Summary
In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll für die Entwicklung eines Xenotransplantatmodells für menschliches Ovarialgewebe und demonstrieren die Wirksamkeit der Technik, den Zeitrahmen für die Revaskularisierung des Transplantats und die Lebensfähigkeit des Gewebes über einen Zeitraum von 6 Tagen.
Abstract
Die Kryokonservierung und Transplantation von Eierstockgewebe ist eine wirksame Strategie zur Erhaltung der Fruchtbarkeit, hat jedoch einen großen Nachteil, nämlich den massiven Follikelverlust, der kurz nach der Reimplantation aufgrund einer abnormalen Follikelaktivierung und des Todes auftritt. Nagetiere sind Benchmark-Modelle für die Untersuchung der Follikelaktivierung, aber die Kosten, der Zeitaufwand und die ethischen Überlegungen werden immer unerschwinglicher, was die Entwicklung von Alternativen vorantreibt. Das Modell der Chorioallantoismembran (CAM) von Küken ist besonders attraktiv, da es kostengünstig ist und die natürliche Immundefizienz bis zum Tag 17 nach der Befruchtung aufrechterhält, was es ideal für die Untersuchung der kurzfristigen Xenotransplantation von menschlichem Eierstockgewebe macht. Das CAM ist auch stark vaskularisiert und wurde häufig als Modell zur Erforschung der Angiogenese verwendet. Dies verschafft ihm einen bemerkenswerten Vorteil gegenüber In-vitro-Modellen und ermöglicht die Untersuchung von Mechanismen, die den frühen Follikelverlustprozess nach der Transplantation beeinflussen. Das hier beschriebene Protokoll zielt darauf ab, die Entwicklung eines CAM-Xenografting-Modells für menschliches Ovarialgewebe zu beschreiben, mit spezifischen Einblicken in die Wirksamkeit der Technik, den Zeitrahmen für die Revaskularisierung des Transplantats und die Lebensfähigkeit des Gewebes über einen Transplantationszeitraum von 6 Tagen.
Introduction
Die Nachfrage nach Fertilitätserhalt bei onkologischen und gutartigen Indikationen sowie aus sozialen Gründen ist in den letzten Jahrzehnten dramatisch gestiegen. Verschiedene Behandlungen, die zur Heilung von bösartigen und nicht-bösartigen Erkrankungen eingesetzt werden, sind jedoch hochtoxisch für die Keimdrüsen und können zu einer iatrogenen vorzeitigen Ovarialinsuffizienz führen, die letztendlich zu Unfruchtbarkeit führt1. Zu den etablierten Techniken zur Erhaltung der Fruchtbarkeit gehören die Kryokonservierung von Embryonen, die Vitrifikation unreifer oder reifer Eizellen und die Kryokonservierung von Eierstockgewebe 2,3,4. Das Einfrieren von Eierstockgewebe ist die einzige verfügbare Option zur Erhaltung der Fruchtbarkeit bei präpubertären Mädchen oder Frauen, die eine sofortige Krebstherapie benötigen. Die Wiederherstellung der endokrinen Funktion nach einer Transplantation von Eierstockgewebe tritt bei über 95 % der Patientinnen auf, wobei die Lebendgeburtenraten zwischen 18 % und 42 % liegen5,6,7,8,9.
Obwohl sich die Transplantation von gefrorenem und aufgetautem Eierstockgewebe bewährt hat, gibt es noch Raum für Verbesserungen. Da die kortikalen Fragmente der Eierstöcke ohne vaskuläre Anastomose transplantiert werden, erleben sie eine Phase der Hypoxie, in der die Revaskularisierung des Transplantats stattfindet 10,11,12. Die überwiegende Mehrheit der Studien, die die Transplantation von menschlichem Eierstockgewebe untersuchen, haben ein Xenografting-Modell verwendet, bei dem Eierstockgewebe an immundefiziente Mäuse transplantiert wird. Die vollständige Revaskularisation der Xenotransplantate dauert etwa 10 Tage, wobei sowohl die Wirts- als auch die Transplantatgefäße zur Bildung funktioneller Gefäße beitragen 12,13,14. Etwa 50%-90% der Follikelreserve gehen während dieses hypoxischen Fensters vor Abschluss der Revaskularisation des Transplantats verloren 10,15,16. Es wurde stark vermutet, dass dieser massive Follikelverlust sowohl durch den direkten Follikeltod, wie er sich in einer Abnahme der absoluten Follikelzahl nach der Transplantation zeigt, als auch durch die Aktivierung des primordialen Follikelwachstums auftritt, was durch Veränderungen der Follikelproportionen in Richtung erhöhter Wachstumsraten der Follikel angezeigt wird17,18.
Interessanterweise haben frühere Forschungsarbeiten mit verschiedenen tierischen Eierstockgeweben, die auf die Chorioallantoismembran (CAM) des Kükens transplantiert wurden, die eine Konstitution hat, die die typische Transplantationsstelle des Peritoneums nachahmt, über die Hemmung der spontanen Follikelaktivierung berichtet, wobei die primordiale Follikelreserve bis zu 10 Tage intakt bleibt 19,20,21,22. Unser Team hat bereits gezeigt, dass die Transplantation von gefrorenem und aufgetautem menschlichem Ovarialgewebe in CAM einen zuverlässigen Ansatz für die Untersuchung der Transplantation von menschlichem Eierstockgewebe in ihren ersten ischämischen Stadien darstellt23 und kürzlich gezeigt, dass diese Transplantationsmethode in der Lage ist, der Follikelaktivierung entgegenzuwirken24.
