Summary
Ce protocole présente un ensemble d’expériences adoptées pour l’évaluation de peptides anticancéreux photocommutables, qui peuvent être utilisés dans le criblage préclinique de tels composés. Cela comprend l’évaluation de la cytotoxicité dans des cultures cellulaires 2D et 3D, l’évaluation de l’efficacité de la photoisomérisation ex vivo (tissu modèle) et l’efficacité in vivo .
Abstract
Les composés photocontrôlés biologiquement actifs sont une classe émergente de candidats médicaments « intelligents ». Ils offrent une sécurité supplémentaire dans la chimiothérapie systémique en raison de leur activation spatio-temporelle précise en dirigeant une lumière bénigne et non ionisable vers un endroit spécifique du corps du patient. Cet article présente un ensemble de méthodes pour évaluer la puissance in vitro et l’efficacité ex vivo de la photoactivation de composés biologiquement actifs photocontrôlés ainsi que l’efficacité in vivo aux premiers stades du développement de médicaments. La méthodologie est appliquée aux peptides cytotoxiques anticancéreux, à savoir les analogues contenant du diaryléthane d’un antibiotique connu, la gramicidine S. Les expériences sont réalisées en utilisant des cultures cellulaires 2D (cellules adhérentes) et 3D (sphéroïdes) d’une lignée cellulaire cancéreuse (carcinome pulmonaire de Lewis, LLC), de substituts de tissus vivants (hachis de viande de porc) et d’un modèle de cancer allogreffé (LLC sous-cutané) chez des souris immunocompétentes. La sélection des composés les plus efficaces et l’estimation de fenêtres photothérapeutiques réalistes sont effectuées par microscopie à fluorescence automatisée. L’efficacité de la photoactivation à différents régimes d’éclairage est déterminée à différentes profondeurs dans un tissu modèle, et le dosage optimal de la lumière est appliqué dans l’expérience thérapeutique finale in vivo .
Introduction
Les composés biologiquement actifs photocontrôlés sont apparus au cours des dernières décennies comme un composant prometteur des chimiothérapies sûres pour les maladies humaines et pour éradiquer spécifiquement les tumeurs solides malignes1. Ces composés contiennent des fragments photoisomérisables réversibles (photocommutateurs moléculaires) et peuvent basculer entre les photoisomères inactifs et actifs lors de l’irradiation avec une lumière de différentes longueurs d’onde.
Par rapport à leurs analogues non photocontrôlables, les médicaments photocontrôlés peuvent être plus sûrs car ils peuvent être introduits par voie systémique dans le corps du patient sous des formes moins actives et essentiellement non toxiques, et ne sont ensuite activés par la lumière que lorsque cela est nécessaire, comme dans les tumeurs, les ulcères et les plaies. Bien que de multiples démonstrations passionnantes de tels prototypes de médicaments moléculaires puissent être trouvées dans des articles universitaires récents 2,3,4,5,6,7, le domaine de la photopharmacologie clinique - une application de combinaisons médicament/dispositif médical/maladie approuvées - n’existe pas. La photopharmacologie est encore au stade de la découverte de médicaments et les études précliniques systématiques sont inconnues.
Ce n’est que très récemment que nous avons démontré l’avantage de sécurité in vivo pour certains peptides anticancéreux photocontrôlés, à savoir les analogues du peptide antibiotique gramicidine S8. Ces dérivés photocontrôlés contiennent un photocommutateur diaryléthène (DAE), qui subit des transformations photoinduites réversibles entre les photoformes dites « ring-open » générées par la lumière rouge et les photoformes « ring-closed » générées par UV (illustrées à la figure 1 pour l’un des dérivés, le composé LMB002).
Figure 1 : Peptide cytotoxique photocontrôlé LMB002 et sa photoisomérisation. Le fragment de diaryléthène est représenté en rouge. Abréviation : DAE = diaryléthène. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
La recherche de résultats positifs et l’optimisation du hit-to-lead nécessitent souvent un criblage in vitro et in vivo de banques de composés appropriées 9,10. Nous démontrons ici une méthodologie adaptée au criblage systématique à haut débit de la cytotoxicité de composés photocontrôlés. Nous déterminons également l’efficacité de la photoisomérisation, estimons la dose lumineuse dans les tissus modèles et évaluons l’efficacité in vivo des candidats les plus performants. L’approche est conforme aux considérations de bioéthique et de soins aux animaux.
Dans ce travail, les méthodes précliniques traditionnelles sont modifiées pour éviter la photoisomérisation non contrôlée des composés testés. L’objectif global de l’application de ces méthodes modifiées ici est de développer une stratégie générale qui est simple et rapide et qui produit des données statistiquement significatives pour comparer de manière fiable les activités in vitro et rationaliser les tests d’efficacité in vivo des composés photocommutables pour l’identification et le développement ultérieur du plomb.
La stratégie comporte trois étapes consécutives. La première étape consiste à déterminer la CI 50 (viabilité cellulaire apparente à50 %) dans les dilutions en série pour les photoformes actives et inactives de composés biologiquement actifs photocontrôlés sélectionnés à l’aide de cultures cellulaires bidimensionnelles (2D, monocouche) et tridimensionnelles (3D, sphéroïdes) et de microscopie confocale automatisée à fluorescence à haut débit. Les fenêtres photothérapeutiques sont comparées par rapport à la différence IC50 entre les deux photoformes, et les candidats les plus performants sont sélectionnés. Il n’y a pas d’avantage particulier à évaluer la toxicité par microscopie automatisée et autres plateformes de dépistage de la cytotoxicité (essais)11; Des modèles tumoraux cellulaires plus complexes12 pourraient être facilement mis en œuvre à ce stade.
Pour les composés sélectionnés à l’étape 1, la deuxième étape consiste à estimer de manière réaliste leur efficacité de photocommutation à l’intérieur des tissus en fonction de la profondeur à partir de la surface du tissu irradié en quantifiant l’efficacité de photocommutation des photoformes moins actives dans un substitut tissulaire par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) détectée par UV d’extraits d’échantillons irradiés. In vivo , l’efficacité de la photocommutation pourrait être étudiée, mais nous proposons d’utiliser un substitut tissulaire simple - la viande de porc hachée. Nous avons testé la validité de cette approche. Nous avons mesuré la conversion de nos composés photocommutables in vivo sur un modèle de cancer de souris et observé approximativement la même photoconversion à une profondeur mesurée lors d’expériences précédentes avec des souris8. Tout autre tissu artificielapproprié 13, tissu/organe bioimprimé en 3D14, matériel de biopsie ou autre matériel animal exempté pourrait être utilisé. Cependant, cette configuration est un bon compromis car elle est économique, rapide et éthique.
La troisième étape est la détermination de l’efficacité anticancéreuse in vivo dans un modèle de cancer murin. Les composés présentant des caractéristiques supérieures dans les expériences in vitro et une photocommutation efficace à une profondeur d’au moins 1-1,5 cm dans les tissus modèles sont sélectionnés pour cette expérience.
