Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

מודל הממברנה הכוריאואלנטואית של אפרוח (CAM) ככלי לחקר השתלת רקמת שחלה

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/64867
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Gynecology Research Unit, Institut de Recherche Expérimentale et Clinique, Université Catholique de Louvain, 2Gynecology Department, Cliniques Universitaires Saint-Luc

Summary

במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול לפיתוח מודל קסנוגרפטינג של קרום כוריואלנטואי אפרוח (CAM) עבור רקמת שחלה אנושית ומדגימים את יעילות הטכניקה, מסגרת הזמן של רה-וסקולריזציה של השתל ויכולת הקיום של הרקמה על פני תקופת השתלה של 6 ימים.

Abstract

שימור והשתלת רקמת שחלות היא אסטרטגיה יעילה לשימור פוריות, אך יש לה חסרון עיקרי אחד, והוא אובדן זקיקים מסיבי המתרחש זמן קצר לאחר ההשתלה מחדש עקב הפעלת זקיק חריגה ומוות. מכרסמים הם מודלים לבחינת הפעלת זקיקים, אך העלות, הזמן והשיקולים האתיים הופכים לאוסרים יותר ויותר, ובכך מניעים את הפיתוח של חלופות. מודל הממברנה הכוריאואלנטואית של האפרוחים (CAM) אטרקטיבי במיוחד, בהיותו זול ושומר על כשל חיסוני טבעי עד היום ה -17 לאחר ההפריה, מה שהופך אותו לאידיאלי ללמוד קסנוגרפטינג לטווח קצר של רקמת שחלה אנושית. ה- CAM הוא גם מאוד וסקולרי ונמצא בשימוש נרחב כמודל לחקר אנגיוגנזה. זה נותן לו יתרון יוצא דופן על פני מודלים במבחנה ומאפשר לחקור מנגנונים המשפיעים על תהליך אובדן זקיק מוקדם לאחר השתלה. הפרוטוקול המתואר כאן נועד לתאר את הפיתוח של מודל קסנוגרפטינג CAM עבור רקמת שחלה אנושית, עם תובנות ספציפיות לגבי יעילות הטכניקה, מסגרת הזמן של רה-וסקולריזציה של השתל ויכולת הקיום של הרקמה על פני תקופת השתלה של 6 ימים.

Introduction

הביקוש לשימור פוריות להתוויות אונקולוגיות ושפרות, כמו גם מסיבות חברתיות, גדל באופן דרמטי בעשורים האחרונים. עם זאת, טיפולים שונים המשמשים לריפוי מחלות ממאירות ולא ממאירות רעילים מאוד לגונדות ויכולים לגרום לאי ספיקת שחלות מוקדמת יאטרוגנית, מה שמוביל בסופו של דבר לאי פוריות1. טכניקות מבוססות לשימור פוריות כוללות שימור בהקפאת עוברים, ויטריפיקציה של ביציות לא בשלות או בוגרות, ושימור בהקפאה של רקמת שחלה 2,3,4. הקפאת רקמת שחלה היא האפשרות היחידה הזמינה לשימור פוריות אצל נערות לפני גיל ההתבגרות או נשים הזקוקות לטיפול מיידי בסרטן. שיקום התפקוד האנדוקריני לאחר השתלת רקמת שחלה מתרחש ביותר מ-95% מהנבדקות, כאשר שיעורי לידות החי נעים בין 18% ל-42%5,6,7,8,9.

למרות שהשתלת רקמת שחלה קפואה ומופשרת הוכחה כמוצלחת, עדיין יש מקום לשיפור. ואכן, כאשר שברי קליפת המוח בשחלות מושתלים ללא אנסטומוזה וסקולרית, הם חווים תקופה של היפוקסיה שבמהלכה מתרחשת revascularization השתל 10,11,12. הרוב המכריע של המחקרים שחקרו השתלת רקמת שחלה אנושית השתמשו במודל קסנוגרפטינג, שבו רקמת שחלה מושתלת בעכברות מדוכאות חיסון. הרה-וסקולריזציה המלאה של הקסנוגרפטים אורכת כ-10 ימים, כאשר הן כלי המארח והן כלי השתל תורמים להיווצרות כלי דם פונקציונליים 12,13,14. בסביבות 50%-90% מרזרבת הזקיק אובדת בחלון היפוקסי זה לפני השלמת רה-וסקולריזציה של השתל 10,15,16. הוצע מאוד כי אובדן זקיקים מסיבי זה מתרחש הן באמצעות מוות ישיר של זקיקים, כפי שמודגם על ידי ירידה במספר הזקיקים המוחלט שנותר לאחר השתלה, והן על ידי הפעלת צמיחת זקיקים קדמונית, כפי שעולה משינויים בפרופורציות הזקיקים לקראת שיעורים מוגברים של גידול זקיקים17,18.

באופן מעניין, עבודות מחקר קודמות שהשתמשו ברקמות שחלות שונות של בעלי חיים שהושתלו בקרום כוריאואלנטואי אפרוח (CAM), שיש לו מבנה המחקה את אתר ההשתלה הטיפוסי של הצפק, דיווחו על עיכוב של הפעלת זקיק ספונטנית, כאשר רזרבת הזקיק הראשונית נשארת שלמה עד 10 ימים 19,20,21,22. הצוות שלנו הוכיח בעבר כי השתלת רקמת שחלה אנושית קפואה-מופשרת ל-CAM היוותה גישה אמינה לחקר השתלת רקמת שחלה אנושית בשלביה האיסכמיים הראשונים23 ולאחרונה הראה כי שיטת השתלה זו הצליחה לנטרל את הפעלת זקיק24.

