Summary
이 프로토콜은 이러한 화합물의 전임상 스크리닝에 사용할 수 있는 광전환 가능한 항암 펩타이드의 평가를 위해 채택된 일련의 실험을 제시합니다. 여기에는 2D 및 3D 세포 배양에서의 세포 독성 평가, 생체 외 (모델 조직) 광이성질화 효율 평가 및 생체 내 효능이 포함됩니다.
Abstract
광제어 생물학적 활성 화합물은 "스마트" 약물 후보의 새로운 부류입니다. 그들은 양성이고 이온화할 수 없는 빛을 환자의 신체 내 특정 위치로 향하게 함으로써 정확한 시공간 활성화로 인해 전신 화학 요법에서 추가적인 안전성을 제공합니다. 이 논문은 약물 개발 초기 단계에서 생체 내 효능뿐만 아니라 광제어 생물학적 활성 화합물의 광활성화에 대한 시험관 내 효능 및 생체 외 효율성을 평가하는 일련의 방법을 제시합니다. 상기 방법론은 항암 세포독성 펩타이드, 즉 디아릴에텐 함유 유사체로 공지된 항생제인 그라미시딘 S에 적용된다. 실험은 면역 적격 마우스에서 암 세포주(Lewis lung carcinoma, LLC), 살아있는 조직 대리모(돼지고기 다진 고기) 및 동종이식 암 모델(피하 LLC)의 2D(부착 세포) 및 3D(스페로이드) 세포 배양을 사용하여 수행됩니다. 가장 효과적인 화합물의 선택과 사실적인 광치료 창의 추정은 자동 형광 현미경을 통해 수행됩니다. 다양한 조명 요법에서의 광활성화 효율은 모델 조직의 상이한 깊이에서 결정되고, 최적의 광량은 최종 치료적 생체 내 실험에 적용된다.
Introduction
광조절된 생물학적 활성 화합물은 최근 수십 년 동안 인간 질병에 대한 안전한 화학 요법의 유망한 구성 요소로 등장했으며 특히 악성 고형 종양을 박멸합니다1. 이 화합물은 가역적으로 광이성질체화 가능한 단편(분자 광스위치)을 포함하며 다른 파장의 빛을 조사할 때 비활성 광이성질체와 활성 광이성질체 사이를 전환할 수 있습니다.
광제어 불가능한 유사체와 비교할 때, 광제어 약물은 덜 활동적이고 본질적으로 독성이 없는 형태로 환자의 신체에 전신적으로 도입될 수 있고 종양, 궤양 및 상처와 같이 필요한 경우에만 빛에 의해 활성화될 수 있기 때문에 더 안전할 수 있습니다. 이러한 분자 약물 프로토타입에 대한 여러 흥미로운 시연이 최근 학술 논문 2,3,4,5,6,7에서 찾을 수 있지만 승인된 약물/의료 기기/질병 조합의 응용인 임상 광약리학 분야는 존재하지 않습니다. 광약리학은 아직 신약 개발 단계에 있으며 체계적인 전임상 연구는 알려져 있지 않습니다.
우리는 매우 최근에야 일부 광제어 항암 펩티드, 즉 항생제 그라미시딘 S8의 유사체에 대한 생체 내 안전성 이점을 입증했습니다. 이러한 광제어 유도체는 디아릴에텐(DAE) 광스위치를 함유하고 있으며, 이는 소위 적색광으로 생성된 "개환형"과 UV로 생성된 "개폐형" 광형태 사이에서 가역적인 광유도 변환을 겪습니다(유도체 중 하나인 화합물 LMB002에 대해 그림 1에 설명됨).
그림 1: 광제어 세포독성 펩타이드 LMB002 및 광이성질체화. 디아릴에텐 단편은 빨간색으로 표시됩니다. 약어: DAE = 디아릴에텐. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
히트를 찾고 히트-투-리드 최적화를 수행하는 것은 종종 적절한 화합물 라이브러리 9,10의 시험관내 및 생체내 스크리닝을 필요로 한다. 여기에서 우리는 광제어 화합물의 세포독성에 대한 체계적인 고처리량 스크리닝에 적합한 방법론을 보여줍니다. 우리는 또한 광이성질화 효율을 결정하고, 모델 조직에서 광량을 추정하고, 가장 성능이 좋은 후보의 생체 내 효능을 평가합니다. 이 접근 방식은 생명 윤리 및 동물 관리 고려 사항을 준수합니다.
이 작업에서는 테스트 된 화합물의 제어되지 않은 광 이성질화를 피하기 위해 전통적인 전임상 방법을 수정합니다. 여기에 이러한 변형된 방법을 적용하는 전반적인 목표는 간단하고 빠르며 통계적으로 유의미한 데이터를 생성하여 시험관 내 활성을 안정적으로 비교하고 리드 식별 및 추가 개발을 위한 광전환 가능한 화합물의 생체 내 효능 테스트를 합리화하는 일반적인 전략을 개발하는 것입니다.
전략은 세 가지 연속 단계로 구성됩니다. 첫 번째 단계는 2차원(2D, 단층) 및 3차원(3D, 스페로이드) 세포 배양 및 컨포칼 고처리량 자동 형광 현미경을 사용하여 선택된 광제어 생물학적 활성 화합물의 활성 및 비활성 광형에 대한 연속 희석액에서IC50 (겉보기 50% 세포 생존율)을 측정하는 것입니다. 광선치료 윈도우를 두 포토폼 간의IC50 차이와 비교하여 가장 성능이 좋은 후보를 선택합니다. 자동화된 현미경 및 기타 세포독성 스크리닝 플랫폼(분석)에 의한 독성 평가에는 특별한 이점이 없습니다11; 보다 복잡한 세포-기반 종양 모델(12 )은 이 단계에서 용이하게 구현될 수 있다.
단계 1에서 선택된 화합물의 경우, 두 번째 단계는 조사된 시료 추출물의 UV 검출 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 조직 대리모에서 덜 활성인 광형체의 광전환 효율을 정량화함으로써 조사된 조직 표면으로부터 깊이의 함수로서 조직 내부의 광전환 효율을 현실적으로 추정하는 것입니다. 생체 내에서 광 전환 효율을 연구 할 수 있지만 간단한 조직 대리모 인 다진 돼지 고기를 사용할 것을 제안합니다. 우리는 이 접근 방식의 타당성을 테스트했습니다. 우리는 생쥐 암 모델에서 생체 내에서 광전환 가능한 화합물의 전환을 측정하고 생쥐를 대상으로 한 이전 실험에서 측정된 깊이에서 거의 동일한 광전환을 관찰했습니다8. 임의의 적합한 대안적 인공 조직(13), 3D 바이오프린팅된 조직/기관(14), 생검 물질, 또는 다른 면제 동물 물질이 사용될 수 있다. 그러나 이 설정은 경제적이고 빠르며 윤리적이기 때문에 좋은 절충안입니다.
세 번째 단계는 쥐암 모델에서 생체 내 항암 효능을 결정하는 것입니다. 시험 관내 실험에서 우수한 특성을 나타내고 모델 조직에서 적어도 1-1.5 cm의 깊이에서 효율적으로 광전환시키는 화합물이 본 실험을 위해 선택된다.
