Summary
Bu protokol, bu tür bileşiklerin klinik öncesi taramasında kullanılabilecek fotoanahtarlanabilir antikanser peptitlerinin değerlendirilmesi için benimsenen bir dizi deney sunmaktadır. Bu, 2D ve 3D hücre kültürlerinde sitotoksisite değerlendirmesini, ex vivo (model doku) fotoizomerizasyon etkinliğinin değerlendirilmesini ve in vivo etkinliği içerir.
Abstract
Fotokontrollü, biyolojik olarak aktif bileşikler, "akıllı" ilaç adaylarının ortaya çıkan bir sınıfıdır. Sistemik kemoterapide, iyi huylu, iyonize edilemeyen bir ışığı hastanın vücudundaki belirli bir yere yönlendirerek hassas uzaysal zamansal aktivasyonları nedeniyle ek güvenlik sağlarlar. Bu yazıda, fotokontrollü, biyolojik olarak aktif bileşiklerin fotoaktivasyonunun in vitro potensi ve ex vivo etkinliğinin yanı sıra ilaç geliştirmenin erken aşamalarında in vivo etkinliği değerlendirmek için bir dizi yöntem sunulmaktadır. Metodoloji, antikanser sitotoksik peptitlere, yani bilinen bir antibiyotik olan gramicidin S'nin günlükleten içeren analoglarına uygulanır. Deneyler, bir kanser hücre hattının (Lewis akciğer karsinomu, LLC) 2D (yapışkan hücreler) ve 3D (sferoidler) hücre kültürleri, canlı doku vekilleri (domuz eti kıyması) ve immünkompetan farelerde bir allogreft kanser modeli (subkutan LLC) kullanılarak gerçekleştirilir. En etkili bileşiklerin seçimi ve gerçekçi fototerapötik pencerelerin tahmini, otomatik floresan mikroskobu ile gerçekleştirilir. Farklı aydınlatma rejimlerinde fotoaktivasyon verimliliği, bir model dokuda farklı derinliklerde belirlenir ve optimal ışık dozu, son terapötik in vivo deneyde uygulanır.
Introduction
Fotokontrollü biyolojik olarak aktif bileşikler, son yıllarda insan hastalıkları için güvenli kemoterapilerin umut verici bir bileşeni olarak ortaya çıkmıştır ve malign solid tümörleri spesifik olarak ortadan kaldırmaktadır1. Bu bileşikler geri dönüşümlü fotoizomerize edilebilir fragmanlar (moleküler fotoanahtarlar) içerir ve farklı dalga boylarındaki ışıkla ışınlama üzerine inaktif ve aktif fotoizomerler arasında geçiş yapabilir.
Fotokontrol edilemeyen analoglarıyla karşılaştırıldığında, fotokontrollü ilaçlar daha güvenli olabilir, çünkü hastanın vücuduna sistemik olarak daha az aktif ve esasen toksik olmayan formlarda sokulabilirler ve daha sonra tümörler, ülserler ve yaralar gibi sadece gerektiğinde ışıkla aktive edilirler. Bu tür moleküler ilaç prototiplerinin çok sayıda heyecan verici gösterimi son akademik makalelerde bulunabilse de 2,3,4,5,6,7, klinik fotofarmakoloji alanı - onaylanmış ilaç / tıbbi cihaz / hastalık kombinasyonlarının bir uygulaması - mevcut değildir. Fotofarmakoloji henüz ilaç keşif aşamasındadır ve sistematik preklinik çalışmalar bilinmemektedir.
Çok yakın zamanda, bazı fotokontrollü antikanser peptitleri, yani peptid antibiyotik gramicidin S8'in analogları için in vivo güvenlik avantajını gösterdik. Bu fotokontrollü türevler, kırmızı ışık tarafından üretilen "halka açık" ve UV tarafından üretilen "halka kapalı" fotoformlar arasında geri dönüşümlü fotoindüklenmiş dönüşümlere maruz kalan bir günlük (DAE) fotoanahtarı içerir (türevlerden biri için Şekil 1'de gösterilmiştir, LMB002 bileşiği).
Resim 1: Fotokontrollü sitotoksik peptid LMB002 ve fotoizomerizasyonu. Günlükleten parçası kırmızı renkle gösterilmiştir. Kısaltma: DAE = diarylethene. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
İsabetleri bulmak ve isabet-kurşun optimizasyonu gerçekleştirmek genellikle uygun bileşik kütüphanelerin in vitro ve in vivo taramasını gerektirir 9,10. Burada, fotokontrollü bileşiklerin sitotoksisitesinin sistematik yüksek verimli taraması için uygun bir metodoloji gösteriyoruz. Ayrıca fotoizomerizasyon etkinliğini belirler, model dokulardaki ışık dozunu tahmin eder ve en iyi performans gösteren adayların in vivo etkinliğini değerlendiririz. Yaklaşım, biyoetik ve hayvan bakımı hususları ile uyumludur.
Bu çalışmada, test edilen bileşiklerin kontrolsüz fotoizomerizasyonunu önlemek için geleneksel preklinik yöntemler modifiye edilmiştir. Bu modifiye yöntemleri burada uygulamanın genel amacı, basit ve hızlı olan ve in vitro aktiviteleri güvenilir bir şekilde karşılaştırmak ve kurşun tanımlama ve daha fazla geliştirme için fotoanahtarlanabilir bileşiklerin in vivo etkinlik testini rasyonelleştirmek için istatistiksel olarak anlamlı veriler sağlayan genel bir strateji geliştirmektir.
Strateji birbirini izleyen üç adımdan oluşur. İlk adım, iki boyutlu (2B, tek katmanlı) ve üç boyutlu (3B, küresel) hücre kültürleri ve konfokal yüksek verimli otomatik floresan mikroskobu kullanılarak seçilen fotokontrollü biyolojik olarak aktif bileşiklerin aktif ve inaktif fotoformları için seri seyreltmelerde IC 50'nin (görünür%50 hücre canlılığı) belirlenmesini içerir. Fototerapötik pencereler, iki fotoform arasındaki IC50 farkı açısından karşılaştırılır ve en iyi performans gösteren adaylar seçilir. Otomatik mikroskopi ve diğer sitotoksisite tarama platformları (tahliller) ile toksisite değerlendirmesinde spesifik bir avantaj yoktur11; Daha karmaşık hücre bazlı tümör modelleri12 bu aşamada kolayca uygulanabilir.
1. adımda seçilen bileşikler için ikinci adım, ışınlanmış numune ekstraktlarının UV ile tespit edilen yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) kullanılarak bir doku vekilindeki daha az aktif fotoformların fotoanahtarlama verimliliğini ölçerek, ışınlanmış doku yüzeyinden derinliğin bir fonksiyonu olarak dokular içindeki fotoanahtarlama verimliliklerini gerçekçi bir şekilde tahmin etmektir. In vivo , fotoanahtarlama verimliliği incelenebilir, ancak basit bir doku vekili - kıyılmış domuz eti kullanmayı öneriyoruz. Bu yaklaşımın geçerliliğini test ettik. Fotodeğiştirilebilir bileşiklerimizin in vivo dönüşümünü bir fare kanseri modelinde ölçtük ve farelerle yapılan önceki deneylerde ölçülen bir derinlikte yaklaşık olarak aynı fotokonversiyon gözlemledik8. Uygun herhangi bir alternatif yapay doku13, 3D biyobaskılı doku / organ14, biyopsi materyalleri veya başka bir muaf hayvan materyali kullanılabilir. Ancak, bu kurulum ekonomik, hızlı ve etik olduğu için iyi bir uzlaşmadır.
Üçüncü adım, bir murin kanseri modelinde in vivo antikanser etkinliğinin belirlenmesidir. Bu deney için in vitro deneylerde üstün özellikler gösteren ve model dokularda en az 1-1,5 cm derinlikte verimli bir şekilde fotoanahtarlama yapan bileşikler seçilmiştir.