מודל CAM מושך במיוחד לא רק בגלל שביציות זולות בהרבה מעכברות, אלא גם בגלל האופי הווסקולרי מאוד של CAM, המאפשר לבחון את הקשר בין הפעלת זקיקים לבין רה-וסקולריזציה של שתל השחלות. מערכת העופות היא, אכן, אחת הדרכים הנפוצות והמגוונות ביותר לחקר אנגיוגנזה25. התפתחות עובר אפרוח (ED) אורכת 21 יום עד הבקיעה, וה-CAM נוצר בתוך 4-5 הימים הראשונים באמצעות איחוי האלנטואי והכוריון26. יש לציין כי עובר האפרוח הוא פונדקאי חיסוני באופן טבעי עד היום ה-17 של ED, כך שניתן לבצע ניסויים בקסנוגרפטינג ללא כל סיכון לדחיית השתל27,28. יתר על כן, גישת מודל CAM אינה מעלה כל חשש אתי או משפטי במונחים של החוק האירופי29, מה שהופך אותו חלופה אטרקטיבית למודלים אחרים של בעלי חיים. באשר לתנאי הרבייה, עוברי אפרוחים זקוקים רק לאינקובטור שנקבע על 37 מעלות צלזיוס עם לחות אוויר יחסית של 40%-60%. דרישות ניסוי מוגבלות אלה מפחיתות באופן משמעותי את עלויות המחקר בהשוואה לשימוש בעכברים מדוכאי חיסון.

הפרוטוקול המוצג כאן נועד לתאר את הפיתוח של מודל קסנוגרפטינג CAM עבור רקמת שחלה אנושית ולספק תובנות ספציפיות לגבי יעילות הטכניקה, מסגרת הזמן של רה-וסקולריזציה של השתל וכדאיות הרקמה על פני תקופת השתלה של 6 ימים. פרוטוקול זה יכול להיות בעל עניין רב לחקר המנגנונים מאחורי אובדן זקיק מוקדם לאחר השתלה ולחקר ההשפעה של מספר גורמים (גורמי גדילה, הורמונים וכו ') על תופעה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

השימוש ברקמה אנושית אושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של האוניברסיטה הקתולית של לוביין. המטופלות נתנו את הסכמתן מדעת בכתב לשימוש ברקמת השחלה שלהן למטרות מחקר.

1. הזמנת יום 0 ביציות בעלות סיכוי גבוה לעבור

  1. מצאו ספק מוסמך של ביצי לגהורן לבנות שנבחר על ידי לוהמן ברמת מעבדה, המדווח על שיעורים גבוהים של ביציות עובריות, התלוי בעיקר בגיל האפרוחים.

2. הכנת הביצים לדגירה;

  1. לפני הגעת הביצים, יש להרכיב ולאזן את אינקובטור הביצים לטמפרטורה של 37°C בלחות אוויר יחסית של 40%-60%. עקוב אחר הטמפרטורה ולחות האוויר על ידי הכנסת מדחום ומד לחות לאינקובטור. ודא שמכסה האינקובטור מצויד בחלון זכוכית כדי לאפשר לבדוק את הפרמטרים הפנימיים של האינקובטור מבלי לפתוח אותו (איור 1).
  2. לאחר שקיבלו את היום 0 ביצים מאפרוחי לגהורן לבנים שנבחרו על ידי לוהמן מספק ביצים מוסמך במעבדה, נקו את פני הקליפות בנייר לחות וייבשו אותן מיד.
    הערה: מכיוון שקרום קליפת הביצה נקבובי, ניתן להשתמש במים אוטוקלאביים לניקוי משטחי ביצים ולבקרת לחות בתוך האינקובטור על מנת למזער את סיכוני הזיהום.
  3. תייגו את הביצים באמצעות סמן (למשל, תאריך ומספר ביצה).
  4. דוגרים על הביצים כשהקצה המחודד פונה כלפי מטה, ומסובבים אותן כדי לאפשר ל-CAM להתפתח. סובבו ידנית את הביצים ב-180° פעמיים עד שלוש פעמים ביום או השתמשו במסובב אוטומטי.
    הערה: על מנת לוודא שהביצים אכן מסובבות, ניתן לסמן את קליפת הביצה באותיות "X" ו-"O" בשני הצדדים הצדיים המנוגדים באמצעות עיפרון או טוש. חלון הזכוכית במכסה האינקובטור מאפשר לבדוק את סיבוב הביצים מבלי לפתוח את המכשיר.

3. פתיחת קליפת הביצה ביום השלישי של ED

הערה: חלון מלבני נעשה בקליפת הביצה ביום 3 של ED.