Ce protocole peut être appliqué à des composés possédant différents types de photocommutateurs, à condition que leurs photoformes (ou leurs états photostationnaires, PSS) soient stables pendant un temps raisonnable (quelques jours ou plus). À titre d’illustration, un LMB002 dérivé du DAE décrit précédemment est utilisé15. Les photoformes LMB002 sont thermiquement stables et peuvent être stockées à −20 °C pendant au moins un an sans dégradation substantielle. Les cellules de carcinome pulmonaire de Lewis (LLC) sont choisies pour cette démonstration in vitro et in vivo, mais aucune restriction n’est imposée sur le type cellulaire. Les cellules LLC sont adhérentes, facilement cultivables en 3D et utilisées pour générer des tumoroïdes (comme décrit dans la référence16). In vivo Les cellules LLC sont utilisées pour modéliser les processus métastatiques et peuvent facilement générer des tumeurs solides chez des souris immunocompétentes après injection sous-cutanée. Cette méthodologie in vivo peut être universellement appliquée à d’autres modèles de cancer17,18. La mise en œuvre détaillée de cette stratégie est décrite ci-dessous.
Protocol
Les soins aux animaux et les procédures expérimentales ont été effectués conformément aux réglementations locales et internationales pour la conduite de projets de recherche impliquant des animaux de laboratoire (Loi de l’Ukraine sur la protection des animaux contre la cruauté, Convention européenne sur la protection des animaux vertébrés utilisés à des fins expérimentales ou à d’autres fins scientifiques (Convention européenne, Strasbourg, 1986), Directive 2010/63/UE sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques). Cette étude est approuvée par la Commission de Bioéthique de la société Bienta. Des souris C57BL/6NCrl (femelles adultes pesant environ 20 g chacune) ont été utilisées dans ces expériences. Les matériaux, réactifs et équipements spécifiques sont énumérés dans le tableau des matériaux.
1. Évaluation IC50 pour LMB002 (formes « fermées en anneau » et « ouvertes en anneau ») à l’aide de cultures cellulaires LLC 2D et 3D
- Préparation des tampons et des solutions mères des composés
REMARQUE : Préparez les tampons à l’aide des procédures standard. Vous pouvez également utiliser des solutions disponibles dans le commerce.- Préparer 10x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) en ajoutant 14,2 g deNa2HPO4, 2,4 g de KH2PO4, 80 g de NaCl et 2 g de KCl à 1 L d’eau distillée. Autoclave préparé 10x PBS et le diluer dans une solution 1x en ajoutant 100 ml de solution 10x à 900 mL d’eau distillée. Ensuite, conservez la solution à 4 °C.
- Préparer le PBS (DPBS) de Dulbecco en ajoutant 4,78 g de poudre de DPBS à 1 L d’eau distillée. Remuer la solution jusqu’à ce que tout le solide se dissolve, vérifier le pH à l’aide d’un pH-mètre et l’ajuster en ajoutant 1 M NaOH ou 1 M HCl (pH 7,3-7,4). Après avoir atteint le niveau de pH souhaitable, filtrer le milieu à travers un filtre à vide de 0,22 μm dans une armoire stérile. Conserver à 4 °C.
- Préparer 1 M de solution tampon d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinééthanésulfonique (HEPES) en ajoutant 238,3 g de HEPES à 1 L d’eau distillée. Ajuster le pH de la solution avec 1 M de NaOH jusqu’à pH 7,5. Filtrer à travers un filtre à vide de 0,22 μm dans une armoire stérile. Conserver à 4 °C.
- Préparer 1x solution de trypsine-EDTA (EDTA = acide éthylènediaminetétraacétique) en diluant 10x solution. Pour ce faire, ajoutez 5 mL de 10x Trypsin-EDTA à 45 mL 1x PBS solution dans un tube stérile de 50 mL. Conserver à 4 °C.
- Préparer le milieu Eagle modifié (DMEM) de base de Dulbecco en ajoutant 13,4 g de poudre de DMEM à haute teneur en glucose et 3,7 g de Na2CO3 à 1 L d’eau distillée dans une éprouvette graduée à l’aide d’une tige d’agitation magnétique placée sur une plaque d’agitation. Remuer la solution jusqu’à ce que tout le solide se dissolve, vérifier le pH à l’aide d’un pH-mètre et l’ajuster en ajoutant 1 M NaOH ou 1 M HCl (pH 7,3-7,4). Après avoir atteint le pH souhaitable, filtrer le milieu à travers un filtre à vide de 0,22 μm dans une armoire stérile et conserver à 4 °C.
- Préparer le milieu complet DMEM en ajoutant 100 mL de sérum fœtal bovin (FBS), 10 mL de solution pénicilline-streptomycine, 10 mL de solution de L-glutamine et 10 mL de tampon HEPES 1 M à 900 mL de DMEM basique. Conserver à 4 °C.
- Préparer les solutions mères pour les composés d’essai.
- Pour chaque composé, peser deux lots de 5,12 mg (p. ex. LMB002) dans la photoforme fermée à anneau dans deux tubes microcentrifugés de 1,5 mL (un avec des parois transparentes et l’autre noir non transparent). Peser 2,28 mg de témoin positif (p. ex. gramicidine S) dans un tube mural extra-transparent. Ajouter 100 μL de DMSO pur à chaque échantillon et vortex pendant 30 s.
- Photoisomériser la solution mère (LMB002) dans le tube à paroi transparente de la forme « fermée à anneau » à la forme « anneau-ouverte » en irradiant la solution avec un laser 660 nm (densité de puissance lumineuse 0,6 W / cm2) avec vortex pour assurer un mélange complet. Continuez jusqu’à ce que la couleur passe visiblement du violet foncé au brun clair. Protéger de la lumière à l’aide de papier d’aluminium.
- Expérience de culture cellulaire 2D - ensemencement des cellules (jour 1)
- Transvaser 10 mL du milieu complet DMEM du ballon T-75 avec une culture cellulaire LLC vers un tube stérile de 15 mL. Aspirer le milieu restant avec une pompe à vide.
- Lavez la culture cellulaire avec 5 ml de 1x DPBS et aspirez la solution avec une pompe à vide.
- Couvrir les cellules avec 3 mL de 1x solution trypsine-EDTA et incuber la fiole pendant 2-3 min à 37 °C dans une atmosphère de 5% de CO2 .
- Arrêter l’action de la trypsine en ajoutant 6 mL du milieu DMEM (préalablement transféré dans un tube stérile) dans le flacon de culture cellulaire contenant 1x solution trypsine-EDTA et en pipetant la suspension plusieurs fois pour laver les cellules des parois du flacon de culture cellulaire.
- Transférer la suspension dans un tube de 15 ml et centrifuger à 200 × g pendant 4 min. Après centrifugation, aspirer le surnageant avec une pompe à vide. Évitez de toucher la pastille de la cellule au fond du tube.
- Remettez les cellules en suspension en ajoutant 2 mL de milieu complet DMEM frais et en pipetant plusieurs fois.
