Summary
ここでは、ヒト卵巣組織のニワトリ絨毛膜(CAM)異種移植モデルを開発するためのプロトコルについて説明し、技術の有効性、移植片血行再建術の時間枠、および6日間の移植期間にわたる組織の生存率を示します。
Abstract
卵巣組織の凍結保存と移植は、妊孕性を維持するための効果的な戦略ですが、1つの大きな欠点があります、すなわち、異常な卵胞の活性化と死のために再移植直後に発生する大量の卵胞喪失です。げっ歯類は卵胞の活性化を調査するためのベンチマークモデルですが、コスト、時間、および倫理的考慮事項がますます法外になりつつあるため、代替法の開発が推進されています。ニワトリ絨毛膜(CAM)モデルは特に魅力的で、安価で、受精後17日目まで自然免疫不全を維持するため、ヒト卵巣組織の短期異種移植の研究に理想的です。また、CAMは高度に血管新生しており、血管新生を探索するためのモデルとして広く使用されています。これにより、 in vitro モデルよりも優れた利点が得られ、移植後の卵胞喪失プロセスの初期に影響を与えるメカニズムの調査が可能になります。本稿で概説するプロトコルは、ヒト卵巣組織のCAM異種移植モデルの開発を説明することを目的としており、技術の有効性、移植片血行再建術の時間枠、および6日間の移植期間にわたる組織生存率に関する具体的な洞察を備えています。
Introduction
腫瘍学的および良性の適応症、および社会的理由による妊孕性温存の需要は、ここ数十年で劇的に増加しています。しかし、悪性疾患や非悪性疾患の治療に用いられる様々な治療法は、生殖腺に対して非常に毒性が高く、医原性早期卵巣不全を引き起こし、最終的に不妊症につながる可能性があります1。妊孕性温存のための確立された技術には、胚凍結保存、未熟または成熟卵母細胞のガラス化、および卵巣組織凍結保存が含まれます2,3,4。卵巣組織の凍結は、思春期前の女児または即時のがん治療を必要とする女性の生殖能力を維持するために利用可能な唯一の選択肢です。卵巣組織移植後の内分泌機能の回復は、被験者の95%以上で発生し、出生率は18%から42%の範囲です5,6,7,8,9。
凍結融解した卵巣組織の移植は成功しているが、まだ改善の余地がある。実際、卵巣皮質断片は血管吻合なしで移植されるため、移植片血行再建術が行われる低酸素状態の期間を経験します10,11,12。ヒトの卵巣組織移植を調査する研究の大部分は、卵巣組織を免疫不全マウスに移植する異種移植モデルを使用していました。異種移植片の完全な血行再建術には約10日かかり、宿主血管と移植血管の両方が機能血管の形成に寄与します12,13,14。卵胞予備力の約50%〜90%は、移植片血行再建術が完了する前のこの低酸素ウィンドウ中に失われます10,15,16。この大規模な卵胞の喪失は、移植後に残された卵胞の絶対数の減少によって示されるように、直接的な卵胞死と、卵胞の成長率の増加に対する卵胞の割合の変化によって示されるように、原始卵胞の成長の活性化の両方によって起こることが強く示唆されています17,18。
興味深いことに、腹膜の典型的な移植部位を模倣した体質を持つニワトリ絨毛膜(CAM)に移植されたさまざまな動物の卵巣組織を使用した以前の研究研究では、自発的な卵胞活性化の阻害が報告されており、原始卵胞予備能は最大10日間無傷のままです19,20,21,22.私たちのチームは以前、凍結融解したヒト卵巣組織のCAMへの移植が、最初の虚血期のヒト卵巣組織移植を調査するための信頼できるアプローチを構成することを実証し23、最近、この移植法が卵胞の活性化を打ち消すことができることを示しました24。
CAMモデルは、卵子がマウスよりもはるかに安価であるだけでなく、CAMの高度に血管新生する性質により、卵胞の活性化と卵巣移植片血行再建術との関連を精査できるため、特に魅力的です。鳥類系は、実際、血管新生を研究する最も一般的で用途の広い方法の1つです25。ニワトリの胚発生(ED)は孵化まで21日かかり、CAMは尿膜と絨毛膜の融合により最初の4〜5日以内に形成されます26。特に、ニワトリ胚はEDの17日目までは自然に免疫不全の宿主であるため、異種移植実験は移植片拒絶反応のリスクなしに実行できます27,28。さらに、CAMモデルアプローチは、欧州法29の観点から倫理的または法的懸念を生じさせないため、他の動物モデルに代わる魅力的な選択肢となっています。繁殖条件に関しては、ニワトリの胚は、相対湿度が40%〜60%の37°Cに設定されたインキュベーターのみを必要とします。これらの限られた実験要件は、免疫不全マウスの使用と比較して研究コストを大幅に削減します。
