 上，显示出血管形成所需的血管轮辐模式（图 2A、B）。移植 6 天后，所有植入物仍然粘附（图 2C），除了两个没有附着在 CAM 上。它们呈现坏死外观，被排除在进一步分析之外（图3），导致6天后移植组织存活率为83%（10/12）。总而言之，人类卵巢移植物的活力评估显示，无论移植日期如何，总体组织存活率为91%（20/22）（表 2）。
在移植后第3天左右，发现移植物被第二层CAM覆盖，最终被包裹，导致更好的移植物血管化（图2C）。总体而言，80%的移植物也穿透了卵子（图2D），在某些情况下，很难在第6天取回它们。
移植物的显微镜评估
分析从5名不同患者获得的总共30个冻融的人卵巢片段，并在移植第0天、第1天或第6天固定在4%多聚甲醛中，包埋在石蜡中，并连续切成5μm切片进行组织学评估（图4）。
为了评估卵巢卵泡存活率，每个时间点和每位患者在 12 个随机苏木精和伊红染色切片中对卵泡进行计数。分析仅考虑具有可见卵母细胞的形态正常的卵泡32。在所有时间点都观察到健康的卵泡（图4B-D）。通过确定移植后的剩余卵泡密度（卵泡数/mm 3）并将其归一化为非移植对照中的卵泡密度（被认为是100%）来计算卵泡存活率。移植后卵泡密度趋于降低，但不足以达到统计学意义（p > 0.8）（表2）。同样，卵泡存活率在移植期间保持不变，第 1 天为 95% ± 19%，第 6 天为 83% ± 27%（p > 0.5）。
通过检测异种移植卵巢组织血管中的禽类红细胞，进一步研究了血运重建过程。禽红细胞很容易辨别，因为它们是有核的（图4A，C，D）。令人惊讶的是，在移植仅 1 天后，我们就能够在 30% 的植入物中观察到卵巢血管中的禽类红细胞，并在第 6 天在所有植入物中观察到禽类红细胞，表现出非常快速的血运重建（表 2）。
图 1：鸡蛋孵化器。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：可行植入物的宏观方面。 （A） 嫁接第 0 天。（B） 第 1 天植入，CAM 显示朝向卵巢组织的血管轮辐模式。（C） 在第 6 天用 CAM 封装植入物，导致更好的移植物血管形成。（D） 嫁接穿透卵子。箭头指向移植的卵巢组织。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：坏死植入物的宏观方面。 （A） 移植第 0 天的卵巢组织看起来很健康。（B） 6 天后植入物的坏死方面。箭头指向卵巢组织。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：植入物的微观方面。 苏木精和伊红染色的植入物切片移植 （A，B） 1 天和 （C，D） 6 天。箭头指向 （A） 1 天和 （C，D） 6 天移植后灌注卵巢血管的禽红细胞。箭头表示移植 （B） 1 天和 （C，D） 6 天的植入物中看起来健康的原始卵泡。比例尺：50 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
| 步骤 | 浴 | 时间 |
| 第二次固定 | 1 福尔马林 10% 浴液 | 2小时 |
| 脱水 | 7个甲醇浴 | 7x 1小时 |
| 澄清 | 3个甲苯浴 | 3x 1小时 |
| 受精 | 3 个液体石蜡浴 （60°C） | 15 分钟 – 30 分钟 – 30 分钟 |
表 1：石蜡包埋步骤。
| 非嫁接 | 嫁接第1天 | 嫁接第6天 | P 值 | |
| 移植物的宏观方面 | ||||
| 组织成活率 | - | 100% (10/10) | 83% (10/12) | / |
| 移植物的微观方面 | ||||
| 卵泡密度 （n/mm3） | 848 ± 272 | 817 ± 370 | 684 ± 236 | 第 0.8 > |
| 卵泡存活率 | 100% | 95% ± 19% | 83% ± 27% | p > 0.5 |
| 植入物中存在的禽类红细胞 | 0% (0/10) | 30% (3/10) | 100% (10/10) | / |
表 2：结果。 使用单因素方差分析进行统计分析，然后进行 Sidak 校正。结果表示为平均值±标准差。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