- Compter les cellules en échantillonnant environ 15 μL de la suspension dans un tube de 0,5 mL, en ajoutant 15 μL de bleu de trypan à 0,4% et en transférant le mélange obtenu dans une chambre de comptage des cellules.
- Après le comptage, préparer 25 mL de la suspension cellulaire par point temporel. Semer 5 000 à 10 000 (8 000 en moyenne) cellules LLC/puits dans 200 μL de DMEM dans les 60 puits centraux d’une plaque de 96 puits avec fond clair et parois noires non transparentes. Remplissez les 36 puits restants avec du DMEM pur.
- Placez les plaques dans un incubateur de culture cellulaire pendant une nuit à 37 °C et 5% de CO2. Utilisez des couvercles de plaques en plastique en dessous pour éviter le chauffage inégal de la plaque inférieure.
- Expérience de culture cellulaire 2D - ajout des composés (jour 2)
- Surveillez les cellules par microscopie optique dans les plaques jusqu’à ce que les cellules aient atteint 70% à 80% de confluence.
- Aspirez le fluide des puits avec une pompe à vide dans une armoire stérile. Ajouter 100 μL du milieu DMEM frais préchauffé et placer les plaques dans un incubateur de culture cellulaire.
- Préparer les dilutions en série des composés d’essai et le témoin positif dans des plaques transparentes autoclavées en polypropylène. Effectuez les solutions suivantes pour les mesures ponctuelles individuelles :
NOTE: Commencez avec les stocks de DMSO et diluez avec du DMEM, mais ne dépassez pas 1% v/v de DMSO à la concentration finale la plus élevée.- Pour obtenir une solution 128 μM de gramicidine S, ajouter 1,3 μL de solution mère de 20 mM à 198,7 μL de DMEM.
- Pour obtenir une solution 256 μM de LMB002, forme « à anneau ouvert », ajouter 1,3 μL de solution de 40 mM à 198,7 μL de DMEM.
- Pour obtenir une solution 512 μM de LMB002, forme « fermée par anneau », ajouter 2,6 μL de solution mère de 40 mM à 197,4 μL de DMEM.
- Effectuer trois répétitions supplémentaires pour obtenir quatre séries de chaque point de concentration. Préparer une série de double dilution en aspirant 100 μL de chaque puits de départ, en transférant dans un puits avec 100 μL de DMEM et en mélangeant soigneusement.
REMARQUE: Le travail avec des composés photocommutables nécessite un réglage de l’éclairage pour empêcher la photoisomérisation arrière. Il est recommandé d’éteindre la lumière dans les armoires stériles. - Obtenir les concentrations finales des composés dans des puits (5-150 μM) en transférant 100 μL des solutions préparées à chaque fois dans 56 puits avec 100 μL de DMEM préalablement ajouté. Ajouter 100 μL de DMEM à chaque fois dans quatre puits pour servir de témoin négatif.
- Plaques de recouvrement avec papier d’aluminium ou couvercle de protection en plastique non transparent pour empêcher la photocommutation incontrôlée. Placez les plaques dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C (en utilisant des couvercles de plaques en plastique supplémentaires) pendant la durée d’incubation choisie (10 min, 60 min, 24 h ou 72 h).
- Expérience de culture cellulaire 2D - coloration et imagerie (jours 2-5)
- Après incubation avec des composés pour différentes périodes, ajouter 50 μL de la solution de coloration par puits aux plaques qui ont été incubées avec des composés pendant 10 et 60 min. Incuber les plaques à 37 °C pendant 20 min.
REMARQUE : Préparer les solutions de coloration par point temporel en ajoutant 8 μL de solution Hoechst 33342 de 20 mM (concentration finale de 5 μM), 32,5 μL de solution d’iodure de propidium (PI) de 1 mM (concentration finale de 1 μM) et 650 μL de FBS non stérile à 5 810 μL de PBS non stérile 1x. Préchauffez FBS et PBS au bain-marie à 37 °C pour éviter que les cellules ne subissent un choc thermique. - Effectuez une imagerie de fluorescence automatisée à l’aide d’une lentille d’objectif 20x.
- Répétez la même procédure de coloration et d’imagerie (étapes 1.4.1 -1.4.2) pour les plaques qui ont été incubées avec des composés pendant 24 (jour 3) et 72 (jour 5) h.
REMARQUE : Les cartes de plaques 2D typiques sont illustrées à la figure 2.
- Après incubation avec des composés pour différentes périodes, ajouter 50 μL de la solution de coloration par puits aux plaques qui ont été incubées avec des composés pendant 10 et 60 min. Incuber les plaques à 37 °C pendant 20 min.
- Expérience de culture cellulaire 3D - ensemencement des cellules (jour 1)
REMARQUE : Les étapes de cette section sont identiques à celles décrites pour la préparation expérimentale 2D de la culture cellulaire, l’incubation avec les composés testés et l’imagerie (étapes 1.1-1.4.) Cependant, dans ce cas, les cellules sont préparées sous forme de sphéroïdes matures compacts dans une plaque de fond en U à ultra-faible adhérence de 384 puits avec des parois noires non transparentes. L’utilisation d’une plaque de cette taille permet de comparer deux composés en une seule expérience.- Répétez les étapes 1.2.1-1.2.9 du protocole d’expérience 2D avec une culture cellulaire LLC.
- Après avoir compté les cellules, préparez 25 mL de la suspension cellulaire. Ensemencer 1 000 cellules par puits dans tous les puits dans 50 μL de DMEM dans une plaque de fond en U à faible liaison de 384 puits.
- Centrifuger à 40 × g pendant 30 s et agiter avec un agitateur à plaques à 250 tr/min pendant 1 min pour secouer les cellules des parois des puits jusqu’au fond.
- Placez les plaques dans un incubateur à 37 °C et 5% de CO2 sur des couvercles de plaques en plastique supplémentaires pour éviter le chauffage inégal du fond de la plaque pendant 48 h.
- Expérience de culture cellulaire 3D - ajout des composés (jour 3)
- Surveiller les cellules dans les plaques par microscopie pour s’assurer que des sphéroïdes matures compacts se sont formés.
- Préparer une dilution en série des composés étudiés dans des plaques transparentes autoclavées en polypropylène. Dans ce cas, inclure un composé supplémentaire. Effectuez les solutions suivantes pour les mesures ponctuelles individuelles :
- Pour obtenir des solutions de gramicidine S de 175 μM et 350 μM, ajouter 1,8 μL de solution mère de 20 mM à 198,2 μL de DMEM et ajouter 3,6 μL de stock à 196,4 μL de DMEM en conséquence.
- Pour obtenir des solutions 175 μM et 350 μM de LMB002, forme « à anneau ouvert », ajouter 1 μL de solution mère de 40 mM à 199 μL de DMEM et ajouter 1,8 μL de stock à 198,2 μL de DMEM en conséquence.