本明細書で提示するプロトコルは、ヒト卵巣組織のCAM異種移植モデルの開発を説明し、技術の有効性、移植片血行再建術の時間枠、および6日間の移植期間にわたる組織生存率に関する特定の洞察を提供することを目的としています。このプロトコルは、移植後の早期卵胞喪失の背後にあるメカニズムを調査し、この現象に対するいくつかの薬剤(成長因子、ホルモンなど)の影響を研究するために非常に興味深いものになる可能性があります。
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Protocol
人体組織の使用は、ルーヴァン・カトリック大学の治験審査委員会によって承認されました。患者は、研究目的で卵巣組織を使用することについて、書面によるインフォームドコンセントを与えました。
1.受胎可能性が高い0日目の卵子を注文する
- 主に雛の年齢に依存する胚卵の割合が高いと報告している、認定されたラボグレードのローマンが選択した白いレグホーン卵のサプライヤーを見つけてください。
2.卵を孵化させる準備
- 卵が到着する前に、卵インキュベーターを組み立てて、相対湿度37%〜40%で60°Cに平衡化します。温度計と湿度計をインキュベーターに挿入して、温度と湿度を監視します。インキュベーターの蓋にガラス窓が付いており、インキュベーターを開けなくても内部パラメータを確認できるようにしてください(図1)。
- ローマンが選択した白いレグホーンの雛から認定された実験室グレードの卵サプライヤーから0日目の卵を受け取ったら、加湿した紙で殻の表面をきれいにし、すぐに乾燥させます。
注:卵殻膜は多孔質であるため、汚染リスクを最小限に抑えるために、卵の表面を洗浄し、インキュベーター内の湿度を制御するためにオートクレーブ水を使用できます。 - マーカー(日付や卵子番号など)を使用して卵にラベルを付けます。
- 尖った端を下に向けて卵を孵化させ、回転させてCAMを発達させます。1日に2〜3回、手動で卵を180°回転させるか、自動回転器を使用します。
注意: 卵が実際に回転していることを確認するために、卵の殻には、鉛筆またはマーカーを使用して、反対側の2つの側面に「X」と「O」のマークを付けることができます。インキュベーターの蓋にあるガラス窓により、装置を開かずに卵の回転を確認できます。
3. ED3日目に卵の殻を開ける
注:EDの3日目に卵の殻に長方形の窓が作られます。
- 無菌状態で作業するために、層流フードを準備します。以下の器具をボンネットの下に置き、70%エタノールで消毒します(まだ滅菌されていない場合)。
-エッグラック
-エッグキャンドラーまたは焦点冷光源
-マーカー
-滅菌ストレートピン
-滅菌済み19G針
-5 mL滅菌シリンジ
-スクロールソーブレード (Scroll saw blade)
-滅菌鉗子 (Sterile forceps)
-粘着テープ - 1つの卵をインキュベーターからフードの下に置かれたエッグラックに移し、エッグローテーターの電源を切ります。
- 暗闇の中で、卵のキャンドル(または焦点の冷光源)を卵の殻に当てて、卵のエアポケットを特定します。エアポケットは卵の鈍い端に局在しています。マーカーを使用して、卵殻のエアポケットの中心を特定します。
- ライトを点灯します。滅菌したまっすぐなピンをそっと回転させて、卵の殻に印が付けられている場所に小さな穴を開けます。通常、直径約1mmの小さな開口部で十分です。
注意: ピンを卵に完全に押し込まないように注意してください。このような場合は、卵を捨ててください。 - 滅菌済みの 19 G 針を滅菌済みの 5 mL シリンジに接続します。
- 暗闇の中で、卵キャンドル(または焦点冷光源)を使用して卵黄嚢を見つけ、卵の底に向かって45°の角度で滅菌した19Gの針を使用して、手順3.4で開けた穴から卵に穴を開けます。卵黄嚢を破壊しないように細心の注意を払ってください。1.5〜2 mLの卵白を吸引してCAMをシェルから剥がし、粘着テープで穴を塞ぎます。
注:吸引中に卵黄嚢が破壊された場合、シリンジ内の吸引液は透明(卵白)ではなく黄色になります。その場合は、針とシリンジを交換してください。比較的大量の卵黄を吸い上げると、胚の生存率が損なわれる可能性があります。 - ライトを点灯します。卵を水平に置き、マーカーで1cm×1.5cmの長方形の窓を描きます。窓を通常の粘着テープの幅よりも大きくしないでください。