  1. הכינו את מכסה המנוע של הזרימה הלמינרית על מנת לעבוד בתנאים סטריליים. הניחו את המכשירים הבאים מתחת למכסה המנוע, וחיטאו אותם באתנול 70% (אם לא עבר חיטוי כבר):
    - מתלה ביצים
    - נר ביצים או מקור אור קר מוקד
    -סמן
    - סיכה סטרילית ישרה
    -מחט סטרילית 19 גרם
    -5 מ"ל מזרק סטרילי
    - להב מסור גלילה
    -מלקחיים סטריליים
    - סרט הדבקה
  2. מעבירים ביצה אחת מהאינקובטור למתלה הביצים שמונח מתחת למכסה המנוע, ומכבים את מסובב הביצים.
  3. בחושך, זהו את כיס האוויר של הביצה על ידי הנחת נר הביצה (או מקור אור קר מוקדי) כנגד קליפת הביצה. כיס האוויר ממוקם בקצה הקהה של הביצה. השתמשו בטוש כדי לאתר את מרכז כיס האוויר על קליפת הביצה.
  4. הדליקו את האורות. עשו חור קטן בקליפת הביצה, שם היא מסומנת על ידי סיבוב עדין של סיכה ישרה סטרילית. פתח זעיר בקוטר של כ-1 מ"מ מספיק בדרך כלל.
    הערה: היזהרו לא לדחוף את הסיכה עד הביצה. אם זה קורה, השליכו את הביצה.
  5. חבר מחט סטרילית של 19 גרם למזרק סטרילי של 5 מ"ל.
  6. בחושך, אתר את שק החלמון באמצעות נר הביצה (או מקור אור קר מוקדי), ונקב את הביצה דרך החור שנוצר בשלב 3.4 עם מחט סטרילית 19 G בזווית של 45° לכיוון תחתית הביצה; היזהרו מאוד לא לשבש את שק החלמון. שואפים בין 1.5-2 מ"ל של אלבומן כדי לנתק את CAM מן הקליפה, ולאחר מכן לסגור את החור עם חתיכת סרט דבק.
    הערה: אם שק החלמון משובש במהלך השאיפה, הנוזל השואף במזרק יהיה בצבע צהוב ולא שקוף (אלבומן). אם זה קורה, להחליף את המחט ואת מזרק. אם נשאבת כמות גדולה יחסית של חלמון ביצה, הדבר עלול לסכן את יכולת הקיום של העובר.
  7. הדליקו את האורות. מניחים את הביצה בצורה אופקית, ומציירים בטוש חלון מלבני בגודל 1X1.5 ס"מ. אין להגדיל את החלון מהרוחב הרגיל של סרט הדבקה סטנדרטי.
  8. החזיקו את הביצה ביד אחת, וראו בעדינות את החלון ששורטט קודם לכן לתוך קליפת הביצה באמצעות להב מסור גלילה. ודא כי הקליפה אינה נסדקת ולא לחתוך כל הדרך עד CAM מדוכא. נשפו באופן קבוע כדי להסיר אבק פגזים ופסולת.
  9. החליקו מלקחיים סטריליים מתחת לחתיכה המלבנית של הקליפה המנוסרת, ואחזו במיומנות כדי להסיר אותה בצורה נקייה מבלי לפגוע ב- CAM. בנוסף, השליכו את קרום הקליפה החיצונית הלבנה כדי שתוכלו לראות את העובר ואת ה-CAM שלו.
    הערה: אם אבק קליפות ביצים או פסולת נופלים על CAM, ניתן להסיר אותו באמצעות מלקחיים סטריליים, נזהר מאוד לא לקרוע את CAM.
  10. זהה ביציות עובריות בנות קיימא. ניתן להבחין בהם על ידי האלבומן השקוף שלהם וטבעת כלי הדם סביב העובר, שם לב פועם עשוי לפעמים להיות מזוהה אפילו בשלב זה (יום 3 של ED). יש להשליך עוברים לא מופרים או מתים.
  11. הניחו סרט הדבקה על החלון החדש שנוצר כדי למנוע התייבשות. הקפד לקפל קצה אחד מעל עצמו כדי להקל על ההסרה.
  12. החזירו את הביצה לאינקובטור כשהחלון הפתוח פונה כלפי מעלה והקלטת לא נוגעת ב-CAM. השתמשו בפיסת נייר מקופלת או בחלק ממדף הביצים כדי למנוע מהביצה להתגלגל. ודא שהמגש המסתובב כבוי.
  13. חזור על שלבים 3.2-3.12 כדי לפתוח את הביציות הנותרות.

4. השתלת רקמת שחלה אנושית קפואה-מופשרת ל-CAM

הערה: השתלה ל- CAM צריכה להתחיל באופן אידיאלי בין הימים 7-10 של ED.

  1. הפשירו רצועות קליפת המוח של השחלות תחת מכסה המנוע של הזרימה הלמינרית בהתאם לפרוטוקול המתואר במקום אחר30.
  2. חותכים את רצועות קליפת המוח לשלושה שברים של 4 מ"מ x 2 מ"מ x 1 מ"מ. השתמש בחתיכה אחת כבקרה ללא השתלה ובשתיים האחרות לקסנוגרפטינג למשך יום אחד או 6 ימים.
    הערה: אם יש מספיק רקמה זמינה, עבוד בכפילות.
  3. מעבירים ביצה אחת מהאינקובטור למתלה הביצים הממוקם מתחת למכסה המנוע, כשהחלון פונה כלפי מעלה.
  4. קלפו את הסרט מהחלון, וודאו שהעובר בר-קיימא. בשלב זה, עוברים בני קיימא כוללים כלי דם נרחבים, אלבומן שקוף, פעימות לב נראות לעין ותנועה מסוימת של העובר.
  5. הכן את אתר ההשתלה על ידי טראומה עדינה של אזור קטן של CAM על ידי הנחת רצועה של 1 ס"מ2 של נייר עדשה סטרילי Ether-extracted על משטח האפיתל והסרתו מיד.
    הערה: ה- CAM הוא מחסום בלתי חדיר אלא אם כן הממברנה עברה טראומה על ידי הסרת החלק ההיקפי העליון של שכבת האפיתל הכפולה, והותירה את שכבת הבסיס שלמה. טכניקה זו גם משפרת את תהליך revascularization על ידי הפעלת ריפוי פצע. אם נייר העדשה הסטרילי שחולץ מאתר נשאר על ה-CAM זמן רב מדי, הממברנה עלולה להידבק לנייר העדשה ולהיקרע. אם זה קורה, השליכו את הביצה.
  6. אחזו ברצועה אחת של קליפת המוח השחלתית שהוקפאה והופשרה (4 מ"מ x 2 מ"מ x 1 מ"מ) בעזרת מלקחיים מיקרוכירורגיים, והניחו אותה על ה-CAM שעבר טראומה עם הצד המדולרי כנגד ה-CAM. להשתיל חתיכת רקמה אחת לכל ביצה.
  7. מכסים את החלון בסרט דבק, ומחזירים בזהירות את הביצה לאינקובטור. ודאו שפתח קליפת הביצה זקוף והביצה בטוחה.
  8. חזור על שלבים 4.1-4.7 להשתלת כל הרקמות הנותרות.
    הערה: יש לבדוק את השתלים בכל יום השתלה כדי להעריך את כדאיות העובר ולעקוב אחר שינויים בכלי הדם.