- Pour obtenir des solutions 350 μΜ et 1 750 μM de LMB002, forme « fermée en anneau », ajouter 1,8 μL de solution mère de 40 mM à 198,2 μL de DMEM et ajouter 8,8 μL de mère à 191,2 μL de DMEM en conséquence.
- Effectuer trois répétitions supplémentaires pour obtenir quatre ensembles de chaque point de concentration. Acquérir des dilutions en série en prélevant 20 μL de chaque puits de départ, en les transférant dans le puits, avec 180 μL de DMEM, et en mélangeant soigneusement.
REMARQUE: Le travail avec des composés photocommutables nécessite un réglage de l’éclairage pour empêcher la photoisomérisation arrière. Il est recommandé d’éteindre les lumières dans les armoires stériles. - Obtenir les concentrations finales des composés dans les puits en transférant 20 μL des solutions préparées à chaque fois dans 128 puits contenant 50 μL de DMEM. Ajouter 20 μL de DMEM à chaque fois dans trois puits pour servir de contrôle. Couvrez les plaques avec du papier d’aluminium ou une couverture protectrice en plastique pour empêcher la photocommutation ou l’évaporation.
- Placez les plaques dans un incubateur de culture cellulaire sur des couvercles de plaques en plastique pour le temps d’incubation choisi.
- Expérience de culture cellulaire 3D - coloration et imagerie (jours 3-6)
- Préparer la solution de coloration par point temporel en ajoutant 13 μL de solution de calcéine AM 1 mM (concentration finale de 1 μM), 22 μL de solution Hoechst 33342 20 mM (concentration finale de 33 μM), 40 μL de solution PI 1 mM (concentration finale de 3 μM), 300 μL de FBS non stérile à 2 625 μL de 1x PBS non stérile. Préchauffez FBS et PBS au bain-marie à 37 °C pour éviter que les cellules ne subissent un choc thermique.
- Après incubation pendant différentes périodes avec les composés, ajouter 20 μL de solution de coloration par puits dans les puits qui ont été incubés avec des composés pendant 10 min. Incuber à 37 °C pendant 2 h.
- Effectuez une imagerie confocale en fluorescence à l’aide d’une lentille d’objectif 20x.
- Répéter la même procédure de coloration et d’imagerie pour les puits qui ont été incubés avec des composés pendant 24 (jour 4) et 72 (jour 6) h.
REMARQUE: Dans cette expérience, la calcéine AM est utilisée comme troisième composant de la solution de coloration multicolore. Les images obtenues à partir d’expériences 2D et 3D sont analysées à l’aide du logiciel d’analyse d’images automatisé de l’instrument. Les cellules cocolorées avec des colorants Hoechst et iodure de propidium sont considérées comme necrotiquement mortes, et leur fraction en fonction de la concentration est utilisée pour calculer la valeur IC50 .
Figure 2 : Exemple de cartes de plaques typiques pour les expériences de culture 2D. Les codes de couleur pour les composés et le contrôle sont indiqués. Les concentrations des composés testés (nombre à l’intérieur des puits) sont données en μM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
2. Détermination de l’efficacité de la photocommutation chez un substitut tissulaire
- Assembler le train optique pour l’irradiation de l’échantillon comme illustré à la figure 3 (composé d’un câble optique provenant de la source lumineuse laser, d’une lentille à focale variable, d’une seringue avec un couvercle non transparent et d’une extrémité à coupe plate).
- En modifiant la distance focale et l’ouverture de la lentille, obtenir un faisceau de lumière plat d’un diamètre supérieur de 1 à 1,5 mm au diamètre intérieur de la seringue utilisée, mais toujours dans l’ouverture.
- Utilisez une seringue de 5 mL avec une extrémité coupée et un diamètre intérieur de 12,4 mm et recouverte d’un couvercle en plastique non transparent. À une puissance de sortie laser de 200 mW, régler la densité de puissance à la sortie du système optique à ~103 mW/cm2 mesurée avec un photomètre.
REMARQUE : Toutes les opérations subséquentes doivent être effectuées dans une pièce sombre avec le minimum d’éclairage possible sur le lieu de travail. - Préparer 3 mL de solution mère LMB002 (forme « à anneau fermé ») dans du PBS à une concentration de 1 mg/mL.
- Préparer un échantillon de tissu modèle chargé de la photoforme inactive de LMB002 dans un récipient en plastique. Dans une course typique, 5 g de viande de porc hachée fraîche sont mélangés mécaniquement avec 277 μL de solution mère LMB002 et 260 μL de PBS pour atteindre la concentration finale de 50 mg / kg dans l’échantillon, et le rapport tissu / PBS de ~ 9/1 (v / v).
- Remplissez la seringue avec l’échantillon préparé, en vous assurant qu’il n’y a pas de bulles d’air à l’intérieur, et formez une surface plane à l’extrémité de l’exposition (coupe).
NOTE: Le cylindre de l’échantillon dans la seringue doit occuper ~40 mm le long de l’axe. - Irradier l’échantillon dans le train optique comme le montre la figure 3 pendant 9 min 44 s, correspondant à ~60 J/cm2 d’exposition.
- Préparer des tranches de l’échantillon de 4 mm d’épaisseur après l’exposition en le poussant hors de la seringue à l’aide du piston et en le coupant avec un scalpel. Peser et placer les tranches dans des tubes à essai séparés et les marquer par la distance moyenne (mm) de la surface irradiée.
- Préparer deux échantillons témoins (quantité optimale, 0,5-0,7 g) dans des tubes à essai : dans l’un, de la viande hachée mélangée à 10 % (volume) de PBS (54 μL), et dans l’autre, l’échantillon de tissu modèle obtenu à l’étape 2.4 irradié par une lumière laser de 500 mW pendant 10 min pour s’assurer que toutes les molécules LMB002 « fermées en anneau » sont converties en forme « à anneau ouvert ».
- Ajouter le mélange acétonitrile-eau (70 %/30 % v/v, complété par de l’acide trifluoroacétique (TFA) à 0,01 %, 1,4 mL/g) à chaque tranche et aux échantillons témoins. Bien mélanger le contenu à l’aide d’une tige de verre.
- Incuber à température ambiante pendant au moins 10 min et centrifuger les mélanges à 5220 x g pendant 20 min ou centrifuger à 20 x g pendant 30 min deux fois pour éliminer la matière insoluble et recueillir le surnageant.
- Recueillir soigneusement les surnageants (~0,7 mL) et les centrifuger à nouveau à 16 000 x g pendant 30 min.
- Recueillir les surnageants (~0,5 mL chacun) et les analyser par chromatographie liquide haute performance en phase inverse (CLHP RP) avec une colonne analytique C18, gradient linéaire A:B de 3,46 % B/min, débit de 2,0 mL/min et 100 μL de volume injecté. Enregistrer les chromatogrammes détectés par UV à 570 nm (détection de la forme « fermée à anneau ») et à 270 nm (détection de la forme « anneau ouvert »). Utiliser les échantillons témoins non irradiés (étape 2.4) et irradiés (étape 2.8) pour déterminer les temps de rétention spécifiques des deux photoformes (éluant A: aqueux 0,1 % TFA; éluant B: 90 % acétonitrile-eau, 0,1 % TFA) et étalonner la méthode.