- 卵を片手で持ち、スクロールソーの刃を使用して、前に描いた窓を卵の殻にそっとのこぎりで切ります。シェルに亀裂が入らないようにし、押し下げた CAM まで切り込まないようにします。定期的に吹き飛ばして、シェルのほこりや破片を取り除きます。
- 鋸で挽いたシェルの長方形の部分の下に滅菌鉗子をスライドさせ、巧みにつかんでCAMを損傷することなくきれいに取り外します。さらに、白い外殻膜を捨てて、胚とそのCAMを確認できるようにします。
注意: 卵殻のほこりや破片がCAMに落ちた場合は、CAMを引き裂かないように細心の注意を払って、滅菌鉗子を使用して取り除くことができます。 - 生存可能な胚卵子を特定します。それらは、透明な卵白と胚の周りの血管リングによって識別でき、この段階(EDの3日目)でも心臓の鼓動が検出されることがあります。未受精または死んだ胚を廃棄します。
- 脱水症状を防ぐために、新しく作成した窓に粘着テープを貼ります。取り外しやすいように、必ず片方の端を折りたたんでください。
- 開いた窓を上に向けて、テープがCAMに触れないように卵をインキュベーターに戻します。折りたたんだ紙または卵ラックの一部を使用して、卵が転がるのを止めます。回転トレイがオフになっていることを確認します。
- 手順3.2〜3.12を繰り返して、残りの卵を開きます。
4. 凍結融解したヒト卵巣組織をCAMに移植
注:CAMへの移植は、理想的にはEDの7〜10日目の間に開始する必要があります。
- 凍結保存された卵巣皮質ストリップを、他の場所に記載されているプロトコルに従って層流フードの下で融解します30。
- 皮質ストリップを4 mm x 2 mm x 1 mmの3つの断片に切断します。1枚を非移植対照として使用し、他の2枚を1日または6日間の異種移植に使用します。
注意: 十分な組織が利用可能な場合は、二重に作業します。 - 1つの卵をインキュベーターからフードの下にあるエッグラックに移し、窓を上に向けてください。
- 窓からテープをはがし、胚が生存可能であることを確認します。この段階では、生存可能な胚は、広範な血管系、透明な卵白、目に見える心拍、およびいくつかの胚の動きを特徴としています。
- 1 cm2 の滅菌エーテル抽出レンズペーパーを上皮表面に置き、すぐに取り除くことにより、CAM の小さな領域に穏やかな外傷を与えることにより、移植部位を準備します。
注:CAMは、二重上皮層の上部皮周囲部分の除去によって膜が外傷を受け、基底層が無傷のままでない限り、侵入できないバリアです。この技術は、創傷治癒を活性化することにより、血行再建プロセスも強化します。滅菌エーテル抽出レンズペーパーがCAMに長く留まると、メンブレンがレンズペーパーに付着して破れる可能性があります。このような場合は、卵を捨ててください。 - 凍結融解した卵巣皮質ストリップ(4 mm x 2 mm x 1 mm)をマイクロサージェリー鉗子でつかみ、髄様側をCAMに当てて外傷を負ったCAMに置きます。卵1個につき1つのティッシュ片を移植します。
- 窓を粘着テープで覆い、卵を慎重にインキュベーターに戻します。卵の殻の開口部が直立し、卵がしっかりしていることを確認してください。
- 残りのすべての組織を移植するために、手順4.1〜4.7を繰り返します。
注:インプラントは、胚の生存率を評価し、血管系の変化を監視するために、移植日ごとにチェックする必要があります。
5.接ぎ木の採取
注:異種移植片は、胚の免疫系が18日目から成熟して有能になるため、遅くともEDの17日目までに収穫する必要があります。
- 卵をラックに置き、卵殻の窓を大きくして、移植片の視覚化と操作を容易にします。
- 移植片を肉眼的に評価し、移植片に対するCAMの血管反応に特に注意を払います。記録のためにデジタル写真またはビデオを撮ります。
- 鉗子で組織または周囲のCAMをつかみ、ハサミまたはメスを使用してCAMから移植片を慎重に切除します。
注:移植片は、移植の3日目頃にCAMの2番目の層で覆われ、最終的にカプセル化されます。また、6日目までに卵の中を移動した可能性があり、場合によっては回収が困難になります。 - 切除した組織を、特定の実験に適した方法で分析します。本研究では、組織片をパラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋し、以下に概説する手順に従ってヘマトキシリンとエオシンで染色しました。