이 프로토콜은 광형(또는 광정지 상태, PSS)이 합리적인 시간(며칠 이상) 동안 안정적인 경우 다양한 유형의 광스위치를 소유하는 화합물에 적용할 수 있습니다. 예시를 위해, 앞서 기술한 DAE 유래 LMB002가 사용된다(15). LMB002 포토폼은 열적으로 안정적이며 -20°C에서 최소 1년 동안 상당한 성능 저하 없이 보관할 수 있습니다. 루이스 폐암(LLC) 세포는 시험관내 및 생체내 시연을 위해 선택되지만, 세포 유형에 대한 제한은 없습니다. LLC 세포는 부착성이고, 3D로 용이하게 배양가능하고, 종양을 생성하는데 사용된다 (참고문헌16에 기재된 바와 같이). 생체 내 LLC 세포는 전이 과정을 모델링하는 데 사용되며 피하 주사 후 면역 적격 마우스에서 고형 종양을 쉽게 생성할 수 있습니다. 이러한 생체 내 방법론은 다른 암 모델에도 보편적으로 적용될 수 있다17,18. 이 전략의 자세한 구현은 아래에 설명되어 있습니다.
Protocol
동물 관리 및 실험 절차는 실험실 동물과 관련된 연구 프로젝트 수행에 대한 지역 및 국제 규정에 따라 수행되었습니다("잔인함으로부터 동물 보호에 관한 우크라이나 법률", 실험 및 기타 과학적 목적으로 사용되는 척추동물 보호를 위한 유럽 협약(유럽 협약, Strasburg, 1986), 과학적 목적으로 사용되는 동물 보호에 관한 지침 2010/63/EU). 이 연구는 Bienta 회사의 생명윤리 위원회의 승인을 받았습니다. C57BL/6NCrl 마우스(각각 체중이 약 20g인 성체 암컷)를 본 실험에 사용하였다. 특정 재료, 시약 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. 2D 및 3D LLC 세포 배양물을 사용한 LMB002("ring-closed" 및 "ring-open" 형태)에 대한IC50 평가
- 화합물의 완충액 및 원액의 제조
참고: 표준 절차를 사용하여 버퍼를 준비합니다. 또는 상업적으로 이용 가능한 솔루션을 사용하십시오.- 증류수 1L에 Na2HPO414.2g, KH2PO4 2.4g, NaCl 80g, KCl 2g을 가하여 10x 인산완충식염수(PBS)를 준비한다. 오토클레이브는 10x PBS를 제조하고, 900mL의 증류수에 10x 용액 100mL를 첨가하여 이를 1x 용액으로 희석한다. 이어서, 용액을 4°C에서 보관한다.
- 증류수 1L에 DPBS 분말 4.78g을 첨가하여 Dulbecco's PBS(DPBS)를 준비합니다. 모든 고체가 용해 될 때까지 용액을 저어주고 pH 측정기를 사용하여 pH를 확인한 다음 1M NaOH 또는 1M HCl (pH 7.3-7.4)을 첨가하여 조정합니다. 원하는 pH 수준에 도달한 후 멸균 캐비닛에서 0.22μm 진공 필터를 통해 배지를 여과합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
- 증류수 1L에 HEPES 238.3g을 첨가하여 1M 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES) 완충용액을 준비한다. pH 7.5가 될 때까지 1M NaOH로 용액의 pH를 조정합니다. 멸균 캐비닛의 0.22μm 진공 필터를 통해 여과합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
- 1x 용액을 희석하여 1x 트립신-EDTA(EDTA = 에틸렌디아민테트라아세트산) 용액을 준비합니다. 이렇게 하려면 50mL 멸균 튜브에 있는 45mL 1x PBS 용액에 10배 트립신-EDTA 5mL를 추가합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
- 1L의 증류수에 DMEM 고포도당 분말 13.4g과Na2CO33.7g을 교반판에 자석 교반봉을 놓고 측정 실린더에 넣어 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) basic을 준비합니다. 모든 고체가 용해 될 때까지 용액을 저어주고 pH 측정기를 사용하여 pH를 확인한 다음 1M NaOH 또는 1M HCl (pH 7.3-7.4)을 첨가하여 조정합니다. 바람직한 pH에 도달한 후, 멸균 캐비닛에서 0.22 μm 진공 필터를 통해 배지를 여과하고 4°C에서 보관한다.
- DMEM 염기성 900mL에 소태아혈청(FBS) 100mL, 페니실린-스트렙토마이신 용액 10mL, L-글루타민 용액 10mL, 1M HEPES 완충액 10mL를 넣어 DMEM 완전배지를 준비한다. 4 °C에서 보관하십시오.
- 테스트 화합물에 대한 원액을 준비합니다.
- 각 화합물에 대해 고리 폐쇄 포토폼에 있는 5.12mg(예: LMB002) 2개의 1.5mL 미세 원심분리기 튜브(하나는 투명하고 다른 하나는 검은색 불투명 벽)로 무게를 잰다. 2.28mg의 양성 대조군(예: 그라미시딘 S)을 매우 투명한 벽 튜브에 잰다. 각 샘플에 100μL의 순수 DMSO를 추가하고 30초 동안 소용돌이칩니다.
- 투명 벽 튜브의 원액(LMB002)을 660nm 레이저(광출력 밀도 0.6W/cm2)로 조사하여 "링 폐쇄"에서 "링 개방" 형태로 광이성질화하여 완전한 혼합을 보장합니다. 색상이 짙은 자주색에서 밝은 갈색으로 눈에 띄게 바뀔 때까지 계속하십시오. 알루미늄 호일을 사용하여 빛으로부터 보호하십시오.
- 2D 세포 배양 실험-세포 파종(1일차)
- 10 mL의 DMEM 완전 배지를 LLC 세포 배양물과 함께 T-75 플라스크로부터 15 mL 멸균 튜브로 옮긴다. 진공 펌프로 남은 매체를 흡입합니다.
- 5mL의 1x DPBS로 세포 배양액을 세척하고 진공 펌프로 용액을 흡인합니다.
- 세포를 3 mL의 1x 트립신-EDTA 용액으로 덮고, 플라스크를 5%CO2 분위기 하에 37°C에서 2-3분 동안 인큐베이션한다.
- 1x 트립신-EDTA 용액이 들어 있는 세포 배양 플라스크에 DMEM 배지(이전에 멸균 튜브로 옮김) 6mL를 추가하고 현탁액을 여러 번 피펫팅하여 세포 배양 플라스크 벽에서 세포를 씻어냄으로써 트립신 작용을 중지합니다.
- 현탁액을 15mL 튜브로 옮기고 200× g 에서 4분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 진공 펌프로 상층액을 흡인합니다. 튜브 바닥에 있는 세포 펠릿을 만지지 마십시오.
- 2mL의 새로운 DMEM 완전 배지를 추가하고 여러 번 피펫팅하여 세포를 재현탁합니다.
- 약 15 μL의 현탁액을 0.5 mL 튜브에 샘플링하고, 15 μL의 0.4% 트립판 블루를 첨가하고, 수득한 혼합물을 세포 계수 챔버로 옮겨 세포를 계수한다.
- 계수 후, 시점당 25mL의 세포 현탁액을 준비한다. 투명한 바닥과 검은색 불투명 벽이 있는 96웰 플레이트의 중앙 60웰에 있는 200μL의 DMEM에 5,000-10,000개(평균 8,000개) LLC 세포/웰을 시드합니다. 나머지 36개의 웰을 순수 DMEM으로 채웁니다.
- 플레이트를 37°C 및 5% CO2에서 하룻밤 동안 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 바닥판의 고르지 않은 가열을 방지하기 위해 아래에 플라스틱 판 뚜껑을 사용하십시오.
- 2D 세포 배양 실험 - 화합물 첨가(2일째)
- 세포가 70%-80% 밀도에 도달할 때까지 플레이트에서 광학 현미경으로 세포를 모니터링합니다.