- Déterminer les quantités réelles de photoformes LMB002 dans les échantillons analysés en utilisant les courbes d’étalonnage obtenues en prenant et en analysant les chromatogrammes des solutions LMB002 de concentrations connues. Pour l’étalonnage, préparer les solutions LMB002 « à anneau fermé » en diluant la solution mère (étape 2.3) avec un mélange acétonitrile-eau (70 %/30 % v/v complété par 0,01 % TFA) pour obtenir 0,36, 0,9 et 3,6 μg par 100 μL (le volume injecté); Le gradient et le débit de l’éluant sont les mêmes qu’à l’étape 2.12.
- Répétez l’expérience (étapes 2.4-2.12) trois fois et tracez le pourcentage normalisé de chaque photoforme sur la parcelle (pourcentage) en fonction de la distance (à partir de la surface du tissu irradié). Calculer les statistiques (c.-à-d. l’écart-type à chaque point de concentration).
Figure 3 : Installation expérimentale pour déterminer l’efficacité de la photoconversion dans le tissu modèle. (A) Schéma et (B) photographie; 1, câble optique de la source lumineuse laser; 2, objectif à focale variable; et 3, un mélange de solution saline tamponnée au phosphate LMB002 de viande placé dans 4, une seringue avec un couvercle non transparent et une extrémité avant coupée (illustrée en (B) sans le couvercle). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
3. Détermination de l’efficacité anticancéreuse in vivo
REMARQUE : Le calendrier et les critères d’évaluation des expériences sont illustrés à la figure 4. Les normes de soins aux animaux pendant la période de post-traitement devraient être conformes aux règles 3R - le logement devrait inclure une densité de cage appropriée et la disponibilité des ressources. Dans la mesure du possible, respectez les méthodes de manipulation des animaux non aversives telles que le tunnel ou les ventouses.
Figure 4 : Calendrier de l’expérience thérapeutique in vivo. Désignation des groupes expérimentaux, détails du traitement, critères d’évaluation et calendriers d’analyse post mortem. Abréviations : LLC = carcinome pulmonaire de Lewis; IV = intraveineuse; SC = sous-cutanée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
- Préparation des cellules cancéreuses pour l’inoculation sous-cutanée (jour 0).
- Passage des cellules LLC dans DMEM (4,5 g / L de glucose) avec 10% FBS, 100 U / mL de pénicilline et 100 μg / mL de streptomycine à 37 ° C et 5% de CO2.
- Récoltez les cellules en utilisant une solution trypsine-EDTA à 0,05%, centrifugez et suspendez-les dans du DMEM sans sérum.
- Compter les cellules et déterminer leur viabilité à l’aide d’un hémocytomètre et d’un test d’exclusion du bleu de trypan.
- Préparer la suspension cellulaire finale à une concentration de 10 × 106 cellules/mL dans le mélange DMEM et Matrigel (1:1). Gardez la suspension sur glace avant l’injection.
- Inoculation cellulaire LLC (jour 0)
- Placez la souris C57BL/6NCrl femelle adulte (pesant ~20 g) dans la chambre d’induction de l’appareil d’anesthésie à l’isoflurane. Effectuez une sédation à 5% d’isoflurane et attendez que l’animal soit complètement inconscient.
- Retirer la fourrure de la zone d’inoculation cellulaire par rasage.
- Inoculer 5 × 105 cellules LLC dans ~100 μL de DMEM: mélange Matrigel (1: 1) dans le membre postérieur droit.
REMARQUE : Dans la mesure du possible, respectez la pratique d’utilisation d’une seule aiguille.
- Administration de composés et photoirradiation
REMARQUE: Dans les 5-8 jours post-inoculation, les animaux sont prêts pour le traitement lorsque leurs tumeurs sont palpables et ont atteint ~50-100 mm3 volume. Effectuer toutes les opérations ultérieures avec LMB002 et des souris traitées par ce composé dans des conditions semi-obscures (une lampe LED de 4 W à au moins 5 m du poste de travail).- Dissoudre LMB002 (forme « fermée en anneau ») dans une solution saline physiologique stérile à une concentration de 1 mg/mL à la dose de 5 mg/kg (IV) pour obtenir des solutions homogènes bleu foncé.
- Avant l’irradiation, assemblez au hasard quatre groupes de huit animaux et retirez la fourrure de la tumeur et des zones voisines en se rasant.
- Placez une souris dans le support pour les injections intraveineuses et préchauffez la queue de l’animal dans un bain-marie à 37 °C pour rendre la veine de la queue visible.
REMARQUE: Envisagez une analgésie préopératoire. - Injecter le composé à 5 mL/kg dans la veine de la queue. Pour les deux groupes témoins, injecter 100 μL de solution saline (par voie intraveineuse) par animal (20 g de poids corporel). S’assurer que les animaux des deux groupes expérimentaux reçoivent le composé testé sous la photoforme inactive (1 mg/mL dans une solution saline).
REMARQUE : Dans la mesure du possible, respectez la pratique d’utilisation d’une seule aiguille. - Ensuite, 2 h 45 min après l’injection du composé, placez la souris sous anesthésie. Induire la sédation avec 3% -4% d’isoflurane dans l’oxygène. Maintenir l’anesthésie pendant 15 minutes avec 0,5% -1% d’isoflurane dans l’oxygène.
- Couvrez la souris avec un masque noir possédant un trou n’exposant que la zone tumorale à la lumière.
- Allumez le module de diode laser avec un laser de 650 nm et réglez la puissance du laser rouge sur 200 mW et celle du laser de guidage bleu/UV sur 2 mW.
REMARQUE: Utilisez des lunettes de protection bleues lorsque l’appareil laser est allumé. - Mesurer le flux lumineux du laser rouge (loin des souris) avec un photomètre et déterminer la distance du câble optique où le flux lumineux est de 100 mW/cm2. Fixez le câble sur un support pour vous assurer que la source de lumière est à la distance déterminée de la tumeur et que la lumière couvre toute la zone tumorale. Utilisez une lumière laser de guidage bleue / UV pendant cette procédure.
- Allumez le laser rouge pour irradier la zone tumorale pendant 20 min.
- Après l’irradiation, coupez le flux d’isoflurane, remettez l’animal dans sa cage et observez attentivement son état pendant les 30 minutes suivantes.
REMARQUE: Après l’administration du composé, gardez les souris dans l’obscurité pendant 2 jours. Seul le cycle lumière-jour doit être modifié; Toutes les autres conditions de logement devraient rester inchangées.
- Observations post-traitement
- Observez les animaux quotidiennement et mesurez le poids et les dimensions de leurs tumeurs. Mesurer le volume tumoral et noter la progression de la nécrose.