Bu protokol, fotoformlarının (veya fotodurağan durumlarının, PSS) makul bir süre (birkaç gün veya daha uzun) stabil olması koşuluyla, farklı tipte fotoanahtarlara sahip bileşiklere uygulanabilir. Örnek olarak, daha önce açıklanan DAE türetilmiş LMB00215 kullanılır. LMB002 fotoformları termal olarak kararlıdır ve önemli bir bozulma olmadan en az bir yıl boyunca -20 ° C'de saklanabilir. Lewis akciğer karsinomu (LLC) hücreleri bunun için in vitro ve in vivo gösterim için seçilir, ancak hücre tipine herhangi bir kısıtlama getirilmez. LLC hücreleri yapışkandır, 3D'de kolayca kültürlenebilir ve tümöroidler üretmek için kullanılır (referans16'da açıklandığı gibi). İn vivo LLC hücreleri metastatik süreçleri modellemek için kullanılır ve deri altı enjeksiyonundan sonra immünokompetan farelerde kolayca katı tümörler üretebilir. Bu in vivo metodoloji evrensel olarak diğer kanser modellerine uygulanabilir17,18. Bu stratejinin ayrıntılı uygulaması aşağıda açıklanmıştır.
Protocol
Hayvan bakımı ve deneysel prosedürler, laboratuvar hayvanlarını içeren araştırma projelerinin yürütülmesine yönelik yerel ve uluslararası düzenlemelere (Ukrayna "Hayvanların Zulümden Korunmasına İlişkin Kanun", deneysel ve diğer bilimsel amaçlar için kullanılan omurgalı hayvanların korunmasına ilişkin Avrupa Sözleşmesi (Avrupa sözleşmesi, Strasburg, 1986), bilimsel amaçlarla kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin 2010/63/EU sayılı Direktif) uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma Bienta firmasının Biyoetik Komisyonu tarafından onaylanmıştır. Bu deneylerde C57BL / 6NCrl fareler (her biri yaklaşık 20 g ağırlığındaki yetişkin dişiler) kullanılmıştır. Belirli malzemeler, reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. 2D ve 3D LLC hücre kültürlerini kullanarak LMB002 ("halka kapalı" ve "halka açık" formlar) için IC50 değerlendirmesi
- Tamponların hazırlanması ve bileşiklerin stok çözeltileri
NOT: Arabellekleri standart yordamları kullanarak hazırlayın. Alternatif olarak, piyasada satılan çözümleri kullanın.- 14.2 g Na 2 HPO 4,2.4 g KH2PO4, 80 g NaCl ve 2g KCl ila 1 L damıtılmış su ekleyerek 10x fosfat tamponlu salin (PBS) hazırlayın. Otoklav 10x PBS hazırladı ve 900 mL damıtılmış suya 100 mL 10x çözelti ekleyerek 1x çözeltiye seyreltin. Ardından, çözeltiyi 4 ° C'de saklayın.
- 1 L damıtılmış suya 4,78 g DPBS tozu ekleyerek Dulbecco'nun PBS'sini (DPBS) hazırlayın. Tüm katı madde çözünene kadar çözeltiyi karıştırın, pH ölçüm cihazı kullanarak pH'ı kontrol edin ve 1 M NaOH veya 1 M HCl (pH 7.3-7.4) ekleyerek ayarlayın. İstenilen pH seviyesine ulaştıktan sonra, ortamı steril bir kabinde 0,22 μm'lik bir vakum filtresinden geçirin. 4 °C'de saklayın.
- 1 L damıtılmış suya 238,3 g HEPES ekleyerek 1 M 4-(2-hidroksietil)-1-piperazineetansülfonik asit (HEPES) tampon çözeltisi hazırlayın. Çözeltinin pH'ını pH 7.5'e kadar 1 M NaOH ile ayarlayın. Steril bir kabinde 0,22 μm vakum filtresinden süzün. 4 °C'de saklayın.
- 10x çözeltisini seyrelterek 1x tripsin-EDTA (EDTA = etilendiamintetraasetik asit) çözeltisi hazırlayın. Bunu yapmak için, 50 mL'lik steril bir tüp içinde 45 mL 1x PBS çözeltisine 5 mL 10x Tripsin-EDTA ekleyin. 4 °C'de saklayın.
- Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) bazini, karıştırma plakasına yerleştirilmiş manyetik bir karıştırma çubuğu ile bir ölçüm silindirine 13,4 g DMEM yüksek glikoz tozu ve 3,7 g Na2CO3 ila 1 L damıtılmış su ekleyerek hazırlayın. Tüm katı madde çözünene kadar çözeltiyi karıştırın, pH ölçüm cihazı kullanarak pH'ı kontrol edin ve 1 M NaOH veya 1 M HCl (pH 7.3-7.4) ekleyerek ayarlayın. İstenilen pH'a ulaştıktan sonra, ortamı steril bir kabinde 0,22 μm vakum filtresinden geçirin ve 4 ° C'de saklayın.
- 900 mL DMEM baziğine 100 mL fetal sığır serumu (FBS), 10 mL penisilin-streptomisin çözeltisi, 10 mL L-glutamin çözeltisi ve 10 mL 1 M HEPES tamponu ekleyerek DMEM komple ortamını hazırlayın. 4 °C'de saklayın.
- Test bileşikleri için stok çözeltileri hazırlayın.
- Her bileşik için, halka kapalı fotoformda iki adet 5.12 mg'lık (örneğin, LMB002) partiyi, iki adet 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne (biri berrak ve diğeri siyah şeffaf olmayan duvarlarla) tartın. Ekstra berrak bir duvar tüpünde 2,28 mg pozitif kontrol (örneğin, gramicidin S) tartın. Her numuneye 100 μL saf DMSO ve 30 s boyunca vorteks ekleyin.
- Şeffaf duvar tüpündeki stok çözeltisini (LMB002) "halka kapalı" formdan "halka açık" forma kadar fotoizomerize ederek, çözeltiyi 660 nm lazer (ışık gücü yoğunluğu 0,6 W /cm2) ile vorteksleme ile ışınlayarak iyice karıştırmayı sağlayın. Renk gözle görülür şekilde koyu mordan açık kahverengiye değişene kadar devam edin. Alüminyum folyo kullanarak ışıktan koruyun.
- 2D hücre kültürü deneyi-hücrelerin tohumlanması (1. gün)
- DMEM komple ortamının 10 mL'sini bir LLC hücre kültürüne sahip T-75 şişesinden 15 mL'lik steril bir tüpe aktarın. Kalan ortamı bir vakum pompası ile aspire edin.
- Hücre kültürünü 5 mL 1x DPBS ile yıkayın ve çözeltiyi bir vakum pompasıyla aspire edin.
- Hücreleri 3 mL 1x tripsin-EDTA çözeltisi ile örtün ve şişeyi% 5 CO 2 atmosferinde 37 ° C'de2-3 dakika inkübe edin.
- 1x tripsin-EDTA çözeltisi içeren hücre kültürü şişesine 6 mL DMEM ortamı (daha önce steril bir tüpe aktarılmış) ekleyerek ve hücreleri hücre kültürü şişesi duvarlarından yıkamak için süspansiyonu birkaç kez pipetleyerek tripsin etkisini durdurun.
- Süspansiyonu 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 4 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı bir vakum pompasıyla aspire edin. Tüpün altındaki hücre peletine dokunmaktan kaçının.
- 2 mL taze DMEM tam ortam ekleyerek ve birkaç kez pipetleyerek hücreleri yeniden askıya alın.
- Süspansiyonun yaklaşık 15 μL'sini 0,5 mL'lik bir tüpe örnekleyerek, 15 μL'den% 0,4 tripan mavisi ekleyerek ve elde edilen karışımı bir hücre sayım odasına aktararak hücreleri sayın.
- Saydıktan sonra, zaman noktası başına 25 mL hücre süspansiyonu hazırlayın. Tohum 5.000-10.000 (ortalama 8.000) LLC hücresi / kuyusu, şeffaf tabanlı ve siyah şeffaf olmayan duvarlara sahip 96 delikli bir plakanın merkezi 60 kuyusunda 200 μL DMEM içinde. Kalan 36 kuyuyu saf DMEM ile doldurun.
- Plakaları gece boyunca 37 ° C ve% 5 CO2'de bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Alt plakanın eşit olmayan şekilde ısınmasını önlemek için altında plastik plaka kapakları kullanın.
- 2D hücre kültürü deneyi - bileşiklerin eklenmesi (2. gün)
- Hücreler% 70-80 akıcılığa ulaşana kadar plakalardaki ışık mikroskobu ile hücreleri izleyin.
