Summary
Denne protokol præsenterer et sæt eksperimenter vedtaget til evaluering af fotoomskiftelige anticancerpeptider, der kan anvendes til præklinisk screening af sådanne forbindelser. Dette omfatter cytotoksicitetsvurdering i 2D- og 3D-cellekulturer, evaluering af ex vivo (modelvæv) fotoisomeriseringseffektivitet og in vivo-effektivitet .
Abstract
Fotokontrollerede, biologisk aktive forbindelser er en ny klasse af "smarte" lægemiddelkandidater. De giver ekstra sikkerhed i systemisk kemoterapi på grund af deres præcise rumlige tidsmæssige aktivering ved at lede et godartet, ikke-ioniserbart lys til et bestemt sted i patientens krop. Dette papir præsenterer et sæt metoder til evaluering af in vitro-styrken og ex vivo-effektiviteten af fotoaktiveringen af fotokontrollerede, biologisk aktive forbindelser samt in vivo-effektiviteten på tidlige stadier af lægemiddeludvikling. Metoden anvendes til anticancer cytotoksiske peptider, nemlig de diarylethenholdige analoger af et kendt antibiotikum, gramicidin S. Eksperimenterne udføres ved hjælp af 2D (klæbende celler) og 3D (sfæroider) cellekulturer af en kræftcellelinje (Lewis lungecarcinom, LLC), levende vævssurrogater (svinekødshakkekød) og en allograft kræftmodel (subkutan LLC) i immunkompetente mus. Udvælgelsen af de mest effektive forbindelser og estimering af realistiske fototerapeutiske vinduer udføres via automatiseret fluorescensmikroskopi. Fotoaktiveringseffektiviteten ved forskellige belysningsregimer bestemmes i forskellige dybder i et modelvæv, og den optimale lysdosering anvendes i det endelige terapeutiske in vivo-eksperiment.
Introduction
Fotokontrollerede biologisk aktive forbindelser er opstået i de seneste årtier som en lovende komponent i sikre kemoterapier til menneskelige sygdomme og til specifikt at udrydde ondartede solide tumorer1. Disse forbindelser indeholder reversibelt fotoisomeriserbare fragmenter (molekylære fotokontakter) og kan skifte mellem inaktive og aktive fotoisomerer ved bestråling med lys med forskellige bølgelængder.
Sammenlignet med deres ikke-fotostyrbare analoger kan fotokontrollerede lægemidler være sikrere, fordi de systematisk kan indføres i patientens krop i mindre aktive og i det væsentlige ikke-toksiske former og derefter kun aktiveres af lys, hvor det er nødvendigt, såsom i tumorer, sår og sår. Selvom flere spændende demonstrationer af sådanne molekylære lægemiddelprototyper kan findes i nyere akademiske artikler 2,3,4,5,6,7, eksisterer området klinisk fotofarmakologi - en anvendelse af godkendte kombinationer af lægemiddel / medicinsk udstyr / sygdom - ikke. Fotofarmakologi er endnu i lægemiddelopdagelsesstadiet, og systematiske prækliniske undersøgelser er ukendte.
Vi har først for nylig demonstreret in vivo-sikkerhedsfordelen for nogle fotokontrollerede anticancerpeptider, nemlig analogerne af peptidantibiotikummet gramicidin S8. Disse fotostyrede derivater indeholder en diarylethenfotoswitch (DAE), som gennemgår reversible fotoinducerede transformationer mellem de såkaldte røde lysgenererede "ringåbne" og UV-genererede "ringlukkede" fotoformer (illustreret i figur 1 for et af derivaterne, forbindelsen LMB002).
Figur 1: Fotokontrolleret cytotoksisk peptid LMB002 og dets fotoisomerisering. Dagbogsfragmentet er vist med rødt. Forkortelse: DAE = dagbog. Klik her for at se en større version af denne figur.
At finde hits og udføre hit-to-lead-optimering kræver ofte in vitro- og in vivo-screening af passende sammensatte biblioteker 9,10. Her demonstrerer vi en metode, der er egnet til systematisk high-throughput screening af cytotoksicitet af fotokontrollerede forbindelser. Vi bestemmer også fotoisomeriseringseffektiviteten, estimerer lysdosis i modelvæv og evaluerer in vivo-effekten af de bedst præsterende kandidater. Tilgangen er i overensstemmelse med bioetik og dyrepleje.
I dette arbejde modificeres traditionelle prækliniske metoder for at undgå ikke-kontrolleret fotoisomerisering af testede forbindelser. Det overordnede mål med at anvende disse modificerede metoder heri er at udvikle en generel strategi, der er ligetil og hurtig og giver statistisk signifikante data til pålideligt at sammenligne in vitro-aktiviteter og rationalisere in vivo-effektivitetstestning af fotoswitchable forbindelser til identifikation og videreudvikling af bly.
Strategien består af tre på hinanden følgende trin. Det første trin involverer bestemmelse af IC 50 (tilsyneladende50 % cellelevedygtighed) i serielle fortyndinger for de aktive og inaktive fotoformer af udvalgte fotokontrollerede biologisk aktive forbindelser ved anvendelse af todimensionale (2D, monolag) og tredimensionale (3D, sfæriske) cellekulturer og konfokal automatiseret fluorescensmikroskopi med høj kapacitet. Fototerapeutiske vinduer sammenlignes med hensyn til IC50-forskellen mellem de to fotoformer, og de bedst præsterende kandidater vælges. Der er ingen specifik fordel ved toksicitetsvurdering ved hjælp af automatiseret mikroskopi og andre cytotoksicitetsscreeningsplatforme (assays)11; Mere komplekse cellebaserede tumormodeller12 kunne let implementeres på dette stadium.
For de forbindelser, der er udvalgt i trin 1, er det andet trin realistisk at vurdere deres fotokoblingseffektivitet inde i vævene som funktion af dybden fra den bestrålede vævsoverflade ved at kvantificere fotokoblingseffektiviteten af de mindre aktive fotoformer i en vævssurrogat ved hjælp af UV-detekteret højtryksvæskekromatografi (HPLC) af bestrålede prøveekstrakter. In vivo kunne fotoskifteeffektivitet undersøges, men vi foreslår at bruge et simpelt vævsurrogat - hakket svinekød. Vi har testet gyldigheden af denne tilgang. Vi målte konverteringen af vores fotoomskiftelige forbindelser in vivo på en musekræftmodel og observerede omtrent den samme fotokonvertering i en dybde målt i tidligere forsøg med mus8. Ethvert egnet alternativt kunstigt væv13, 3D bioprintet væv/organ14, biopsimateriale eller andet undtaget animalsk materiale kan anvendes. Denne opsætning er dog et godt kompromis, da den er økonomisk, hurtig og etisk.
Det tredje trin er bestemmelsen af in vivo anticancer effekt i en murine cancer model. De forbindelser, der udviser overlegne egenskaber i in vitro-forsøgene og effektivt fotoskifter i en dybde på mindst 1-1,5 cm i modelvævene, udvælges til dette forsøg.