REMARQUE : Les normes de soins aux animaux pendant la période post-traitement doivent être conformes aux règles 3R - le logement doit inclure une densité de cage appropriée et la disponibilité des ressources. - Utilisez les données recueillies à l’étape précédente pour évaluer la mortalité. Déterminez le taux de survie à l’aide de la procédure standard.
REMARQUE: Les animaux doivent être sacrifiés et comptés comme morts lorsqu’ils révèlent des signes cliniques graves (perte de poids corporel de plus de 15%, ulcération tumorale ne guérit pas en 7 jours et vocalisation) ou dès que le volume tumoral atteint 2 500 mm3.
- Observez les animaux quotidiennement et mesurez le poids et les dimensions de leurs tumeurs. Mesurer le volume tumoral et noter la progression de la nécrose.
Representative Results
Dans ce travail, des expériences de cellules 2D et 3D ont été menées pour déterminer la CI50 pour les formes LMB002 « fermées en anneau » et « ouvertes en anneau » (voir Figure 1) à différents moments d’incubation. Ces valeurs ont été comparées à celles obtenues pour le peptide prototype, la gramicidine S (utilisé comme témoin positif). Un ensemble typique d’images de l’incubation dans une culture LLC cultivée en 2D après coloration est illustré à la figure 5. La cocoloration avec Hoechst 33342 (bleu) et l’iodure de propidium (rouge) résultant en différentes nuances de violet dans une plus grande fraction de cellules dans le cas d’un traitement sous forme « ouverte en anneau » par rapport à « fermée en anneau » indique une différence notable de cytotoxicité entre deux formes qui peut facilement être quantifiée. L’exemple démontré d’une expérience réussie est basé sur les données recueillies à l’aide du format de plaque à 96 puits, où les variantes peptidiques à différentes concentrations ont été ajoutées, comme le montre la figure 2. Des données similaires peuvent être acquises avec des plaques à 384 puits et à haute densité. Cependant, étant donné que les volumes par puits sont réduits, les erreurs techniques et systématiques et, par conséquent, la précision de la détermination IC50 diminueront avec l’augmentation de la densité du puits.
Figure 5 : Images représentatives de l’essai de cytotoxicité dans la LLC cultivée en monocouche. Les cellules ont été colorées avec Hoechst 33342 (bleu) et de l’iodure de propidium (rouge). Les temps indiqués : 10 min, 60 min, 24 h et 72 h sont des temps d’incubation avec des composés. Barres d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
La photoconversion de LMB002 par irradiation à la lumière laser dans un tissu modèle - hachis de porc frais - a été déterminée à l’aide d’un échantillon composé de viande hachée mélangée à la forme LMB002 « fermée à anneau » (inactive) dissoute dans du PBS et en mesurant la conversion de cette forme inactive en forme LMB002 « à anneau » (activée) dans le sens de la propagation par rayonnement. L’échantillon a été placé dans une seringue et irradié d’un côté avec un faisceau plat de rayonnement laser pendant la durée d’exposition de ~10 min (habituellement utilisé dans les expériences in vivo ), comme le montre la figure 3. Après l’exposition, le cylindre d’échantillon a été divisé en parties en appuyant sur le piston de la seringue et en coupant les tranches de la même hauteur avec un scalpel. La concentration de LMB002 « ring-open » dans les extraits des tranches a été déterminée par HPLC RP.
La figure 6 illustre les courbes dose-effet obtenues par la figure 6A-D à partir de l’analyse des données. Pour identifier le pourcentage de cellules mortes avec co-coloration nucléaire de colorants Hoechst 33342 et PI, nous avons utilisé un outil de classification intégré qui définit des seuils numériques à des paramètres mesurés sélectionnés pour diviser tous les nombres de cellules en plusieurs catégories. Par exemple, lorsque le signal du canal rouge (iodure de propidium) dans le témoin était au seuil (environ 110-130 unités), les cellules pouvaient être classées comme PI-positives, considérées comme mortes, ou PI-négatives, considérées comme non affectées par les composés. Pour LMB002, on peut observer des dépendances sigmoïdales du pourcentage de cellules à iodure de propidium positif sur la concentration du composé. À partir de ces données, les valeurs IC50 peuvent être déterminées.
Figure 6 : Analyse de la cytotoxicité en culture 2D. Sigmoïde s’adapte comme on l’a obtenu dans la culture LLC pendant (A) 10 min, (B) 60 min, (C) 24 h et (D) 72 h-temps intervalles pris pour l’incubation avec des composés. Le raccord permet de déterminer avec précision les valeurs IC50 (non représentées). Les barres d’erreur sont SEM. Abréviations : LLC = carcinome pulmonaire de Lewis; PI = iodure de propidium. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Compte tenu des valeurs obtenues de CI50 , nous pouvons conclure que la toxicité des trois composés a augmenté avec le temps d’incubation. Notre expérience a révélé que la forme « à anneau » de LMB002 est environ une étape de dilution moins toxique que le peptide prototype, la gramicidine S. Alors que la forme « fermée à anneau » présente trois à quatre étapes de dilution une toxicité inférieure, qui augmente avec le temps d’incubation. La différence entre les deux étapes de dilution n’est pas affectée par l’augmentation du temps d’incubation et peut être utilisée numériquement comme fenêtre photothérapeutique6 déterminée expérimentalement pour la comparaison avec d’autres composés dans un criblage de bibliothèque potentiel. La valeur IC50 pour la gramicidine S a été définie comme point de référence pour corriger les erreurs expérimentales ou les sorties différentielles dans les répétitions biologiques.
Les expériences de cellules 3D ont produit le même type de données brutes - les images sphéroïdes résolues par une seule cellule. L’inclusion de calcéine comme troisième colorant colorant permet de quantifier la fraction de cellules métaboliquement actives (observée dans le canal vert). En utilisant des plaques de 384 puits, en augmentant le nombre de répétitions techniques, en excluant les points de temps de co-incubation redondants et en modifiant le pli de dilution, nous avons pu comparer directement plusieurs composés en un seul essai (en utilisant une seule plaque), comme illustré dans la carte des plaques de la figure 7.
Figure 7 : Carte des plaques pour l’expérience de culture 3D avec deux composés. Les codes de couleur pour les composés et le contrôle sont indiqués. Les nombres dans les puits sont des concentrations en μM. 10 min, 24 h et 72 h sont des temps d’incubation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
La figure 8 montre les images de répliques techniques sélectionnées de sphéroïdes LLC cultivés à une densité de 1 sphéroïde/puits en présence de composés testés et de sphéroïdes témoins capturés après coloration.
Figure 8 : Images représentatives du test de cytotoxicité en culture 3D. Les images montrent des sphéroïdes LLC âgés de 48 h colorés avec Hoechst 33342 (bleu), calcéine AM (vert) et iodure de propidium (rouge) après 10 min, 24 h et 72 h de co-incubation avec les photoformes LMB002 et la gramicidine S. Barres d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
À l’aide du logiciel de l’instrument, les courbes dose-effet, comme celles de l’expérience 2D, ont été obtenues à partir des piles d’images empilées en z (Figure 9A). De plus, les sphéroïdes compacts et non déformés dans les cultures 3D pourraient être caractérisés par le diamètre du sphéroïde entier (Figure 9B). Il a également été noté que le diamètre global du sphéroïde varie avec la concentration du composé.