这里描述的方案中最具挑战性的部分是制作吸出蛋白所需的小孔，以便在创建窗口之前将 CAM 从蛋壳上分离出来。施加过大的压力会导致过度渗透，甚至可能破裂并破坏鸡蛋，对 CAM 及其脉管系统造成不可挽回的损害。为了在最初尝试分离 CAM 时将错误降至最低，强烈建议练习使用直针在未受精的杂货店购买的鸡蛋的蛋壳上打小孔。此外，鉴于不同批次的生育能力的自然差异，以及并非所有胚胎都能在手术中存活的事实，建议从卵子供应商处获得多余的卵子。为了达到最佳的胚胎存活率和发育良好的CAM，卵子需要在理想条件下孵化。在生存能力低的情况下，不同的方面可能是罪魁祸首，需要调查。应联系卵子供应商，因为此时供应商的胚胎存活率可能较低。种蛋存活率低也可能是由于孵化器设置不准确或不合适造成的，这可能会影响 CAM 的发育。使用独立的湿度计和温度计可以确保设置准确稳定，但制造商应提供详细的故障排除说明。最后，也有人认为，过于频繁地检查移植的卵子可能会导致温度和湿度波动，这可能会对移植的胚胎产生有害影响33。
在本方案中，通过从胚胎中吸出约2mL蛋白以将CAM从壳中分离出来，在ED的第3天通过从胚胎中抽取约2mL蛋白来执行蛋壳的窗口，这反过来又允许在不损坏CAM的情况下创建窗口。4天后的胚胎存活率为79%，与之前的研究一致34,35。已经报道了其他方法，并取得了不同程度的成功。一种替代方法是通过对气囊施加吸力来将 CAM 从壳体上撬开，通常在 ED 的第 7-10 天左右。这种方法不需要刺破卵子33,36。在文献中，报告使用后一种技术的胚胎存活率的研究很少，而且相差甚远，一个团队报告了高达90%的胚胎存活率36。另一种可以考虑的选择是无壳雏鸡胚胎培养，也称为卵外培养。去除蛋壳可以不受限制地进入胚胎，从而促进胚胎操作和手术，并允许使用高分辨率成像技术进行现场实验，例如荧光显微镜和显微计算机形貌37,38。为了进行卵外培养，胚胎（包括其胚外膜）在ED的第2天和第4天之间被转移到特定的培养容器中。然而，这种技术是高度侵入性的，胚胎通常在第 12 天左右死亡，其中只有不到 18% 的胚胎存活到第 15 天38,39。
在此报道的异种移植实验中，通过将一小条无菌乙醚提取的晶状体纸贴在上皮表面并立即将其移除，将人卵巢植入物移植到受到轻微创伤的 CAM 上。总体而言，胚胎存活率非常好，在移植期间达到 96%，这与之前涉及将卵巢组织碎片移植到 CAM的研究一致 23,40。此外，这种方法已被证明可以提高移植物粘附率并增强随后的新生血管形成，血管生成可能由最初的伤口愈合过程诱导23。事实上，发现将大鼠卵巢组织异种移植到小鼠伤口愈合肉芽组织可以改善移植物血管化41。同样，在冷冻保存的人卵巢组织原位移植后报告的首例活产中，Donnez 等人在植入前 7 天创建了一个腹膜窗口并凝固其边缘，以刺激移植部位的血管生成和新生血管形成 42。
关于移植的人卵巢组织的组织学评估，卵泡存活率令人鼓舞，超过80%的卵泡在移植6天后保持完整。有趣的是，文献中报道的将人冻融卵巢组织移植到免疫缺陷小鼠腹膜后的卵泡存活率仅为30%左右10,14,18,43,44，远低于本研究。我们在将人卵巢组织移植到 CAM 后卵泡存活率增强的发现证实了我们最近发表的数据，其中我们证明了 CAM 抑制卵泡活化和细胞凋亡24。此外，禽类血管能够穿透植入物，移植仅 1 天后禽类红细胞的存在就证明了这一点。总而言之，这些结果表明，CAM方法是进一步检查人类卵巢组织移植的合适模型，因为它支持组织的存活。
CAM模型的主要缺点是嫁接的时间有限。事实上，移植最早可以在ED的第7天进行，一旦CAM充分发育，直到第17天，在雏鸡胚胎获得免疫能力并孵化之前。尽管移植时间很短，但CAM模型仍然是研究人类卵巢组织移植最初缺血阶段的有用工具。人们还可以使用该模型来测试促血管生成因子、保护性抗氧化剂、细胞因子、生长和生殖相关激素以及控制移植人卵巢组织中卵泡活化的因子的影响，所有这些都在易于控制的实验条件下进行 25,45。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢 Mira Hryniuk， BA 对本文的英文版进行审阅。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agani hypodermic needle, 19 G | Terumo Europe | AN*1950R1 | 19 G needle to aspirate albumen |
| Terumo syringe, 5 mL concentric Luer lock | Terumo Europe | SS*05LE1 | 5-mL sterile syringe |
| Caseviewer v2.2 | 3DHISTECH | Image analysis software | |
| Diethyl ether | Merck Chemicals | 603-022-00-4 | Sterile ether to traumatize the CAM |
| Eosin Y aqueous solution 0.5% | Merck | 1098441000 | Staining solution |