Denne protokol kan anvendes på forbindelser, der besidder forskellige typer fotoafbrydere, forudsat at deres fotoformer (eller deres fotostationære tilstande, PSS) er stabile i en rimelig tid (nogle få dage eller længere). Til illustration anvendes en tidligere beskrevet DAE-afledt LMB00215. LMB002 fotoformerne er termisk stabile og kan opbevares ved -20 °C i mindst et år uden væsentlig nedbrydning. Lewis lungecarcinom (LLC) celler vælges til denne in vitro og in vivo demonstration, men der pålægges ingen begrænsninger på celletypen. LLC-celler er klæbende, let dyrkelige i 3D og bruges til at generere tumoroider (som beskrevet i reference16). In vivo LLC-celler bruges til at modellere metastatiske processer og kan let generere solide tumorer hos immunkompetente mus efter subkutan injektion. Denne in vivo-metode kan anvendes universelt på andre kræftmodeller17,18. Den detaljerede gennemførelse af denne strategi er beskrevet nedenfor.
Protocol
Dyrepleje og eksperimentelle procedurer blev udført i henhold til de lokale og internationale regler for gennemførelse af forskningsprojekter, der involverer forsøgsdyr (Ukraines lov "om beskyttelse af dyr mod grusomhed", europæisk konvention om beskyttelse af hvirveldyr, der anvendes til forsøg og andre videnskabelige formål (europæisk konvention, Strasburg, 1986), direktiv 2010/63 / EU om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål). Denne undersøgelse er godkendt af Bioethics Commission of Bienta selskab. C57BL/6NCrl-mus (voksne hunner, der vejer ca. 20 g hver) blev anvendt i disse forsøg. Specifikke materialer, reagenser og udstyr er angivet i materialetabellen.
1. IC50-evaluering for LMB002 ("ringlukkede" og "ringåbne" former) ved hjælp af 2D- og 3D LLC-cellekulturer
- Fremstilling af stødpuder og stamopløsninger af forbindelserne
BEMÆRK: Forbered buffere ved hjælp af standardprocedurer. Alternativt kan du bruge kommercielt tilgængelige løsninger.- Der fremstilles 10x fosfatbufret saltvand (PBS) ved tilsætning af 14,2 gNa2HPO4, 2,4 g KH2PO4, 80 g NaCl og 2 g KCl til 1 liter destilleret vand. Autoklave fremstillede 10x PBS og fortynd det til 1x opløsning ved at tilsætte 100 ml 10x opløsning til 900 ml destilleret vand. Derefter opbevares opløsningen ved 4 °C.
- Forbered Dulbeccos PBS (DPBS) ved at tilsætte 4,78 g DPBS-pulver til 1 liter destilleret vand. Opløsningen omrøres, indtil alt det faste stof er opløst, pH-værdien kontrolleres ved hjælp af en pH-meter, og den justeres ved at tilsætte 1 M NaOH eller 1 M HCl (pH 7,3-7,4). Efter at have nået det ønskede pH-niveau, filtreres mediet gennem et 0,22 μm vakuumfilter i et sterilt skab. Opbevares ved 4 °C.
- Der fremstilles 1 M 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonsyre (HEPES) bufferopløsning ved tilsætning af 238,3 g HEPES til 1 liter destilleret vand. Opløsningens pH justeres med 1 M NaOH indtil pH 7,5. Filtrer gennem et 0,22 μm vakuumfilter i et sterilt skab. Opbevares ved 4 °C.
- Forbered 1x trypsin-EDTA (EDTA = ethylendiamintetraeddikesyre) opløsning ved fortynding af 10x opløsning. For at gøre dette tilsættes 5 ml 10x Trypsin-EDTA til 45 ml 1x PBS-opløsning i et 50 ml sterilt rør. Opbevares ved 4 °C.
- Forbered Dulbeccos DMEM-basisk (Modified Eagle Medium) ved at tilsætte 13,4 g DMEM-højglukosepulver og 3,7 gNa2CO3 til 1 liter destilleret vand i et måleglas med en magnetisk omrøringsstang anbragt på en omrøringsplade. Opløsningen omrøres, indtil alt det faste stof er opløst, pH-værdien kontrolleres ved hjælp af en pH-meter, og den justeres ved at tilsætte 1 M NaOH eller 1 M HCl (pH 7,3-7,4). Når den ønskede pH-værdi er nået, filtreres substratet gennem et 0,22 μm vakuumfilter i et sterilt kabinet og opbevares ved 4 °C.
- Forbered DMEM komplet medium ved at tilsætte 100 ml føtalt bovint serum (FBS), 10 ml penicillin-streptomycinopløsning, 10 ml L-glutaminopløsning og 10 ml 1 M HEPES-buffer til 900 ml DMEM-basisk. Opbevares ved 4 °C.
- Forbered stamopløsninger til testforbindelserne.
- For hver forbindelse vejes to batcher på 5,12 mg (f.eks. LMB002) i den ringlukkede fotoform i to 1,5 ml mikrocentrifugeglas (et med klare og andre sorte uigennemsigtige vægge). Der afvejes 2,28 mg positiv kontrol (f.eks. gramicidin S) i et ekstra klart vægrør. Der tilsættes 100 μL ren DMSO til hver prøve og hvirvel i 30 sekunder.
- Fotoisomerisere stamopløsningen (LMB002) i det klare vægrør fra den "ringlukkede" til den "ringåbne" form ved at bestråle opløsningen med 660 nm laser (lyseffekttæthed 0,6 W / cm2) med hvirvelstrøm for at sikre grundig blanding. Fortsæt, indtil farven synligt skifter fra mørk lilla til lysebrun. Beskyt mod lys ved hjælp af aluminiumsfolie.
- 2D-cellekultureksperiment-såning af cellerne (dag 1)
- Overfør 10 ml DMEM komplet medium fra T-75-kolben med en LLC-cellekultur til et 15 ml sterilt rør. Opsug det resterende medium med en vakuumpumpe.
- Vask cellekulturen med 5 ml 1x DPBS og aspirer opløsningen med en vakuumpumpe.
- Cellerne dækkes med 3 ml 1x trypsin-EDTA-opløsning og inkuberes kolben i 2-3 minutter ved 37 °C i en 5% CO2 atmosfære.
- Stop trypsinvirkningen ved at tilsætte 6 ml DMEM-substrat (tidligere overført til et sterilt rør) til cellekulturkolben indeholdende 1x trypsin-EDTA-opløsning og pipettere suspensionen flere gange for at vaske cellerne af cellekulturkolbens vægge.
- Overfør suspensionen til et 15 ml rør og centrifuger ved 200 × g i 4 min. Efter centrifugering aspireres supernatanten med en vakuumpumpe. Undgå at røre cellepillen i bunden af røret.
- Resuspender cellerne ved at tilsætte 2 ml frisk DMEM komplet medium og pipettere flere gange.
- Cellerne tælles ved at tage prøver af ca. 15 μL af suspensionen i et 0,5 ml rør, tilsætte 15 μL 0,4% trypanblåt og overføre den opnåede blanding til et celletællekammer.
- Efter tælling fremstilles 25 ml af cellesuspensionen pr. tidspunkt. Frø 5.000-10.000 (8.000 i gennemsnit) LLC-celler / brønd i 200 μL DMEM i de centrale 60 brønde i en 96-brøndplade med klar bund og sorte uigennemsigtige vægge. Fyld de resterende 36 brønde med ren DMEM.
- Pladerne anbringes i en cellekulturkuvøse natten over ved 37 °C og 5 % CO2. Brug plastpladelåg nedenunder for at forhindre ujævn opvarmning af bundpladen.