Das CAM-Modell ist besonders attraktiv, nicht nur, weil Eizellen viel billiger sind als Mäuse, sondern auch wegen der stark vaskularisierten Natur der CAM, die es ermöglicht, den Zusammenhang zwischen Follikelaktivierung und Revaskularisierung des Eierstocktransplantats zu untersuchen. Das Vogelsystem ist in der Tat eine der gebräuchlichsten und vielseitigsten Methoden zur Untersuchung der Angiogenese25. Die Entwicklung des Kükenembryos (ED) dauert 21 Tage bis zum Schlüpfen, und das CAM wird innerhalb der ersten 4-5 Tage durch die Verschmelzung von Allantois und Chorion26 gebildet. Bemerkenswert ist, dass der Kükenembryo bis zum 17. Tag der ED ein von Natur aus immundefizienter Wirt ist, so dass Xenografting-Experimente ohne das Risiko einer Transplantatabstoßung durchgeführt werden können27,28. Darüber hinaus wirft der CAM-Modellansatz keine ethischen oder rechtlichen Bedenken im Sinne des europäischen Rechtsauf 29 und ist damit eine attraktive Alternative zu anderen Tiermodellen. In Bezug auf die Zuchtbedingungen benötigen Kükenembryonen nur einen auf 37 °C eingestellten Inkubator mit einer relativen Luftfeuchtigkeit von 40%-60%. Diese begrenzten Versuchsanforderungen reduzieren die Forschungskosten im Vergleich zur Verwendung von immundefizienten Mäusen erheblich.
Das hier vorgestellte Protokoll zielt darauf ab, die Entwicklung eines CAM-Xenografting-Modells für menschliches Ovarialgewebe zu beschreiben und spezifische Einblicke in die Wirksamkeit der Technik, den Zeitrahmen der Revaskularisation des Transplantats und die Lebensfähigkeit des Gewebes über einen Transplantationszeitraum von 6 Tagen zu geben. Dieses Protokoll könnte von großem Interesse sein, um die Mechanismen hinter dem frühen Follikelverlust nach der Transplantation zu untersuchen und die Auswirkungen verschiedener Wirkstoffe (Wachstumsfaktoren, Hormone usw.) auf dieses Phänomen zu untersuchen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Die Verwendung von menschlichem Gewebe wurde vom Institutional Review Board der Katholischen Universität Löwen genehmigt. Die Patientinnen gaben ihre schriftliche Einverständniserklärung für die Verwendung ihres Eierstockgewebes zu Forschungszwecken.
1. Bestellung von Eizellen vom Tag 0, bei denen die Wahrscheinlichkeit hoch ist, dass sie embryoniert werden
- Finden Sie einen zertifizierten, von Lohman ausgewählten Lieferanten von weißen Leghorn-Eiern in Laborqualität, der eine hohe Rate an embryonierten Eiern meldet, die in erster Linie vom Alter der Küken abhängt.
2. Vorbereitung der Eier für die Bebrütung
- Vor der Ankunft der Eier den Eierbrutkasten zusammenbauen und auf 37 °C bei 40%-60% relativer Luftfeuchtigkeit ausbalancieren. Überwachen Sie die Temperatur und Luftfeuchtigkeit, indem Sie ein Thermometer und ein Hygrometer in den Inkubator einführen. Stellen Sie sicher, dass der Deckel des Inkubators mit einem Glasfenster ausgestattet ist, damit die internen Parameter des Inkubators überprüft werden können, ohne ihn öffnen zu müssen (Abbildung 1).
- Nachdem Sie die Tag-0-Eier von von Lohman ausgewählten weißen Leghorn-Küken von einem zertifizierten Eierlieferanten in Laborqualität erhalten haben, reinigen Sie die Oberfläche der Schalen mit befeuchtetem Papier und trocknen Sie sie sofort.
HINWEIS: Da die Eierschalenmembran porös ist, kann autoklaviertes Wasser verwendet werden, um die Eieroberflächen zu reinigen und die Luftfeuchtigkeit im Inkubator zu kontrollieren, um das Kontaminationsrisiko zu minimieren. - Beschriften Sie die Eier mit einem Marker (z. B. Datum und Einummer).
- Bebrüten Sie die Eier mit dem spitzen Ende nach unten und drehen Sie sie, damit sich das CAM entwickeln kann. Drehen Sie die Eier zwei- bis dreimal täglich manuell um 180° oder verwenden Sie einen automatischen Rotator.
HINWEIS: Um sicherzustellen, dass die Eier tatsächlich gedreht werden, kann die Eierschale mit einem Bleistift oder Marker auf den beiden gegenüberliegenden Seitenseiten mit einem "X" und einem "O" markiert werden. Das Glasfenster im Deckel des Inkubators ermöglicht es, die Rotation der Eier zu überprüfen, ohne das Gerät zu öffnen.
3. Öffnen der Eierschale am 3. Tag der ED
HINWEIS: Ein rechteckiges Fenster wird am Tag 3 der ED in die Eierschale gegossen.
- Bereiten Sie die Laminar-Flow-Haube so vor, dass sie unter sterilen Bedingungen arbeiten kann. Platzieren Sie die folgenden Instrumente unter der Haube und desinfizieren Sie sie in 70%igem Ethanol (falls nicht bereits sterilisiert):
-Eierregal
-Eierkerze oder fokale Kaltlichtquelle
-Markierung
-Steriler gerader Stift
-Sterile 19 G Nadel
-5 ml sterile Spritze
-Dekupiersägeblatt
-Sterile Pinzette
-Klebeband - Legen Sie ein Ei aus dem Brutkasten in das Eierregal unter der Haube und schalten Sie den Eierrotator aus.
- Identifiziere im Dunkeln die Lufteinschlüsse des Eies, indem du den Eierkerzenkerl (oder die Brennlichtquelle) an die Eierschale legst. Die Lufttasche befindet sich am stumpfen Ende des Eies. Verwende einen Marker, um die Mitte der Lufttasche auf der Eierschale zu lokalisieren.