| Formaldehyde 4% aqueous solution buffered (Formalin 10%) | VWR | 97139010 | Formaldehyde used for tissue fixation |
| Fridge | Liebherr | 7081260 | Fridge at 4 °C used for paraffin-embedding |
| Heating plate | Schott | SLK2 | Hot plate used to dry the slides |
| Incubator | Thermo Forma Scientific 3111 | 10365156 | Oven used for slide incubation |
| Leica CLS 150 XE microscope cold light source | Leica | CLS 150 XE | Focal cold light source to candle the eggs |
| Lens cleaning tissue, grade 541 | VWR | 111-5003 | Tissue to soak in sterile ether to traumatize the CAM |
| Mayer's hematoxylin | MERCK | 1092491000 | Staining solution |
| Methanol | VWR | 20847307 | Methanol |
| Microtome | ThermoScientific-MICROM | HM325-2 | Microtome |
| Pannoramic P250 Flash III | 3DHISTECH | / | Slide scanner at 20x magnification |
| Paraformaldehyde | Merck | 1,04,00,51,000 | Paraffin-embedding solution |
| Paraplast Plus R | Sigma | P3683-1KG | Paraffin |
| Petri dish, 60x15 mm, sterile | Greiner | 628161 | Sterile petri dish |
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Pin holder |
| Polyhatch | Brinsea | CP01F | Egg incubator with automatic rotator |
| Scroll saw blade, 132 mm | Sencys | / | Saw blade to create a window in the eggshell |
| Stainless steel insert pins | Fine Science Tools | 26007-02 | Straight pin to make a hole in the eggshell |
| Steril-Helios | Angelantoni Industrie | ST-00275400000 | Laminar flow hood |
| Superfrost Plus bords rodés 90° | VWR | 631-9483 | Glass slides |
| Tissue-Tek VIP 6Al | Sakura | 60320417-0711 VID6E3-1 | Automatic embedding device |
| Titanium forceps | Fine Science Tools | 11602-16 | Forceps for eggshell removal and ovarian tissue manipulation |
| Toluene, pa | VWR | 28701364 | Paraffin-embedding solution |
References
- Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue and oocyte cryopreservation prior to iatrogenic premature ovarian insufficiency. Best Practice & Research Clinical Obstetrics & Gynaecology. 81, 119-133 (2022).