- 2D-cellekultureksperiment - tilsætning af forbindelserne (dag 2)
- Overvåg cellerne ved lysmikroskopi i pladerne, indtil cellerne har nået 70% -80% sammenløb.
- Opsug mediet fra brøndene med en vakuumpumpe i et sterilt skab. Der tilsættes 100 μL frisk forvarmet DMEM-substrat og pladerne anbringes i en cellekulturkuvøse.
- Der fremstilles serielle fortyndinger af teststofferne og positiv kontrol i polypropylenautoklaverede klare plader. Foretag følgende løsninger til individuelle punktmålinger:
BEMÆRK: Start med lagrene i DMSO og fortynd med DMEM, men overskrid ikke 1% v/v DMSO i den endelige højeste koncentration.- For at opnå en 128 μM opløsning af gramicidin S tilsættes 1,3 μL 20 mM stamopløsning til 198,7 μL DMEM.
- For at opnå en 256 μM opløsning af LMB002, "ring-åben" form, tilsættes 1,3 μL 40 mM opløsning til 198,7 μL DMEM.
- For at opnå en 512 μM opløsning af LMB002, "ringlukket" form, tilsættes 2,6 μL 40 mM stamopløsning til 197,4 μL DMEM.
- Udfør yderligere tre gentagelser for at opnå fire sæt af hvert koncentrationspunkt. Der fremstilles en serie dobbeltfortyndingsserier ved at opsuge 100 μL fra hvert starthul, overføres til et hul med 100 μL DMEM og blandes grundigt.
BEMÆRK: Arbejde med fotoomskiftelige forbindelser kræver lysjustering for at forhindre tilbagefotoisomerisering. Det anbefales at slukke lyset i sterile skabe. - Der opnås de endelige koncentrationer af forbindelserne i brønde (5-150 μM) ved at overføre 100 μL af de fremstillede opløsninger hver gang i 56 brønde med 100 μL tidligere tilsat DMEM. Der tilsættes 100 μL DMEM hver gang i fire huller for at fungere som negativ kontrol.
- Dækplader med aluminiumsfolie eller plastbeskyttende uigennemsigtigt dæksel for at forhindre ukontrolleret fotoskift. Pladerne anbringes i en cellekulturkuvøse ved 37 °C (under ekstra plastpladelåg) til den valgte inkubationstid (10 min, 60 min, 24 timer eller 72 timer).
- 2D cellekultur eksperiment - farvning og billeddannelse (dag 2-5)
- Efter inkubation med forbindelser i forskellige perioder tilsættes 50 μL af farvningsopløsningen pr. hul til pladerne, der blev inkuberet med forbindelser i 10 og 60 minutter. Pladerne inkuberes ved 37 °C i 20 min.
BEMÆRK: Forbered stamfarvningsopløsninger pr. tidspunkt ved at tilsætte 8 μL 20 mM Hoechst 33342-opløsning (slutkoncentration er 5 μM), 32,5 μL 1 mM propidiumiodidopløsning (PI) (slutkoncentration er 1 μM) og 650 μL ikke-steril FBS til 5,810 μL ikke-steril 1x PBS. Forvarm FBS og PBS i et vandbad ved 37 °C for at forhindre, at cellerne oplever temperaturchok. - Udfør automatiseret fluorescensbilleddannelse ved hjælp af en 20x objektivlinse.
- Den samme farvnings- og billeddannelsesprocedure (trin 1.4.1 -1.4.2) gentages for pladerne, der blev inkuberet med forbindelser i 24 (dag 3) og 72 (dag 5) timer.
BEMÆRK: Typiske 2D-pladekort er vist i figur 2.
- Efter inkubation med forbindelser i forskellige perioder tilsættes 50 μL af farvningsopløsningen pr. hul til pladerne, der blev inkuberet med forbindelser i 10 og 60 minutter. Pladerne inkuberes ved 37 °C i 20 min.
- 3D-cellekultureksperiment - såning af cellerne (dag 1)
BEMÆRK: Trinene i dette afsnit er identiske med dem, der er beskrevet for 2D-eksperimentpræparation af cellekulturen, inkubation med de testede forbindelser og billeddannelse (trin 1.1-1.4.) I dette tilfælde fremstilles cellerne imidlertid som kompakte modne sfæroider i en 384-brønds ultra-lav vedhæftning U-bundplade med sorte, uigennemsigtige vægge. Brug af en plade af denne størrelse gør det muligt at sammenligne to forbindelser i et eksperiment.- Gentag trin 1.2.1-1.2.9 fra 2D-eksperimentprotokollen med en LLC-cellekultur.
- Efter optælling af cellerne fremstilles 25 ml af cellesuspensionen. Frø 1.000 celler pr. brønd i alle brønde i 50 μL DMEM i en 384-brønd, lavbindende, U-bundplade.
- Der centrifugeres ved 40 × g i 30 sek. og rystes med en pladeryster ved 250 omdr./min. i 1 minut for at ryste cellerne fra brøndens vægge til bunden.
- Pladerne anbringes i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO2 oven på de ekstra plastpladelåg for at forhindre ujævn opvarmning af pladebunden i 48 timer.
- 3D-cellekultureksperiment - tilsætning af forbindelserne (dag 3)
- Overvåg cellerne i plader ved mikroskopi for at sikre, at kompakte modne sfæroider er dannet.
- Forbered en seriel fortynding af studerede forbindelser i polypropylenautoklaverede klare plader. I dette tilfælde skal du inkludere en ekstra forbindelse. Foretag følgende løsninger til individuelle punktmålinger:
- For at opnå 175 μM og 350 μM opløsninger af gramicidin S tilsættes 1,8 μL 20 mM stamopløsning til 198,2 μL DMEM og tilsættes 3,6 μL stamopløsning til 196,4 μL DMEM tilsvarende.
- For at opnå 175 μM og 350 μM opløsninger af LMB002, "ring-åben" form, tilsættes 1 μL 40 mM stamopløsning til 199 μL DMEM og tilsættes 1,8 μL stamopløsning til 198,2 μL DMEM tilsvarende.
- For at opnå 350 μΜ og 1.750 μM opløsninger af LMB002, "ring lukket" form, tilsættes 1,8 μL 40 mM stamopløsning til 198,2 μL DMEM og tilsættes 8,8 μL lager til 191,2 μL DMEM tilsvarende.
- Udfør yderligere tre replikater for at opnå fire sæt af hvert koncentrationspunkt. Der opnås serielle fortyndinger ved at trække 20 μL ud af hver startbrønd, overføre den til brønden med 180 μL DMEM og blande grundigt.
BEMÆRK: Arbejde med fotoomskiftelige forbindelser kræver lysjustering for at forhindre tilbagefotoisomerisering. Det anbefales at slukke lyset i sterile skabe. - De endelige koncentrationer af forbindelser i brønde opnås ved hver gang at overføre 20 μL af de fremstillede opløsninger i 128 brønde indeholdende 50 μL DMEM. Der tilsættes 20 μL DMEM hver gang i tre huller for at fungere som kontrol. Dæk pladerne med aluminiumsfolie eller plastbeskyttelsesdæksel for at forhindre fotoskift eller fordampning.
- Placer pladerne i en cellekulturinkubator på plastpladelåg til den valgte inkubationstid.