- Schalten Sie das Licht ein. Mache ein kleines Loch in die Eierschale, wo sie durch leichtes Drehen eines sterilen geraden Stecknadels markiert wird. Eine winzige Öffnung von etwa 1 mm Durchmesser ist in der Regel ausreichend.
HINWEIS: Achten Sie darauf, den Stift nicht ganz durch das Ei zu drücken. In diesem Fall das Ei wegwerfen. - Schließen Sie eine sterile 19-g-Nadel an eine sterile 5-ml-Spritze an.
- Lokalisieren Sie im Dunkeln den Dottersack mit dem Eierkerzen (oder der Brennlichtquelle) und stechen Sie das Ei durch das in Schritt 3.4 entstandene Loch mit der sterilen 19-G-Nadel, die in einem Winkel von 45° zum Boden des Eies geneigt ist. Achten Sie darauf, den Dottersack nicht zu stören. Saugen Sie zwischen 1,5 und 2 ml Eiweiß an, um das CAM von der Hülle zu lösen, und verschließen Sie das Loch dann mit einem Stück Klebeband.
HINWEIS: Wenn der Dottersack während der Aspiration unterbrochen wird, ist die angesaugte Flüssigkeit in der Spritze gelb und nicht transparent (Eiweiß). Tauschen Sie in diesem Fall die Nadel und die Spritze aus. Wenn eine relativ große Menge Eigelb aufgesaugt wird, kann dies die Lebensfähigkeit des Embryos gefährden. - Schalten Sie das Licht ein. Lege das Ei waagerecht hin und zeichne mit einem Filzstift ein rechteckiges Fenster mit den Maßen 1 cm x 1,5 cm. Machen Sie das Fenster nicht größer als die übliche Breite von Standardklebeband.
- Halten Sie das Ei in einer Hand und sägen Sie das zuvor gezeichnete Fenster vorsichtig mit einem Dekupiersägeblatt in die Eierschale. Achten Sie darauf, dass die Schale nicht reißt und schneiden Sie nicht bis zum gedrückten CAM ein. Blasen Sie regelmäßig, um Schalenstaub und Schmutz zu entfernen.
- Schieben Sie die sterile Pinzette unter das rechteckige Stück der gesägten Schale und fassen Sie sie geschickt an, um es sauber zu entfernen, ohne das CAM zu beschädigen. Werfen Sie zusätzlich die weiße äußere Schalenmembran ab, um den Embryo und seine CAM sehen zu können.
HINWEIS: Wenn Eierschalenstaub oder Schmutz auf das CAM fällt, kann es mit einer sterilen Pinzette entfernt werden, wobei sehr darauf zu achten ist, dass das CAM nicht zerreißt. - Identifizierung lebensfähiger embryonierter Eizellen. Sie sind an ihrem klaren Eiweiß und dem Gefäßring um den Embryo zu erkennen, wo manchmal sogar in diesem Stadium (Tag 3 der ED) ein schlagendes Herz festgestellt werden kann. Nicht befruchtete oder tote Embryonen verwerfen.
- Kleben Sie Klebeband über das neu geschaffene Fenster, um ein Austrocknen zu vermeiden. Achte darauf, dass du ein Ende über dich selbst klappst, um das Entfernen zu erleichtern.
- Legen Sie das Ei mit dem geöffneten Fenster nach oben zurück in den Inkubator, ohne dass das Klebeband das CAM berührt. Verwende ein gefaltetes Stück Papier oder einen Teil des Eierrosts, um zu verhindern, dass das Ei rollt. Vergewissern Sie sich, dass das Drehfach ausgeschaltet ist.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.2-3.12, um die restlichen Eier zu öffnen.
4. Transplantation von gefrorenem und aufgetautem menschlichem Eierstockgewebe in die CAM
HINWEIS: Die Transplantation in das CAM sollte idealerweise zwischen dem 7. und 10. Tag der ED eingeleitet werden.
- Kryokonservierte kortikale Streifen der Eierstöcke unter der Laminar-Flow-Haube nach dem an anderer Stelle beschriebenen Protokoll30 auftauen.
- Schneiden Sie die kortikalen Streifen in drei Fragmente von 4 mm x 2 mm x 1 mm. Verwenden Sie ein Stück als nicht transplantierte Kontrolle und die anderen beiden für die Xenotransplantation für 1 Tag oder 6 Tage.
HINWEIS: Wenn genügend Gewebe vorhanden ist, in doppelter Ausführung arbeiten. - Geben Sie ein Ei aus dem Brutkasten in das Eierregal, das sich unter der Haube befindet, mit dem Fenster nach oben.
- Ziehen Sie das Klebeband vom Fenster ab und stellen Sie sicher, dass der Embryo lebensfähig ist. In diesem Stadium zeichnen sich lebensfähige Embryonen durch ein ausgedehntes Gefäßsystem, ein klares Eiweiß, einen sichtbaren Herzschlag und eine gewisse Bewegung des Embryos aus.
- Bereiten Sie die Transplantationsstelle vor, indem Sie einen kleinen Bereich des CAM sanft traumatisieren, indem Sie einen 1 cm2 langen Streifen sterilen, etherextrahierten Linsenpapiers auf die Epitheloberfläche legen und sofort entfernen.
HINWEIS: Die CAM ist eine undurchdringliche Barriere, es sei denn, die Membran wurde durch die Entfernung des oberen peridermalen Teils der Doppelepithelschicht traumatisiert, wobei die Basalschicht intakt bleibt. Diese Technik verbessert auch den Revaskularisierungsprozess, indem sie die Wundheilung aktiviert. Wenn das sterile, aus Ether extrahierte Linsenpapier zu lange auf dem CAM verbleibt, kann die Membran am Linsenpapier haften bleiben und reißen. In diesem Fall das Ei wegwerfen. - Fassen Sie einen gefroren-aufgetauten kortikalen Streifen der Ovarialrinde (4 mm x 2 mm x 1 mm) mit einer mikrochirurgischen Pinzette und legen Sie ihn mit der medullären Seite gegen das CAM auf das traumatisierte CAM. Transplantieren Sie ein Gewebestück pro Eizelle.