- 멸균 캐비닛의 진공 펌프로 우물에서 매체를 흡인합니다. 예열된 신선한 DMEM 배지 100μL를 추가하고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다.
- 테스트 화합물의 연속 희석액과 폴리프로필렌 오토클레이브 투명 플레이트에서 양성 대조군을 준비합니다. 개별 시점 측정에 대해 다음과 같은 솔루션을 만듭니다.
참고: DMSO의 스톡으로 시작하여 DMEM으로 희석하되 최종 최고 농도에서 DMSO의 1% v/v를 초과하지 마십시오.- 그라미시딘 S의 128 μM 용액을 수득하기 위해, 198.7 μL의 DMEM에 1.3 μL의 20 mM 저장 용액을 첨가한다.
- "개환" 형태의 LMB002의 256 μM 용액을 수득하기 위해, 198.7 μL의 DMEM에 1.3 μL의 40 mM 용액을 첨가한다.
- "고리-닫힌" 형태의 LMB002의 512 μM 용액을 얻기 위해, 197.4 μL의 DMEM에 2.6 μL의 40 mM 저장 용액을 첨가한다.
- 각 농도 지점의 4세트를 얻기 위해 3번의 추가 반복을 수행합니다. 각 시작 웰에서 100 μL를 흡인하고, 100 μL의 DMEM이 있는 웰로 옮기고, 완전히 혼합하여 이중 희석 시리즈를 준비합니다.
알림: 광전환 가능한 화합물로 작업하려면 다시 광이성질화를 방지하기 위해 조명 조정이 필요합니다. 멸균 캐비닛의 조명을 끄는 것이 좋습니다. - 미리 첨가된 DMEM 100μL와 함께 56개의 웰에서 매번 100μL의 준비된 용액을 옮겨 웰(5-150μM)에서 화합물의 최종 농도를 얻습니다. 4개의 웰에 매번 100μL의 DMEM을 추가하여 음성 대조군으로 사용합니다.
- 제어되지 않은 광 전환을 방지하기 위해 알루미늄 호일 또는 플라스틱 보호용 불투명 덮개로 플레이트를 덮으십시오. 선택한 배양 시간(10분, 60분, 24시간 또는 72시간) 동안 37°C(여분의 플라스틱 플레이트 뚜껑 아래 사용)의 세포 배양 배양기에 플레이트를 놓습니다.
- 2D 세포 배양 실험 - 염색 및 이미징(2-5일)
- 상이한 기간 동안 화합물과 함께 배양한 후, 10분 및 60분 동안 화합물과 함께 인큐베이션한 플레이트에 웰 당 50μL의 염색 용액을 추가합니다. 플레이트를 37°C에서 20분 동안 인큐베이션합니다.
참고: 8μL의 20mM Hoechst 33342 용액(최종 농도는 5μM), 32.5μL의 1mM 프로피듐 요오드화물(PI) 용액(최종 농도는 1μM) 및 650μL의 비멸균 FBS를 5,810μL의 비멸균 1x PBS에 추가하여 시점당 스톡 염색 용액을 준비합니다. 세포가 온도 충격을 받는 것을 방지하기 위해 37°C의 수조에서 FBS 및 PBS를 예열합니다. - 20x 대물 렌즈를 사용하여 자동 형광 이미징을 수행합니다.
- 24일(3일) 및 72일(5일) 동안 화합물과 함께 인큐베이션된 플레이트에 대해 동일한 염색 및 이미징 절차(단계 1.4.1 -1.4.2)를 반복합니다.
참고: 일반적인 2D 플레이트 맵은 그림 2에 나와 있습니다.
- 상이한 기간 동안 화합물과 함께 배양한 후, 10분 및 60분 동안 화합물과 함께 인큐베이션한 플레이트에 웰 당 50μL의 염색 용액을 추가합니다. 플레이트를 37°C에서 20분 동안 인큐베이션합니다.
- 3D 세포 배양 실험 - 세포 파종(1일차)
참고: 이 섹션의 단계는 2D 실험(세포 배양 준비, 테스트된 화합물로 배양 및 이미징)에 대해 설명된 단계와 동일합니다(1.1-1.4단계). 그러나 이 경우 셀은 검은색의 불투명한 벽이 있는 384웰 초저접착 U자형 바닥 플레이트에서 콤팩트한 성숙 스페로이드로 준비됩니다. 이 크기의 플레이트를 사용하면 한 번의 실험에서 두 화합물을 비교할 수 있습니다.- LLC 세포 배양을 사용하여 2D 실험 프로토콜에서 1.2.1-1.2.9단계를 반복합니다.
- 세포를 계수한 후, 25mL의 세포 현탁액을 준비한다. 384웰의 저결합 U자형 바닥판에 있는 50μL의 DMEM에 있는 모든 웰에서 웰당 1,000개의 세포를 시딩합니다.
- 40 × g 에서 30 초 동안 원심 분리하고 플레이트 셰이커로 250 rpm에서 1 분 동안 흔들어 웰 벽에서 바닥까지 세포를 흔들어줍니다.
- 플레이트를 37°C 및 5%CO2 의 인큐베이터에 배치하여 플레이트 바닥이 48시간 동안 고르지 않게 가열되는 것을 방지하기 위해 여분의 플라스틱 플레이트 뚜껑 위에 놓습니다.
- 3D 세포 배양 실험 - 화합물 첨가(3일째)
- 현미경으로 플레이트의 세포를 모니터링하여 콤팩트한 성숙 스페로이드가 형성되었는지 확인합니다.
- 폴리프로필렌 오토클레이브 투명 플레이트에서 연구된 화합물의 연속 희석을 준비합니다. 이 경우 추가 화합물을 포함하십시오. 개별 시점 측정에 대해 다음과 같은 솔루션을 만듭니다.
- 그라미시딘 S의 175 μM 및 350 μM 용액을 얻기 위해, 198.2 μL의 DMEM에 1.8 μL의 20 mM 저장 용액을 추가하고, 그에 따라 196.4 μL의 DMEM에 3.6 μL의 스톡을 추가한다.
- LMB002의 175 μM 및 350 μM 용액을 얻기 위해, "링 개방"형태, 199 μL의 DMEM에 1 μL의 40 mM 저장 용액을 추가하고, 1.8 μL의 스톡을 198.2 μL의 DMEM에 첨가한다.
- LMB002의 350μΜ 및 1,750μM 용액을 얻으려면 "고리 폐쇄" 형태로, 198.2μL의 DMEM에 1.8μL의 40mM 원액을 추가하고 이에 따라 191.2μL의 DMEM에 8.8μL의 스톡을 추가합니다.
- 3번의 추가 반복을 수행하여 각 농도점의 4세트를 얻습니다. 각 시작 웰에서 20 μL를 빼내고 180 μL의 DMEM과 함께 웰로 옮기고 완전히 혼합하여 연속 희석액을 얻습니다.
알림: 광전환 가능한 화합물로 작업하려면 다시 광이성질화를 방지하기 위해 조명 조정이 필요합니다. 멸균 캐비닛의 조명을 끄는 것이 좋습니다. - 50 μL의 DMEM을 함유하는 128개의 웰에 매번 20 μL의 준비된 용액을 옮겨 웰에서 화합물의 최종 농도를 얻는다. 대조군 역할을 하기 위해 3개의 웰에 매번 20μL의 DMEM을 추가합니다. 광전환 또는 증발을 방지하기 위해 알루미늄 호일 또는 플라스틱 보호 덮개로 플레이트를 덮으십시오.
- 선택한 배양 시간 동안 플라스틱 플레이트 뚜껑의 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 놓습니다.