Figure 9 : Évaluation de la cytotoxicité avec des cultures 3D. (A) Courbes d’ajustement de cytotoxicité dépendantes de la concentration et (B) tracés de diamètre de sphéroïde dépendants de la concentration obtenus dans les cultures 3D de LLC co-incubées avec la gramicidine S pendant 10 min, 24 h et 72 h et capturées avant coloration. Les barres d’erreur sont SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
L’expérience de l’étape 2 permet de déterminer les concentrations de LMB002 dans les deux photoformes en utilisant la chromatographie liquide haute performance détectée par UV. L’efficacité de la photoconversion dans les tissus modèles a été facilement évaluée et quantifiée à l’aide de cette configuration (Figure 3). Les données ont été obtenues à partir de l’analyse quantitative des chromatogrammes des extraits d’échantillons. Dans ces expériences d’essai, les chromatogrammes LMB002 ont été détectés spectroscopiquement à 270 nm et 570 nm. À 270 nm, de nombreux signaux supplémentaires ont été observés et attribués aux composés co-extraits du tissu modèle (vérifiés à partir de l’extrait témoin sans le composé). Les deux photoformes étaient suffisamment différentes en termes de temps de rétention et d’absorbance. Cependant, le signal « d’ouverture en anneau » LMB002 était séparé de ces signaux de fond (voir un chromatogramme représentatif à la figure 10A). Par conséquent, ce signal peut être intégré sans problème. À 570 nm, les chromatogrammes ne contenaient que le signal de forme LMB002 « fermé en anneau » (Figure 10B). Ici, nous avons effectué la détermination de la concentration à l’aide de la CLHP RP. Néanmoins, une précision encore plus élevée et des limites de détection inférieures pourraient être obtenues en utilisant la LC/MS comme méthode analytique.
Figure 10 : Chromatogrammes représentatifs de LMB002 extraits de tissus modèles. (A) Échantillon à 2 mm de la surface irradiée, enregistré à 270 nm (la forme LMB002 « ring-open » est intégrée); (B) échantillon à 38 mm de la surface irradiée, enregistré à 570 nm (le pic de LMB002 « ring-closed » est intégré). Les valeurs de temps de rétention (indiquées) ont également confirmé l’identité du composé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Les données obtenues après intégration des signaux correspondants de tous les échantillons prélevés ont été utilisées pour construire les graphiques concentration-profondeur, comme le montre la figure 11. Sur la base de ces graphiques, l’efficacité de la photoconversion à différentes profondeurs du tissu modèle a été facilement évaluée. Il confirme que notre source de lumière rouge induit la photoconversion LMB002 « fermée en anneau » à une profondeur allant jusqu’à 1 c, dans le substitut tissulaire, viande hachée (à environ 103 mW/cm2).
Figure 11 : Évaluation de l’efficacité de la photoconversion. Concentration (A, mg/kg) des formes LMB002 « anneau fermé » (points bleus non activés) et « anneau ouvert » (activés, points orange) à différentes distances de la surface irradiée du tissu modèle (L, mm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Les résultats de l’expérience in vivo - étape 3 de notre méthodologie réalisée selon le calendrier présenté à la figure 4 - ont été représentés par des graphiques montrant la croissance tumorale en fonction du temps (Figure 12) et des courbes de survie de Kaplan-Meier (Figure 13).
Figure 12 : Dynamique de la croissance tumorale chez l’animal. Animaux traités avec LMB002 par rapport aux animaux traités dans le véhicule (modèle d’allogreffe LLC sous-cutanée chez la souris C57BL/6NCrl, dose composée 7 mg/kg, IV, 2 h 40 min d’incubation, puis irradiation à 650 nm, 100 mW/cm2, 20 min). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 13 : Courbes de mortalité animale. Animaux traités avec LMB002 par rapport aux animaux traités dans le véhicule (modèle d’allogreffe LLC sous-cutanée chez la souris C57BL/6NCrl, dose composée 7 mg/kg, IV, 2 h 40 min d’incubation, puis irradiation à 650 nm, 100 mW/cm2, 20 min). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Discussion
Les composés photocontrôlés sont sans précédent dans le développement de médicaments; cependant, aucune méthode n’a été établie pour leur évaluation préclinique et clinique. L’analogue de monothérapie le plus proche, la thérapie photodynamique (PDT), est la modalité de traitement à usage clinique adoptée par de nombreux pays contre le cancer et est en cours de développement pour d’autres indications19,20. Semblable à la photopharmacologie, la PDT est également basée sur l’utilisation de la lumière pour activer la substance bioactive (oxygène singulet). Par conséquent, certaines méthodes expérimentales utilisées pour les études précliniques et cliniques en PDT peuvent être adoptées pour la photopharmacologie. Par exemple, les sources lumineuses, les approches d’administration de la lumière et les dispositifs médicaux sont bien développés et approuvés pour la TPD; Ils peuvent être directement utilisés pour l’évaluation de médicaments photocontrôlés. Cependant, la PDT et la photopharmacologie présentent de nombreuses distinctions l’une del’autre4, ce qui justifie la nécessité d’établir des méthodes spécifiques pour cette dernière.
Premièrement, la substance non activée dans la PDT (oxygène) est toujours présente dans les tissus vivants à des concentrations non toxiques. En revanche, les composés biologiquement actifs photocontrôlés non activés peuvent avoir une activité résiduelle et une toxicité indésirable. Par conséquent, les médicaments de photopharmacologie idéaux devraient avoir minimisé l’activité biologique sous leur forme administrée et doivent être très actifs dans leur forme générée par la lumière, la « fenêtre photothérapeutique»21 doit être aussi grande que possible. Trouver le hit et effectuer l’optimisation hit-to-lead nécessite l’identification de composés appropriés et le criblage de bibliothèques relativement grandes, déjà aux premiers stades du développement de médicaments. Ici, nous avons proposé une microscopie fluorescente confocale automatisée à haut débit pour identifier les composés de photocommutation efficaces.
La méthode choisie d’évaluation de la cytotoxicité permet de mettre en œuvre facilement l’exigence la plus critique - le maintien du PSS ou la stabilité du photoisomère sensible à la lumière visible. En effet, lors de sa mise en œuvre, l’exposition à la lumière est minimisée. Par conséquent, si vous choisissez des méthodes alternatives, les méthodes automatisées devraient être préférées. Cette approche est fiable et informative. L’utilisation de cultures cellulaires 3D (sphéroïdes) à ce stade fournit une compréhension holistique de la réponse de la cellule au traitement dans un microenvironnement tissulaire plus réaliste. En outre, des informations précieuses sur le mécanisme d’action des composés peuvent être obtenues en utilisant la microscopie comme méthode directe. La microscopie confocale fluorescente avec protocole de coloration approprié permet l’évaluation visuelle de la morphologie des cellules et des sphéroïdes; Des détails importants sur la mort cellulaire et les changements à l’intérieur des cellules peuvent également être détectés.