- Decken Sie das Fenster mit Klebeband ab und legen Sie das Ei vorsichtig in den Brutkasten zurück. Achten Sie darauf, dass die Eierschalenöffnung aufrecht sitzt und das Ei sicher sitzt.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.7 für die Transplantation aller verbleibenden Gewebe.
HINWEIS: Die Implantate sollten an jedem Transplantationstag überprüft werden, um die Lebensfähigkeit des Embryos zu beurteilen und Veränderungen im Gefäßsystem zu überwachen.
5. Entnahme der Transplantate
HINWEIS: Xenotransplantate sollten spätestens am 17. Tag der ED entnommen werden, da das Immunsystem des Embryos ab dem 18. Tag reif und kompetent ist.
- Legen Sie das Ei auf ein Gestell und vergrößern Sie das Fenster in der Eierschale, um eine bessere Visualisierung des Transplantats und eine einfachere Handhabung zu ermöglichen.
- Beurteilen Sie das Transplantat makroskopisch und achten Sie besonders auf die vaskuläre Reaktion des CAM auf das Transplantat. Nehmen Sie digitale Fotos oder Videos für die Aufzeichnung auf.
- Fassen Sie das Gewebe oder das umgebende CAM mit einer Pinzette an und verwenden Sie eine Schere oder ein Skalpell, um das Transplantat vorsichtig aus dem CAM zu entfernen.
HINWEIS: Die Transplantate werden etwa am 3. Tag der Transplantation mit einer zweiten CAM-Schicht bedeckt und schließlich eingekapselt. Es kann auch sein, dass sie sich am 6. Tag in das Ei bewegt haben, was es in einigen Fällen schwierig macht, sie zu finden. - Analysieren Sie das herausgeschnittene Gewebe mit einer Methode, die für das jeweilige Experiment geeignet ist. In der vorliegenden Studie wurden Gewebestücke in Paraformaldehyd fixiert, in Paraffin eingebettet und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt, wobei die folgenden Schritte befolgt wurden:
- Die Fragmente werden 24 Stunden lang in 4%igem Paraformaldehyd fixiert und mit einer automatischen Einbettvorrichtung in Paraffin eingebettet, wobei die in Tabelle 1 genannten Schritte ausgeführt werden.
- Lassen Sie die in Paraffin eingebetteten Blöcke über Nacht bei 4 °C stehen, bevor Sie sie mit einem Mikrotom in 5 μm dicke Abschnitte schneiden.
- Die Gewebeschnitte auf einem Objektträger auf einer heißen Platte (30 °C) verteilen und 2 h trocknen lassen, gefolgt von 24 h im Ofen bei 37 °C.
- Anschließend färben Sie die Objektträger mit Hämatoxylin und Eosin nach einem an anderer Stelle beschriebenen Protokoll31. Anschließend digitalisieren Sie die Proben mit einem Objektträgerscanner und analysieren sie mit einer Bildanalysesoftware.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Überlebensraten von Kükenembryonen
Die Überlebensrate des Embryos vom Fenstering (Tag 3 der ED) bis zur Transplantation von Eierstockgewebe (Tag 7 der ED) betrug 79% (33/42). Da der prozentuale Anteil der embryonierten Tag-0-Eier unbekannt ist, wurden überzählige Tag-0-Eier von Lohman-selektierten weißen Leghorn-Hühnern bestellt, um sicherzustellen, dass genügend embryonierte Eizellen für die Transplantation zur Verfügung stehen. Insgesamt wurden 23 lebensfähige Eizellen am Tag 7 für die Transplantation verwendet, von denen eine in den ersten 24 Stunden verlor, was zu einer Gesamtüberlebensrate des Embryos von 96% nach der Transplantation führte (22/23).
Makroskopischer Aspekt der Transplantate
Nach 1 Tag der Transplantation sahen die Transplantate in 100% (10/10) der Fälle lebensfähig aus und waren bereits zumindest teilweise am CAM haftend, was ein Radspeichenmuster von Blutgefäßen zeigte, die für ihre Vaskularisierung benötigt wurden (Abbildung 2A,B). Nach 6 Tagen der Transplantation waren alle Implantate immer noch adhärent (Abbildung 2C), mit Ausnahme von zweien, die nicht am CAM befestigt waren. Sie nahmen ein nekrotisches Aussehen an und wurden von der weiteren Analyse ausgeschlossen (Abbildung 3), was zu einer Überlebensrate des transplantierten Gewebes von 83% (10/12) nach 6 Tagen führte. Insgesamt ergab die Viabilitätsbeurteilung der humanen Ovarialtransplantate eine Gesamtüberlebensrate von 91 % (20/22), unabhängig vom Tag der Transplantation (Tabelle 2).
Etwa am Tag 3 nach der Transplantation wurde festgestellt, dass die Transplantate mit einer zweiten CAM-Schicht bedeckt waren, und sie wurden schließlich eingekapselt, was zu einer noch besseren Vaskularisierung des Transplantats führte (Abbildung 2C). Insgesamt waren 80 % der Transplantate auch in die Eizelle eingedrungen (Abbildung 2D), was es in einigen Fällen schwierig machte, sie am 6. Tag zu entnehmen.
Mikroskopische Beurteilung der Transplantate
Insgesamt 30 gefrorene und aufgetaute menschliche Ovarialfragmente, die von fünf verschiedenen Patientinnen gewonnen wurden, wurden analysiert und am Tag 0, Tag 1 oder Tag 6 in 4% Paraformaldehyd fixiert, in Paraffin eingebettet und zur histologischen Beurteilung seriell in 5-μm-Schnitte geschnitten (Abbildung 4).
Um die Überlebensraten der ovariellen Follikel zu beurteilen, wurden die Follikel in 12 zufälligen Hämatoxylin- und Eosin-gefärbten Abschnitten pro Zeitpunkt und pro Patientin gezählt. Nur morphologisch normale Follikel mit sichtbarer Eizelle wurden für die Analyse berücksichtigt32. Zu allen Zeitpunkten wurden gesunde Follikel beobachtet (Abbildung 4B-D). Die Follikelüberlebensraten wurden berechnet, indem die verbleibende Follikeldichte (Anzahl der Follikel/mm3) nach der Transplantation bestimmt und auf die Follikeldichte bei nicht transplantierten Kontrollen (100 %) normalisiert wurde. Die Follikeldichten nahmen nach der Transplantation tendenziell ab, aber nicht genug, um eine statistische Signifikanz zu erreichen (p > 0,8) (Tabelle 2). In ähnlicher Weise wurden die Überlebensraten der Follikel während der Transplantationsphase beibehalten und lagen an Tag 1 bei 95 % ± 19 % und an Tag 6 bei 83 % ± 27 % (p > 0,5).
Der Revaskularisierungsprozess wurde durch den Nachweis von roten Blutkörperchen in Gefäßen aus dem xenotransplantierten Ovarialgewebe weiter untersucht. Aviäre Erythrozyten sind leicht zu erkennen, da sie kernhaltig sind (Abbildung 4A, C, D). Überraschenderweise konnten wir bei 30% der Implantate nach nur 1 Tag der Transplantation aviäre Erythrozyten in den Ovarialgefäßen und bei allen Implantaten bis zum 6. Tag beobachten, wobei eine sehr schnelle Revaskularisation auftrat (Tabelle 2).
Abbildung 1: Eier-Inkubator. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Makroskopischer Aspekt lebensfähiger Implantate. (A) Tag 0 der Veredelung. (B) Implantate an Tag 1, wobei das CAM ein Radspeichenmuster von Blutgefäßen in Richtung des Eierstockgewebes zeigt. (C) Implantate, die am 6. Tag mit CAM verkapselt werden, was zu einer noch besseren Vaskularisierung des Transplantats führt. (D) Transplantat, das in die Eizelle eindringt. Die Pfeile zeigen auf das transplantierte Eierstockgewebe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Makroskopischer Aspekt von nekrotischen Implantaten. (A) Gesund aussehendes Eierstockgewebe am Tag 0 der Transplantation. (B) Nekrotischer Aspekt des Implantats 6 Tage später. Die Pfeile zeigen auf das Eierstockgewebe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Mikroskopischer Aspekt von Implantaten. Hämatoxylin- und Eosin-gefärbte Schnitte von Implantaten, die für (A,B) 1 Tag und für (C,D) 6 Tage transplantiert wurden. Die Pfeilspitzen deuten darauf hin, dass die roten Blutkörperchen der Vögel die Eierstockgefäße nach (A) 1 Tag und (C,D) 6 Tagen der Transplantation durchbluten. Die Pfeile zeigen gesund aussehende primordiale Follikel in Implantaten an, die für (B) 1 Tag und (C,D) 6 Tage transplantiert wurden. Maßstab: 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Schritte | Badeanstalt | Zeit |
| Zweite Fixierung | 1 Formalin 10% Bad | 2 h |
| Austrocknung | 7 Methanolbäder | 7x 1 h |
| Klärung | 3 Toluol-Bäder | 3x 1 h |
| Imprägnierung | 3 flüssige Paraffinbäder (60°C) | 15 min – 30 min – 30 min |
Tabelle 1: Schritte zum Einbetten von Paraffin.
| Nicht gepfropft | Veredelung Tag 1 | Veredelung Tag 6 | p-Wert | |
| Makroskopischer Aspekt von Transplantaten | ||||
| Überlebensrate des Gewebes | - | 100% (10/10) | 83% (10/12) | / |
| Mikroskopischer Aspekt von Transplantaten | ||||
| Follikeldichte (n/mm3) | 848 ± 272 | 817 ± 370 | 684 ± 236 | p > 0,8 |
| Überlebensrate der Follikel | 100% | 95% ± 19% | 83 % ± 27 % | p > 0,5 |
| Rote Blutkörperchen von Vögeln in Implantaten | 0% (0/10) | 30% (3/10) | 100% (10/10) | / |
Tabelle 2: Ergebnisse. Statistische Analyse mit unidirektionaler ANOVA, gefolgt von einer Sidak-Korrektur. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der schwierigste Teil des hier beschriebenen Protokolls besteht darin, das kleine Loch zu bohren, das zum Absaugen des Eiweißes erforderlich ist, um das CAM von der Eierschale zu lösen, bevor ein Fenster entsteht. Zu viel Druck kann zu einer übermäßigen Penetration führen oder sogar die Eizelle zerbrechen und zerstören, was zu einer unwiderruflichen Schädigung des CAM und seines Gefäßsystems führt. Um Fehler bei den ersten Versuchen, das CAM zu trennen, auf ein Minimum zu reduzieren, wird dringend empfohlen, das Bohren kleiner Löcher in die Eierschale von unbefruchteten, im Supermarkt gekauften Eiern mit einem geraden Stift zu üben. Darüber hinaus wird angesichts der natürlichen Variabilität der Fruchtbarkeit zwischen den Chargen und der Tatsache, dass nicht alle Embryonen den Eingriff überleben, empfohlen, überzählige Eizellen vom Eizelllieferanten zu erhalten. Um optimale Überlebensraten der Embryonen und ein gut entwickeltes CAM zu erreichen, müssen die Eizellen unter idealen Bedingungen bebrütet werden. Im Falle einer geringen Rentabilität können verschiedene Aspekte schuld sein und müssen untersucht werden. Der Eizelllieferant sollte kontaktiert werden, da die Lebensfähigkeit von Embryonen des Lieferanten zu diesem Zeitpunkt einfach geringer sein kann. Eine geringe Lebensfähigkeit der Eier kann auch auf ungenaue oder ungeeignete Inkubatoreinstellungen zurückzuführen sein, die die CAM-Entwicklung beeinträchtigen können. Die Verwendung eines unabhängigen Hygrometers und Thermometers kann sicherstellen, dass die Einstellungen genau und stabil sind, aber der Hersteller sollte detaillierte Anweisungen zur Fehlerbehebung bereitstellen. Schließlich wurde auch darauf hingewiesen, dass eine zu häufige Kontrolle der transplantierten Eizellen zu Temperatur- und Feuchtigkeitsschwankungen führen kann, die sich nachteilig auf die transplantierten Embryonen auswirken könnten33.
Im vorliegenden Protokoll wurde das Fenstern der Eierschale am Tag 3 der ED durchgeführt, indem etwa 2 ml Eiweiß aus dem Embryo abgesaugt wurden, um das CAM von der Schale zu lösen, was wiederum die Schaffung eines Fensters ermöglichte, ohne das CAM zu beschädigen. Die Überlebensrate der Embryonen 4 Tage später betrug 79%, was mit früheren Studien übereinstimmt 34,35. Es wurde über andere Methoden berichtet, mit unterschiedlichem Erfolg. Eine Alternative besteht darin, das CAM von der Schale wegzuhebeln, indem man den Luftsack ansaugt, typischerweise am 7. bis 10. Tag der Notaufnahme. Bei dieser Methode muss die Eizelle nicht punktiert werden33,36. Studien, die über die Überlebensraten von Embryonen mit der letztgenannten Technik berichten, sind in der Literatur rar gesät, wobei ein Team über bis zu 90 % des Überlebens von Embryonen berichtet36. Eine weitere Option, die Sie in Betracht ziehen sollten, ist die schalenlose Embryonenkultur, die auch als Ex-ovo-Kultur bezeichnet wird. Das Entfernen der Eierschale ermöglicht einen uneingeschränkten Zugang zum Embryo, was die Manipulation und Operation des Embryos erleichtert und auch den Einsatz hochauflösender bildgebender Verfahren für Live-Experimente wie Fluoreszenzmikroskopie und Mikrocomputertopographie ermöglicht37,38. Um eine Ex-ovo-Kultur durchzuführen, wird der Embryo einschließlich seiner extraembryonalen Membranen zwischen Tag 2 und Tag 4 der ED in ein spezifisches Kulturcontainment überführt. Diese Technik ist jedoch sehr invasiv, da die Embryonen in der Regel um den 12. Tag herum sterben und weniger als 18 % von ihnen bis zum 15. Tag überleben38,39.
Während der Xenografting-Experimente, über die hierin berichtet wird, wurden menschliche Ovarialimplantate auf CAMs transplantiert, die sanft traumatisiert worden waren, indem ein kleiner Streifen sterilen, aus Äther extrahierten Linsenpapiers auf die Oberfläche des Epithels aufgebracht und sofort entfernt wurde. Insgesamt waren die Überlebensraten der Embryonen ausgezeichnet und erreichten während der Transplantationsphase 96 %, was mit früheren Studien übereinstimmt, in denen Eierstockgewebefragmente in CAMs transplantiert wurden23,40. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass dieser Ansatz die Adhäsionsraten des Transplantats erhöht und die anschließende Etablierung einer Neovaskularisation fördert, wobei die Angiogenese wahrscheinlich durch den anfänglichen Wundheilungsprozess induziert wird23. In der Tat wurde festgestellt, dass die Xenotransplantation von Ratten-Ovarialgewebe in wundheilendes Granulationsgewebe der Maus die Vaskularisierung des Transplantats verbessert41. In ähnlicher Weise schufen Donnez et al. bei der ersten Lebendgeburt, die nach orthotoper Transplantation von kryokonserviertem menschlichem Ovarialgewebe berichtet wurde, ein peritoneales Fenster und koagulierten dessen Ränder 7 Tage vor der Implantation, um die Angiogenese und Neovaskularisation in der Transplantationsstelle zu stimulieren42.
In Bezug auf die histologische Beurteilung von transplantiertem menschlichem Ovarialgewebe waren die Überlebensraten der Follikel ermutigend, wobei mehr als 80 % der Follikel nach 6 Tagen der Transplantation intakt blieben. Interessanterweise liegen die in der Literatur berichteten Follikelüberlebensraten nach der Transplantation von menschlichem, gefrorenem, aufgetautem Eierstockgewebe in das Peritoneum immundefizienter Mäuse nur bei etwa 30%10,14,18,43,44, was viel niedriger ist als in der vorliegenden Studie. Unsere Ergebnisse eines verbesserten Follikelüberlebens nach der Transplantation von menschlichem Ovarialgewebe in das CAM bestätigen unsere kürzlich veröffentlichten Daten, in denen wir zeigen, dass CAM die Follikelaktivierung und Apoptose hemmt24. Darüber hinaus waren die Blutgefäße der Vögel in der Lage, die Implantate zu durchdringen, wie das Vorhandensein von aviären Erythrozyten nach nur 1 Tag der Transplantation zeigte. Alles in allem zeigen diese Ergebnisse, dass der CAM-Ansatz ein geeignetes Modell ist, um die Transplantation von menschlichem Eierstockgewebe weiter zu untersuchen, da er das Überleben des Gewebes unterstützt.