5. קצירת השתלים

הערה: Xenografts יש לקצור לכל המאוחר עד יום 17 של ED, שכן המערכת החיסונית של העובר הופך בוגר ומוכשר מהיום 18.

  1. הניחו את הביצה על מתלה, והגדילו את החלון בקליפת הביצה כדי לאפשר הדמיה טובה יותר של השתל ומניפולציה קלה יותר.
  2. להעריך את השתל באופן מקרוסקופי, ולשים לב במיוחד לתגובה וסקולרית של CAM כלפי השתל. צלם תמונות דיגיטליות או סרטונים לפרוטוקול.
  3. אחזו את הרקמה או את ה-CAM שמסביבה במלקחיים, והשתמשו במספריים או באזמל כדי להוציא את השתל מה-CAM בזהירות.
    הערה: השתלים מתכסים בשכבה שנייה של CAM בסביבות היום השלישי של ההשתלה ובסופו של דבר הופכים לעטופים. ייתכן גם שהם נעו בתוך הביצה ביום 6, מה שמקשה על שליפתם במקרים מסוימים.
  4. לנתח את הרקמות שנכרתו בכל שיטה המתאימה לניסוי הנתון. במחקר הנוכחי, חלקי רקמה היו קבועים בפרפורמלדהיד, משובצים בפרפין ומוכתמים בהמטוקסילין ואוזין בעקבות השלבים המתוארים להלן:
    1. תקן את השברים בפרפורמלדהיד 4% למשך 24 שעות, והטמע אותם בפרפין באמצעות התקן הטבעה אוטומטי עם השלבים המוזכרים בטבלה 1.
    2. השאירו את הקוביות המשובצות בפרפין למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C לפני שתחתכו אותן למקטעים בעובי 5 מיקרומטר בעזרת מיקרוטום.
    3. מורחים את חלקי הרקמה על מגלשת זכוכית המונחת על צלחת חמה (30 מעלות צלזיוס), ומשאירים אותם להתייבש במשך 2 שעות, ואחריו 24 שעות בתנור ב 37 מעלות צלזיוס.
    4. לאחר מכן, הכתימו את המגלשות בהמטוקסילין ובאאוסין בהתאם לפרוטוקול המתואר במקום אחר31. לאחר מכן, הפוך את הדגימות לדיגיטליות באמצעות סורק שקופיות, ונתח אותן באמצעות תוכנת ניתוח תמונות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שיעורי הישרדות עוברי אפרוחים
שיעור הישרדות העוברים מחלון (יום 3 של ED) להשתלת רקמת שחלה (יום 7 של ED) היה 79% (33/42). מכיוון שאחוז הביציות המועברות ביום 0 אינו ידוע, נצטוו מספר על 0 ביצים מתרנגולות לגהורן לבנות שנבחרו על ידי לוהמן כדי להבטיח שיהיו מספיק ביצים עובריות זמינות להשתלה. בסך הכל 23 ביציות בנות קיימא שימשו להשתלה, אחת מהן נספתה במהלך 24 השעות הראשונות, וכתוצאה מכך שיעור הישרדות העובר הכולל של 96% לאחר ההשתלה (22/23).

היבט מקרוסקופי של השתלים
לאחר יום אחד של השתלה, השתלים נראו בני קיימא ב-100% (10/10) מהמקרים, וכבר היו נצמדים לפחות חלקית ל-CAM, מה שמראה דפוס דיבור גלגל של כלי דם הדרושים לכלי הדם שלהם (איור 2A,B). לאחר 6 ימים של השתלה, כל השתלים עדיין היו דבוקים (איור 2C), מלבד שניים שלא התחברו ל-CAM. הם קיבלו מראה נמק ולא נכללו בניתוח נוסף (איור 3), מה שהביא לשיעור הישרדות של רקמה מושתלת של 83% (10/12) לאחר 6 ימים. בסך הכל, הערכת הכדאיות של השתלים בשחלות אנושיות גילתה שיעור הישרדות רקמה כולל של 91% (20/22), ללא קשר ליום ההשתלה (טבלה 2).

בסביבות היום השלישי לאחר ההשתלה, נמצא שהשתלים מכוסים בשכבה שנייה של CAM, ובסופו של דבר הם הפכו עטופים, מה שהוביל לכלי דם טובים עוד יותר של השתל (איור 2C). בסך הכל, 80% מההשתלות חדרו גם לביצית (איור 2D), ובמקרים מסוימים הקשו על שליפתן ביום השישי.

הערכה מיקרוסקופית של השתלים
30 מקטעי שחלות אנושיות קפואות ומופשרות שהתקבלו מחמש מטופלות שונות נותחו וקובעו בפרפורמלדהיד של 4% ביום ההשתלה ביום 0, יום 1 או יום 6, מוטמעים בפרפין, ונחתכים באופן סדרתי למקטעים של 5 מיקרומטר לצורך הערכה היסטולוגית (איור 4).