- フラグメントを 4% パラホルムアルデヒドで 24 時間固定し、 表 1 に示す手順で自動包埋装置を使用してパラフィンに包埋します。
- パラフィン包埋ブロックを4°Cで一晩放置してから、ミクロトームで厚さ5μmに切断します。
- ホットプレート(30°C)に置いたスライドガラス上に組織切片を広げ、2時間乾燥させた後、37°Cのオーブンで24時間放置します。
- その後、スライドをヘマトキシリンとエオシンで染色し、他の場所で説明するプロトコルに従って31。その後、スライドスキャナーでサンプルをデジタル化し、画像解析ソフトで解析します。
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Representative Results
ニワトリ胚の生存率
ウィンドウ化(EDの3日目)から卵巣組織移植(EDの7日目)までの胚生存率は79%(33/42)でした。0日目の胚卵の割合は不明であるため、十分な胚卵を接ぎ木に利用できるようにするために、ローマンが選択した白いレグホーン鶏の0日目の卵を過剰に注文しました。合計23個の生存可能な7日目の卵子が移植に使用され、そのうちの1個は最初の24時間で死亡し、移植後の全胚生存率は96%(22/23)でした。
移植片の巨視的側面
移植の1日後、移植片は100%(10/10)の症例で生存可能に見え、すでに少なくとも部分的にCAMに接着しており、血管新生に必要な血管のホイールスポークパターンを示しました(図2A、B)。移植の6日後、CAMに付着しなかった2つのインプラントを除いて、すべてのインプラントは依然として接着していました(図2C)。それらは壊死性の外観を呈し、さらなる分析から除外され(図3)、6日後の移植組織生存率は83%(10/12)でした。全体として、ヒト卵巣移植片の生存率評価では、移植日に関係なく、91%(20/22)の全組織生存率が明らかになりました(表 2)。
移植後3日目頃、移植片は第2層のCAMで覆われていることが判明し、最終的にはカプセル化され、移植片の血管新生がさらに良好になりました(図2C)。全体として、移植の80%は卵子にも貫通しており(図2D)、場合によっては6日目に卵子を回収するのが困難であった。
移植片の顕微鏡的評価
5人の異なる患者から得られた合計30個の凍結融解したヒト卵巣断片を分析し、移植0日目、1日目、または6日目に4%パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋し、組織学的評価のために5μm切片に連続的に切断しました(図4)。
卵巣卵胞の生存率を評価するために、卵胞は、時点および患者ごとに12のランダムなヘマトキシリンおよびエオシン染色切片でカウントされました。目に見える卵母細胞を有する形態学的に正常な卵胞のみが分析のために考慮された32。健康な卵胞はすべての時点で観察されました(図4B-D)。卵胞生存率は、移植後の残りの卵胞密度(卵胞数/mm3)を決定し、移植されていない対照(100%と見なされる)の卵胞密度に正規化することによって計算されました。卵胞密度は移植後に減少する傾向があったが、統計的有意性に達するには十分ではなかった(p > 0.8)(表2)。同様に、卵胞の生存率は移植期間中も維持され、1日目は95%±19%、6日目は83%±27%でした(p > 0.5)。
血行再建過程は、異種移植卵巣組織からの血管内の鳥類赤血球の検出によってさらに調査されました。鳥類の赤血球は有核であるため、容易に識別できます(図4A、C、D)。驚いたことに、移植後わずか1日でインプラントの30%、6日目までにすべてのインプラントで卵巣血管内の鳥類赤血球を観察し、非常に急速な血行再建術を示すことができました(表 2)。