- 3D 세포 배양 실험 - 염색 및 이미징(3-6일)
- 1 mM 칼세인 AM 용액 13 μL(최종 농도는 1 μM), 20 mM Hoechst 33342 용액 22 μL(최종 농도는 33 μM), 1 mM PI 용액 40 μL(최종 농도는 3 μM), 비멸균 FBS 300 μL를 비멸균 1x PBS 2,625 μL에 첨가하여 시점당 염색 용액을 준비한다. 세포가 온도 충격을 받는 것을 방지하기 위해 37°C의 수조에서 FBS 및 PBS를 예열합니다.
- 화합물과 함께 상이한 기간 동안 배양한 후, 10분 동안 화합물과 함께 인큐베이션한 웰에 웰 당 20 μL의 염색 용액을 첨가한다. 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
- 20x 대물 렌즈를 사용하여 형광 컨포칼 이미징을 수행합니다.
- 24시간(4일) 및 72시간(6일) 동안 화합물과 함께 배양된 웰에 대해 동일한 염색 및 이미징 절차를 반복합니다.
참고: 이 실험에서 칼세인 AM은 다색 염색 용액의 세 번째 성분으로 사용됩니다. 2D 및 3D 실험에서 얻은 이미지는 기기의 자동 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 분석됩니다. Hoechst 및 프로피듐 요오드화물 염료와 함께 염색된 세포는 괴사적으로 죽은 것으로 간주되며, 농도의 함수로서의 분획은IC50 값을 계산하는 데 사용됩니다.
그림 2: 2D 배양 실험을 위한 일반적인 플레이트 맵의 예. 화합물 및 대조군에 대한 색상 코드가 표시됩니다. 시험된 화합물의 농도(웰 내부의 수)는 μM으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. 조직 대리모의 광전환 효율 결정
- 그림 3과 같이 샘플 조사를 위한 광학 트레인을 조립합니다(레이저 광원의 광 케이블, 가변 초점 거리의 렌즈, 불투명 커버가 있는 주사기 및 평평한 절단 끝으로 구성됨).
- 렌즈의 초점 거리와 조리개를 변경하여 사용된 주사기의 내경보다 1-1.5mm 더 큰 직경을 가진 평평한 광선을 얻을 수 있지만 가능한 한 조리개 내에 있습니다.
- 끝이 절단되고 내경이 12.4mm이고 불투명 플라스틱 덮개로 덮인 5mL 주사기를 사용하십시오. 200mW의 레이저 출력에서 광도계로 측정한 대로 광학 시스템 출력의 전력 밀도를 ~103mW/cm2 로 설정합니다.
알림: 모든 후속 작업은 가능한 최소한의 작업장 조명이 있는 어두운 방에서 수행해야 합니다. - PBS에 3mg/mL 농도의 LMB002("고리 폐쇄" 형태) 원액을 1mL 준비합니다.
- 플라스틱 용기에 LMB002의 비활성 광형이 로딩된 모델 조직 샘플을 준비한다. 일반적인 실행에서 신선한 다진 돼지고기 5g을 LMB002 원액 277μL 및 PBS 260μL와 기계적으로 혼합하여 샘플의 최종 농도 50mg/kg에 도달하고 조직/PBS 비율이 ~9/1(v/v)입니다.
- 준비된 샘플로 주사기를 채우고 내부에 기포가 없는지 확인하고 노출(절단) 끝에서 평평한 표면을 형성합니다.
알림: 주사기에 있는 샘플의 실린더는 축을 따라 ~40mm를 차지해야 합니다. - 방사선 조사amp 그림 3 과 같이 광학 트레인에서 9분 44초 동안 ~60J/cm2 노출에 해당합니다.
- 노출 후 피스톤을 사용하여 주사기에서 밀어내고 메스로 절단하여 4mm 두께의 샘플 조각을 준비합니다. 슬라이스의 무게를 측정하여 별도의 시험관에 넣고 조사된 표면으로부터의 평균 거리(mm)로 표시합니다.
- 시험관에서 두 개의 대조군 샘플 (최적량, 0.5-0.7 g)을 준비한다 : 하나는 PBS (54 μL)의 10 % (부피)와 혼합 된 다진 고기이고, 다른 하나는 2.4 단계에서 얻은 모델 조직 샘플을 10 분 동안 500 mW 레이저 광으로 조사하여 모든 LMB002 "고리 폐쇄"분자가 "고리 개방"형태로 전환되도록한다.
- 아세토니트릴-물 혼합물(70%/30% v/v, 0.01% 트리플루오로아세트산(TFA) 보충, 1.4mL/g)을 각 슬라이스와 대조군 샘플에 추가합니다. 유리 막대를 사용하여 내용물을 완전히 혼합하십시오.
- 실온에서 최소 10분 동안 인큐베이션하고, 혼합물을 5220 x g에서 20분 동안 원심분리하거나, 20 x g 에서 30분 동안 2회 원심분리하여 불용성 물질을 제거하고 상청액을 수집한다.
- 상층액(~0.7mL)을 조심스럽게 수집하고 16,000 x g 에서 30분 동안 다시 원심분리합니다.
- 상층액(각각 ~0.5mL)을 수집하고 분석용 C18 컬럼, 3.46% B/min의 선형 A:B 그래디언트, 2.0mL/min 유속 및 100μL의 주입 부피를 사용하여 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP HPLC)로 분석합니다. UV 검출 크로마토그램을 570nm("고리 닫힘" 형태 검출) 및 270nm("고리 개방" 형태 검출)에서 기록합니다. 조사되지 않은(단계 2.4) 및 조사된 대조군(단계 2.8) 샘플을 사용하여 두 광형의 특이적 머무름 시간을 결정하고(용리액 A: 수성 0.1% TFA; 용리액 B: 90% 아세토니트릴-물, 0.1% TFA) 방법을 보정합니다.
- 알려진 농도의 LMB002 용액의 크로마토그램을 취하여 분석한 검량선을 사용하여 분석된 샘플에서 LMB002 광형의 실제 양을 결정합니다. 보정을 위해 원액(2.3단계)을 아세토니트릴-물 혼합물(0.01% TFA로 보충된 70%/30% v/v)로 희석하여 LMB002 "링 폐쇄" 용액을 준비하여 100μL(주입된 부피)당 0.36, 0.9 및 3.6μg; 용리액 기울기 및 유속은 단계 2.12와 동일합니다.
- 실험 (2.4-2.12 단계)을 세 번 반복하고 플롯 (백분율) 대 거리 (조사 된 조직 표면으로부터)에 각 광형의 정규화 된 백분율을 플로팅합니다. 통계(즉, 각 농도 지점에서의 표준 편차)를 계산합니다.
그림 3: 모델 조직에서 광변환의 효율을 결정하기 위한 실험 설정. (a) 개략도 및 (b) 사진; 1, 레이저 광원의 광 케이블; 2, 가변 초점 거리의 렌즈; 및 3, 고기 다진 고기-LMB002-포스페이트-완충 식염수 혼합물 4에 넣고, 불투명 커버 및 절단된 프론트엔드를 갖는 주사기(커버 없이 (B)에 나타냄). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3. 생체 내 항암 효능 결정
참고: 실험 일정과 끝점은 그림 4에 나와 있습니다. 후처리 기간의 동물 관리 기준은 적절한 케이지 밀도와 자원 가용성을 포함해야 하는 3R 규칙을 준수해야 합니다. 가능하면 터널이나 부항과 같은 혐오적이지 않은 동물 취급 방법을 준수하십시오.
도 4: 생체 내 치료 실험 일정. 실험 그룹의 지정, 치료 세부 사항, 종점 및 사후 분석 일정. 약어: LLC = 루이스 폐암; IV = 정맥 주사; SC = 피하. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 피하접종을 위한 암세포의 제조(0일).