על מנת להעריך את שיעורי ההישרדות של זקיקי השחלות, זקיקים נספרו ב-12 מקטעים אקראיים המוכתמים בהמטוקסילין ובאאוזין לכל נקודת זמן ולכל מטופלת. רק זקיקים תקינים מורפולוגית עם ביצית נראית נלקחו בחשבון לניתוח32. זקיקים בריאים נצפו בכל נקודות הזמן (איור 4B-D). שיעורי הישרדות הזקיק חושבו על ידי קביעת צפיפות הזקיק הנותרת (מספר זקיקים/מ"מ 3) לאחר השתלתה ונורמליזציה לצפיפות הזקיק בבקרות לא מושתלות (נחשב 100%). צפיפות הזקיקים נטתה לרדת לאחר ההשתלה, אך לא מספיק כדי להגיע למובהקות סטטיסטית (עמ' > 0.8) (טבלה 2). באופן דומה, שיעורי הישרדות הזקיקים נשמרו במהלך תקופת ההשתלה, ועמדו על 95% ± 19% ביום הראשון ועל 83% ± 27% ביום 6 (p > 0.5).

תהליך הרה-וסקולריזציה נחקר עוד יותר על ידי זיהוי תאי דם אדומים של עופות בכלי הדם מרקמת השחלה הקסנוגרפית. קל להבחין באריתרוציטים של עופות מאחר שהם בעלי גרעין (איור 4A,C,D). באופן מפתיע, הצלחנו לצפות באריתרוציטים של עופות בכלי הדם בשחלות ב-30% מהשתלים לאחר יום אחד בלבד של ההשתלה ובכל השתלים ביום ה-6, תוך הפגנת רה-וסקולריזציה מהירה מאוד (טבלה 2).

Figure 1
איור 1: אינקובטור ביצים. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: היבט מקרוסקופי של שתלים בני קיימא. (א) יום השתלה 0. (B) שתלים ביום הראשון, כאשר ה-CAM מראה תבנית של כלי דם לכיוון רקמת השחלה. (C) שתלים עטופים על ידי CAM ביום 6, מה שמוביל לכלי דם טובים עוד יותר של השתל. (D) שתל החודר לביצה. החיצים מצביעים על רקמת השחלה המושתלת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: היבט מקרוסקופי של שתלים נמקיים. (A) רקמת שחלה בריאה למראה ביום 0 להשתלה. (B) אספקט נמק של השתל 6 ימים לאחר מכן. החיצים מצביעים על רקמת השחלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: היבט מיקרוסקופי של שתלים. חלקים המוכתמים בהמטוקסילין ובאאוזין של שתלים שהושתלו במשך (A,B) יום אחד ולמשך (C,D) 6 ימים. ראשי החץ מצביעים על תאי דם אדומים של עופות המנקבים את כלי הדם בשחלות לאחר (A) יום אחד ו-(C,D) 6 ימים של השתלה. החיצים מצביעים על זקיקים קדמוניים בריאים למראה בשתלים שהושתלו במשך (B) יום אחד ו-(C,D) 6 ימים. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

שלבים אמבטיות זמן
קיבוע שני 1 פורמלין 10% אמבט 2 שעות
התייבשות 7 אמבטיות מתנול 7x 1 שעות
הבהרה 3 אמבטיות טולואן 3x 1 שעות
הספגה 3 אמבטיות פרפין נוזליות (60°C) 15 דקות – 30 דקות – 30 דקות

טבלה 1: שלבי הטבעה של פרפין.

לא מושתל יום השתלה 1 יום השתלה 6 ערך P
היבט מקרוסקופי של שתלים
שיעור הישרדות רקמות - 100% (10/10) 83% (10/12) /
היבט מיקרוסקופי של שתלים
צפיפות זקיקים (n/mm3) 848 ± 272 817 ± 370 684 ± 236 פ > 0.8
שיעור הישרדות זקיקים 100% 95% ± 19% 83% ± 27% פ > 0.5
תאי דם אדומים של עופות הנמצאים בשתלים 0% (0/10) 30% (3/10) 100% (10/10) /

טבלה 2: תוצאות. ניתוח סטטיסטי שנערך באמצעות ANOVA חד כיוונית, ואחריו תיקון Sidak. התוצאות מבוטאות כממוצע ± סטיית תקן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

החלק המאתגר ביותר בפרוטוקול המתואר כאן הוא יצירת החור הקטן הדרוש לשאיפת האלבומן על מנת לנתק את ה- CAM מקליפת הביצה לפני יצירת חלון. הפעלת לחץ רב מדי עלולה לגרום לחדירת יתר או אפילו לסדוק ולהרוס את הביצית, ולגרום נזק בלתי הפיך ל- CAM ולכלי הדם שלה. כדי לצמצם את הטעויות למינימום במהלך הניסיונות הראשוניים להפריד את ה-CAM, מומלץ מאוד לתרגל יצירת חורים קטנים בקליפת הביצה של ביצים לא מופרות, שנקנו במכולת באמצעות סיכה ישרה. יתר על כן, בהתחשב בשונות הטבעית של הפוריות בין אצוות, יחד עם העובדה שלא כל העוברים שורדים את ההליך, מומלץ להשיג ביציות סופר-מספריות מספק הביציות. על מנת להשיג שיעורי הישרדות אופטימליים של עוברים ו-CAM מפותח, הביציות צריכות להיות מודגרות בתנאים אידיאליים. במקרה של כדאיות נמוכה, היבטים שונים עשויים להיות אשמים וצריך לחקור. יש ליצור קשר עם ספק הביציות, שכן הכדאיות של עוברים מהספק עשויה פשוט להיות נמוכה יותר בנקודת זמן זו. כדאיות ביצים נמוכה יכולה לנבוע גם מהגדרות אינקובטור לא מדויקות או לא מתאימות, מה שעלול לסכן את פיתוח ה- CAM. השימוש במדחום ומדחום עצמאיים יכול להבטיח שההגדרות מדויקות ויציבות, אך יש לספק הוראות מפורטות לפתרון בעיות על ידי היצרן. לבסוף, הוצע גם כי בדיקת ביציות מושתלות לעתים קרובות מדי עלולה לגרום לתנודות טמפרטורה ולחות, אשר עלולות להיות השפעות מזיקות על העוברים המושתלים33.