- Dolmans, M. -M., Hossay, C., Nguyen, T. Y. T., Poirot, C. Fertility preservation: How to preserve ovarian function in children, adolescents and adults. Journal of Clinical Medicine. 10 (22), 5247 (2021).
- Donnez, J., Dolmans, M. -M.
- Donnez, J., Dolmans, M. -M.
- Dolmans, M. -M., et al. Transplantation of cryopreserved ovarian tissue in a series of 285 women: a review of five leading European centers. Fertility and Sterility. 115 (5), 1102-1115 (2021).
- Shapira, M., Dolmans, M. -M., Silber, S., Meirow, D. Evaluation of ovarian tissue transplantation: results from three clinical centers. Fertility and Sterility. 114 (2), 388-397 (2020).
- Jensen, A. K., et al. Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark. Human Reproduction. 30 (12), 2838-2845 (2015).
- Vander Ven, H., et al. Ninety-five orthotopic transplantations in 74 women of ovarian tissue after cytotoxic treatment in a fertility preservation network: Tissue activity, pregnancy and delivery rates. Human Reproduction. 31 (9), 2031-2041 (2016).
- Diaz-Garcia, C., et al. Oocyte vitrification versus ovarian cortex transplantation in fertility preservation for adult women undergoing gonadotoxic treatments: A prospective cohort study. Fertility and Sterility. 109 (3), 478-485 (2018).
- Nisolle, M., Casanas-Roux, F., Qu, J., Motta, P., Donnez, J. Histologic and ultrastructural evaluation of fresh and frozen-thawed human ovarian xenografts in nude mice. Fertility and Sterility. 74 (1), 122-129 (2000).
- Van Eyck, A. -S., et al. Electron paramagnetic resonance as a tool to evaluate human ovarian tissue reoxygenation after xenografting. Fertility and Sterility. 92 (1), 374-381 (2009).
- Van Eyck, A. -S., et al. Both host and graft vessels contribute to revascularization of xenografted human ovarian tissue in a murine model. Fertility and Sterility. 93 (5), 1676-1685 (2010).
- Hossay, C., et al. Can frozen-thawed human ovary withstand refreezing-rethawing in the form of cortical strips. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (12), 3077-3087 (2020).
- Manavella, D. D., et al. Two-step transplantation with adipose tissue-derived stem cells increases follicle survival by enhancing vascularization in xenografted frozen-thawed human ovarian tissue. Human Reproduction. 33 (6), 1107-1116 (2018).
- Rahimi, G., et al. Re-vascularisation in human ovarian tissue after conventional freezing or vitrification and xenotransplantation. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 149 (1), 63-67 (2010).
- Cacciottola, L., Manavella, D. D., Amorim, C. A., Donnez, J., Dolmans, M. -M. In vivo characterization of metabolic activity and oxidative stress in grafted human ovarian tissue using microdialysis. Fertility and Sterility. 110 (3), 534-544 (2018).
- Gavish, Z., et al. Follicle activation is a significant and immediate cause of follicle loss after ovarian tissue transplantation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 35 (1), 61-69 (2018).
- Masciangelo, R., Hossay, C., Donnez, J., Dolmans, M. -M. Does the Akt pathway play a role in follicle activation after grafting of human ovarian tissue. Reproductive BioMedicine Online. 39 (2), 196-198 (2019).
- Fortune, J. E., Cushman, R. A., Wahl, C. M., Kito, S. The primordial to primary follicle transition. Molecular and Cellular Endocrinology. (1-2), 53-60 (2000).
- Cushman, R. A. Bovine ovarian cortical pieces grafted to chick embryonic membranes: A model for studies on the activation of primordial follicles. Human Reproduction. 17 (1), 48-54 (2002).