- Ortamı steril bir kabinde bir vakum pompası ile kuyulardan aspire edin. Taze önceden ısıtılmış DMEM ortamından 100 μL ekleyin ve plakaları bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.
- Test bileşiklerinin seri seyreltilerini hazırlayın ve polipropilen otoklavlanmış şeffaf plakalarda pozitif kontrol. Bireysel zaman noktası ölçümleri için aşağıdaki çözümleri yapın:
NOT: DMSO'daki stoklarla başlayın ve DMEM ile seyreltin, ancak son en yüksek konsantrasyonda DMSO'nun% 1 v / v'sini aşmayın.- 128 μM'lik bir gramicidin S çözeltisi elde etmek için, 198,7 μL DMEM'ye 1,3 μL 20 mM stok çözeltisi ekleyin.
- LMB002'nin 256 μM'lik bir çözeltisini, "halka açık" formu elde etmek için, 198,7 μL DMEM'e 1,3 μL 40 mM çözelti ekleyin.
- LMB002'nin 512 μM'lik bir çözeltisini, "halka kapalı" formu elde etmek için, 197,4 μL DMEM'e 2,6 μL 40 mM stok çözeltisi ekleyin.
- Her konsantrasyon noktasından dört set elde etmek için üç ek tekrar gerçekleştirin. Her başlangıç kuyucuğundan 100 μL aspire ederek, 100 μL DMEM ile bir kuyuya aktararak ve iyice karıştırarak bir çift seyreltme serisi hazırlayın.
NOT: Foto-değiştirilebilir bileşiklerle çalışmak, geri fotoizomerizasyonu önlemek için aydınlatma ayarı gerektirir. Steril dolaplarda ışığın kapatılması önerilir. - Bileşiklerin kuyucuklardaki (5-150 μM) nihai konsantrasyonlarını, hazırlanan çözeltilerin 100 μL'sini her seferinde 56 kuyucukta 100 μL önceden eklenmiş DMEM ile aktararak elde edin. Negatif bir kontrol görevi görmek için dört kuyucuğa her seferinde 100 μL DMEM ekleyin.
- Kontrolsüz foto geçişi önlemek için alüminyum folyo veya plastik koruyucu şeffaf olmayan kapaklı kapak plakaları. Plakaları, seçilen inkübasyon süresi (10 dakika, 60 dakika, 24 saat veya 72 saat) için 37 ° C'de (ekstra plastik plaka kapaklarının altına kullanarak) bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.
- 2D hücre kültürü deneyi - boyama ve görüntüleme (2-5. günler)
- Farklı dönemlerde bileşiklerle inkübasyondan sonra, 10 ve 60 dakika boyunca bileşiklerle inkübe edilen plakalara kuyucuk başına 50 μL boyama çözeltisi ekleyin. Plakaları 37 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe edin.
NOT: 5.810 μL steril olmayan 1x PBS'ye 8 μL 20 mM Hoechst 33342 çözeltisi (nihai konsantrasyon 5 μM), 32,5 μL 1 mM propidyum iyodür (PI) çözeltisi (nihai konsantrasyon 1 μM) ve 650 μL steril olmayan FBS ekleyerek zaman noktası başına stok boyama çözeltileri hazırlayın. Hücrelerin sıcaklık şoku yaşamasını önlemek için FBS ve PBS'yi 37 ° C'de bir su banyosunda önceden ısıtın. - 20x objektif lens kullanarak otomatik floresan görüntüleme gerçekleştirin.
- Aynı boyama ve görüntüleme prosedürünü (adım 1.4.1 -1.4.2), 24 (gün 3) ve 72 (gün 5) saat boyunca bileşiklerle inkübe edilen plakalar için tekrarlayın.
NOT: Tipik 2B plaka haritaları Şekil 2'de gösterilmiştir.
- Farklı dönemlerde bileşiklerle inkübasyondan sonra, 10 ve 60 dakika boyunca bileşiklerle inkübe edilen plakalara kuyucuk başına 50 μL boyama çözeltisi ekleyin. Plakaları 37 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe edin.
- 3D hücre kültürü deneyi - hücrelerin tohumlanması (1. gün)
NOT: Bu bölümdeki adımlar, hücre kültürünün 2B deney hazırlığı, test edilen bileşiklerle inkübasyon ve görüntüleme (adım 1.1-1.4) için açıklananlarla aynıdır. Bununla birlikte, bu durumda, hücreler siyah, şeffaf olmayan duvarlara sahip 384 kuyucuklu ultra düşük yapışma U-taban plakasında kompakt olgun sferoidler olarak hazırlanır. Bu büyüklükte bir plaka kullanmak, bir deneyde iki bileşiğin karşılaştırılmasına izin verir.- Bir LLC hücre kültürü ile 2D deney protokolünden 1.2.1-1.2.9 adımlarını tekrarlayın.
- Hücreleri saydıktan sonra, hücre süspansiyonunun 25 mL'sini hazırlayın. Tüm kuyucuklarda kuyucuk başına 1.000 hücreyi 50 μL DMEM içinde 384 kuyucuklu, düşük bağlayıcılı, U-tabanlı bir plakada tohumlayın.
- 30 s boyunca 40 × g'da santrifüj yapın ve hücreleri kuyucukların duvarlarından tabana doğru sallamak için 1 dakika boyunca 250 rpm'de bir plaka çalkalayıcı ile çalkalayın.
- Plaka tabanının 48 saat boyunca eşit olmayan şekilde ısınmasını önlemek için plakaları 37 ° C'de bir inkübatöre ve% 5 CO2'de ekstra plastik plaka kapaklarının üzerine yerleştirin.
- 3D hücre kültürü deneyi - bileşiklerin eklenmesi (3. gün)
- Kompakt olgun sferoidlerin oluştuğundan emin olmak için plakalardaki hücreleri mikroskopi ile izleyin.
- İncelenen bileşiklerin polipropilen otoklavlanmış şeffaf plakalarda seri seyreltilmesini hazırlayın. Bu durumda, ek bir bileşik ekleyin. Bireysel zaman noktası ölçümleri için aşağıdaki çözümleri yapın:
- 175 μM ve 350 μM gramicidin S çözeltileri elde etmek için, 198,2 μL DMEM'e 1,8 μL 20 mM stok çözeltisi ekleyin ve buna karşılık olarak 196,4 μL DMEM'e 3,6 μL stok ekleyin.
- LMB002'nin 175 μM ve 350 μM çözeltilerini, "halka açık" formu elde etmek için, 199 μL DMEM'e 1 μL 40 mM stok çözeltisi ekleyin ve buna karşılık olarak 198,2 μL DMEM'e 1,8 μL stok ekleyin.
- LMB002'nin 350 μΜ ve 1.750 μM çözeltilerini, "halka kapalı" formu elde etmek için, 198,2 μL DMEM'e 1,8 μL 40 mM stok çözeltisi ekleyin ve buna karşılık olarak 191,2 μL DMEM'e 8,8 μL stok ekleyin.
- Her konsantrasyon noktasından dört set elde etmek için üç ek çoğaltma gerçekleştirin. Her başlangıç kuyusundan 20 μL çekerek, 180 μL DMEM ile kuyuya aktararak ve iyice karıştırarak seri seyreltmeler elde edin.
NOT: Foto-değiştirilebilir bileşiklerle çalışmak, geri fotoizomerizasyonu önlemek için aydınlatma ayarı gerektirir. Steril dolaplardaki ışıkların kapatılması önerilir. - 50 μL DMEM içeren 128 kuyucukta her seferinde hazırlanan çözeltilerin 20 μL'sini transfer ederek kuyulardaki bileşiklerin nihai konsantrasyonlarını elde edin. Kontrol görevi görmesi için her seferinde üç kuyucuğa 20 μL DMEM ekleyin. Fotoanahtarlamayı veya buharlaşmayı önlemek için plakaları alüminyum folyo veya plastik koruyucu kaplama ile örtün.
- Plakaları, seçilen inkübasyon süresi için plastik plaka kapakları üzerindeki bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.