בפרוטוקול הנוכחי, החלון של קליפת הביצה בוצע ביום 3 של ED על ידי שאיפה סביב 2 מ"ל של אלבומן מן מן העובר כדי לנתק את CAM מן הקליפה, אשר, בתורו, אפשרה יצירת חלון מבלי לפגוע CAM. שיעור הישרדות העוברים 4 ימים לאחר מכן היה 79%, עקבי עםמחקרים קודמים 34,35. שיטות אחרות דווחו, בדרגות שונות של הצלחה. חלופה אחת היא להרחיק את ה- CAM מהמעטפת על ידי הפעלת יניקה על שק האוויר, בדרך כלל סביב יום 7-10 של ED. שיטה זו אינה דורשת ניקוב הביצה33,36. מחקרים המדווחים על שיעורי הישרדות עוברים באמצעות הטכניקה האחרונה הם מעטים ורחוקים בספרות, כאשר צוות אחד דיווח על עד 90% מהישרדות העובר36. אפשרות נוספת שיש לשקול היא תרבית עוברי אפרוח ללא קליפה, הידועה גם בשם תרבות אקס אובו. הסרת קליפת הביצה מספקת גישה בלתי מוגבלת לעובר, ובכך מקלה על מניפולציה וניתוח של העובר וגם מאפשרת שימוש בטכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה לניסויים חיים, כגון מיקרוסקופ פלואורסצנטי וטופוגרפיה מיקרו-ממוחשבת37,38. על מנת לבצע תרבית אקס-אובו, העובר, כולל הקרומים החוץ-עובריים שלו, מועבר לתרבית ספציפית בין היום השני ליום הרביעי של ED. עם זאת, טכניקה זו היא פולשנית מאוד, עם עוברים בדרך כלל למות סביב היום 12 ופחות מ 18% מהם שורדים עד יום 1538,39.

במהלך ניסויי הקסנוגרפטינג שדווחו כאן, הושתלו שתלי שחלות אנושיים ב- CAMs שעברו טראומה עדינה על ידי מריחת רצועה קטנה של נייר עדשה סטרילי שחולץ מאתר על פני השטח של האפיתל והסרתו מיד. בסך הכל, שיעורי הישרדות העוברים היו מצוינים והגיעו ל -96% במהלך תקופת ההשתלה, אשר עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים שכללו השתלת שברי רקמת שחלה ל- CAMs23,40. יתר על כן, גישה זו הוכחה כמגבירה את שיעורי הידבקות השתל ומשפרת את ההתבססות הבאה של ניאו-וסקולריזציה, כאשר אנגיוגנזה נגרמת ככל הנראה על ידי תהליך ריפוי הפצע הראשוני23. ואכן, רקמת שחלה של חולדה לרקמת גרנולציה מרפאת פצעים מורין נמצאה כמשפרת את כלי הדם של השתל41. כמו כן, בלידת החי הראשונה שדווחה לאחר השתלה אורתוטופית של רקמת שחלה אנושית שמורה בהקפאה, Donnez et al. יצרו חלון פריטוניאלי וקרשו את שוליו 7 ימים לפני ההשתלה כדי לעורר אנגיוגנזה וניאו-וסקולריזציה באתר ההשתלה42.

באשר להערכה היסטולוגית של רקמת שחלה אנושית מושתלת, שיעורי הישרדות הזקיקים היו מעודדים, כאשר יותר מ -80% מהזקיקים נותרו שלמים לאחר 6 ימים של השתלה. באופן מעניין, שיעורי הישרדות הזקיקים המדווחים בספרות לאחר השתלת רקמת שחלה אנושית קפואה-מופשרת לצפק של עכברים מדוכאי חיסון הם רק סביב 30%10,14,18,43,44, וזה הרבה יותר נמוך מאשר במחקר הנוכחי. הממצאים שלנו על הישרדות זקיקים משופרת לאחר השתלת רקמת שחלה אנושית ל- CAM מאששים את הנתונים שפורסמו לאחרונה, בהם אנו מראים כי CAM מעכב את הפעלת הזקיק ואפופטוזיס24. יתר על כן, כלי הדם של העופות הצליחו לחדור את השתלים, כפי שהודגם על ידי נוכחות של אריתרוציטים של עופות לאחר יום אחד בלבד של השתלה. בסיכומו של דבר, תוצאות אלה מוכיחות כי גישת CAM היא מודל מתאים לבחינה נוספת של השתלת רקמת שחלה אנושית, שכן היא תומכת בהישרדות הרקמה.