- Gigli, I., Cushman, R. A., Wahl, C. M., Fortune, J. E. Evidence for a role for anti-Müllerian hormone in the suppression of follicle activation in mouse ovaries and bovine ovarian cortex grafted beneath the chick chorioallantoic membrane. Molecular Reproduction and Development. 71 (4), 480-488 (2005).
- Qureshi, A. I., et al. Testosterone selectively increases primary follicles in ovarian cortex grafted onto embryonic chick membranes: relevance to polycystic ovaries. Reproduction. 136 (2), 187-194 (2008).
- Martinez-Madrid, B., et al. Chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) model: A useful tool to study short-term transplantation of cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 91 (1), 285-292 (2009).
- Hossay, C., et al. Follicle outcomes in human ovarian tissue: Effect of freezing, culture, and grafting. Fertility and Sterility. 119 (1), 135-145 (2023).
- Ribatti, D. The Chick Embryo Chorioallantoic Membrane in the Study of Angiogenesis and Metastasis. , Springer. Dordrecht, the Netherlands. (2010).
- Pawlikowska, P., et al. Exploitation of the chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) as a platform for anti-metastatic drug testing. Scientific Reports. 10 (1), 16876 (2020).
- Davison, T. F. The immunologists' debt to the chicken. British Poultry Science. 44 (1), 6-21 (2003).
- Schilling, M. A., et al. Transcriptional innate immune response of the developing chicken embryo to Newcastle disease virus infection. Frontiers in Genetics. 9, 61 (2018).
- Directives originating from the EU. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes (Text with EEA relevance). The National Archives. , Available from: https://www.legislation.gov.uk/eudr/2010/63/contents (2010).
- Dolmans, M. -M., et al. A review of 15 years of ovarian tissue bank activities. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (3), 305-314 (2013).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), 4986 (2008).
- Anderson, R. A., McLaughlin, M., Wallace, W. H. B., Albertini, D. F., Telfer, E. E. The immature human ovary shows loss of abnormal follicles and increasing follicle developmental competence through childhood and adolescence. Human Reproduction. 29 (1), 97-106 (2014).
- Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the chicken chorioallantoic membrane in vivo model to study gynecological and urological cancers. Journal of Visualized Experiments. (155), e60651 (2020).
- Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13 (8), 9959-9970 (2012).
- Sys, G. M. L., et al. The In ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. Journal of Visualized Experiments. (77), e50522 (2013).
- Li, M., et al. The in ovo chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an efficient xenograft model of hepatocellular carcinoma. Journal of Visualized Experiments. (104), e52411 (2015).
- Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
- Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications. Journal of Visualized Experiments. (44), e2154 (2010).
- Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts. Stem Cells International. 2013, 960958 (2013).
- Beck, K., Singh, J., Dar, M. A., Anzar, M. Short-term culture of adult bovine ovarian tissues: chorioallantoic membrane (CAM) vs. traditional in vitro culture systems. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 21 (2018).
- Israely, T., Nevo, N., Harmelin, A., Neeman, M., Tsafriri, A. Reducing ischaemic damage in rodent ovarian xenografts transplanted into granulation tissue. Human Reproduction. 21 (6), 1368-1379 (2006).
- Donnez, J., et al. Livebirth after orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue. The Lancet. 364 (9443), 1405-1410 (2004).
- Dolmans, M. -M., et al. Short-term transplantation of isolated human ovarian follicles and cortical tissue into nude mice. Reproduction. 134 (2), 253-262 (2007).
- Baird, D. T., Webb, R., Campbell, B. K., Harkness, L. M., Gosden, R. G. Long-term ovarian function in sheep after ovariectomy and transplantation of autografts stored at −196 C. Endocrinology. 140 (1), 462-471 (1999).
- Ribatti, D., Vacca, A., Roncali, L., Dammacco, F. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for in vivo research on anti-angiogenesis. Current Pharmaceutical Biotechnology. 1 (1), 73-82 (2000).