- 3D hücre kültürü deneyi - boyama ve görüntüleme (3-6. günler)
- 13 μL 1 mM kalsein çözeltisi (nihai konsantrasyon 1 μM), 22 μL 20 mM Hoechst 33342 çözeltisi (nihai konsantrasyon 33 μM), 40 μL 1 mM PI çözeltisi (nihai konsantrasyon 3 μM), 300 μL steril olmayan FBS ila 2.625 μL steril olmayan 1x PBS ekleyerek zaman noktası başına boyama çözeltisini hazırlayın. Hücrelerin sıcaklık şoku yaşamasını önlemek için FBS ve PBS'yi 37 ° C'de bir su banyosunda önceden ısıtın.
- Bileşiklerle farklı periyotlarda inkübasyondan sonra, 10 dakika boyunca bileşiklerle inkübe edilen kuyucuklara kuyu başına 20 μL boyama çözeltisi ekleyin. 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- 20x objektif lens kullanarak floresan konfokal görüntüleme gerçekleştirin.
- Aynı boyama ve görüntüleme prosedürünü, 24 (gün 4) ve 72 (gün 6) saat boyunca bileşiklerle inkübe edilen kuyucuklar için tekrarlayın.
NOT: Bu deneyde, kalsein, çok renkli boyama çözeltisinin üçüncü bir bileşeni olarak kullanılmıştır. 2D ve 3D deneylerden elde edilen görüntüler, cihazın otomatik görüntü analiz yazılımı kullanılarak analiz edilir. Hoechst ve propidium iyodür boyaları ile birlikte boyanan hücreler nekrotik olarak ölü kabul edilir ve konsantrasyonun bir fonksiyonu olarak fraksiyonları IC50 değerini hesaplamak için kullanılır.
Şekil 2: 2B kültür deneyleri için tipik plaka haritaları örneği. Bileşikler ve kontrol için renk kodları belirtilmiştir. Test edilen bileşiklerin konsantrasyonları (kuyucukların içindeki sayılar) μM cinsinden verilir . Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
2. Bir doku vekilinde fotoanahtarlama etkinliğinin belirlenmesi
- Örnek ışınlama için optik treni Şekil 3'te gösterildiği gibi monte edin (lazer ışık kaynağından bir optik kablo, değişken odak uzaklığına sahip bir lens, şeffaf olmayan kapaklı bir şırınga ve düz bir kesim ucundan oluşur).
- Odak uzaklığını ve lensin diyafram açıklığını değiştirerek, kullanılan şırınganın iç çapından 1-1,5 mm daha büyük bir çapa sahip, ancak yine de mümkün olduğunca diyafram açıklığı içinde olan düz bir ışık demeti elde edin.
- Kesilmiş ucu ve iç çapı 12,4 mm olan ve şeffaf olmayan plastik bir kapakla kaplanmış 5 mL'lik bir şırınga kullanın. 200 mW'lık bir lazer güç çıkışında, optik sistemin çıkışındaki güç yoğunluğunu bir fotometre ile ölçüldüğü gibi ~ 103 mW /cm2 olarak ayarlayın.
NOT: Sonraki tüm işlemler, mümkün olan en az işyeri aydınlatması ile karanlık bir odada yapılmalıdır. - PBS'de 1 mg/mL konsantrasyonda 3 mL LMB002 ("halka kapalı" form) stok çözeltisi hazırlayın.
- Plastik bir kapta LMB002'nin inaktif fotoformu ile yüklenmiş bir model doku örneği hazırlayın. Tipik bir çalışmada, 5 g taze kıyılmış domuz eti, numunedeki 50 mg / kg'lık nihai konsantrasyona ve ~ 9/1 (v / v) doku / PBS oranına ulaşmak için 277 μL LMB002 stok çözeltisi ve 260 μL PBS ile mekanik olarak karıştırılır.
- Şırıngayı hazırlanan numune ile doldurun, içeride hava kabarcığı olmadığından emin olun ve pozlama (kesim) ucunda düz bir yüzey oluşturun.
NOT: Şırıngadaki numunenin silindiri eksen boyunca ~ 40 mm işgal etmelidir. - Numuneyi optik trende Şekil 3'te gösterildiği gibi ~60 J/cm2 pozlamaya karşılık gelen 9 dakika 44 sn boyunca ışınlayın.
- Maruz kaldıktan sonra numunenin 4 mm kalınlığında dilimlerini, pistonu kullanarak şırıngadan iterek ve bir neşterle keserek hazırlayın. Dilimleri tartın ve ayrı test tüplerine yerleştirin ve ışınlanmış yüzeyden ortalama mesafeye (mm) göre işaretleyin.
- Test tüplerinde iki kontrol numunesi (optimal miktar, 0,5-0,7 g) hazırlayın: birinde,% 10 (hacim) PBS (54 μL) ile karıştırılmış kıyılmış et ve diğerinde, adım 2.4'te elde edilen model doku örneği, tüm LMB002 "halka kapalı" moleküllerin "halka açık" forma dönüştürülmesini sağlamak için 10 dakika boyunca 500 mW lazer ışığı ile ışınlanmıştır.
- Her dilime ve kontrol numunelerine asetonitril-su karışımı (%70/%30 v/v, %0,01 trifloroasetik asit (TFA), 1,4 mL/g) ekleyin. İçeriği bir cam çubuk kullanarak iyice karıştırın.
- Oda sıcaklığında en az 10 dakika inkübe edin ve çözünmeyen malzemeyi çıkarmak ve süpernatanı toplamak için karışımları 20 dakika boyunca 5220 x g'de santrifüj veya 30 dakika boyunca 20 x g'de santrifüjü iki kez santrifüj edin.
- Süpernatantları (~ 0.7 mL) dikkatlice toplayın ve 30 dakika boyunca 16.000 x g'de tekrar santrifüj edin.
- Süpernatantları (her biri ~ 0,5 mL) toplayın ve analitik bir C18 sütunu, %3,46 B/dak doğrusal A:B gradyanı, 2,0 mL/dak akış hızı ve 100 μL enjekte edilen hacim ile ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi (RP HPLC) ile analiz edin. UV tarafından algılanan kromatogramları 570 nm'de ("halka kapalı" formun algılanması) ve 270 nm'de ("halka açık" formun algılanması) kaydedin. Her iki fotoformun (elüent A: sulu% 0.1 TFA; elüent B: % 90 asetonitril-su,% 0,1 TFA) spesifik tutma sürelerini belirlemek için ışınlanmamış (adım 2.4) ve ışınlanmış kontrol (adım 2.8) numunelerini kullanın ve yöntemi kalibre edin.
- Bilinen konsantrasyonlardaki LMB002 çözeltilerinin kromatogramlarını alarak ve analiz ederek elde edilen kalibrasyon eğrilerini kullanarak analiz edilen numunelerdeki LMB002 fotoformlarının gerçek miktarlarını belirleyin. Kalibrasyon için, 100 μL (enjekte edilen hacim) başına 0,36, 0,9 ve 3,6 μg elde etmek için stok çözeltisini (adım 2.3) asetonitril-su karışımı (% 0.01 TFA ile desteklenmiş% 70/% 30 v / v) ile seyrelterek LMB002 "halka kapalı" çözeltileri hazırlayın; Elüent gradyanı ve akış hızı, adım 2.12'deki ile aynıdır.
- Deneyi (adım 2.4-2.12) üç kez tekrarlayın ve grafikteki her fotoformun normalleştirilmiş yüzdesini (yüzde) mesafeye (ışınlanmış doku yüzeyinden) karşı çizin. İstatistikleri hesaplayın (yani, her konsantrasyon noktasındaki standart sapma).
Şekil 3: Model dokuda fotokonversiyonun etkinliğini belirlemek için deneysel düzenek. (A) Şematik ve (B) fotoğraf; 1, lazer ışık kaynağından optik kablo; 2, değişken odak uzaklığına sahip lens; ve 3, et kıyması-LMB002-fosfat tamponlu salin karışımı 4'e yerleştirilir, şeffaf olmayan bir örtüye ve kesilmiş ön uca sahip bir şırınga (kapaksız (B) 'de gösterilmiştir). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
3. İn vivo antikanser etkinlik tayini
NOT: Deneme zamanlaması ve uç noktaları Şekil 4'te gösterilmiştir. Arıtma sonrası dönemde hayvan bakım standartları 3R kurallarına uygun olmalıdır - barınak uygun kafes yoğunluğu ve kaynak kullanılabilirliğini içermelidir. Mümkün olduğunda, tünel veya hacamat gibi rahatsız edici olmayan hayvan taşıma yöntemlerine uyun.