החיסרון העיקרי של מודל CAM הוא התקופה המוגבלת שבה השתלה אפשרית. ואכן, ניתן לבצע השתלה לכל המוקדם ביום השביעי של ED, ברגע שה- CAM התפתח מספיק, עד היום ה -17, לפני שעוברי האפרוחים רוכשים כשירות חיסונית ובוקעים. למרות משך ההשתלה הקצר, מודל CAM הוא עדיין כלי שימושי לחקר השתלת רקמת שחלה אנושית בשלביה האיסכמיים הראשונים. ניתן גם להשתמש במודל זה כדי לבחון את ההשפעה של גורמים פרואנגיוגניים, חומרים נוגדי חמצון מגנים, ציטוקינים, הורמונים הקשורים לגדילה ורבייה, וגורמים השולטים בהפעלת זקיקים ברקמת שחלה אנושית מושתלת, והכל בתנאי ניסוי שניתן לשלוט בהם בקלות25,45.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מודים למירה הריניוק, BA, על סקירת השפה האנגלית של המאמר.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agani hypodermic needle, 19 G Terumo Europe AN*1950R1 19 G needle to aspirate albumen
Terumo syringe, 5 mL concentric Luer lock Terumo Europe SS*05LE1 5-mL sterile syringe
Caseviewer v2.2 3DHISTECH Image analysis software
Diethyl ether Merck Chemicals 603-022-00-4 Sterile ether to traumatize the CAM
Eosin Y aqueous solution 0.5% Merck 1098441000 Staining solution
Formaldehyde 4% aqueous solution buffered (Formalin 10%) VWR 97139010 Formaldehyde used for tissue fixation
Fridge Liebherr 7081260 Fridge at 4 °C used for paraffin-embedding
Heating plate Schott SLK2 Hot plate used to dry the slides
Incubator Thermo Forma Scientific 3111 10365156 Oven used for slide incubation
Leica CLS 150 XE microscope cold light source Leica CLS 150 XE Focal cold light source to candle the eggs
Lens cleaning tissue, grade 541 VWR 111-5003 Tissue to soak in sterile ether to traumatize the CAM
Mayer's hematoxylin MERCK 1092491000 Staining solution
Methanol VWR 20847307 Methanol
Microtome ThermoScientific-MICROM HM325-2 Microtome
Pannoramic P250 Flash III 3DHISTECH / Slide scanner at 20x magnification
Paraformaldehyde  Merck 1,04,00,51,000 Paraffin-embedding solution
Paraplast Plus R Sigma P3683-1KG Paraffin
Petri dish, 60x15 mm, sterile Greiner 628161 Sterile petri dish
Pin holder Fine Science Tools 26016-12 Pin holder
Polyhatch Brinsea CP01F Egg incubator with automatic rotator
Scroll saw blade, 132 mm Sencys / Saw blade to create a window in the eggshell
Stainless steel insert pins Fine Science Tools 26007-02 Straight pin to make a hole in the eggshell
Steril-Helios  Angelantoni Industrie ST-00275400000 Laminar flow hood
Superfrost Plus bords rodés 90° VWR 631-9483 Glass slides 
Tissue-Tek VIP 6Al Sakura 60320417-0711 VID6E3-1 Automatic embedding device
Titanium forceps Fine Science Tools 11602-16 Forceps for eggshell removal and ovarian tissue manipulation
Toluene, pa VWR 28701364 Paraffin-embedding solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue and oocyte cryopreservation prior to iatrogenic premature ovarian insufficiency. Best Practice & Research Clinical Obstetrics & Gynaecology. 81, 119-133 (2022).
  2. Dolmans, M. -M., Hossay, C., Nguyen, T. Y. T., Poirot, C. Fertility preservation: How to preserve ovarian function in children, adolescents and adults. Journal of Clinical Medicine. 10 (22), 5247 (2021).
  3. Donnez, J., Dolmans, M. -M. Fertility preservation in women. New England Journal of Medicine. 377 (17), 1657-1665 (2017).
  4. Donnez, J., Dolmans, M. -M. Fertility preservation in women. Nature Reviews Endocrinology. 9 (12), 735-749 (2013).
  5. Dolmans, M. -M., et al. Transplantation of cryopreserved ovarian tissue in a series of 285 women: a review of five leading European centers. Fertility and Sterility. 115 (5), 1102-1115 (2021).
  6. Shapira, M., Dolmans, M. -M., Silber, S., Meirow, D. Evaluation of ovarian tissue transplantation: results from three clinical centers. Fertility and Sterility. 114 (2), 388-397 (2020).
  7. Jensen, A. K., et al. Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark. Human Reproduction. 30 (12), 2838-2845 (2015).
  8. Vander Ven, H., et al. Ninety-five orthotopic transplantations in 74 women of ovarian tissue after cytotoxic treatment in a fertility preservation network: Tissue activity, pregnancy and delivery rates. Human Reproduction. 31 (9), 2031-2041 (2016).
  9. Diaz-Garcia, C., et al. Oocyte vitrification versus ovarian cortex transplantation in fertility preservation for adult women undergoing gonadotoxic treatments: A prospective cohort study. Fertility and Sterility. 109 (3), 478-485 (2018).
  10. Nisolle, M., Casanas-Roux, F., Qu, J., Motta, P., Donnez, J. Histologic and ultrastructural evaluation of fresh and frozen-thawed human ovarian xenografts in nude mice. Fertility and Sterility. 74 (1), 122-129 (2000).
  11. Van Eyck, A. -S., et al. Electron paramagnetic resonance as a tool to evaluate human ovarian tissue reoxygenation after xenografting. Fertility and Sterility. 92 (1), 374-381 (2009).
  12. Van Eyck, A. -S., et al. Both host and graft vessels contribute to revascularization of xenografted human ovarian tissue in a murine model. Fertility and Sterility. 93 (5), 1676-1685 (2010).
  13. Hossay, C., et al. Can frozen-thawed human ovary withstand refreezing-rethawing in the form of cortical strips. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (12), 3077-3087 (2020).
  14. Manavella, D. D., et al. Two-step transplantation with adipose tissue-derived stem cells increases follicle survival by enhancing vascularization in xenografted frozen-thawed human ovarian tissue. Human Reproduction. 33 (6), 1107-1116 (2018).
  15. Rahimi, G., et al. Re-vascularisation in human ovarian tissue after conventional freezing or vitrification and xenotransplantation. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 149 (1), 63-67 (2010).
  16. Cacciottola, L., Manavella, D. D., Amorim, C. A., Donnez, J., Dolmans, M. -M. In vivo characterization of metabolic activity and oxidative stress in grafted human ovarian tissue using microdialysis. Fertility and Sterility. 110 (3), 534-544 (2018).