- LLC 세포를 37°C 및 5%CO2에서 10% FBS, 100 U/mL 페니실린, 및 100 μg/mL 스트렙토마이신과 함께 DMEM(4.5 g/L 글루코스)으로 계대배양하였다.
- 0.05% 트립신-EDTA 용액을 사용하여 세포를 수확하고, 원심분리하고, 무혈청 DMEM에 현탁시킨다.
- 세포를 계수하고 혈구계 및 트리판 블루 배제 테스트를 사용하여 생존력을 결정합니다.
- DMEM과 Matrigel 혼합물(1:1)에서 농도 10 ×10 6 cells/mL의 최종 세포 현탁액을 준비합니다. 주사하기 전에 현탁액을 얼음 위에 보관하십시오.
- LLC 세포 접종(0일)
- 성인 여성 C57BL/6NCrl 마우스(무게 ~20g)를 이소플루란 마취기의 유도 챔버에 넣습니다. 이소 플루 란의 5 %에서 진정 작용을 수행하고 동물이 완전히 의식을 잃을 때까지 기다리십시오.
- 면도하여 세포 접종 부위에서 모피를 제거하십시오.
- ~100μL의 DMEM: Matrigel(1:1) 혼합물에 5 ×10 5 LLC 세포를 오른쪽 뒷다리에 접종합니다.
알림: 가능하면 단일 바늘 사용 방법을 준수하십시오.
- 화합물 투여 및 광조사
참고: 접종 후 5-8일 이내에 동물은 종양이 만져지고 ~50-100mm3 부피에 도달하면 치료 준비가 됩니다. LMB002 및 세미 다크 조건 (작업장에서 최소 5m 떨어진 4W LED 램프 1 개)에서이 화합물로 처리 된 마우스로 모든 후속 작업을 수행하십시오.- LMB002("고리 폐쇄" 형태)를 5mg/kg(IV) 용량의 1mg/mL 농도로 멸균 생리 식염수에 용해시켜 진한 파란색 균질 용액을 얻습니다.
- 방사선 조사 전에 8 마리의 동물로 구성된 4 개의 그룹을 무작위로 조립하고 면도하여 종양 및 인근 부위에서 모피를 제거합니다.
- IV 주사를 위해 마우스를 홀더에 넣고 꼬리 정맥이 보이도록 37°C의 수조에서 동물의 꼬리를 예열합니다.
참고: 수술 전 진통제를 고려하십시오. - 꼬리 정맥에 5mL/kg의 화합물을 주입합니다. 두 대조군의 경우 동물당 100μL의 식염수(정맥 주사)(체중 20g)를 주사합니다. 두 실험 그룹의 동물이 비활성 광형(식염수 중 1mg/mL)으로 테스트된 화합물을 받도록 합니다.
알림: 가능하면 단일 바늘 사용 방법을 준수하십시오. - 그런 다음 화합물을 주입 한 후 2 시간 45 분 후에 마우스를 마취하에 놓습니다. 산소에서 3%-4% 이소플루란으로 진정을 유도합니다. 산소에 있는 0.5%-1% isoflurane를 가진 15 분 동안 마취를 유지하십시오.
- 종양 부위 만 빛에 노출시키는 구멍이있는 검은 색 마스크로 마우스를 덮으십시오.
- 650nm 레이저로 레이저 다이오드 모듈을 켜고 적색 레이저의 출력을 200mW로, 청색/UV 가이드 레이저의 출력을 2mW로 설정합니다.
알림: 레이저 장치가 켜져 있을 때 파란색 보호 안경을 사용하십시오. - 광도계로 적색 레이저(생쥐에서 떨어짐)의 광속을 측정하고 광속이 100mW/cm2인 광케이블과의 거리를 결정합니다. 광원이 종양에서 결정된 거리에 있고 빛이 전체 종양 영역을 덮도록 스탠드에 케이블을 고정합니다. 이 절차 중에 청색/UV 가이드 레이저 광을 사용하십시오.
- 적색 레이저를 켜서 종양 부위를 20분 동안 조사합니다.
- 조사 후, 이소 플루 란 흐름을 끄고 동물을 새장으로 되돌려 놓고 다음 30 분 동안 상태를주의 깊게 관찰하십시오.
참고: 복합 투여 후 마우스를 2일 동안 어둠 속에 보관하십시오. 빛의 낮 주기만 변경되어야 합니다. 다른 모든 주거 조건은 변경되지 않아야 합니다.
- 후처리 관찰
- 매일 동물을 관찰하고 종양의 무게와 크기를 측정하십시오. 종양 부피를 측정하고 괴사의 진행을 기록하십시오.
참고: 후처리 기간의 동물 관리 기준은 적절한 케이지 밀도와 자원 가용성을 포함해야 하는 3R 규칙을 준수해야 합니다. - 이전 단계에서 수집한 데이터를 사용하여 사망률을 평가합니다. 표준 절차를 사용하여 생존율을 결정하십시오.
참고: 심각한 임상 징후(체중 15% 이상 감소, 종양 궤양이 7일 이내에 치유되지 않음, 발성)가 나타나거나 종양 부피가 2,500mm3에 도달하자마자 동물을 희생하고 죽은 것으로 간주해야 합니다.
- 매일 동물을 관찰하고 종양의 무게와 크기를 측정하십시오. 종양 부피를 측정하고 괴사의 진행을 기록하십시오.
Representative Results
이 작업에서, 상이한 배양 시간에서 LMB002의 "고리-폐쇄" 및 "고리-개방" 형태(도 1 참조)에 대한IC50을 결정하기 위해 2D 및 3D 세포 실험을 수행하였다. 이 값은 프로토타입 펩타이드인 그라미시딘 S(양성 대조군으로 사용됨)에 대해 얻은 값과 비교되었습니다. 염색 후 2D-성장 LLC 배양물에서 배양한 전형적인 이미지 세트가 그림 5에 나와 있습니다. Hoechst 33342(파란색) 및 프로피듐 요오드화물(빨간색)과의 동시 염색은 "고리 폐쇄"와 비교하여 "고리 개방" 형태로 처리한 경우 세포의 더 큰 부분에서 다른 보라색 음영을 초래하여 쉽게 정량화할 수 있는 두 형태 간의 세포 독성에서 눈에 띄는 차이를 나타냅니다. 성공적인 실험의 입증된 예는 그림 2와 같이 다양한 농도의 펩타이드 변이체가 추가된 96웰 플레이트 형식을 사용하여 수집된 데이터를 기반으로 합니다. 384웰 및 고밀도 플레이트에서도 유사한 데이터를 얻을 수 있습니다. 그러나, 웰당 부피가 감소하기 때문에, 기술적 및 체계적 에러가 발생하고, 그 결과, 웰 밀도가 증가함에 따라IC50 측정의 정확도가 감소할 것이다.
그림 5: 단층 성장 LLC의 세포독성 분석의 대표 이미지. 세포를 Hoechst 33342 (청색) 및 요오드화 프로피듐 (적색)으로 염색하였다. 표시된 시간: 10분, 60분, 24시간 및 72시간은 화합물을 사용한 배양 시간입니다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
모델 조직에서의 레이저 광 조사에 의한 LMB002의 광변환-신선한 돼지고기 다진 고기-를 PBS에 용해된 LMB002 "고리-닫힘"(비활성) 형태와 혼합된 다진 고기로 구성된 샘플을 사용하여 결정하고, 방사선 전파 방향에서 LMB002 "고리-개방"(활성화된) 형태로의 이러한 비활성 형태의 전환을 측정하였다. 샘플을 주사기에 넣고 그림 3과 같이 ~10분(일반적으로 생체 내 실험에 사용됨)의 노출 시간 동안 평평한 레이저 방사선 빔으로 한쪽에서 조사했습니다. 노출 후, 샘플 실린더는 주사기 피스톤을 누르고 메스로 동일한 높이의 슬라이스를 절단하여 부분으로 나누었습니다. 절편으로부터의 추출물 중의 LMB002 "개환"의 농도를 RP HPLC를 사용하여 측정하였다.