Şekil 4: İn vivo terapötik deney için zamanlama. Deney gruplarının tanımı, tedavi detayları, sonlanım noktaları ve postmortem analiz programları. Kısaltmalar: LLC = Lewis akciğer karsinomu; IV = intravenöz; SC = deri altı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
- Subkutan aşılama için kanser hücrelerinin hazırlanması (gün 0).
- LLC hücrelerini DMEM'de (4.5 g / L glikoz) % 10 FBS, 100 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin ile 37 ° C'de ve% 5 CO2'de geçirin.
- Hücreleri% 0.05 tripsin-EDTA çözeltisi, santrifüj kullanarak toplayın ve serumsuz DMEM'de askıya alın.
- Hücreleri sayın ve bir hemositometre ve tripan mavisi dışlama testi kullanarak canlılıklarını belirleyin.
- DMEM ve Matrigel karışımında (1:1) konsantrasyon 10 ×10 6 hücre/mL konsantrasyonda son hücre süspansiyonunu hazırlayın. Enjeksiyondan önce süspansiyonu buz üzerinde tutun.
- LLC hücre aşılaması (gün 0)
- Yetişkin dişi C57BL/6NCrl fareyi (~20 g ağırlığında) izofluran anestezi makinesinin indüksiyon odasına yerleştirin. İzoflurane% 5'inde sedasyon yapın ve hayvan tamamen bilinçsiz olana kadar bekleyin.
- Tıraş ederek kürkü hücre aşılama alanından çıkarın.
- 5 × 105 LLC hücrelerini ~ 100 μL DMEM'de aşılayın: Matrigel (1: 1) karışımı sağ arka bacağa.
NOT: Mümkün olduğunda, tek iğne kullanımı uygulamasına uyun.
- Bileşik uygulaması ve fotoışınlama
NOT: Aşılamadan sonraki 5-8 gün içinde, tümörleri palpe edilebilir olduğunda ve ~ 50-100mm3 hacme ulaştığında hayvanlar tedaviye hazırdır. LMB002 ve bu bileşik tarafından işlenen fareler ile yarı karanlık koşullar altında (işyerinden en az 5 m uzaklıkta bir adet 4 W LED lamba) sonraki tüm işlemleri gerçekleştirin.- Koyu mavi homojen çözeltiler elde etmek için LMB002'yi ("halka kapalı" form) steril fizyolojik salin içinde 5 mg/kg (IV) dozunda 1 mg/mL konsantrasyonda çözün.
- Işınlamadan önce, sekiz hayvandan oluşan dört grubu rastgele bir araya getirin ve tıraş ederek kürkü tümörden ve yakındaki bölgelerden çıkarın.
- IV enjeksiyonları için tutucuya bir fare yerleştirin ve kuyruk damarını görünür kılmak için hayvanın kuyruğunu 37 ° C'de bir su banyosunda önceden ısıtın.
NOT: Preoperatif analjezi düşünün. - Bileşiği kuyruk damarına 5 mL / kg'da enjekte edin. İki kontrol grubu için, hayvan başına 100 μL salin (intravenöz olarak) enjekte edin (20 g vücut ağırlığı). İki deney grubundaki hayvanların test edilen bileşiği inaktif fotoformda (salin içinde 1 mg / mL) aldıklarından emin olun.
NOT: Mümkün olduğunda, tek iğne kullanımı uygulamasına uyun. - Daha sonra, bileşiğin enjeksiyonundan 2 saat 45 dakika sonra, fareyi anestezi altına alın. Oksijende% 3-4 izofluran ile sedasyonu indükleyin. Oksijende% 0.5 -% 1 izofluran ile 15 dakika boyunca anestezi uygulayın.
- Fareyi, yalnızca tümör bölgesini ışığa maruz bırakan bir deliğe sahip siyah bir maske ile örtün.
- Lazer diyot modülünü 650 nm lazerle açın ve kırmızı lazerin gücünü 200 mW'a ve mavi / UV kılavuz lazerini 2 mW'a ayarlayın.
NOT: Lazer cihazı açıkken mavi koruyucu gözlük kullanın. - Kırmızı lazerden gelen ışık akısını (farelerden uzakta) bir fotometre ile ölçün ve ışık akısının 100 mW /cm2 olduğu optik kablodan olan mesafeyi belirleyin. Işık kaynağının tümörden belirlenen mesafede olduğundan ve ışığın tüm tümör alanını kapladığından emin olmak için kabloyu bir standa sabitleyin. Bu işlem sırasında mavi / UV kılavuz lazer ışığı kullanın.
- Tümör bölgesini 20 dakika boyunca ışınlamak için kırmızı lazeri açın.
- Işınlamadan sonra, izofluran akışını kapatın, hayvanı kafesine geri döndürün ve önümüzdeki 30 dakika boyunca durumunu dikkatlice gözlemleyin.
NOT: Bileşik uygulamadan sonra, fareleri 2 gün boyunca karanlıkta tutun. Sadece ışık-gün döngüsü değiştirilmelidir; Diğer tüm barınma koşulları değişmeden kalmalıdır.
- Tedavi sonrası gözlemler
- Hayvanları günlük olarak gözlemleyin ve tümörlerinin ağırlığını ve boyutlarını ölçün. Tümör hacmini ölçün ve nekrozun ilerlemesini not edin.
NOT: Arıtma sonrası dönemde hayvan bakım standartları 3R kurallarına uygun olmalıdır - barınak uygun kafes yoğunluğunu ve kaynak kullanılabilirliğini içermelidir. - Mortaliteyi değerlendirmek için önceki adımda toplanan verileri kullanın. Standart prosedürü kullanarak hayatta kalma oranını belirleyin.
NOT: Ciddi klinik bulgular ortaya çıkarken (vücut ağırlığı kaybı% 15'ten fazla vücut ağırlığı kaybı, tümör ülserasyonu 7 gün içinde iyileşmez ve seslendirme) veya tümör hacmi 2.500mm3'e ulaşır ulaşmaz hayvanlar kurban edilmeli ve ölü sayılmalıdır.
- Hayvanları günlük olarak gözlemleyin ve tümörlerinin ağırlığını ve boyutlarını ölçün. Tümör hacmini ölçün ve nekrozun ilerlemesini not edin.
Representative Results
Bu çalışmada, farklı inkübasyon zamanlarında LMB002'nin "halka kapalı" ve "halka açık" formları için IC50'yi belirlemek için 2D ve 3D hücre deneyleri yapılmıştır (bkz. Şekil 1). Bu değerler, prototip peptid, gramicidin S (pozitif kontrol olarak kullanılan) için elde edilenlerle karşılaştırıldı. Boyama işleminden sonra 2D olarak yetiştirilen LLC kültüründeki inkübasyonun tipik bir görüntü seti Şekil 5'te gösterilmiştir. Hoechst 33342 (mavi) ve propidium iyodür (kırmızı) ile birlikte boyanması, "halka kapalı" ile karşılaştırıldığında "halka açık" formla tedavi edilmesi durumunda hücrelerin daha büyük bir fraksiyonunda farklı mor tonlarıyla sonuçlanır, iki form arasında kolayca ölçülebilen sitotoksisitede gözle görülür bir fark olduğunu gösterir. Başarılı bir deneyin kanıtlanmış örneği, Şekil 2'de gösterildiği gibi, değişen konsantrasyonlardaki peptid varyantlarının eklendiği 96 delikli plaka formatı kullanılarak toplanan verilere dayanmaktadır. Benzer veriler 384 kuyucuklu ve yüksek yoğunluklu plakalarla da elde edilebilir. Bununla birlikte, kuyu başına hacimler azaldığından, teknik ve sistematik hatalar ve sonuç olarak, IC50 tayininin doğruluğu, kuyu yoğunluğunun arttırılmasıyla azalacaktır.
Şekil 5: Tek katmanlı yetiştirilen LLC'deki sitotoksisite analizinden temsili görüntüler. Hücreler Hoechst 33342 (mavi) ve propidium iyodür (kırmızı) ile boyandı. Gösterilen süreler: 10 dakika, 60 dakika, 24 saat ve 72 saat, bileşiklerle inkübasyon süreleridir. Ölçek çubukları = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
LMB002'nin bir model dokuda (taze domuz kıyması) lazer ışık ışınlaması ile fotodönüşümü, PBS'de çözünmüş LMB002 "halka kapalı" (inaktif) formla karıştırılmış kıyılmış etten oluşan bir numune kullanılarak ve bu inaktif formun radyasyon yayılımı yönünde LMB002 "halka açık" (aktif) formuna dönüşümünün ölçülmesi kullanılarak belirlendi. Numune bir şırıngaya yerleştirildi ve Şekil 3'te gösterildiği gibi ~ 10 dakikalık maruz kalma süresi için (genellikle in vivo deneylerde kullanılır) düz bir lazer radyasyonu ışını ile bir taraftan ışınlandı. Maruz kaldıktan sonra, numune silindiri şırınga pistonuna basılarak ve aynı yükseklikteki dilimler bir neşterle kesilerek parçalara ayrıldı. Dilimlerden elde edilen ekstraktlardaki LMB002 "halka açık" konsantrasyonu RP HPLC kullanılarak belirlendi.
Şekil 6, veri analizinden elde edilen doz-etki eğrilerini göstermektedir Şekil 6A-D. Hoechst 33342 ve PI boyalarının nükleer birlikte boyanması ile ölü hücrelerin yüzdesini tanımlamak için, tüm hücre sayımlarını birkaç kategoriye ayırmak için seçilen ölçülen parametrelerde sayısal eşikleri ayarlayan yerleşik bir sınıflandırıcı araç kullandık. Örneğin, kontroldeki kırmızı kanal (propidium iyodür) sinyali eşikte olduğunda (yaklaşık 110-130 birim), hücreler PI-pozitif, ölü olarak kabul edilebilir veya bileşiklerden etkilenmemiş olarak kabul edilen PI-negatif olarak sınıflandırılabilir. LMB002 için, propidyum iyodür-pozitif hücrelerin yüzdesinin bileşik konsantrasyonu üzerindeki sigmoidal bağımlılıkları görülebilir. Bu verilerden IC50 değerleri belirlenebilir.
Şekil 6: 2D kültürde sitotoksisite analizi. LLC kültüründe elde edildiği gibi sigmoid, (A) 10 dakika, (B) 60 dakika, (C) 24 saat ve (D) bileşiklerle inkübasyon için alınan 72 saatlik zaman aralıkları için uygundur. Montaj, IC50 değerlerinin doğru bir şekilde belirlenmesini sağlar (gösterilmemiştir). Hata çubukları SEM'dir. Kısaltmalar: LLC = Lewis akciğer karsinomu; PI = propidium iyodür. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Elde edilen IC50 değerleri göz önüne alındığında, her üç bileşiğin toksisitesinin de inkübasyon süresi ile arttığı sonucuna varabiliriz. Deneyimiz, LMB002'nin "halka açık" formunun, prototip peptit, gramicidin S.'den yaklaşık bir seyreltme adımı daha az toksik olduğunu ortaya koydu. İki seyreltme adımı arasındaki fark, inkübasyon süresindeki artıştan etkilenmez ve potansiyel bir kütüphane taramasındaki diğer bileşiklerle karşılaştırmak için deneysel olarak belirlenmiş bir fototerapötik pencere6 olarak sayısal olarak kullanılabilir. Gramicidin S için IC50 değeri, biyolojik replikalardaki deneysel hataları veya diferansiyel çıktıları düzeltmek için referans noktası olarak ayarlandı.
3D hücre deneyleri aynı tür ham verileri üretti - tek hücre çözümlü, kuyu başına bir tane küresel görüntüler. Kalseinin üçüncü bir boyama boyası olarak dahil edilmesi, metabolik olarak aktif hücrelerin fraksiyonunun (yeşil kanalda gözlenen) nicelleştirilmesini sağlar. 384 delikli plakalar kullanarak, teknik kopyaların sayısını artırarak, gereksiz birlikte inkübasyon zaman noktalarını hariç tutarak ve seyreltme kıvrımını değiştirerek, Şekil 7'deki plaka haritasında gösterildiği gibi tek bir test çalışmasında (tek plaka kullanarak) birkaç bileşiği doğrudan karşılaştırabildik.
Şekil 7: İki bileşikle yapılan 3D kültür deneyi için plaka haritası. Bileşikler ve kontrol için renk kodları belirtilmiştir. Kuyulardaki sayılar μM cinsinden konsantrasyonlardır. 10 dakika, 24 saat ve 72 saat kuluçka süreleridir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8, test edilmiş bileşiklerin varlığında 1 sferoid / kuyu yoğunluğunda yetiştirilen LLC sferoidlerinin seçilen teknik kopyalarının görüntülerini ve boyama işleminden sonra yakalanan kontrol sferoidlerini göstermektedir.
Şekil 8: 3D kültür sitotoksisite analizinden temsili görüntüler. Görüntüler, hem LMB002 fotoformları hem de gramicidin S. Scale çubukları = 100 μm ile 10 dakika, 24 saat ve 72 saat birlikte inkübasyondan sonra Hoechst 33342 (mavi), kalsein (yeşil) ve propidium iyodür (kırmızı) ile boyanmış 48 saatlik LLC sferoidlerini göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Cihaz yazılımı kullanılarak, 2D deneydekiler gibi doz-etki eğrileri, z-istiflenmiş görüntü yığınlarından elde edildi (Şekil 9A). Ek olarak, 3D kültürlerdeki kompakt ve deforme olmamış sferoidler, tüm sferoid çapı ile karakterize edilebilir (Şekil 9B). Ayrıca, genel sferoid çapının bileşik konsantrasyonuna göre değiştiği de belirtildi.
Şekil 9: 3D kültürlerle sitotoksisite değerlendirmesi. (A) Konsantrasyona bağlı sitotoksisite uyum eğrileri ve (B) LLC'nin 3D kültürlerinde elde edilen konsantrasyona bağlı sferoidin çap grafikleri, gramisidin S ile 10 dakika, 24 saat ve 72 saat boyunca birlikte inkübe edilir ve boyamadan önce yakalanır. Hata çubukları SEM'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Adım 2 için yapılan deney, UV ile algılanan yüksek performanslı sıvı kromatografisi kullanılarak her iki fotoformdaki LMB002 konsantrasyonlarının belirlenmesine izin verir. Model dokularda fotokonversiyonun etkinliği bu kurulum kullanılarak kolayca değerlendirilmiş ve ölçülmüştür (Şekil 3). Veriler, numune ekstraktlarının kromatogramlarının kantitatif analizinden elde edilmiştir. Bu test deneylerinde, LMB002 kromatogramları spektroskopik olarak 270 nm ve 570 nm'de tespit edildi. 270 nm'de, birçok ek sinyal gözlendi ve model dokudan birlikte ekstrakte edilen bileşiklere atfedildi (bileşik olmadan kontrol ekstraktından doğrulandı). Her iki fotoform da tutma süreleri ve absorbans açısından yeterince farklıydı. Bununla birlikte, LMB002 "halka açık" sinyali, bu arka plan sinyallerinden taban çizgisiyle ayrılmıştır ( Şekil 10A'daki temsili bir kromatograma bakınız). Bu nedenle, bu sinyal sorunsuz bir şekilde entegre edilebilir. 570 nm'de, kromatogramlar sadece LMB002 "halka kapalı" form sinyalini içeriyordu (Şekil 10B). Burada RP HPLC kullanarak konsantrasyon tayini gerçekleştirdik. Bununla birlikte, analitik yöntem olarak LC / MS kullanılarak daha yüksek doğruluk ve daha düşük tespit limitleri elde edilebilir.
Şekil 10: Model dokulardan çıkarılan LMB002'nin temsili kromatogramları. (A) Işınlanmış yüzeyden 2 mm'de numune, 270 nm'de kaydedilmiştir (LMB002 "halka açık" form entegre edilmiştir); (B) ışınlanmış yüzeyden 38 mm'de numune, 570 nm'de kaydedilir (LMB002 "halka kapalı" pik entegre edilmiştir). Tutma süresi değerleri (belirtilen) ayrıca bileşiğin kimliğini doğruladı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Toplanan tüm numunelerin karşılık gelen sinyallerini entegre ettikten sonra elde edilen veriler, Şekil 11'de gösterildiği gibi konsantrasyon-derinlik grafiklerini oluşturmak için kullanılmıştır. Bu grafiklere dayanarak, model dokunun farklı derinliklerinde fotokonversiyonun etkinliği kolayca değerlendirildi. Kırmızı ışık kaynağımızın, doku vekili, kıyılmış ette (yaklaşık 103 mW / cm2'de) 1 c'ye kadar derinlikte "halka kapalı" LMB002 fotokonversiyonunu indüklediğini doğrular.