  17. Gavish, Z., et al. Follicle activation is a significant and immediate cause of follicle loss after ovarian tissue transplantation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 35 (1), 61-69 (2018).
  18. Masciangelo, R., Hossay, C., Donnez, J., Dolmans, M. -M. Does the Akt pathway play a role in follicle activation after grafting of human ovarian tissue. Reproductive BioMedicine Online. 39 (2), 196-198 (2019).
  19. Fortune, J. E., Cushman, R. A., Wahl, C. M., Kito, S. The primordial to primary follicle transition. Molecular and Cellular Endocrinology. (1-2), 53-60 (2000).
  20. Cushman, R. A. Bovine ovarian cortical pieces grafted to chick embryonic membranes: A model for studies on the activation of primordial follicles. Human Reproduction. 17 (1), 48-54 (2002).
  21. Gigli, I., Cushman, R. A., Wahl, C. M., Fortune, J. E. Evidence for a role for anti-Müllerian hormone in the suppression of follicle activation in mouse ovaries and bovine ovarian cortex grafted beneath the chick chorioallantoic membrane. Molecular Reproduction and Development. 71 (4), 480-488 (2005).
  22. Qureshi, A. I., et al. Testosterone selectively increases primary follicles in ovarian cortex grafted onto embryonic chick membranes: relevance to polycystic ovaries. Reproduction. 136 (2), 187-194 (2008).
  23. Martinez-Madrid, B., et al. Chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) model: A useful tool to study short-term transplantation of cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 91 (1), 285-292 (2009).
  24. Hossay, C., et al. Follicle outcomes in human ovarian tissue: Effect of freezing, culture, and grafting. Fertility and Sterility. 119 (1), 135-145 (2023).
  25. Ribatti, D. The Chick Embryo Chorioallantoic Membrane in the Study of Angiogenesis and Metastasis. , Springer. Dordrecht, the Netherlands. (2010).
  26. Pawlikowska, P., et al. Exploitation of the chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) as a platform for anti-metastatic drug testing. Scientific Reports. 10 (1), 16876 (2020).
  27. Davison, T. F. The immunologists' debt to the chicken. British Poultry Science. 44 (1), 6-21 (2003).
  28. Schilling, M. A., et al. Transcriptional innate immune response of the developing chicken embryo to Newcastle disease virus infection. Frontiers in Genetics. 9, 61 (2018).
  29. Directives originating from the EU. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes (Text with EEA relevance). The National Archives. , Available from: https://www.legislation.gov.uk/eudr/2010/63/contents (2010).
  30. Dolmans, M. -M., et al. A review of 15 years of ovarian tissue bank activities. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (3), 305-314 (2013).
  31. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), 4986 (2008).
  32. Anderson, R. A., McLaughlin, M., Wallace, W. H. B., Albertini, D. F., Telfer, E. E. The immature human ovary shows loss of abnormal follicles and increasing follicle developmental competence through childhood and adolescence. Human Reproduction. 29 (1), 97-106 (2014).
  33. Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the chicken chorioallantoic membrane in vivo model to study gynecological and urological cancers. Journal of Visualized Experiments. (155), e60651 (2020).
  34. Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13 (8), 9959-9970 (2012).
  35. Sys, G. M. L., et al. The In ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. Journal of Visualized Experiments. (77), e50522 (2013).
  36. Li, M., et al. The in ovo chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an efficient xenograft model of hepatocellular carcinoma. Journal of Visualized Experiments. (104), e52411 (2015).
  37. Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
  38. Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications. Journal of Visualized Experiments. (44), e2154 (2010).
  39. Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts. Stem Cells International. 2013, 960958 (2013).
  40. Beck, K., Singh, J., Dar, M. A., Anzar, M. Short-term culture of adult bovine ovarian tissues: chorioallantoic membrane (CAM) vs. traditional in vitro culture systems. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 21 (2018).
  41. Israely, T., Nevo, N., Harmelin, A., Neeman, M., Tsafriri, A. Reducing ischaemic damage in rodent ovarian xenografts transplanted into granulation tissue. Human Reproduction. 21 (6), 1368-1379 (2006).
  42. Donnez, J., et al. Livebirth after orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue. The Lancet. 364 (9443), 1405-1410 (2004).
  43. Dolmans, M. -M., et al. Short-term transplantation of isolated human ovarian follicles and cortical tissue into nude mice. Reproduction. 134 (2), 253-262 (2007).
  44. Baird, D. T., Webb, R., Campbell, B. K., Harkness, L. M., Gosden, R. G. Long-term ovarian function in sheep after ovariectomy and transplantation of autografts stored at −196 C. Endocrinology. 140 (1), 462-471 (1999).
  45. Ribatti, D., Vacca, A., Roncali, L., Dammacco, F. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for in vivo research on anti-angiogenesis. Current Pharmaceutical Biotechnology. 1 (1), 73-82 (2000).

Tags

ביולוגיה גיליון 196 הפעלת זקיקים אובדן זקיקים שימור בהקפאה השתלה מודלים של מכרסמים חלופות חסכוני חיסכון בזמן שיקולים אתיים קסנוגרפטינג רקמת שחלה אנושית כשל חיסוני אנגיוגנזה תהליך אובדן זקיקים לאחר השתלה מודל קסנוגרפטינג CAM מסגרת זמן רה-וסקולריזציה כדאיות רקמות
מודל הממברנה הכוריאואלנטואית של אפרוח (CAM) ככלי לחקר השתלת רקמת שחלה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hossay, C., Cacciottola, L.,… More

Hossay, C., Cacciottola, L., Storder, S., Van Kerk, O., Dolmans, M. M. The Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Model as a Tool to Study Ovarian Tissue Transplantation. J. Vis. Exp. (196), e64867, doi:10.3791/64867 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter