Summary
Denne protokollen presenterer et sett med eksperimenter vedtatt for evaluering av fotoswitchable anticancer peptider, som kan brukes i preklinisk screening av slike forbindelser. Dette inkluderer cytotoksisitetsvurdering i 2D- og 3D-cellekulturer, evaluering av fotoisomeriseringseffektivitet ex vivo (modellvev) og in vivo-effekt.
Abstract
Fotokontrollerte, biologisk aktive forbindelser er en fremvoksende klasse av "smarte" legemiddelkandidater. De gir ekstra sikkerhet i systemisk kjemoterapi på grunn av deres presise spatiotemporal aktivering ved å lede et godartet, ikke-ioniserbart lys til et bestemt sted i pasientens kropp. Denne artikkelen presenterer et sett med metoder for å evaluere in vitro-styrken og ex vivo-effektiviteten av fotoaktivering av fotokontrollerte, biologisk aktive forbindelser, samt in vivo-effekten i tidlige stadier av legemiddelutvikling. Metoden brukes på anticancer cytotoksiske peptider, nemlig de diarylethenholdige analogene av et kjent antibiotika, gramicidin S. Forsøkene utføres ved hjelp av 2D (adherente celler) og 3D (sfæroider) cellekulturer av en kreftcellelinje (Lewis lungekarsinom, LLC), levende vevssurrogater (kjøttdeig) og en allograftkreftmodell (subkutan LLC) i immunkompetente mus. Utvelgelsen av de mest effektive forbindelsene og estimering av realistiske fototerapeutiske vinduer utføres via automatisert fluorescensmikroskopi. Fotoaktiveringseffektiviteten ved varierende belysningsregimer bestemmes på forskjellige dybder i et modellvev, og den optimale lysdoseringen påføres i det endelige terapeutiske in vivo-eksperimentet.
Introduction
Fotokontrollerte biologisk aktive forbindelser har dukket opp de siste tiårene som en lovende komponent i trygge kjemoterapier for menneskelige sykdommer og for å spesifikt utrydde ondartede solide svulster1. Disse forbindelsene inneholder reversibelt fotoisomererbare fragmenter (molekylære fotobrytere) og kan veksle mellom inaktive og aktive fotoisomerer ved bestråling med lys av forskjellige bølgelengder.
Sammenlignet med deres ikke-fotokontrollerbare analoger, kan fotokontrollerte legemidler være tryggere fordi de kan systematisk innføres i pasientens kropp i mindre aktive og i hovedsak ikke-toksiske former, og aktiveres deretter av lys bare der det er nødvendig, for eksempel i svulster, sår og sår. Selv om flere spennende demonstrasjoner av slike molekylære legemiddelprototyper finnes i nyere akademiske artikler 2,3,4,5,6,7, eksisterer ikke feltet klinisk fotofarmakologi - en anvendelse av godkjente kombinasjoner av legemiddel / medisinsk utstyr / sykdom - . Fotofarmakologi er ennå i legemiddeloppdagelsesstadiet, og systematiske prekliniske studier er ukjente.
Vi har bare nylig demonstrert in vivo sikkerhetsfordelen for noen fotokontrollerte anticancerpeptider, nemlig analogene til peptidantibiotikumet gramicidin S8. Disse fotokontrollerte derivatene inneholder en diarylethene (DAE) fotobryter, som gjennomgår reversible fotoinduserte transformasjoner mellom de såkalte røde lysgenererte "ringåpne" og UV-genererte "ringlukkede" fotoformene (illustrert i figur 1 for en av derivatene, forbindelsen LMB002).
Figur 1: Fotokontrollert cytotoksisk peptid LMB002 og fotoisomerisering. Diarylethenfragmentet er vist i rødt. Forkortelse: DAE = diarylethene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Å finne treff og utføre hit-to-lead-optimalisering krever ofte in vitro og in vivo-screening av passende sammensatte biblioteker 9,10. Her demonstrerer vi en metodikk som er egnet for systematisk høykapasitetsscreening av cytotoksisitet av fotokontrollerte forbindelser. Vi bestemmer også fotoisomeriseringseffektiviteten, estimerer lysdosen i modellvev og evaluerer in vivo-effekten til de best presterende kandidatene. Tilnærmingen er i samsvar med bioetikk og dyrepleiehensyn.
I dette arbeidet modifiseres tradisjonelle prekliniske metoder for å unngå ukontrollert fotoisomerisering av testede forbindelser. Det overordnede målet med å anvende disse modifiserte metodene her er å utvikle en generell strategi som er enkel og rask og gir statistisk signifikante data for pålitelig å sammenligne in vitro-aktiviteter og rasjonalisere in vivo-effektivitetstestingen av fotosvitsjebare forbindelser for blyidentifikasjon og videreutvikling.
Strategien består av tre påfølgende trinn. Det første trinnet innebærer bestemmelse av IC 50 (tilsynelatende50 % cellelevedyktighet) i serielle fortynninger for de aktive og inaktive fotoformene av utvalgte fotokontrollerte biologisk aktive forbindelser ved bruk av todimensjonale (2D, monolag) og tredimensjonale (3D, sfæroid) cellekulturer og konfokal høy gjennomstrømning automatisert fluorescensmikroskopi. Fototerapeutiske vinduer sammenlignes med hensyn til IC50-forskjellen mellom de to fotoformene, og de best presterende kandidatene velges. Det er ingen spesifikk fordel i toksisitetsvurdering ved automatisert mikroskopi og andre cytotoksisitetsscreeningsplattformer (analyser)11; Mer komplekse cellebaserte tumormodeller12 kan enkelt implementeres på dette stadiet.
For forbindelsene som er valgt i trinn 1, er det andre trinnet å realistisk estimere fotovekslingseffektiviteten inne i vevet som en funksjon av dybde fra den bestrålte vevsoverflaten ved å kvantifisere fotovekslingseffektiviteten til de mindre aktive fotoformene i et vevsurrogat ved bruk av UV-detektert høyytelsesvæskekromatografi (HPLC) av bestrålte prøveekstrakter. In vivo kan fotoswitching-effektivitet studeres, men vi foreslår å bruke et enkelt vevsurrogat - hakket svinekjøtt. Vi har testet gyldigheten av denne tilnærmingen. Vi målte konverteringen av våre fotoswitchable forbindelser in vivo på en muskreftmodell og observerte omtrent samme fotokonvertering på en dybde målt i tidligere eksperimenter med mus8. Ethvert egnet alternativt kunstig vev13, 3D bioprintet vev/organ14, biopsimaterialer eller annet unntatt animalsk materiale kan brukes. Imidlertid er dette oppsettet et godt kompromiss, da det er økonomisk, raskt og etisk.
Det tredje trinnet er bestemmelse av in vivo anticancer effekt i en murine cancer modell. Forbindelsene som demonstrerer overlegne egenskaper i in vitro-forsøkene og effektivt fotoswitching på en dybde på minst 1-1,5 cm i modellvevene, er valgt for dette eksperimentet.
Denne protokollen kan brukes på forbindelser som har forskjellige typer fotobrytere, forutsatt at fotoformene deres (eller deres fotostasjonære tilstander, PSS) er stabile i rimelig tid (noen dager eller lenger). Til illustrasjon er en tidligere beskrevet DAE-avledet LMB002 brukt15. LMB002-fotoformene er termisk stabile og kan lagres ved -20 °C i minst ett år uten vesentlig nedbrytning. Lewis lungekarsinom (LLC) celler er valgt for dette in vitro og in vivo demonstrasjon, men ingen restriksjoner pålegges celletype. LLC-celler er adherente, lett dyrkbare i 3D, og brukes til å generere tumoroider (som beskrevet i referansen16). In vivo LLC-celler brukes til å modellere metastatiske prosesser og kan lett generere solide svulster i immunkompetente mus etter subkutan injeksjon. Denne in vivo-metodikken kan brukes universelt på andre kreftmodeller17,18. Den detaljerte implementeringen av denne strategien er beskrevet nedenfor.
Protocol
Dyrepleie og eksperimentelle prosedyrer ble utført i henhold til lokale og internasjonale forskrifter for gjennomføring av forskningsprosjekter som involverer forsøksdyr (The Law of Ukraine "On the Protection of Animals from Cruelty", European Convention for the Protection of virveldyr som brukes til eksperimentelle og andre vitenskapelige formål (European convention, Strasburg, 1986), direktiv 2010/63 / EU om beskyttelse av dyr som brukes til vitenskapelige formål). Denne studien er godkjent av Bioethics Commission of Bienta company. C57BL/6NCrl-mus (voksne hunner som veier ca. 20 g hver) ble brukt i disse forsøkene. Spesifikke materialer, reagenser og utstyr er oppført i materialfortegnelsen.
1. IC50-evaluering for LMB002 ("ringlukkede" og "ringåpne" former) ved bruk av 2D og 3D LLC cellekulturer
- Fremstilling av buffere og stamløsninger av forbindelsene
MERK: Klargjør buffere ved hjelp av standardprosedyrer. Alternativt kan du bruke kommersielt tilgjengelige løsninger.- Forbered 10x fosfatbufret saltvann (PBS) ved å tilsette 14,2 g Na 2 HPO 4, 2,4 g KH 2 PO4, 80 g NaCl og2g KCl til 1 liter destillert vann. Autoklav fremstilt 10x PBS og fortynn den til 1x løsning ved å tilsette 100 ml 10x løsning til 900 ml destillert vann. Oppbevar deretter oppløsningen ved 4 °C.
- Forbered Dulbeccos PBS (DPBS) ved å tilsette 4,78 g DPBS-pulver til 1 liter destillert vann. Rør oppløsningen til alt fast stoff er oppløst, kontroller pH-verdien med en pH-måler, og juster den ved å tilsette 1 M NaOH eller 1 M HCl (pH 7,3-7,4). Etter å ha nådd ønsket pH-nivå, filtrer mediet gjennom et 0,22 μm vakuumfilter i et sterilt skap. Oppbevares ved 4 °C.
- Forbered 1 M 4- (2-hydroksyetyl)-1-piperazineetansulfonsyre (HEPES) bufferløsning ved å tilsette 238,3 g HEPES til 1 liter destillert vann. Juster oppløsningens pH med 1 M NaOH til pH 7,5. Filtrer gjennom et 0,22 μm vakuumfilter i et sterilt skap. Oppbevares ved 4 °C.
- Klargjør 1x trypsin-EDTA (EDTA = etylendiamintetraeddiksyre) løsning ved å fortynne 10x løsning. For å gjøre dette, tilsett 5 ml 10x Trypsin-EDTA til 45 ml 1x PBS-løsning i et 50 ml sterilt rør. Oppbevares ved 4 °C.
- Forbered Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) grunnleggende ved å tilsette 13,4 g DMEM høyt glukosepulver og 3,7 g Na2CO3 til 1 liter destillert vann i en målesylinder med en magnetisk omrøringsstang plassert på en omrøringsplate. Rør oppløsningen til alt fast stoff er oppløst, kontroller pH-verdien med en pH-måler, og juster den ved å tilsette 1 M NaOH eller 1 M HCl (pH 7,3-7,4). Etter å ha nådd ønsket pH, filtrer mediet gjennom et 0,22 μm vakuumfilter i et sterilt skap og oppbevar ved 4 °C.
- Forbered DMEM komplett medium ved å tilsette 100 ml føtal bovint serum (FBS), 10 ml penicillin-streptomycinoppløsning, 10 ml L-glutaminoppløsning og 10 ml 1 M HEPES-buffer til 900 ml DMEM basisk. Oppbevares ved 4 °C.
- Forbered lagerløsninger for testforbindelsene.
- For hver forbindelse veier du to partier på 5,12 mg (f.eks. LMB002) i den lukkede fotoformen i to 1,5 ml mikrosentrifugerør (ett med klare og andre svarte ikke-gjennomsiktige vegger). Vei 2,28 mg positiv kontroll (f.eks. gramicidin S) i et ekstra klart veggrør. Tilsett 100 μL ren DMSO til hver prøve og virvel i 30 s.
- Fotoisomeriser stamløsningen (LMB002) i det klare veggrøret fra "ringlukket" til "ringåpen" form ved å bestråle løsningen med 660 nm laser (lyseffekttetthet 0,6 W / cm2) med vortexing for å sikre grundig blanding. Fortsett til fargen synlig endres fra mørk lilla til lysebrun. Beskytt mot lys med aluminiumsfolie.
- 2D cellekultur eksperiment-seeding cellene (dag 1)
- Overfør 10 ml av DMEM komplett medium fra T-75-kolben med en LLC-cellekultur til et 15 ml sterilt rør. Aspirer mediet som er til overs med en vakuumpumpe.
- Vask cellekulturen med 5 ml 1x DPBS og aspirer løsningen med en vakuumpumpe.
- Dekk cellene med 3 ml 1x trypsin-EDTA-løsning og inkuber kolben i 2-3 minutter ved 37 °C i en 5% CO2 atmosfære.
- Stopp trypsinvirkningen ved å tilsette 6 ml av DMEM-mediet (tidligere overført til et sterilt rør) til cellekulturkolben som inneholder 1x trypsin-EDTA-løsning og pipettere suspensjonen flere ganger for å vaske cellene av cellekulturkolbeveggene.
- Overfør suspensjonen til et 15 ml rør og sentrifuge ved 200 × g i 4 minutter. Etter sentrifugering, aspirer supernatanten med en vakuumpumpe. Unngå å berøre cellepelleten i bunnen av røret.
- Resuspender cellene ved å tilsette 2 ml fersk DMEM komplett medium og pipettering flere ganger.
- Telle cellene ved prøvetaking ca. 15 μL av suspensjonen i et 0,5 ml rør, tilsett 15 μL 0,4% trypanblått og overfør den oppnådde blandingen til et celletellekammer.
- Etter telling, klargjør 25 ml av cellesuspensjonen per tidspunkt. Frø 5,000-10,000 (8,000 i gjennomsnitt) LLC celler / brønn i 200 μL DMEM i de sentrale 60 brønnene i en 96-brønnplate med klar bunn og svarte ikke-gjennomsiktige vegger. Fyll de resterende 36 brønnene med ren DMEM.
- Legg platene i en cellekulturinkubator over natten ved 37 °C og 5% CO2. Bruk plastplatelokk under for å forhindre ujevn oppvarming av bunnplaten.
- 2D cellekultureksperiment - legge til forbindelsene (dag 2)
- Overvåk cellene ved lysmikroskopi i platene til cellene har nådd 70% -80% konfluens.
- Aspirer mediet fra brønnene med en vakuumpumpe i et sterilt skap. Tilsett 100 μL av det friske forvarmede DMEM-mediet og legg platene i en cellekulturinkubator.
- Tilbered serielle fortynninger av testforbindelsene og positiv kontroll i polypropylenautoklaverte klare plater. Gjør følgende løsninger for individuelle tidspunktmålinger:
MERK: Start med aksjene i DMSO og fortynn med DMEM, men ikke overstige 1% v / v av DMSO i den endelige høyeste konsentrasjonen.- For å oppnå en 128 μM oppløsning av gramicidin S, tilsett 1,3 μL 20 mM stamløsning til 198,7 μL DMEM.
- For å oppnå en 256 μM-oppløsning av LMB002, "ring-åpen" form, tilsett 1,3 μL 40 mM oppløsning til 198,7 μL DMEM.
- For å oppnå en 512 μM-løsning av LMB002, "ringlukket" form, tilsett 2,6 μL 40 mM stamløsning til 197,4 μL DMEM.
- Utfør ytterligere tre repetisjoner for å oppnå fire sett med hvert konsentrasjonspunkt. Forbered en dobbel fortynningsserie ved å aspirere 100 μL fra hver startbrønn, overføre til en brønn med 100 μL DMEM og blande grundig.
MERK: Arbeid med fotobryterbare forbindelser krever lysjustering for å forhindre fotoisomerisering tilbake. Det anbefales å slå av lyset i sterile skap. - Oppnå de endelige konsentrasjonene av forbindelsene i brønner (5-150 μM) ved å overføre 100 μL av de tilberedte løsningene hver gang i 56 brønner med 100 μL tidligere tilsatt DMEM. Legg til 100 μL DMEM hver gang i fire brønner for å tjene som en negativ kontroll.
- Dekkplater med aluminiumsfolie eller plastbeskyttende ikke-gjennomsiktig deksel for å forhindre ukontrollert fotoveksling. Plasser platene i en cellekulturinkubator ved 37 °C (ved bruk under ekstra plastplatelokk) for den valgte inkubasjonstiden (10 min, 60 min, 24 timer eller 72 timer).
- 2D cellekultureksperiment - farging og avbildning (dag 2-5)
- Etter inkubering med forbindelser i forskjellige perioder, tilsett 50 μL av fargeløsningen per brønn til platene som ble inkubert med forbindelser i 10 og 60 minutter. Inkuber platene ved 37 °C i 20 minutter.
MERK: Forbered lagerfargeløsninger per tidspunkt ved å tilsette 8 μL 20 mM Hoechst 33342-løsning (endelig konsentrasjon er 5 μM), 32,5 μL 1 mM propidiumjodid (PI) løsning (endelig konsentrasjon er 1 μM) og 650 μL ikke-steril FBS til 5,810 μL ikke-steril 1x PBS. Forvarm FBS og PBS i et vannbad ved 37 °C for å forhindre at cellene får temperatursjokk. - Utfør automatisert fluorescensavbildning ved hjelp av en 20x objektivlinse.