- 3D-cellekultureksperiment - farvning og billeddannelse (dag 3-6)
- Farveopløsningen fremstilles pr. tidspunkt ved at tilsætte 13 μL 1 mM calcein AM-opløsning (slutkoncentration er 1 μM), 22 μL 20 mM Hoechst 33342-opløsning (slutkoncentration er 33 μM), 40 μL 1 mM PI-opløsning (slutkoncentration er 3 μM), 300 μL ikke-steril FBS til 2,625 μL ikke-steril 1x PBS. Forvarm FBS og PBS i et vandbad ved 37 °C for at forhindre, at cellerne oplever temperaturchok.
- Efter inkubation i forskellige perioder med forbindelserne tilsættes 20 μL af farvningsopløsningen pr. hul til hullerne, der blev inkuberet med forbindelser i 10 minutter. Der inkuberes ved 37 °C i 2 timer.
- Udfør fluorescenskonfokal billeddannelse ved hjælp af en 20x objektivlinse.
- Gentag den samme farvnings- og billeddannelsesprocedure for brønde, der blev inkuberet med forbindelser i 24 (dag 4) og 72 (dag 6) h.
BEMÆRK: I dette eksperiment anvendes calcein AM som en tredje komponent i den flerfarvede farvningsopløsning. Billeder opnået fra 2D- og 3D-eksperimenter analyseres ved hjælp af instrumentets automatiserede billedanalysesoftware. Celler, der er farves sammen med Hoechst- og propidiumiodidfarvestoffer, betragtes som nekrotisk døde, og deres fraktion som funktion af koncentrationen anvendes til beregning af IC50-værdien .
Figur 2: Eksempel på typiske pladekort til 2D-kultureksperimenterne. Farvekoder for forbindelserne og kontrollen er angivet. Koncentrationerne af testede forbindelser (antal inde i brøndene) er angivet i μM. Klik her for at se en større version af denne figur.
2. Bestemmelse af fotokoblingseffektiviteten i et vævssurrogat
- Saml det optiske tog til prøvebestrålingen som vist i figur 3 (bestående af et optisk kabel fra laserlyskilden, et objektiv med variabel brændvidde, en sprøjte med et uigennemsigtigt dæksel og en fladskåret ende).
- Ved at ændre objektivets brændvidde og blænde opnås en flad lysstråle med en diameter, der er 1-1,5 mm større end den indvendige diameter på den anvendte sprøjte, men som stadig så vidt muligt er inden for blænden.
- Brug en 5 ml sprøjte med en skåret ende og en indvendig diameter på 12,4 mm og er dækket af et uigennemsigtigt plastdæksel. Ved en lasereffekt på 200 mW indstilles effekttætheden ved udgangen fra det optiske system til ~103 mW/cm2 målt med et fotometer.
BEMÆRK: Alle efterfølgende operationer skal udføres i et mørkt rum med mindst mulig belysning på arbejdspladsen. - Forbered 3 ml LMB002 ("ringlukket" stamopløsning i PBS med en koncentration på 1 mg/ml.
- Der fremstilles en vævsmodelprøve fyldt med den inaktive fotoform af LMB002 i en plastbeholder. I en typisk serie blandes 5 g fersk hakket svinekød mekanisk med 277 μL LMB002 stamopløsning og 260 μL PBS for at nå den endelige koncentration på 50 mg/kg i prøven og forholdet væv/PBS på ~9/1 (v/v).
- Fyld sprøjten med den forberedte prøve, og sørg for, at der ikke er luftbobler indeni, og dann en plan overflade ved eksponeringen (skåret).
BEMÆRK: Cylinderen på prøven i sprøjten skal optage ~40 mm langs aksen. - Bestråle prøven i det optiske tog som vist i figur 3 i 9 min 44 s, svarende til ~60 J/cm2 eksponering.
- Forbered 4 mm tykke skiver af prøven efter eksponeringen ved at skubbe den af sprøjten ved hjælp af stemplet og skære det med en skalpel. Skiverne vejes og anbringes i separate reagensglas og mærkes med middelafstanden (mm) fra den bestrålede overflade.
- Der fremstilles to kontrolprøver (optimal mængde, 0,5-0,7 g) i reagensglas: i det ene hakket kød blandet med 10 % (volumen) PBS (54 μL), og i det andet bestråles modelvævsprøven opnået i trin 2,4 med 500 mW laserlys i 10 minutter for at sikre, at alle LMB002 "ringlukkede" molekyler omdannes til den "ringåbne" form.
- Der tilsættes acetonitril-vand-blanding (70%/30% v/v, suppleret med 0,01% trifluoreddikesyre (TFA), 1,4 ml/g) til hver skive og kontrolprøverne. Bland indholdet grundigt ved hjælp af en glasstang.
- Der inkuberes ved stuetemperatur i mindst 10 minutter, og blandingerne centrifugeres ved 5220 x g i 20 minutter eller centrifugeres ved 20 x g i 30 minutter to gange for at fjerne det uopløselige materiale og opsamle supernatanten.
- Supernatanterne (~0,7 ml) opsamles forsigtigt og centrifugeres igen ved 16.000 x g i 30 minutter.
- Supernatanterne (~0,5 ml hver) opsamles, og de analyseres ved højtryksvæskekromatografi med omvendt fase (RP HPLC) med en analytisk C18-kolonne, lineær A:B-gradient på 3,46 % B/min, 2,0 ml/min strømningshastighed og 100 μL injiceret volumen. De UV-detekterede kromatogrammer registreres ved 570 nm (detektion af "ringlukket" form) og 270 nm (detektion af den "ringåbne" form). Der anvendes prøver af ikke-bestrålet (trin 2.4) og bestrålet kontrol (trin 2.8) til bestemmelse af de specifikke retentionstider for begge fotoformer (elueringsmiddel A: vandig 0,1% TFA; elueringsmiddel B: 90% acetonitrilvand, 0,1% TFA), og metoden kalibreres.
- Bestem de faktiske mængder LMB002-fotoformer i de analyserede prøver ved hjælp af kalibreringskurverne opnået ved at tage og analysere kromatogrammerne af LMB002-opløsninger med kendte koncentrationer. Til kalibrering fremstilles LMB002 "ringlukkede" opløsninger ved at fortynde stamopløsningen (trin 2.3) med acetonitril-vand-blanding (70 %/30 % v/v suppleret med 0,01 % TFA) for at opnå 0,36, 0,9 og 3,6 μg pr. 100 μL (det indsprøjtede volumen); Elueringsgradienten og strømningshastigheden er den samme som i trin 2.12.
- Forsøget gentages (trin 2.4-2.12) tre gange, og den normaliserede procentdel af hver fotoform afbildes på observationsområdet (procent) i forhold til afstanden (fra den bestrålede vævsoverflade). Beregn statistikken (dvs. standardafvigelse ved hvert koncentrationspunkt).
Figur 3: Eksperimentel opsætning til bestemmelse af effektiviteten af fotokonvertering i modelvæv. (A) skematisk og (B) fotografi; 1, optisk kabel fra laserlyskilden; 2, objektiv med variabel brændvidde; og 3, kødhakke-LMB002-fosfatbufret saltvandsblanding anbragt i 4, en sprøjte med et uigennemsigtigt låg og skåret frontend (vist i (B) uden låg). Klik her for at se en større version af denne figur.
3. Bestemmelse af in vivo-anticancereffektivitet
BEMÆRK: Eksperimentplanen og slutpunkterne er vist i figur 4. Standarder for dyrepleje i efterbehandlingsperioden bør være i overensstemmelse med 3R-reglerne - opstaldning bør omfatte korrekt burtæthed og ressourcetilgængelighed. Når det er muligt, skal du overholde ikke-aversive dyrehåndteringsmetoder såsom tunnel eller cupping.
Figur 4: Tidsplan for det terapeutiske in vivo-forsøg . Eksperimentelle gruppers betegnelse, terapidetaljer, endepunkter og post mortem-analyseplaner . Forkortelser: LLC = Lewis lungekarcinom; IV = intravenøs; SC = subkutant. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Forberedelse af kræftcellerne til subkutan podning (dag 0).
- Passage LLC-cellerne i DMEM (4,5 g / L glucose) med 10% FBS, 100 U / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin ved 37 ° C og 5% CO2.
- Høst cellerne ved hjælp af 0,05% trypsin-EDTA-opløsning, centrifuger og suspender i serumfri DMEM.
- Tæl cellerne og bestem deres levedygtighed ved hjælp af et hæmocytometer og trypanblå udelukkelsestest.
- Den endelige cellesuspension fremstilles med en koncentration på 10 × 106 celler/ml i DMEM- og Matrigel-blandingen (1:1). Opbevar suspensionen på is før injektion.
- LLC celle podning (dag 0)
- Anbring den voksne kvindelige C57BL/6NCrl-mus (vejer ~20 g) i induktionskammeret i isoflurananæstesimaskinen. Udfør sedation ved 5% isofluran og vent, indtil dyret er helt bevidstløst.
- Fjern pelsen fra celleinokulationsområdet ved barbering.
- Inokuler 5 × 105 LLC-celler i ~ 100 μL DMEM: Matrigel (1: 1) blanding i højre bagben.
BEMÆRK: Når det er muligt, skal du overholde praksis for brug af en enkelt nål.
- Administration af forbindelser og fotobestråling
BEMÆRK: I 5-8 dage efter podning er dyrene klar til behandling, når deres tumorer er håndgribelige og har nået ~ 50-100 mm3 volumen. Udfør alle efterfølgende operationer med LMB002 og mus behandlet med denne forbindelse under halvmørke forhold (en 4 W LED-lampe mindst 5 m fra arbejdspladsen).- LMB002 ("ringlukket" form) opløses i sterilt fysiologisk saltvand i en koncentration på 1 mg/ml i en dosis på 5 mg/kg (IV) for at opnå mørkeblå homogene opløsninger.
- Før bestrålingen samles tilfældigt fire grupper på otte dyr og fjerner pelsen fra tumoren og nærliggende områder ved barbering.
- Anbring en mus i holderen til IV-injektioner, og forvarm dyrets hale i et vandbad ved 37 °C for at gøre halevenen synlig.
BEMÆRK: Overvej præoperativ analgesi. - Injicer forbindelsen ved 5 ml / kg i halevenen. For de to kontrolgrupper injiceres 100 μL saltvand (intravenøst) pr. dyr (20 g legemsvægt). Sørg for, at dyrene i de to forsøgsgrupper får det testede stof i den inaktive fotoform (1 mg/ml i saltvand).
BEMÆRK: Når det er muligt, skal du overholde praksis for brug af en enkelt nål. - Derefter placeres musen under anæstesi 2 timer og 45 minutter efter injektionen af forbindelsen. Inducer sedation med 3% -4% isofluran i ilt. Bevar anæstesi i 15 minutter med 0,5% -1% isofluran i ilt.
- Dæk musen med en sort maske, der har et hul, der kun udsætter tumorområdet for lyset.
- Tænd laserdiodemodulet med en 650 nm laser, og indstil effekten af den røde laser til 200 mW og den blå/UV-styrelaser til 2 mW.
BEMÆRK: Brug blå beskyttelsesbriller, når laserenheden er tændt. - Mål lysstrømmen fra den røde laser (væk fra musene) med et fotometer og bestem afstanden fra det optiske kabel, hvor lysstrømmen er 100 mW/cm2. Fastgør kablet på et stativ for at sikre, at lyskilden er i den bestemte afstand fra tumoren, og lyset dækker hele tumorområdet. Brug blå/UV-styret laserlys under denne procedure.
- Tænd den røde laser for at bestråle tumorområdet i 20 minutter.
- Efter bestrålingen skal du slukke for isofluranstrømmen, sætte dyret tilbage i buret og nøje observere dets tilstand i løbet af de næste 30 minutter.
BEMÆRK: Efter sammensat administration skal musene holdes i mørke i 2 dage. Kun lysdagscyklussen skal ændres; Alle de øvrige boligforhold bør forblive uændrede.
- Observationer efter behandling
- Overhold dyrene dagligt og mål vægten og dimensionerne af deres tumorer. Mål tumorvolumenet og bemærk udviklingen af nekrosen.
BEMÆRK: Dyreplejestandarder i efterbehandlingsperioden skal overholde 3R-reglerne - opstaldning skal omfatte korrekt burtæthed og ressourcetilgængelighed. - Brug data indsamlet i det foregående trin til at evaluere dødeligheden. Bestem overlevelsesraten ved hjælp af standardproceduren.
BEMÆRK: Dyr skal ofres og tælles som døde, når de afslører alvorlige kliniske tegn (kropsvægttab på mere end 15%, tumorsårdannelse heler ikke om 7 dage og vokalisering) eller så snart tumorvolumenet når 2.500 mm3.
- Overhold dyrene dagligt og mål vægten og dimensionerne af deres tumorer. Mål tumorvolumenet og bemærk udviklingen af nekrosen.
Representative Results
I dette arbejde blev 2D- og 3D-celleeksperimenter udført for at bestemme IC50 for "ringlukkede" og "ringåbne" former af LMB002 (se figur 1) ved forskellige inkubationstider. Disse værdier blev sammenlignet med dem, der blev opnået for prototypepeptidet, gramicidin S (anvendt som en positiv kontrol). Et typisk sæt billeder af inkubationen i 2D-dyrket LLC-kultur efter farvning er vist i figur 5. Samtidig farvning med Hoechst 33342 (blå) og propidiumiodid (rød), hvilket resulterer i forskellige lilla nuancer i en større brøkdel af cellerne ved behandling med "ringåben" form sammenlignet med "ringlukket", indikerer en mærkbar forskel i cytotoksicitet mellem to former, der let kan kvantificeres. Det demonstrerede eksempel på et vellykket eksperiment er baseret på data indsamlet ved hjælp af 96-brønds pladeformatet, hvor peptidvarianterne i varierende koncentrationer blev tilsat, som vist i figur 2. Lignende data kan erhverves med 384-brønd og højdensitetsplader. Da pr. Brøndvolumen reduceres, vil tekniske og systematiske fejl og som følge heraf nøjagtigheden af IC50-bestemmelsen falde med stigende brøndtæthed.