Der größte Nachteil des CAM-Modells ist der begrenzte Zeitraum, in dem eine Transplantation möglich ist. In der Tat kann die Transplantation frühestens am 7. Tag der ED durchgeführt werden, sobald sich die CAM ausreichend entwickelt hat, bis zum 17. Tag, bevor die Kükenembryonen Immunkompetenz erwerben und schlüpfen. Trotz der kurzen Transplantationsdauer ist das CAM-Modell immer noch ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung der Transplantation von menschlichem Eierstockgewebe in ihren ersten ischämischen Stadien. Man kann dieses Modell auch verwenden, um die Auswirkungen von proangiogenetischen Faktoren, schützenden antioxidativen Wirkstoffen, Zytokinen, wachstums- und fortpflanzungsbezogenen Hormonen und Faktoren, die die Follikelaktivierung in transplantiertem menschlichem Eierstockgewebe steuern, zu testen, und das alles unter experimentellen Bedingungen, die leicht kontrolliert werden können25,45.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren danken Mira Hryniuk, BA, für die Durchsicht der englischen Sprache des Artikels.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agani hypodermic needle, 19 G | Terumo Europe | AN*1950R1 | 19 G needle to aspirate albumen |
| Terumo syringe, 5 mL concentric Luer lock | Terumo Europe | SS*05LE1 | 5-mL sterile syringe |
| Caseviewer v2.2 | 3DHISTECH | Image analysis software | |
| Diethyl ether | Merck Chemicals | 603-022-00-4 | Sterile ether to traumatize the CAM |
| Eosin Y aqueous solution 0.5% | Merck | 1098441000 | Staining solution |
| Formaldehyde 4% aqueous solution buffered (Formalin 10%) | VWR | 97139010 | Formaldehyde used for tissue fixation |
| Fridge | Liebherr | 7081260 | Fridge at 4 °C used for paraffin-embedding |
| Heating plate | Schott | SLK2 | Hot plate used to dry the slides |
| Incubator | Thermo Forma Scientific 3111 | 10365156 | Oven used for slide incubation |
| Leica CLS 150 XE microscope cold light source | Leica | CLS 150 XE | Focal cold light source to candle the eggs |
| Lens cleaning tissue, grade 541 | VWR | 111-5003 | Tissue to soak in sterile ether to traumatize the CAM |
| Mayer's hematoxylin | MERCK | 1092491000 | Staining solution |
| Methanol | VWR | 20847307 | Methanol |
| Microtome | ThermoScientific-MICROM | HM325-2 | Microtome |
| Pannoramic P250 Flash III | 3DHISTECH | / | Slide scanner at 20x magnification |
| Paraformaldehyde | Merck | 1,04,00,51,000 | Paraffin-embedding solution |
| Paraplast Plus R | Sigma | P3683-1KG | Paraffin |
| Petri dish, 60x15 mm, sterile | Greiner | 628161 | Sterile petri dish |
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Pin holder |
| Polyhatch | Brinsea | CP01F | Egg incubator with automatic rotator |
| Scroll saw blade, 132 mm | Sencys | / | Saw blade to create a window in the eggshell |
| Stainless steel insert pins | Fine Science Tools | 26007-02 | Straight pin to make a hole in the eggshell |
| Steril-Helios | Angelantoni Industrie | ST-00275400000 | Laminar flow hood |
| Superfrost Plus bords rodés 90° | VWR | 631-9483 | Glass slides |
| Tissue-Tek VIP 6Al | Sakura | 60320417-0711 VID6E3-1 | Automatic embedding device |
| Titanium forceps | Fine Science Tools | 11602-16 | Forceps for eggshell removal and ovarian tissue manipulation |
| Toluene, pa | VWR | 28701364 | Paraffin-embedding solution |
References
- Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue and oocyte cryopreservation prior to iatrogenic premature ovarian insufficiency. Best Practice & Research Clinical Obstetrics & Gynaecology. 81, 119-133 (2022).
- Dolmans, M. -M., Hossay, C., Nguyen, T. Y. T., Poirot, C. Fertility preservation: How to preserve ovarian function in children, adolescents and adults. Journal of Clinical Medicine. 10 (22), 5247 (2021).
- Donnez, J., Dolmans, M. -M.
- Donnez, J., Dolmans, M. -M.
- Dolmans, M. -M., et al. Transplantation of cryopreserved ovarian tissue in a series of 285 women: a review of five leading European centers. Fertility and Sterility. 115 (5), 1102-1115 (2021).
- Shapira, M., Dolmans, M. -M., Silber, S., Meirow, D. Evaluation of ovarian tissue transplantation: results from three clinical centers. Fertility and Sterility. 114 (2), 388-397 (2020).
- Jensen, A. K., et al. Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark. Human Reproduction. 30 (12), 2838-2845 (2015).
- Vander Ven, H., et al. Ninety-five orthotopic transplantations in 74 women of ovarian tissue after cytotoxic treatment in a fertility preservation network: Tissue activity, pregnancy and delivery rates. Human Reproduction. 31 (9), 2031-2041 (2016).
- Diaz-Garcia, C., et al. Oocyte vitrification versus ovarian cortex transplantation in fertility preservation for adult women undergoing gonadotoxic treatments: A prospective cohort study. Fertility and Sterility. 109 (3), 478-485 (2018).
- Nisolle, M., Casanas-Roux, F., Qu, J., Motta, P., Donnez, J. Histologic and ultrastructural evaluation of fresh and frozen-thawed human ovarian xenografts in nude mice. Fertility and Sterility. 74 (1), 122-129 (2000).
- Van Eyck, A. -S., et al. Electron paramagnetic resonance as a tool to evaluate human ovarian tissue reoxygenation after xenografting. Fertility and Sterility. 92 (1), 374-381 (2009).