도 6은 데이터 분석으로부터 얻어진 용량-효과 곡선 도 6A-D를 도시한다. Hoechst 33342 및 PI 염료의 핵 동시 염색으로 죽은 세포의 비율을 식별하기 위해 선택한 측정 매개변수에서 수치 임계값을 설정하여 모든 세포 수를 여러 범주로 분할하는 내장 분류기 도구를 사용했습니다. 예를 들어, 대조군의 적색 채널(프로피듐 요오드화물) 신호가 임계값(약 110-130 단위)에 있을 때 세포는 죽은 것으로 간주되는 PI 양성 또는 화합물의 영향을 받지 않는 것으로 간주되는 PI 음성으로 분류될 수 있습니다. LMB002의 경우, 화합물 농도에 대한 프로피듐 요오드화물 양성 세포의 백분율의 S상 결장성 의존성을 볼 수 있습니다. 이들 데이터로부터,IC50 값이 결정될 수 있다.
그림 6: 2D 배양에서 세포독성 분석. 화합물과의 인큐베이션을 위해 취한 (A) 10분, (B) 60분, (C) 24시간 및 (D) 72시간 간격 동안 LLC 배양에서 얻은 시그모이드 적합. 피팅을 통해IC50 값(도시되지 않음)을 정확하게 측정할 수 있습니다. 오차 막대는 SEM입니다. 약어: LLC = 루이스 폐암; PI = 요오드화 프로피듐. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
얻어진 IC50 값을 고려할 때, 우리는 세 가지 화합물 모두의 독성이 배양 시간에 따라 증가한다는 결론을 내릴 수 있습니다. 우리의 실험은 LMB002의 "환-개방" 형태가 프로토타입 펩티드인 그라미시딘 S보다 약 1 희석 단계 덜 독성인 반면, "환-폐쇄" 형태는 배양 시간에 따라 증가하는 3 내지 4개의 희석 단계 더 낮은 독성을 입증하는 것으로 밝혀졌다. 두 희석 단계 사이의 차이는 배양 시간의 증가에 의해 영향을 받지 않으며, 잠재적인 라이브러리 스크리닝에서 다른 화합물과 비교하기 위해 실험적으로 결정된 광치료 윈도우(6 )로서 수치적으로 사용될 수 있다. 그라미시딘 S에 대한IC50 값은 생물학적 복제물에서 실험 오류 또는 차등 출력을 수정하기 위한 기준점으로 설정되었습니다.
3D 세포 실험은 동일한 유형의 원시 데이터, 즉 단일 세포 분해 웰당 하나의 스페로이드 이미지를 생성했습니다. 세 번째 염색 염료로 칼세인을 포함하면 대사 활성 세포의 분획을 정량화할 수 있습니다(녹색 채널에서 관찰됨). 384웰 플레이트를 사용하고, 기술 복제 횟수를 늘리고, 중복 공동 배양 시점을 제외하고, 희석 폴드를 변경함으로써 그림 7의 플레이트 맵에 표시된 대로 단일 테스트 실행(단일 플레이트 사용)에서 여러 화합물을 직접 비교할 수 있었습니다.
그림 7: 두 가지 화합물을 사용한 3D 배양 실험을 위한 플레이트 맵. 화합물 및 대조군에 대한 색상 코드가 표시됩니다. 웰의 숫자는 μM 단위의 농도입니다. 10분, 24시간 및 72시간은 배양 시간입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8은 염색 후 캡처된 테스트 화합물 및 대조군 스페로이드의 존재 하에서 1 스페로이드/웰의 밀도로 성장한 LLC 스페로이드의 선택된 기술 복제 이미지를 표시합니다.
그림 8: 3D 배양 세포독성 분석의 대표 이미지. 이미지는 LMB002 광형과 그라미시딘 S와 함께 10분, 24시간 및 72시간 동시 배양 후 Hoechst 33342(파란색), 칼세인 AM(녹색) 및 요오드화 프로피듐(빨간색)으로 염색된 48시간 된 LLC 스페로이드를 보여줍니다. 스케일 바 = 100μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
기기 소프트웨어를 사용하여 2D 실험에서와 같은 선량-효과 곡선을 z-스택 이미지 더미에서 얻었습니다(그림 9A). 또한, 3D 배양에서 조밀하고 변형되지 않은 스페로이드는 전체 스페로이드 직경으로 특성화할 수 있습니다(그림 9B). 또한 전체 스페로이드 직경은 화합물 농도에 따라 달라진다는 점에 주목했습니다.
그림 9: 3D 배양을 통한 세포 독성 평가. (A) 농도 의존적 세포독성 피팅 곡선 및 (B) 10분, 24시간 및 72시간 동안 그라미시딘 S와 공동 배양하고 염색 전에 캡처한 LLC의 3D 배양에서 얻은 농도 의존적 스페로이드의 직경 플롯. 오차 막대는 SEM입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2단계에 대한 실험에서는 UV 검출 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 두 광형에서 LMB002 농도를 측정할 수 있습니다. 모델 조직에서 광변환의 효율은 이 설정을 사용하여 쉽게 평가하고 정량화했습니다(그림 3). 데이터는 샘플 추출물의 크로마토그램의 정량 분석으로부터 얻어졌다. 이 테스트 실험에서 LMB002 크로마토그램은 270nm 및 570nm에서 분광법으로 검출되었습니다. 270 nm에서, 많은 추가 신호가 관찰되었고, 모델 조직으로부터 공동 추출된 화합물에 기인하였다 (화합물 없이 대조군 추출물로부터 확인됨). 두 광형은 머무름 시간과 흡광도에서 충분히 달랐습니다. 그러나, LMB002 "링-오픈(ring-open)" 신호는 이들 배경 신호로부터 기준선-분리되었다( 도 10A의 대표적인 크로마토그램 참조). 따라서 이 신호는 문제 없이 통합될 수 있습니다. 570nm에서 크로마토그램에는 LMB002 "고리 폐쇄" 형태 신호만 포함되었습니다(그림 10B). 여기서, RP HPLC를 이용하여 농도 측정을 수행하였다. 그럼에도 불구하고 LC/MS를 분석 방법으로 사용하여 더 높은 정확도와 더 낮은 검출 한계를 달성할 수 있었습니다.
그림 10: 모델 조직에서 추출한 LMB002의 대표적인 크로마토그램. (a) 조사된 표면으로부터 2 mm에서의 샘플, 270 nm에서 기록됨 (LMB002 "개환" 형태가 집적됨); (b) 조사된 표면으로부터 38 mm에서의 샘플, 570 nm에서 기록됨 (LMB002의 피크 "고리-폐쇄"가 집적됨). 머무름 시간 값(표시됨)은 화합물의 정체를 추가로 확인했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
수집된 모든 샘플의 해당 신호를 통합한 후 얻은 데이터는 그림 11과 같이 농도-깊이 그래프를 작성하는 데 사용되었습니다. 이러한 그래프를 기반으로 모델 조직의 다른 깊이에서 광변환 효율을 쉽게 평가할 수 있습니다. 그것은 우리의 적색 광원이 조직 대리모, 다진 고기(약 103mW/cm 2에서)에서 최대 1c 깊이에서 "고리 닫힘"LMB002 광변환을 유도한다는 것을 확인합니다.
그림 11: 광변환 효율 평가. 모델 조직(L, mm)의 조사된 표면에서 서로 다른 거리에 있는 LMB002 "고리 닫힘"(비활성화, 파란색 점) 및 "고리 개방" 형태(활성화됨, 주황색 점)의 농도(A, mg/kg). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
생체 내 실험의 결과(그림 4에 제시된 일정에 따라 수행된 방법론의 3단계)는 시간의 함수로서 종양 성장을 보여주는 그래프(그림 12)와 Kaplan-Meier 생존 곡선(그림 13)으로 표시되었습니다.
그림 12: 동물의 종양 성장 역학. 비히클-처리된 동물과 비교하여 LMB002로 처리된 동물 (C57BL/6NCrl 마우스의 피하 LLC 동종이식 모델, 화합물 용량 7 mg/kg, IV, 2시간 40분 인큐베이션, 그 후 650 nm, 100 mW/cm2, 20 분에서 방사선 조사). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 13: 동물의 사망률 곡선. 비히클-처리된 동물과 비교하여 LMB002로 처리된 동물 (C57BL/6NCrl 마우스의 피하 LLC 동종이식 모델, 화합물 용량 7 mg/kg, IV, 2시간 40분 인큐베이션, 그 후 650 nm, 100 mW/cm2, 20 분에서 방사선 조사). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
광제어 화합물은 약물 개발에서 전례가 없습니다. 그러나 전임상 및 임상 평가를 위한 방법은 확립되지 않았습니다. 가장 가까운 단일 요법 유사체 인 광 역학 요법 (PDT)은 암에 대해 많은 국가에서 채택한 임상 사용을위한 치료 방식이며 다른 적응증에 대해 개발 중입니다19,20. 광약리학과 유사하게, PDT는 또한 빛을 사용하여 생리 활성 물질(일중항 산소)을 활성화하는 것을 기반으로 합니다. 따라서 PDT의 전임상 및 임상 연구에 사용되는 일부 실험 방법을 광약리학에 채택할 수 있습니다. 예를 들어, 광원, 광 전달 접근법 및 의료 기기는 PDT에 대해 잘 개발되고 승인되었습니다. 그들은 광제어 약물의 평가에 직접 사용할 수 있습니다. 그러나 PDT와 광약리학은 서로 많은 차이점을 가지고 있다4, 이는 후자에 대한 구체적인 방법을 확립할 필요성을 정당화한다.
첫째, PDT(산소)의 비활성 물질은 항상 무독성 농도로 생체 조직에 존재합니다. 대조적으로, 활성화되지 않은 광제어 생물학적 활성 화합물은 잔류 활성 및 원치 않는 독성을 가질 수 있습니다. 따라서 이상적인 광약리학 약물은 투여된 형태에서 생물학적 활성을 최소화해야 하고 광생성 형태에서 매우 활성이어야 하며, "광치료 창"(21 )은 가능한 한 커야 합니다. 적중을 찾고 적중-리드 최적화를 수행하려면 이미 약물 개발의 초기 단계에 있는 적합한 화합물을 식별하고 비교적 큰 라이브러리를 스크리닝해야 합니다. 여기에서 우리는 효율적인 광전환 화합물을 식별하기 위해 자동화된 고처리량 공초점 형광 현미경을 제안했습니다.
선택된 세포 독성 평가 방법을 사용하면 PSS의 유지 또는 가시 광선에 민감한 광 이성질체의 안정성과 같은 가장 중요한 요구 사항을 쉽게 구현할 수 있습니다. 이는 구현 시 빛 노출이 최소화되기 때문입니다. 따라서 대체 방법을 선택하는 경우 자동화된 방법을 선호해야 합니다. 이 접근 방식은 신뢰할 수 있고 유익합니다. 이 단계에서 3D 세포 배양(스페로이드)을 사용하면 보다 현실적인 조직과 같은 미세 환경에서 치료에 대한 세포의 반응에 대한 전체적인 이해를 얻을 수 있습니다. 또한, 화합물의 작용 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력은 직접적인 방법으로 현미경을 사용하여 얻을 수 있습니다. 적절한 염색 프로토콜을 사용하는 컨포칼 형광 현미경을 사용하면 세포와 스페로이드의 형태를 시각적으로 평가할 수 있습니다. 세포 사멸 및 세포 내부의 변화에 대한 중요한 세부 사항도 감지할 수 있습니다.
둘째, 가벼운 적용은 가벼운 복용량의 신중한 선택이 필요합니다. PDT에서 가벼운 과다 복용은 조직에 매우 해롭다22. 광약리학적 요법은 과도한 광 조사 하에서 유리할 수 있다. 활성 물질의 상한은 비 활성화 물질의 투여 량 및 약물 동력학에 의해 정의된다. 그러나 가벼운 복용량은 여전히 광약리학에서 문제입니다. 조사 전력 밀도와 노출 시간이 치료 요구 사항보다 적지 않도록 주의해야 합니다. 원칙적으로, 활성화 물질의 생성은 생체 내에서 모니터링 될 수있다. 그러나, 생명윤리상의 이유로, 본 발명자들은 비활성 화합물15와 혼합된 모델 조직(신선한 다진 고기)을 사용한 실험을 제안하였다. 이 실험은 간단하며 다른 광원을 사용하도록 수정할 수 있습니다. 또한 광량에 대한 광물리학적 추정과 열 영향 측정에도 적용할 수 있습니다. 여기서, 모델 조직을 사용함으로써, 광 노출을 최소화할 수 있고, 예를 들어, 생체내 조건에서 보다 정확한 광전환 효율 결정과 비교하여, 항상 흥미롭게 고려할 수 있는 대안이다.
마지막으로, 시험관 내 독성 스크리닝에서 우수한 특성을 나타내고 모델 조직에서 최소 1-1.5cm 깊이에서 효율적으로 광전환되는 화합물은 비용이 많이 들고 힘들며 긴 생체 내 연구를 위해 선택될 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 본 발명자들은 동종이식 암 모델을 생성하기 위해 시험관내 평가에서와 동일한 세포주 (LLC)를 사용하였다. 종양 성장 역학, 사망률 및 전이 횟수는 항암 효능을 평가하는 데 가장 적합한 매개변수입니다. 기존의 화학 요법과 비교하여 광 약리학 적 치료에는 빛이라는 추가 요소가 적용됩니다. 그러므로, 두 개의 대조 동물 그룹이 필요하다: 하나는 비히클만 수용하고 다른 하나는 비히클과 방사선 조사를 받는 것이다. 이 설정을 통해 측정된 매개변수에 대한 빛의 영향을 평가할 수 있습니다. 본 실험에서는 두 실험군의 동물에게 비활성 화합물을 투여하고, 한 실험군의 생쥐의 종양을 조사하였다. 조사 체계는 대조군과 치료군에서 동일했습니다. 실험의 주요 목적이 빛과 화합물 적용의 결합 효과를 입증하는 것이기 때문에 이 단계에서는 벤치마크 화학 요법과의 비교가 필요하지 않습니다. 그런 다음 이 효과를 나타내는 최고 성능의 화합물을 선택하여 생체 내 독성에 대한 추가 연구와 개발에 대한 중요한 결정을 내리기 위한 벤치마크와 비교할 수 있습니다. 기술적으로, 우리가 설명하는 생체 내 실험은 약동학 또는 약력학 연구, 예를 들어 이미 약물 리드로 선택된 화합물에 쉽게 적용될 수 있습니다.
Disclosures
IVK, OB, SA 및 ASU는 발행된 특허군에 대한 발명자입니다: "광제어 생물학적 활성을 보유하는 펩티도모방체" (WO2014127919 [A1], EP2958934 [B1], US9481712 [B2], UA113685 [C2]) Lumobiotics GmbH에 라이선스를 부여했습니다. IVK, OB, TS 및 SA는 Lumobiotics GmbH의 설립자이자 주주입니다. IVK는 과학 고문이며 HK, TM, IP 및 PB는 Enamine LLC의 직원입니다. 저자는 공개된 것 외에 출판물에서 논의된 주제 또는 자료에 재정적 이해관계가 있거나 재정적 갈등이 있는 조직 또는 단체와 다른 관련 제휴 또는 재정적 관여가 없습니다.
Acknowledgments
저자는 PELICO (#690973) 및 ALISE (#101007256) 프로젝트를 통한 H2020-MSCA-RISE 프로그램의 EU 자금 지원을 인정합니다. 이 작업은 DFG-GRK 2039 (SA, TS 및 ASU), Helmholtz Society의 NACIP 프로그램 (SA 및 ASU) 및 BMBF의 VIP + (OB 및 ASU)의 지원을 받았습니다. 우리는 화합물 LMB002를 합성하고 정제하고 연구를 위해 화합물을 친절하게 제공한 Karlsruhe Institute of Technology의 Serhii Koniev 박사에게 감사드립니다. 저자는 또한 우크라이나에서 비디오를 촬영하고 편집한 Chupryna Maksym과 이 출판물을 실험적인 작업, 집필 및 촬영할 수 있게 해준 우크라이나의 모든 용감한 수비수들에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent 1100 Series capillary LC system | ALSI-Chrom (Agilent distributor) | - | |
| ATCC CRL-1642, LL/2 (LLC1) Lewis lung carcinoma cell line | ECACC | 90020104 | |
| C57BL/6NCrl mice, female, inbred | Charles River | Strain code: 027 | |
| CelCulture, CO2 incubator | Esco Micro | CCL-170B | |
| Corning Matrigel Basement membrane matrix | Merck | CLS354234 | |
| Corning, 384- well spheroid microplates | Merck | CLS3830 | |
| Fetal bovine serum | Merck | F7524 | |
| Gibco, DPBS | Thermo Fisher Scientific | 21600044 | |
| Gramicidin S | Lumobiotics | Custom synthesis | |
| HyClone, DMEM/high glucose | Cytiva | SH30003.04 | |
| IN Cell Analyzer 6500HS, imaging system | Cytiva | 29240358 | |
| Invitrogen, Calcein AM | Thermo Fisher Scientific | C1430 | |
| Isoflurane anesthesia machine | ASA | S/N ASA 1305 | |
| L-glutamine, 200 mM solution | Merck | G7513 | |
| LIKA-surgeon, diode surgery laser | Fotonika plus | - | |
| LMB002 | Lumobiotics | Custom synthesis | |
| Penicillin–Streptomycin, solution stabilized | Merck | P4333 | |
| PhenoPlate, 96-well plates | PerkinElmer | 6055302 | |
| Photometer PCE-LED 20 | PCE Instruments | PCE-LED 20 | |
| Thermo Scientific, Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Thermo Scientific, Propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | J66764-MC | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Merck | T8154 | |
| Trypsin–EDTA, 10 x solution | Merck | T4174 | |
| UltraCruz Cell culture flasks with vented caps, 75 cm2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-200263 | |
| UltraCruz, bottle top filters, PES, 0.22 μm | Santa Cruz Biotechnology | sc-360882 | |
| Vydac 218TP, C18 HPLC column (4.6 mm × 250 mm, 5 µm) | Altmann Analytik (Avantor distributor) | GR5103827 |
References
- Fuchter, M. J. On the promise of photopharmacology using photoswitches: a medicinal chemist's perspective. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (20), 11436-11447 (2020).
- Volarić, J., Szymanski, W., Simeth, N. A., Feringa, B. L.
- Paoletti, P., Ellis-Davies, G. C. R., Mourot, A. Optical control of neuronal ion channels and receptors. Nature Reviews Neuroscience. 20, 514-532 (2019).
- Hüll, K., Morstein, J., Trauner, D.
- Ma, X., et al. In vivo photopharmacology with a caged mu opioid receptor agonist drives rapid changes in behavior. Nature Methods. 20, 682-685 (2023).
- Sarabando, S. N., Palmeira, A., Sousa, M. E., Faustino, M. A. F., Monteiro, C. J. P. Photomodulation Approaches to Overcome Antimicrobial Resistance. Pharmaceuticals. 16 (5), 682 (2023).
- Kolarski, D., Szymanski, W., Feringa, B. L. Chronophotopharmacology: Methodology for high spatiotemporal control over the circadian rhythm with light. Neuromethods. Hirota, T., Hatori, M., Panda, S. 186, Humana, New York, NY. (2022).
- Babii, O., et al. Peptide drugs for photopharmacology: how much of a safety advantage can be gained by photocontrol. Future Drug Discovery. 2 (1), FDD28 (2020).
- Davis, A. M., Keeling, D. J., Steele, J., Tomkinson, N. P., Tinker, A. C.
- Balani, S. K., Miwa, G. T., Gan, L., Wu, J., Lee, F. W. Strategy of utilizing in vitro and in vivo adme tools for lead optimization and drug candidate selection. Current Topics in Medicinal Chemistry. 5 (11), 1033-1038 (2005).
- Kleijn, A., et al. A Systematic comparison identifies an ATP-based viability assay as most suitable read-out for drug screening in glioma stem-like cells. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Rodrigues, J., Heinrich, M. A., Teixeira, L. M., Prakash, J. 3D in vitro model revolution: unveiling tumor-stroma interactions. Trends in Cancer. 7 (3), 249-264 (2021).
- Sittinger, M., et al. Tissue engineering and autologous transplant formation: practical approaches with resorbable biomaterials and new cell culture techniques. Biomaterials. 17 (3), 237-242 (1996).
- Matai, I., Kaur, G., Seyedsalehi, A., McClinton, A., Laurencin, C. T. Progress in 3D bioprinting technology for tissue/organ regenerative engineering. Biomaterials. 226, 119536 (2020).
- Babii, O., et al. Direct photocontrol of peptidomimetics: an alternative to oxygen-dependent photodynamic cancer therapy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (18), 5493-5496 (2016).
- De Ridder, K., et al. Novel 3D lung tumor spheroids for oncoimmunological assays. Advanced NanoBiomed Research. 2 (4), 2100124 (2022).
- Pauli, C., et al. Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Van Straten, D., Mashayekhi, V., De Bruijn, H. S., Oliveira, S., Robinson, D. J. Oncologic photodynamic therapy: basic principles, current clinical status and future directions. Cancers. 9 (2), 19 (2017).
- Li, X., Kwon, N., Guo, T., Liu, Z., Yoon, J. Innovative strategies for hypoxic-tumor photodynamic therapy. Angewandte Chemie International Edition. 57 (36), 11522-11531 (2018).
- Hull, K., Morstein, J., Trauner, D.
- Babii, O., et al. Structure-activity relationships of photoswitchable diarylethene-based β-hairpin peptides as membranolytic antimicrobial and anticancer agents. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (23), 10793-10813 (2018).
- Heckl, C., Aumiller, M., Rühm, A., Sroka, R., Stepp, H. Fluorescence and treatment light monitoring for interstitial photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 96 (2), 388-396 (2020).