Figur 5: Repræsentative billeder fra cytotoksicitetsanalysen i den monolagsdyrkede LLC. Cellerne var farvet med Hoechst 33342 (blå) og propidiumiodid (rød). De viste tider: 10 min, 60 min, 24 timer og 72 timer er inkubationstider med forbindelser. Skalabjælker = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Fotokonverteringen af LMB002 ved bestråling af laserlys i et modelvæv - fersk svinefars - blev bestemt ved hjælp af en prøve bestående af hakket kød blandet med LMB002 "ringlukket" (inaktiv) form opløst i PBS og måling af omdannelsen af denne inaktive form til LMB002 "ringåben" (aktiveret) form i retning af strålingsudbredelse. Prøven blev anbragt i en sprøjte og bestrålet fra den ene side med en flad stråle laserstråling i eksponeringstiden ~10 min (normalt anvendt i in vivo-forsøg ), som vist i figur 3. Efter eksponeringen blev prøvecylinderen opdelt i dele ved at trykke på sprøjtestemplet og skære skiverne af samme højde med en skalpel. Koncentrationen af LMB002 "ring-open" i ekstrakterne fra skiverne blev bestemt ved hjælp af RP HPLC.
Figur 6 illustrerer dosis-effektkurverne Figur 6A-D opnået ved dataanalyse. For at identificere procentdelen af døde celler med nuklear co-farvning af Hoechst 33342- og PI-farvestoffer brugte vi et indbygget klassificeringsværktøj, der indstiller numeriske tærskler ved udvalgte målte parametre til at opdele alle celletællinger i flere kategorier. For eksempel, når den røde kanal (propidiumiodid) signal i kontrollen var ved tærsklen (ca. 110-130 enheder), kunne cellerne klassificeres som PI-positive, betragtes som døde eller PI-negative, betragtes som upåvirket af forbindelserne. For LMB002 kan sigmoide afhængigheder af procentdelen af propidiumiodid-positive celler på den sammensatte koncentration ses. Ud fra disse data kan IC50-værdierne bestemmes.
Figur 6: Analyse af cytotoksicitet i 2D-kultur. Sigmoide anfald som blev opnået i LLC-kulturen i (A) 10 min, (B) 60 min, (C) 24 timer og (D) 72 timers tidsintervaller taget til inkubation med forbindelser. Montering giver mulighed for nøjagtig bestemmelse af IC50-værdier (ikke vist). Fejlbjælker er SEM. Forkortelser: LLC = Lewis lungekarcinom; PI = propidiumiodid. Klik her for at se en større version af denne figur.
I betragtning af de opnåede IC50-værdier kan vi konkludere, at toksiciteten af alle tre forbindelser steg med inkubationstiden. Vores eksperiment afslørede, at "ring-åben" form af LMB002 er omkring et fortyndingstrin mindre giftigt end prototypepeptidet, gramicidin S. Mens den "ringlukkede" form viser tre til fire fortyndingstrin lavere toksicitet, hvilket stiger med inkubationstiden. Forskellen mellem de to fortyndingstrin påvirkes ikke af stigningen i inkubationstiden og kan anvendes numerisk som et eksperimentelt bestemt fototerapeutisk vindue6 til sammenligning med andre forbindelser i en potentiel biblioteksscreening. IC50-værdien for gramicidin S blev fastsat som referencepunkt for korrektion af eksperimentelle fejl eller differentielle output i biologiske replikater.
3D-celleeksperimenterne producerede den samme type rådata - de enkeltcelleopløste sfæroidbilleder pr. brønd. Inkluderingen af calcein som et tredje farvningsfarvestof muliggør kvantificering af fraktionen af metabolisk aktive celler (observeret i den grønne kanal). Ved at bruge plader med 384 brønde, øge antallet af tekniske replikater, eksklusive overflødige co-inkubationstidspunkter og ændre fortyndingsfolden, var vi i stand til direkte at sammenligne flere forbindelser i en enkelt testkørsel (ved hjælp af en enkelt plade) som illustreret i pladekortet i figur 7.
Figur 7: Pladekort for 3D-kultureksperimentet med to forbindelser. Farvekoder for forbindelserne og kontrollen er angivet. Antallet i brønde er koncentrationer i μM. 10 min, 24 timer og 72 timer er inkubationstider. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8 viser billederne af udvalgte tekniske replikater af LLC-sfæroider dyrket med en densitet på 1 sfæroid / brønd i nærvær af testede forbindelser og kontrolsfæroider fanget efter farvning.
Figur 8: Repræsentative billeder fra 3D-kulturcytotoksicitetsanalyse. Billeder viser 48 timer gamle LLC-sfæroider farvet med Hoechst 33342 (blå), calcein AM (grøn) og propidiumiodid (rød) efter 10 min, 24 timer og 72 timers co-inkubation med både LMB002 fotoformer og gramicidin S. Skalastænger = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Ved hjælp af instrumentsoftwaren blev dosis-effektkurverne, ligesom dem i 2D-eksperimentet, opnået fra de z-stablede bunker af billeder (figur 9A). Derudover kunne kompakte og ikke-deformerede sfæroider i 3D-kulturerne karakteriseres ved helsfæroiddiameteren (figur 9B). Det blev også bemærket, at den samlede sfæroiddiameter varierer med sammensat koncentration.
Figur 9: Cytotoksicitetsevaluering med 3D-kulturer. (A) Koncentrationsafhængige cytotoksicitetstilpasningskurver og (B) koncentrationsafhængige sfæroids diameterplots opnået i 3D-kulturerne i LLC co-inkuberet med gramicidin S i 10 min, 24 timer og 72 timer og fanget før farvning. Fejlbjælker er SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.
Eksperimentet for trin 2 gør det muligt at bestemme LMB002-koncentrationer i begge fotoformer ved hjælp af UV-detekteret højtydende væskekromatografi. Effektiviteten af fotokonvertering i modelvæv blev let vurderet og kvantificeret ved hjælp af denne opsætning (figur 3). Dataene blev opnået ved den kvantitative analyse af kromatogrammerne af prøveekstrakterne. I disse testforsøg blev LMB002-kromatogrammer detekteret spektroskopisk ved 270 nm og 570 nm. Ved 270 nm blev mange yderligere signaler observeret og tilskrevet forbindelserne co-ekstraheret fra modelvævet (verificeret fra kontrolekstraktet uden forbindelsen). Begge fotoformer var tilstrækkeligt forskellige i retentionstider og absorbans. LMB002 "ring-open" signalet var imidlertid baseline-adskilt fra disse baggrundssignaler (se et repræsentativt kromatogram i figur 10A). Derfor kan dette signal integreres uden problemer. Ved 570 nm indeholdt kromatogrammerne kun LMB002 "ringlukket" formsignal (figur 10B). Her udførte vi koncentrationsbestemmelse ved hjælp af RP HPLC. Ikke desto mindre kan der opnås endnu højere nøjagtighed og lavere detektionsgrænser ved hjælp af LC/MS som analysemetode.
Figur 10: Repræsentative kromatogrammer af LMB002 ekstraheret fra modelvæv. A) Prøve 2 mm fra den bestrålede overflade, registreret ved 270 nm (LMB002 "ringåben" form er integreret). B) prøve 38 mm fra den bestrålede overflade, registreret ved 570 nm (toppen af LMB002 "ringlukket" er integreret). Retentionstidsværdier (angivet) bekræftede desuden forbindelsens identitet. Klik her for at se en større version af denne figur.
De data, der blev opnået efter integration af de tilsvarende signaler fra alle de indsamlede prøver, blev brugt til at opbygge koncentrationsdybdegraferne, som vist i figur 11. På grundlag af disse grafer blev effektiviteten af fotokonvertering på forskellige dybder af modelvævet let vurderet. Det bekræfter, at vores røde lyskilde inducerer den "ringlukkede" LMB002-fotokonvertering i en dybde på op til 1 c i vævssurrogat, hakket kød (ved ca. 103 mW/cm2).