Şekil 11: Fotodönüşüm verimliliği değerlendirmesi. LMB002 "halka kapalı" (aktif olmayan, mavi noktalar) ve "halka açık" formların (aktif, turuncu noktalar) model dokunun ışınlanmış yüzeyinden (L, mm) farklı mesafelerde konsantrasyonu (A, mg / kg). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
İn vivo deneyin sonuçları - Şekil 4'te sunulan programa göre gerçekleştirilen metodolojimizin 3. Adımı - tümör büyümesini zamanın bir fonksiyonu olarak gösteren grafiklerle (Şekil 12) ve Kaplan-Meier sağkalım eğrileriyle (Şekil 13) temsil edilmiştir.
Şekil 12: Hayvanlarda tümör büyüme dinamikleri. Araçla tedavi edilen hayvanlarla karşılaştırıldığında LMB002 ile tedavi edilen hayvanlar (C57BL / 6NCrl farelerde deri altı LLC allogreft modeli, bileşik doz 7 mg / kg, IV, 2 saat 40 dakika inkübasyon, daha sonra 650 nm'de ışınlama, 100 mW /cm2, 20 dakika). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 13: Hayvanlar için ölüm eğrileri. Araçla tedavi edilen hayvanlarla karşılaştırıldığında LMB002 ile tedavi edilen hayvanlar (C57BL / 6NCrl farelerde deri altı LLC allogreft modeli, bileşik doz 7 mg / kg, IV, 2 saat 40 dakika inkübasyon, daha sonra 650 nm'de ışınlama, 100 mW /cm2, 20 dakika). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Fotokontrollü bileşikler ilaç geliştirmede benzeri görülmemiştir; ancak preklinik ve klinik değerlendirmeleri için herhangi bir yöntem oluşturulmamıştır. En yakın monoterapi analoğu olan fotodinamik tedavi (PDT), kansere karşı birçok ülke tarafından benimsenen klinik kullanıma yönelik tedavi modalitesidir ve diğer endikasyonlar için de geliştirilmektedir19,20. Fotofarmakolojiye benzer şekilde, PDT ayrıca biyoaktif maddeyi (singlet oksijen) aktive etmek için ışığın kullanımına dayanır. Bu nedenle PDT'de preklinik ve klinik çalışmalarda kullanılan bazı deneysel yöntemler fotofarmakoloji için de benimsenebilir. Örneğin, ışık kaynakları, ışık dağıtım yaklaşımları ve tıbbi cihazlar PDT için iyi geliştirilmiş ve onaylanmıştır; fotokontrollü ilaçların değerlendirilmesinde doğrudan kullanılabilirler. Bununla birlikte, PDT ve fotofarmakolojinin birbirinden birçok farkı vardır4, bu da ikincisi için spesifik yöntemler oluşturma ihtiyacını haklı çıkarır.
İlk olarak, PDT'deki (oksijen) aktive edilmemiş madde her zaman canlı dokularda toksik olmayan konsantrasyonlarda bulunur. Buna karşılık, aktive edilmemiş fotokontrollü biyolojik olarak aktif bileşikler artık aktiviteye ve istenmeyen toksisiteye sahip olabilir. Bu nedenle, ideal fotofarmakoloji ilaçları, uygulanan formlarında biyolojik aktiviteyi en aza indirmiş olmalı ve ışık kaynaklı formlarında oldukça aktif olmalı, "fototerapötik pencere"21 mümkün olduğunca büyük olmalıdır. İsabeti bulmak ve isabetten kurşuna optimizasyonu gerçekleştirmek, uygun bileşiklerin tanımlanmasını ve ilaç geliştirmenin erken aşamalarında olan nispeten büyük kütüphanelerin taranmasını gerektirir. Burada, verimli fotoanahtarlama bileşiklerini tanımlamak için otomatik bir yüksek verimli konfokal floresan mikroskopi önerdik.
Seçilen sitotoksisite değerlendirme yöntemi, en kritik gereksinimin kolayca uygulanmasını sağlar - PSS'nin korunması veya görünür ışığa duyarlı fotoizomerin stabilitesi. Bunun nedeni, uygulandığında ışığa maruz kalmanın en aza indirilmesidir. Bu nedenle alternatif yöntemler seçiliyorsa otomatik yöntemler tercih edilmelidir. Bu yaklaşım güvenilir ve bilgilendiricidir. Bu aşamada 3D hücre kültürlerinin (sferoidler) kullanılması, hücrenin tedaviye verdiği yanıtın daha gerçekçi doku benzeri bir mikro ortamda bütünsel bir şekilde anlaşılmasını sağlar. Ek olarak, bileşiklerin etki mekanizması hakkında değerli bilgiler, doğrudan yöntem olarak mikroskopi kullanılarak elde edilebilir. Uygun boyama protokolüne sahip konfokal floresan mikroskopi, hücrelerin ve sferoidlerin morfolojisinin görsel olarak değerlendirilmesine izin verir; Hücre ölümü ve hücre içindeki değişikliklerle ilgili önemli detaylar da tespit edilebilir.
İkincisi, ışık uygulaması dikkatli bir ışık dozu seçimi gerektirir. PDT'de, hafif doz aşımı dokulara son derece zararlıdır22. Fotofarmakolojik tedavi aşırı ışık ışınlaması altında avantajlı olabilir. Aktif maddenin üst sınırı, aktif olmayan maddenin uygulanan dozu ve farmakokinetiği ile tanımlanır. Bununla birlikte, ışık dozu fotofarmakolojide hala bir sorundur. Işınlama gücü yoğunluğunun ve maruz kalma süresinin tedavinin gerekliliğinden daha az olmamasına dikkat edilmelidir. Prensip olarak, aktif maddenin üretimi in vivo olarak izlenebilir. Bununla birlikte, biyoetik nedenlerden dolayı, aktif olmayan bileşik15 ile karıştırılmış bir model doku (taze kıyılmış et) ile bir deney önerdik. Bu deney basittir ve farklı ışık kaynaklarını kullanmak için değiştirilebilir. Ayrıca ışık dozajının fotofiziksel tahmini ve termal etkilerin ölçümü için uyarlanabilir. Burada yine, model dokuları kullanarak, ışığa maruz kalmanın, örneğin, in vivo koşullarda daha doğru fotoanahtarlama verimliliği belirlemesiyle karşılaştırıldığında, her zaman göz önünde bulundurulması ilginç olabilecek bir alternatifle karşılaştırıldığında, ışığa maruz kalmayı en aza indirmek mümkündür.
Son olarak, in vitro toksisite taramalarında üstün özellikler gösteren ve model dokuda en az 1-1,5 cm derinliğinde verimli bir şekilde fotoanahtarlama yapan bileşikler, maliyetli, zahmetli ve uzun in vivo çalışmalar için seçilebilir. Bu protokolde, allogreft kanseri modelini oluşturmak için in vitro değerlendirmede olduğu gibi aynı hücre hattını (LLC) kullandık. Tümör büyüme dinamikleri, mortalite ve metastaz sayısı antikanser etkinliğini değerlendirmek için en uygun parametrelerdir. Geleneksel kemoterapi ile karşılaştırıldığında, fotofarmakolojik tedavide ek bir faktör uygulanır - ışık. Bu nedenle, iki kontrol hayvan grubuna ihtiyaç vardır: biri sadece aracı alan ve diğeri aracı ve ışınlamayı alan. Bu kurulum, ışığın ölçülen parametreler üzerindeki etkisinin değerlendirilmesini sağlar. Deneyimizde, iki deney grubunun hayvanları aktive edilmemiş bileşiği aldı ve bir gruptaki farelerin tümörleri ışınlandı. Işınlama rejimi kontrol ve tedavi grupları için aynıydı. Bu aşamada kıyaslama kemoterapisi ile karşılaştırmaya gerek yoktur, çünkü deneyin temel amacı ışık ve bileşik uygulamasının birleşik etkisini göstermektir. Bu etkiyi sergileyen en iyi performans gösteren bileşikler daha sonra in vivo toksisiteleri hakkında daha fazla çalışma için seçilebilir ve gelişimleri hakkında önemli go-no-go kararları vermek için kriterlerle karşılaştırılabilir. Teknik olarak, tanımladığımız in vivo deney, örneğin ilaç lideri olarak zaten seçilmiş bir bileşiğin farmakokinetik veya farmakodinamik çalışmalarına kolayca uyarlanabilir.