Deuxièmement, l’application légère nécessite un choix judicieux du dosage de la lumière. Dans la PDT, le surdosage léger est extrêmement nocif pour les tissus22. La thérapie photopharmacologique peut être avantageuse en cas d’irradiation excessive de la lumière. La limite supérieure de la substance activée est définie par la dose administrée de la substance non activée et sa pharmacocinétique. Cependant, le dosage de la lumière est toujours un problème en photopharmacologie. Il faut veiller à ce que la densité de puissance d’irradiation et le temps d’exposition ne soient pas inférieurs à l’exigence du traitement. En principe, la génération de la substance activée peut être surveillée in vivo. Cependant, pour des raisons bioéthiques, nous avons proposé une expérience avec un tissu modèle (viande hachée fraîche) mélangé au composé non activé15. Cette expérience est simple et peut être modifiée pour utiliser différentes sources lumineuses. Il peut également être adapté pour l’estimation photophysique du dosage de la lumière et la mesure des influences thermiques. Là encore, en utilisant des tissus modèles, il est possible de minimiser l’exposition à la lumière, comparée, par exemple, à la détermination plus précise de l’efficacité de la photocommutation dans les conditions in vivo , une alternative qui peut toujours être intéressante à considérer.
Enfin, les composés qui présentent des caractéristiques supérieures dans les criblages de toxicité in vitro et qui photocommutent efficacement à au moins 1-1,5 cm de profondeur dans le tissu modèle peuvent être sélectionnés pour des études in vivo coûteuses, laborieuses et longues. Dans ce protocole, nous avons utilisé la même lignée cellulaire (LLC) que dans l’évaluation in vitro pour générer le modèle de cancer allogreffé. La dynamique de croissance tumorale, la mortalité et le nombre de métastases sont les paramètres les plus appropriés pour évaluer l’efficacité anticancéreuse. Par rapport à la chimiothérapie conventionnelle, un facteur supplémentaire est appliqué dans le traitement photopharmacologique - la lumière. Par conséquent, deux groupes d’animaux témoins sont nécessaires : l’un qui reçoit uniquement le véhicule et l’autre qui reçoit le véhicule et l’irradiation. Cette configuration permet d’évaluer l’impact de la lumière sur les paramètres mesurés. Dans notre expérience, les animaux des deux groupes expérimentaux ont reçu le composé non activé et les tumeurs des souris d’un groupe ont été irradiées. Le régime d’irradiation était identique pour les groupes témoin et de traitement. La comparaison avec la chimiothérapie de référence n’est pas nécessaire à ce stade car le but principal de l’expérience est de démontrer l’effet combiné de l’application de la lumière et du composé. Les composés les plus performants présentant cet effet peuvent ensuite être sélectionnés pour une étude plus approfondie de leur toxicité in vivo et une comparaison avec des critères de référence pour prendre des décisions importantes sur leur développement. Techniquement, l’expérience in vivo que nous décrivons peut être facilement adaptée à des études pharmacocinétiques ou pharmacodynamiques, par exemple, d’un composé déjà sélectionné comme médicament principal.
Disclosures
IVK, OB, SA et ASU sont les inventeurs de la famille de brevets délivrés : « Peptidomimétiques possédant une activité biologique photocontrôlée » (WO2014127919 [A1], EP2958934 [B1], US9481712 [B2], UA113685 [C2]) concédés sous licence à Lumobiotics GmbH. IVK, OB, TS et SA sont les fondateurs et actionnaires de Lumobiotics GmbH. IVK est un conseiller scientifique, HK, TM, IP et PB sont des employés d’Enamine LLC. Les auteurs n’ont aucune autre affiliation ou implication financière pertinente avec une organisation ou une entité ayant un intérêt financier ou un conflit financier avec le sujet ou les documents discutés dans la publication en dehors de ceux divulgués.
Acknowledgments
Les auteurs reconnaissent le financement de l’UE par le programme H2020-MSCA-RISE à travers les projets PELICO (#690973) et ALISE (#101007256). Ce travail a été soutenu par le DFG-GRK 2039 (SA, TS et ASU), le programme NACIP de la Société Helmholtz (SA et ASU) et le VIP+ du BMBF (OB et ASU). Nous remercions le Dr Serhii Koniev, de l’Institut de technologie de Karlsruhe, qui a synthétisé le composé LMB002, l’a purifié et a aimablement fourni le composé pour l’étude. Les auteurs remercient également Chupryna Maksym qui a filmé et compilé la vidéo en Ukraine, et tous les courageux défenseurs de l’Ukraine qui ont rendu possible le travail expérimental, l’écriture et le tournage de cette publication.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent 1100 Series capillary LC system | ALSI-Chrom (Agilent distributor) | - | |
| ATCC CRL-1642, LL/2 (LLC1) Lewis lung carcinoma cell line | ECACC | 90020104 | |
| C57BL/6NCrl mice, female, inbred | Charles River | Strain code: 027 | |
| CelCulture, CO2 incubator | Esco Micro | CCL-170B | |
| Corning Matrigel Basement membrane matrix | Merck | CLS354234 | |
| Corning, 384- well spheroid microplates | Merck | CLS3830 | |
| Fetal bovine serum | Merck | F7524 | |
| Gibco, DPBS | Thermo Fisher Scientific | 21600044 | |
| Gramicidin S | Lumobiotics | Custom synthesis | |
| HyClone, DMEM/high glucose | Cytiva | SH30003.04 | |
| IN Cell Analyzer 6500HS, imaging system | Cytiva | 29240358 | |
| Invitrogen, Calcein AM | Thermo Fisher Scientific | C1430 | |
| Isoflurane anesthesia machine | ASA | S/N ASA 1305 | |
| L-glutamine, 200 mM solution | Merck | G7513 | |
| LIKA-surgeon, diode surgery laser | Fotonika plus | - | |
| LMB002 | Lumobiotics | Custom synthesis | |
| Penicillin–Streptomycin, solution stabilized | Merck | P4333 | |
| PhenoPlate, 96-well plates | PerkinElmer | 6055302 | |
| Photometer PCE-LED 20 | PCE Instruments | PCE-LED 20 | |
| Thermo Scientific, Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Thermo Scientific, Propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | J66764-MC | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Merck | T8154 | |
| Trypsin–EDTA, 10 x solution | Merck | T4174 | |
| UltraCruz Cell culture flasks with vented caps, 75 cm2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-200263 | |
| UltraCruz, bottle top filters, PES, 0.22 μm | Santa Cruz Biotechnology | sc-360882 | |
| Vydac 218TP, C18 HPLC column (4.6 mm × 250 mm, 5 µm) | Altmann Analytik (Avantor distributor) | GR5103827 |
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