Figur 11: Evaluering af fotokonverteringseffektivitet. Koncentration (A, mg/kg) af LMB002 "ringlukkede" (ikke-aktiverede, blå prikker) og "ringåbne" former (aktiverede, orange prikker) i forskellige afstande fra modelvævets bestrålede overflade (L, mm). Klik her for at se en større version af denne figur.
Resultaterne af in vivo-eksperimentet - trin 3 i vores metode udført i henhold til skemaet præsenteret i figur 4 - var repræsenteret af grafer, der viser tumorvækst som funktion af tid (figur 12) og Kaplan-Meier-overlevelseskurver (figur 13).
Figur 12: Tumorvækstdynamik hos dyr. Dyr behandlet med LMB002 sammenlignet med de vehikelbehandlede dyr (subkutan LLC-allograftmodel i C57BL/6NCrl-mus, sammensat dosis 7 mg/kg, IV, 2 timer og 40 min. inkubation, derefter bestråling ved 650 nm, 100 mW/cm2, 20 min). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 13: Dødelighedskurver for dyr. Dyr behandlet med LMB002 sammenlignet med de vehikelbehandlede dyr (subkutan LLC-allograftmodel i C57BL/6NCrl-mus, sammensat dosis 7 mg/kg, IV, 2 timer og 40 min. inkubation, derefter bestråling ved 650 nm, 100 mW/cm2, 20 min). Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Fotokontrollerede forbindelser er uden fortilfælde i lægemiddeludvikling; Der er imidlertid ikke fastlagt metoder til præklinisk og klinisk evaluering heraf. Den nærmeste monoterapianalog, fotodynamisk terapi (PDT), er behandlingsmodaliteten til klinisk brug, der er vedtaget af mange lande mod kræft og er under udvikling for andre indikationer19,20. I lighed med fotofarmakologi er PDT også baseret på brugen af lys til at aktivere det bioaktive stof (singlet oxygen). Derfor kan nogle eksperimentelle metoder, der anvendes til prækliniske og kliniske undersøgelser i PDT, vedtages til fotofarmakologi. For eksempel er lyskilder, lysleveringsmetoder og medicinsk udstyr veludviklede og godkendt til PDT; De kan bruges direkte til evaluering af fotokontrollerede lægemidler. PDT og fotofarmakologi adskiller sig imidlertid i mange tilfældefra hinanden 4, hvilket begrunder behovet for at fastlægge specifikke metoder for sidstnævnte.
For det første er det ikke-aktiverede stof i PDT (oxygen) altid til stede i levende væv i ikke-toksiske koncentrationer. I modsætning hertil kan ikke-aktiverede fotokontrollerede biologisk aktive forbindelser have restaktivitet og uønsket toksicitet. Derfor bør ideelle fotofarmakologiske lægemidler have minimeret biologisk aktivitet i deres administrerede form og skal være meget aktive i deres lysgenererede form, det "fototerapeutiske vindue"21 skal være så stort som muligt. At finde hittet og udføre hit-to-lead-optimering kræver identifikation af egnede forbindelser og screening af relativt store biblioteker, allerede på tidlige stadier af lægemiddeludvikling. Her foreslog vi en automatiseret konfokal fluorescerende mikroskopi med høj kapacitet for at identificere effektive fotoswitchingforbindelser.
Den valgte metode til cytotoksicitetsevaluering muliggør nem implementering af det mest kritiske krav - vedligeholdelse af PSS eller stabilitet af den synlige lysfølsomme fotoisomer. Dette skyldes, at lyseksponeringen minimeres ved implementeringen. Derfor, hvis du vælger alternative metoder, bør automatiserede foretrækkes. Denne tilgang er pålidelig og informativ. Brugen af 3D-cellekulturer (sfæroider) på dette stadium giver en holistisk forståelse af cellens reaktion på behandlingen i et mere realistisk vævslignende mikromiljø. Derudover kan værdifuld indsigt i forbindelsernes virkningsmekanisme opnås ved anvendelse af mikroskopi som den direkte metode. Den konfokale fluorescerende mikroskopi med korrekt farvningsprotokol muliggør visuel vurdering af cellernes og sfæroidernes morfologi; Vigtige detaljer om celledød og ændringer inde i cellerne kan også detekteres.
For det andet kræver let anvendelse et omhyggeligt valg af lysdosering. I PDT er let overdosering ekstremt skadelig for væv22. Fotofarmakologisk terapi kan være fordelagtig under overdreven lysbestråling. Den øvre grænse for det aktiverede stof defineres ved den administrerede dosis af det ikke-aktiverede stof og dets farmakokinetik. Imidlertid er lysdosering stadig et problem i fotofarmakologi. Det skal omhyggeligt sikres, at bestrålingseffekten, tætheden og eksponeringstiden ikke er mindre end behovet for behandlingen. I princippet kan dannelsen af det aktive stof overvåges in vivo. Af bioetiske grunde foreslog vi imidlertid et forsøg med et modelvæv (fersk hakket kød) blandet med den ikke-aktiverede forbindelse15. Dette eksperiment er enkelt og kan ændres til at bruge forskellige lyskilder. Det kan også tilpasses til fotofysisk estimering af lysdosering og måling af termiske påvirkninger. Også her er det ved hjælp af modelvæv muligt at minimere lyseksponeringen sammenlignet med for eksempel den mere nøjagtige bestemmelse af fotoskifteeffektivitet under in vivo-forholdene , et alternativ, der altid kan være interessant at overveje.
Endelig kan de forbindelser, der demonstrerer overlegne egenskaber i in vitro-toksicitetsskærmene og effektivt fotoskifter mindst 1-1,5 cm dybt i modelvævet, vælges til dyre, besværlige og langvarige in vivo-undersøgelser. I denne protokol brugte vi den samme cellelinje (LLC) som i in vitro-vurderingen til at generere allograftcancermodellen. Tumorvækstdynamikken, dødeligheden og metastasetællingen er de parametre, der er bedst egnede til vurdering af kræfteffektivitet. Sammenlignet med konventionel kemoterapi anvendes en yderligere faktor i den fotofarmakologiske behandling - lyset. Der er derfor behov for to kontroldyregrupper: en, der kun modtager køretøjet, og en anden, der modtager køretøjet og bestråling. Denne opsætning muliggør evaluering af lysets indvirkning på de målte parametre. I vores forsøg modtog dyrene i de to forsøgsgrupper den ikke-aktiverede forbindelse, og tumorerne hos musene i en gruppe blev bestrålet. Bestrålingsordningen var identisk for kontrol- og behandlingsgrupperne. Sammenligning med benchmark kemoterapi er ikke nødvendig på dette stadium, fordi hovedformålet med forsøget er at demonstrere den kombinerede effekt af lys og sammensat anvendelse. De forbindelser, der udviser denne effekt, kan derefter udvælges til yderligere undersøgelse af deres in vivo-toksicitet og sammenligning med benchmarks for at træffe vigtige go-no-go-beslutninger om deres udvikling. Teknisk set kan in vivo-eksperimentet, som vi beskriver, let tilpasses farmakokinetiske eller farmakodynamiske undersøgelser, for eksempel af en forbindelse, der allerede er valgt som lægemiddelledning.