- Van Eyck, A. -S., et al. Both host and graft vessels contribute to revascularization of xenografted human ovarian tissue in a murine model. Fertility and Sterility. 93 (5), 1676-1685 (2010).
- Hossay, C., et al. Can frozen-thawed human ovary withstand refreezing-rethawing in the form of cortical strips. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (12), 3077-3087 (2020).
- Manavella, D. D., et al. Two-step transplantation with adipose tissue-derived stem cells increases follicle survival by enhancing vascularization in xenografted frozen-thawed human ovarian tissue. Human Reproduction. 33 (6), 1107-1116 (2018).
- Rahimi, G., et al. Re-vascularisation in human ovarian tissue after conventional freezing or vitrification and xenotransplantation. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 149 (1), 63-67 (2010).
- Cacciottola, L., Manavella, D. D., Amorim, C. A., Donnez, J., Dolmans, M. -M. In vivo characterization of metabolic activity and oxidative stress in grafted human ovarian tissue using microdialysis. Fertility and Sterility. 110 (3), 534-544 (2018).
- Gavish, Z., et al. Follicle activation is a significant and immediate cause of follicle loss after ovarian tissue transplantation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 35 (1), 61-69 (2018).
- Masciangelo, R., Hossay, C., Donnez, J., Dolmans, M. -M. Does the Akt pathway play a role in follicle activation after grafting of human ovarian tissue. Reproductive BioMedicine Online. 39 (2), 196-198 (2019).
- Fortune, J. E., Cushman, R. A., Wahl, C. M., Kito, S. The primordial to primary follicle transition. Molecular and Cellular Endocrinology. (1-2), 53-60 (2000).
- Cushman, R. A. Bovine ovarian cortical pieces grafted to chick embryonic membranes: A model for studies on the activation of primordial follicles. Human Reproduction. 17 (1), 48-54 (2002).
- Gigli, I., Cushman, R. A., Wahl, C. M., Fortune, J. E. Evidence for a role for anti-Müllerian hormone in the suppression of follicle activation in mouse ovaries and bovine ovarian cortex grafted beneath the chick chorioallantoic membrane. Molecular Reproduction and Development. 71 (4), 480-488 (2005).
- Qureshi, A. I., et al. Testosterone selectively increases primary follicles in ovarian cortex grafted onto embryonic chick membranes: relevance to polycystic ovaries. Reproduction. 136 (2), 187-194 (2008).
- Martinez-Madrid, B., et al. Chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) model: A useful tool to study short-term transplantation of cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 91 (1), 285-292 (2009).
- Hossay, C., et al. Follicle outcomes in human ovarian tissue: Effect of freezing, culture, and grafting. Fertility and Sterility. 119 (1), 135-145 (2023).
- Ribatti, D. The Chick Embryo Chorioallantoic Membrane in the Study of Angiogenesis and Metastasis. , Springer. Dordrecht, the Netherlands. (2010).
- Pawlikowska, P., et al. Exploitation of the chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) as a platform for anti-metastatic drug testing. Scientific Reports. 10 (1), 16876 (2020).
- Davison, T. F. The immunologists' debt to the chicken. British Poultry Science. 44 (1), 6-21 (2003).
- Schilling, M. A., et al. Transcriptional innate immune response of the developing chicken embryo to Newcastle disease virus infection. Frontiers in Genetics. 9, 61 (2018).
- Directives originating from the EU. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes (Text with EEA relevance). The National Archives. , Available from: https://www.legislation.gov.uk/eudr/2010/63/contents (2010).
- Dolmans, M. -M., et al. A review of 15 years of ovarian tissue bank activities. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (3), 305-314 (2013).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), 4986 (2008).
- Anderson, R. A., McLaughlin, M., Wallace, W. H. B., Albertini, D. F., Telfer, E. E. The immature human ovary shows loss of abnormal follicles and increasing follicle developmental competence through childhood and adolescence. Human Reproduction. 29 (1), 97-106 (2014).
- Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the chicken chorioallantoic membrane in vivo model to study gynecological and urological cancers. Journal of Visualized Experiments. (155), e60651 (2020).
- Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13 (8), 9959-9970 (2012).
- Sys, G. M. L., et al. The In ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. Journal of Visualized Experiments. (77), e50522 (2013).
- Li, M., et al. The in ovo chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an efficient xenograft model of hepatocellular carcinoma. Journal of Visualized Experiments. (104), e52411 (2015).
- Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
- Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications. Journal of Visualized Experiments. (44), e2154 (2010).
- Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts. Stem Cells International. 2013, 960958 (2013).
- Beck, K., Singh, J., Dar, M. A., Anzar, M. Short-term culture of adult bovine ovarian tissues: chorioallantoic membrane (CAM) vs. traditional in vitro culture systems. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 21 (2018).
- Israely, T., Nevo, N., Harmelin, A., Neeman, M., Tsafriri, A. Reducing ischaemic damage in rodent ovarian xenografts transplanted into granulation tissue. Human Reproduction. 21 (6), 1368-1379 (2006).
- Donnez, J., et al. Livebirth after orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue. The Lancet. 364 (9443), 1405-1410 (2004).
- Dolmans, M. -M., et al. Short-term transplantation of isolated human ovarian follicles and cortical tissue into nude mice. Reproduction. 134 (2), 253-262 (2007).
- Baird, D. T., Webb, R., Campbell, B. K., Harkness, L. M., Gosden, R. G. Long-term ovarian function in sheep after ovariectomy and transplantation of autografts stored at −196 C. Endocrinology. 140 (1), 462-471 (1999).
- Ribatti, D., Vacca, A., Roncali, L., Dammacco, F. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for in vivo research on anti-angiogenesis. Current Pharmaceutical Biotechnology. 1 (1), 73-82 (2000).