Disclosures
IVK, OB, SA ve ASU, verilen patent ailesindeki mucitlerdir: Lumobiotics GmbH'ye lisanslı "Fotokontrollü biyolojik aktiviteye sahip peptidomimetik ürünler" (WO2014127919 [A1], EP2958934 [B1], US9481712 [B2], UA113685 [C2]) IVK, OB, TS ve SA, Lumobiotics GmbH'nin kurucuları ve hissedarlarıdır. IVK bilimsel bir danışmandır, HK, TM, IP ve PB Enamine LLC'nin çalışanlarıdır. Yazarların, açıklananlar dışında, yayında tartışılan konu veya materyallerle finansal çıkarı veya finansal çatışması olan herhangi bir kurum veya kuruluşla başka hiçbir ilgili bağlantısı veya finansal ilişkisi yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, PELICO (#690973) ve ALISE (#101007256) projeleri aracılığıyla H2020-MSCA-RISE programı tarafından AB finansmanını kabul etmektedir. Bu çalışma DFG-GRK 2039 (SA, TS ve ASU), Helmholtz Derneği'nin NACIP programı (SA ve ASU) ve BMBF'nin VIP + (OB ve ASU) tarafından desteklenmiştir. Karlsruhe Teknoloji Enstitüsü'nden Dr. Serhii Koniev'e, LMB002 bileşiğini sentezleyen, saflaştıran ve çalışma için bileşiği nazikçe sağlayan Dr. Serhii Koniev'e teşekkür ederiz. Yazarlar ayrıca, videoyu Ukrayna'da filme alan ve derleyen Chupryna Maksym'e ve bu yayını mümkün kılan deneysel çalışmayı, yazmayı ve filme almayı mümkün kılan Ukrayna'nın tüm cesur savunucularına minnettardır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent 1100 Series capillary LC system | ALSI-Chrom (Agilent distributor) | - | |
| ATCC CRL-1642, LL/2 (LLC1) Lewis lung carcinoma cell line | ECACC | 90020104 | |
| C57BL/6NCrl mice, female, inbred | Charles River | Strain code: 027 | |
| CelCulture, CO2 incubator | Esco Micro | CCL-170B | |
| Corning Matrigel Basement membrane matrix | Merck | CLS354234 | |
| Corning, 384- well spheroid microplates | Merck | CLS3830 | |
| Fetal bovine serum | Merck | F7524 | |
| Gibco, DPBS | Thermo Fisher Scientific | 21600044 | |
| Gramicidin S | Lumobiotics | Custom synthesis | |
| HyClone, DMEM/high glucose | Cytiva | SH30003.04 | |
| IN Cell Analyzer 6500HS, imaging system | Cytiva | 29240358 | |
| Invitrogen, Calcein AM | Thermo Fisher Scientific | C1430 | |
| Isoflurane anesthesia machine | ASA | S/N ASA 1305 | |
| L-glutamine, 200 mM solution | Merck | G7513 | |
| LIKA-surgeon, diode surgery laser | Fotonika plus | - | |
| LMB002 | Lumobiotics | Custom synthesis | |
| Penicillin–Streptomycin, solution stabilized | Merck | P4333 | |
| PhenoPlate, 96-well plates | PerkinElmer | 6055302 | |
| Photometer PCE-LED 20 | PCE Instruments | PCE-LED 20 | |
| Thermo Scientific, Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Thermo Scientific, Propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | J66764-MC | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Merck | T8154 | |
| Trypsin–EDTA, 10 x solution | Merck | T4174 | |
| UltraCruz Cell culture flasks with vented caps, 75 cm2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-200263 | |
| UltraCruz, bottle top filters, PES, 0.22 μm | Santa Cruz Biotechnology | sc-360882 | |
| Vydac 218TP, C18 HPLC column (4.6 mm × 250 mm, 5 µm) | Altmann Analytik (Avantor distributor) | GR5103827 |
References
- Fuchter, M. J. On the promise of photopharmacology using photoswitches: a medicinal chemist's perspective. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (20), 11436-11447 (2020).
- Volarić, J., Szymanski, W., Simeth, N. A., Feringa, B. L.
- Paoletti, P., Ellis-Davies, G. C. R., Mourot, A. Optical control of neuronal ion channels and receptors. Nature Reviews Neuroscience. 20, 514-532 (2019).
- Hüll, K., Morstein, J., Trauner, D.
- Ma, X., et al. In vivo photopharmacology with a caged mu opioid receptor agonist drives rapid changes in behavior. Nature Methods. 20, 682-685 (2023).
- Sarabando, S. N., Palmeira, A., Sousa, M. E., Faustino, M. A. F., Monteiro, C. J. P. Photomodulation Approaches to Overcome Antimicrobial Resistance. Pharmaceuticals. 16 (5), 682 (2023).
- Kolarski, D., Szymanski, W., Feringa, B. L. Chronophotopharmacology: Methodology for high spatiotemporal control over the circadian rhythm with light. Neuromethods. Hirota, T., Hatori, M., Panda, S. 186, Humana, New York, NY. (2022).
- Babii, O., et al. Peptide drugs for photopharmacology: how much of a safety advantage can be gained by photocontrol. Future Drug Discovery. 2 (1), FDD28 (2020).
- Davis, A. M., Keeling, D. J., Steele, J., Tomkinson, N. P., Tinker, A. C.
- Balani, S. K., Miwa, G. T., Gan, L., Wu, J., Lee, F. W. Strategy of utilizing in vitro and in vivo adme tools for lead optimization and drug candidate selection. Current Topics in Medicinal Chemistry. 5 (11), 1033-1038 (2005).
- Kleijn, A., et al. A Systematic comparison identifies an ATP-based viability assay as most suitable read-out for drug screening in glioma stem-like cells. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Rodrigues, J., Heinrich, M. A., Teixeira, L. M., Prakash, J. 3D in vitro model revolution: unveiling tumor-stroma interactions. Trends in Cancer. 7 (3), 249-264 (2021).
- Sittinger, M., et al. Tissue engineering and autologous transplant formation: practical approaches with resorbable biomaterials and new cell culture techniques. Biomaterials. 17 (3), 237-242 (1996).
- Matai, I., Kaur, G., Seyedsalehi, A., McClinton, A., Laurencin, C. T. Progress in 3D bioprinting technology for tissue/organ regenerative engineering. Biomaterials. 226, 119536 (2020).
- Babii, O., et al. Direct photocontrol of peptidomimetics: an alternative to oxygen-dependent photodynamic cancer therapy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (18), 5493-5496 (2016).
- De Ridder, K., et al. Novel 3D lung tumor spheroids for oncoimmunological assays. Advanced NanoBiomed Research. 2 (4), 2100124 (2022).
- Pauli, C., et al. Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Van Straten, D., Mashayekhi, V., De Bruijn, H. S., Oliveira, S., Robinson, D. J. Oncologic photodynamic therapy: basic principles, current clinical status and future directions. Cancers. 9 (2), 19 (2017).
- Li, X., Kwon, N., Guo, T., Liu, Z., Yoon, J. Innovative strategies for hypoxic-tumor photodynamic therapy. Angewandte Chemie International Edition. 57 (36), 11522-11531 (2018).
- Hull, K., Morstein, J., Trauner, D.
- Babii, O., et al. Structure-activity relationships of photoswitchable diarylethene-based β-hairpin peptides as membranolytic antimicrobial and anticancer agents. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (23), 10793-10813 (2018).
- Heckl, C., Aumiller, M., Rühm, A., Sroka, R., Stepp, H. Fluorescence and treatment light monitoring for interstitial photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 96 (2), 388-396 (2020).