図1:卵のインキュベーター。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:実行可能なインプラントの巨視的側面。 (A)接ぎ木0日目。(B)1日目のインプラントで、CAMは卵巣組織に向かう血管のホイールスポークパターンを示しています。(C)6日目にCAMによってカプセル化されたインプラントは、移植片の血管新生をさらに改善します。(D)卵子を貫通する移植片。矢印は移植された卵巣組織を指しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:壊死インプラントの巨視的側面。 (A)移植0日目の健康そうな卵巣組織。(B)6日後のインプラントの壊死面。矢印は卵巣組織を指しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:インプラントの微視的側面。 インプラントのヘマトキシリンおよびエオシン染色切片を (A、B) 1 日間、(C,D) 6 日間移植しました。矢印は、(A)1日および(C、D)6日間の移植後に卵巣血管を灌流する鳥の赤血球を指しています。矢印は、(B)1日間および(C、D)6日間移植されたインプラントの健康に見える原始卵胞を示しています。スケールバー:50 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| ステップス | 風呂 | 時間 |
| 2回目の固定 | ホルマリン10%バス1個 | 2時間 |
| 脱水 | 7つのメタノールバス | 1時間7回 |
| 解明 | トルエン浴3ヶ所 | 1時間×3回 |
| 懐胎 | 流動パラフィン浴3回(60°C) | 15分〜30分〜30分 |
表1:パラフィン包埋ステップ。
| 非グラフト | 接ぎ木1日目 | 接ぎ木6日目 | p値 | |
| 移植片の肉眼的側面 | ||||
| 組織生存率 | - | 100% (10/10) | 83% (10/12) | / |
| 移植片の微視的側面 | ||||
| 卵胞密度(n / mm3) | 848 ± 272 | 817 ± 370 | 684 ± 236 | p > 0.8 |
| 卵胞生存率 | 100% | 95% ± 19% | 83% ± 27% | p > 0.5 |
| インプラントに存在する鳥類の赤血球 | 0% (0/10) | 30% (3/10) | 100% (10/10) | / |
表2:結果 一元配置分散分析を使用して統計分析を行い、その後に Sidak 補正を行います。結果は、標準偏差±平均値で表されます。
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Discussion
ここで説明するプロトコールの最も困難な部分は、窓を作成する前に卵白を卵殻から取り外すために卵白を吸引するために必要な小さな穴を開けることです。圧力をかけすぎると、過剰に浸透したり、卵子にひびが入って破壊したりして、CAMとその血管系に取り返しのつかない損傷を与える可能性があります。CAMを分離する最初の試みで間違いを最小限に抑えるために、まっすぐなピンを使用して、受精していない食料品で購入した卵の卵殻に小さな穴を開ける練習をすることを強くお勧めします。さらに、バッチ間での受胎能の自然な変動性、およびすべての胚が手順を生き残るわけではないという事実を考えると、卵子供給業者から過剰な卵子を入手することをお勧めします。最適な胚生存率と十分に発達したCAMを達成するためには、卵を理想的な条件で孵化させる必要があります。生存率が低い場合は、さまざまな側面が原因であり、調査が必要です。この時点では、供給者からの胚の生存率が単に低い可能性があるため、卵子供給者に連絡する必要があります。卵子の生存率が低いのは、インキュベーターの設定が不正確または不適切であることが原因である可能性もあり、CAMの発育を損なう可能性があります。独立した湿度計と温度計を使用すると、設定が正確で安定していることを確認できますが、詳細なトラブルシューティング手順は製造元から提供される必要があります。最後に、移植された卵子を頻繁にチェックすると、温度と湿度の変動が生じ、移植された胚に悪影響を及ぼす可能性があることも示唆されています33。