Disclosures
IVK, OB, SA og ASU er opfindere på den udstedte patentfamilie: "Peptidomimetika besidder fotokontrolleret biologisk aktivitet" (WO2014127919 [A1], EP2958934 [B1], US9481712 [B2], UA113685 [C2]) licenseret til Lumobiotics GmbH. IVK, OB, TS og SA er grundlæggere og aktionærer i Lumobiotics GmbH. IVK er videnskabelig rådgiver, HK, TM, IP og PB er ansatte i Enamine LLC. Forfatterne har ingen andre relevante tilknytninger eller økonomisk engagement med nogen organisation eller enhed med en økonomisk interesse i eller økonomisk konflikt med emnet eller materialerne, der diskuteres i publikationen, bortset fra dem, der afsløres.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender EU-finansiering fra H2020-MSCA-RISE-programmet gennem PELICO (#690973) og ALISE (#101007256) projekter. Dette arbejde blev støttet af DFG-GRK 2039 (SA, TS og ASU), NACIP-programmet for Helmholtz Society (SA og ASU) og VIP + for BMBF (OB og ASU). Vi anerkender Dr. Serhii Koniev, Karlsruhe Institute of Technology, som har syntetiseret forbindelsen LMB002, renset den og venligt leveret forbindelsen til undersøgelsen. Forfatterne takker også Chupryna Maksym, der filmede og kompilerede videoen i Ukraine, og til alle modige forsvarere af Ukraine, der gjorde det eksperimentelle arbejde, skrivning og filmoptagelse af denne publikation mulig.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent 1100 Series capillary LC system | ALSI-Chrom (Agilent distributor) | - | |
| ATCC CRL-1642, LL/2 (LLC1) Lewis lung carcinoma cell line | ECACC | 90020104 | |
| C57BL/6NCrl mice, female, inbred | Charles River | Strain code: 027 | |
| CelCulture, CO2 incubator | Esco Micro | CCL-170B | |
| Corning Matrigel Basement membrane matrix | Merck | CLS354234 | |
| Corning, 384- well spheroid microplates | Merck | CLS3830 | |
| Fetal bovine serum | Merck | F7524 | |
| Gibco, DPBS | Thermo Fisher Scientific | 21600044 | |
| Gramicidin S | Lumobiotics | Custom synthesis | |
| HyClone, DMEM/high glucose | Cytiva | SH30003.04 | |
| IN Cell Analyzer 6500HS, imaging system | Cytiva | 29240358 | |
| Invitrogen, Calcein AM | Thermo Fisher Scientific | C1430 | |
| Isoflurane anesthesia machine | ASA | S/N ASA 1305 | |
| L-glutamine, 200 mM solution | Merck | G7513 | |
| LIKA-surgeon, diode surgery laser | Fotonika plus | - | |
| LMB002 | Lumobiotics | Custom synthesis | |
| Penicillin–Streptomycin, solution stabilized | Merck | P4333 | |
| PhenoPlate, 96-well plates | PerkinElmer | 6055302 | |
| Photometer PCE-LED 20 | PCE Instruments | PCE-LED 20 | |
| Thermo Scientific, Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Thermo Scientific, Propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | J66764-MC | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Merck | T8154 | |
| Trypsin–EDTA, 10 x solution | Merck | T4174 | |
| UltraCruz Cell culture flasks with vented caps, 75 cm2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-200263 | |
| UltraCruz, bottle top filters, PES, 0.22 μm | Santa Cruz Biotechnology | sc-360882 | |
| Vydac 218TP, C18 HPLC column (4.6 mm × 250 mm, 5 µm) | Altmann Analytik (Avantor distributor) | GR5103827 |
References
- Fuchter, M. J. On the promise of photopharmacology using photoswitches: a medicinal chemist's perspective. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (20), 11436-11447 (2020).
- Volarić, J., Szymanski, W., Simeth, N. A., Feringa, B. L.
- Paoletti, P., Ellis-Davies, G. C. R., Mourot, A. Optical control of neuronal ion channels and receptors. Nature Reviews Neuroscience. 20, 514-532 (2019).
- Hüll, K., Morstein, J., Trauner, D.
- Ma, X., et al. In vivo photopharmacology with a caged mu opioid receptor agonist drives rapid changes in behavior. Nature Methods. 20, 682-685 (2023).
- Sarabando, S. N., Palmeira, A., Sousa, M. E., Faustino, M. A. F., Monteiro, C. J. P. Photomodulation Approaches to Overcome Antimicrobial Resistance. Pharmaceuticals. 16 (5), 682 (2023).
- Kolarski, D., Szymanski, W., Feringa, B. L. Chronophotopharmacology: Methodology for high spatiotemporal control over the circadian rhythm with light. Neuromethods. Hirota, T., Hatori, M., Panda, S. 186, Humana, New York, NY. (2022).
- Babii, O., et al. Peptide drugs for photopharmacology: how much of a safety advantage can be gained by photocontrol. Future Drug Discovery. 2 (1), FDD28 (2020).
- Davis, A. M., Keeling, D. J., Steele, J., Tomkinson, N. P., Tinker, A. C.
- Balani, S. K., Miwa, G. T., Gan, L., Wu, J., Lee, F. W. Strategy of utilizing in vitro and in vivo adme tools for lead optimization and drug candidate selection. Current Topics in Medicinal Chemistry. 5 (11), 1033-1038 (2005).
- Kleijn, A., et al. A Systematic comparison identifies an ATP-based viability assay as most suitable read-out for drug screening in glioma stem-like cells. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Rodrigues, J., Heinrich, M. A., Teixeira, L. M., Prakash, J. 3D in vitro model revolution: unveiling tumor-stroma interactions. Trends in Cancer. 7 (3), 249-264 (2021).
- Sittinger, M., et al. Tissue engineering and autologous transplant formation: practical approaches with resorbable biomaterials and new cell culture techniques. Biomaterials. 17 (3), 237-242 (1996).
- Matai, I., Kaur, G., Seyedsalehi, A., McClinton, A., Laurencin, C. T. Progress in 3D bioprinting technology for tissue/organ regenerative engineering. Biomaterials. 226, 119536 (2020).
- Babii, O., et al. Direct photocontrol of peptidomimetics: an alternative to oxygen-dependent photodynamic cancer therapy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (18), 5493-5496 (2016).
- De Ridder, K., et al. Novel 3D lung tumor spheroids for oncoimmunological assays. Advanced NanoBiomed Research. 2 (4), 2100124 (2022).
- Pauli, C., et al. Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Van Straten, D., Mashayekhi, V., De Bruijn, H. S., Oliveira, S., Robinson, D. J. Oncologic photodynamic therapy: basic principles, current clinical status and future directions. Cancers. 9 (2), 19 (2017).
- Li, X., Kwon, N., Guo, T., Liu, Z., Yoon, J. Innovative strategies for hypoxic-tumor photodynamic therapy. Angewandte Chemie International Edition. 57 (36), 11522-11531 (2018).
- Hull, K., Morstein, J., Trauner, D.
- Babii, O., et al. Structure-activity relationships of photoswitchable diarylethene-based β-hairpin peptides as membranolytic antimicrobial and anticancer agents. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (23), 10793-10813 (2018).
- Heckl, C., Aumiller, M., Rühm, A., Sroka, R., Stepp, H. Fluorescence and treatment light monitoring for interstitial photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 96 (2), 388-396 (2020).