本プロトコルでは、EDの3日目に、胚から約2mLの卵白を吸引してCAMを殻から剥離することにより、卵殻のウィンドウ化を行い、CAMを損傷することなくウィンドウを作成することができました。4日後の胚生存率は79%であり、以前の研究と一致しています34,35。他の方法も報告されていますが、成功の度合いはさまざまです。1つの代替案は、通常EDの7〜10日目頃に気嚢に吸引を加えてCAMを殻から離すことです。この方法では、卵に穴を開ける必要はありません33,36。後者の手法を用いた胚生存率を報告した研究は文献にほとんどなく、あるチームは胚生存率の最大90%を報告している36。検討すべきもう一つの選択肢は、殻のないニワトリ胚培養で、ex ovo cultureとしても知られています。卵殻を取り除くと、胚への無制限のアクセスが可能になり、胚の操作と手術が容易になり、蛍光顕微鏡やマイクロコンピュータートポグラフィーなどのライブ実験のための高解像度イメージング技術の使用も可能になります37,38。ex ovo培養を行うために、胚は、その胚外膜を含めて、EDの2日目から4日目の間に特定の培養封じ込めに移されます。しかし、この技術は非常に侵襲的であり、胚は通常12日目頃に死亡し、15日目まで生き残る胚は18%未満です38,39。
本明細書で報告した異種移植実験では、ヒト卵巣インプラントを、滅菌エーテル抽出レンズペーパーの小さなストリップを上皮の表面に塗布し、直ちに除去することにより、穏やかに外傷を負ったCAMに移植した。全体として、胚の生存率は優れており、移植期間中に96%に達しました これは、卵巣組織断片のCAMへの移植を含む以前の研究と一致しています23,40。さらに、このアプローチは、移植片の接着率を高め、その後の血管新生の確立を促進することが示されており、血管新生は最初の創傷治癒プロセスによって誘発される可能性が高い23。実際、ラットの卵巣組織をマウスの創傷治癒肉芽組織に異種移植すると、移植片の血管新生が改善することがわかった41。同様に、凍結保存されたヒト卵巣組織の同所性移植後に報告された最初の生児出生では、Donnezらは、移植部位における血管新生および血管新生を刺激するために、移植の7日前に腹膜窓を作成し、その縁を凝固させた42。
移植されたヒト卵巣組織の組織学的評価に関しては、卵胞の生存率は有望であり、移植の6日後に卵胞の80%以上が無傷のままでした。興味深いことに、ヒト凍結融解卵巣組織を免疫不全マウスの腹膜に移植した後の卵胞生存率は、約30%10,14,18,43,44程度に過ぎず、本研究よりもはるかに低い。ヒト卵巣組織をCAMに移植した後の卵胞生存率の向上に関する我々の発見は、CAMが卵胞の活性化とアポトーシスを阻害することを実証した、最近発表されたデータを裏付けている24。さらに、移植後わずか1日で鳥類の赤血球が存在することからもわかるように、鳥類の血管はインプラントを貫通することができました。全体として、これらの結果は、CAMアプローチが組織の生存をサポートするため、ヒト卵巣組織の移植をさらに精査するための適切なモデルであることを示しています。
CAMモデルの主な欠点は、接ぎ木が可能な期間が限られていることです。実際、移植は、早くてもEDの7日目に、CAMが十分に発達するとすぐに、ニワトリ胚が免疫能力を獲得して孵化する前の17日目まで行うことができます。移植期間が短いにもかかわらず、CAMモデルは、最初の虚血段階にあるヒト卵巣組織移植を研究するための有用なツールです。また、このモデルを使用して、血管新生促進因子、保護抗酸化剤、サイトカイン、成長および生殖関連ホルモン、および移植されたヒト卵巣組織における卵胞活性化を制御する因子の影響を、すべて簡単に制御できる実験条件下でテストすることもできます25,45。
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Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
著者らは、論文の英語をレビューしてくれたMira Hryniuk(BA)に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agani hypodermic needle, 19 G | Terumo Europe | AN*1950R1 | 19 G needle to aspirate albumen |
| Terumo syringe, 5 mL concentric Luer lock | Terumo Europe | SS*05LE1 | 5-mL sterile syringe |
| Caseviewer v2.2 | 3DHISTECH | Image analysis software | |
| Diethyl ether | Merck Chemicals | 603-022-00-4 | Sterile ether to traumatize the CAM |
| Eosin Y aqueous solution 0.5% | Merck | 1098441000 | Staining solution |
| Formaldehyde 4% aqueous solution buffered (Formalin 10%) | VWR | 97139010 | Formaldehyde used for tissue fixation |
| Fridge | Liebherr | 7081260 | Fridge at 4 °C used for paraffin-embedding |
| Heating plate | Schott | SLK2 | Hot plate used to dry the slides |
| Incubator | Thermo Forma Scientific 3111 | 10365156 | Oven used for slide incubation |
| Leica CLS 150 XE microscope cold light source | Leica | CLS 150 XE | Focal cold light source to candle the eggs |
| Lens cleaning tissue, grade 541 | VWR | 111-5003 | Tissue to soak in sterile ether to traumatize the CAM |
| Mayer's hematoxylin | MERCK | 1092491000 | Staining solution |
| Methanol | VWR | 20847307 | Methanol |
| Microtome | ThermoScientific-MICROM | HM325-2 | Microtome |
| Pannoramic P250 Flash III | 3DHISTECH | / | Slide scanner at 20x magnification |
| Paraformaldehyde | Merck | 1,04,00,51,000 | Paraffin-embedding solution |
| Paraplast Plus R | Sigma | P3683-1KG | Paraffin |
| Petri dish, 60x15 mm, sterile | Greiner | 628161 | Sterile petri dish |
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Pin holder |
| Polyhatch | Brinsea | CP01F | Egg incubator with automatic rotator |
| Scroll saw blade, 132 mm | Sencys | / | Saw blade to create a window in the eggshell |
| Stainless steel insert pins | Fine Science Tools | 26007-02 | Straight pin to make a hole in the eggshell |
| Steril-Helios | Angelantoni Industrie | ST-00275400000 | Laminar flow hood |
| Superfrost Plus bords rodés 90° | VWR | 631-9483 | Glass slides |
| Tissue-Tek VIP 6Al | Sakura | 60320417-0711 VID6E3-1 | Automatic embedding device |
| Titanium forceps | Fine Science Tools | 11602-16 | Forceps for eggshell removal and ovarian tissue manipulation |
| Toluene, pa | VWR | 28701364 | Paraffin-embedding solution |
References
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