- Gjenta samme farge- og avbildningsprosedyre (trinn 1.4.1 -1.4.2) for platene som ble inkubert med forbindelser i 24 (dag 3) og 72 (dag 5) time.
MERK: Typiske 2D-platekart er vist i figur 2.
- Etter inkubering med forbindelser i forskjellige perioder, tilsett 50 μL av fargeløsningen per brønn til platene som ble inkubert med forbindelser i 10 og 60 minutter. Inkuber platene ved 37 °C i 20 minutter.
- 3D-cellekultureksperiment - såing av cellene (dag 1)
MERK: Trinnene i denne delen er identiske med de som er beskrevet for 2D-eksperiment-forberedelse av cellekulturen, inkubasjon med de testede forbindelsene og avbildning (trinn 1.1-1.4.) Men i dette tilfellet fremstilles cellene som kompakte modne sfæroider i en 384-brønns ultra-lav vedheft U-bunnplate med svarte, ikke-gjennomsiktige vegger. Ved å bruke en plate av denne størrelsen kan to forbindelser sammenlignes i ett eksperiment.- Gjenta trinn 1.2.1-1.2.9 fra 2D-eksperimentprotokollen med en LLC-cellekultur.
- Etter å ha talt cellene, lag 25 ml av cellesuspensjonen. Frø 1000 celler per brønn i alle brønner i 50 μL DMEM i en 384-brønn, lavbindende, U-bunnplate.
- Sentrifuge ved 40 × g i 30 s og rist med en platerister ved 250 o / min i 1 min for å riste cellene av brønnens vegger til bunnen.
- Plasser platene i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 på toppen av ekstra plastplatelokk for å forhindre ujevn oppvarming av platebunnen i 48 timer.
- 3D-cellekultureksperiment - legge til forbindelsene (dag 3)
- Overvåk cellene i platene ved mikroskopi for å sikre at kompakte modne sfæroider har dannet seg.
- Forbered en seriell fortynning av studerte forbindelser i polypropylenautoklaverte klare plater. I dette tilfellet inkluderer du en ekstra forbindelse. Gjør følgende løsninger for individuelle tidspunktmålinger:
- For å oppnå 175 μM og 350 μM oppløsninger av gramicidin S, tilsett 1,8 μL 20 mM stamløsning til 198,2 μL DMEM og tilsett 3,6 μL lager til 196,4 μL DMEM tilsvarende.
- For å oppnå 175 μM og 350 μM løsninger av LMB002, "ringåpne" form, tilsett 1 μL 40 mM stamløsning til 199 μL DMEM og tilsett 1,8 μL lager til 198,2 μL DMEM tilsvarende.
- For å oppnå 350 μΜ og 1,750 μM løsninger av LMB002, "ring lukket" form, tilsett 1,8 μL 40 mM stamløsning til 198,2 μL DMEM og tilsett 8,8 μL lager til 191,2 μL DMEM tilsvarende.
- Utfør ytterligere tre replikater for å oppnå fire sett med hvert konsentrasjonspunkt. Oppnå serielle fortynninger ved å trekke 20 μL fra hver startbrønn, overføre den til brønnen, med 180 μL DMEM, og blande grundig.
MERK: Arbeid med fotobryterbare forbindelser krever lysjustering for å forhindre fotoisomerisering tilbake. Det anbefales å slå av lysene i sterile skap. - Oppnå de endelige konsentrasjonene av forbindelser i brønner ved å overføre 20 μL av de tilberedte løsningene hver gang i 128 brønner som inneholder 50 μL DMEM. Legg til 20 μL DMEM hver gang i tre brønner for å tjene som kontroll. Dekk platene med aluminiumsfolie eller plastbeskyttelsesdekning for å forhindre fotoveksling eller fordampning.
- Plasser platene i en cellekulturinkubator på plastplatelokk for den valgte inkubasjonstiden.
- 3D-cellekultureksperiment - farging og avbildning (dag 3-6)
- Forbered fargeløsningen per tidspunkt ved å tilsette 13 μL 1 mM kalcein AM-løsning (endelig konsentrasjon er 1 μM), 22 μL 20 mM Hoechst 33342-løsning (endelig konsentrasjon er 33 μM), 40 μL 1 mM PI-løsning (endelig konsentrasjon er 3 μM), 300 μL ikke-steril FBS til 2,625 μL ikke-steril 1x PBS. Forvarm FBS og PBS i et vannbad ved 37 °C for å forhindre at cellene får temperatursjokk.
- Etter inkubering i forskjellige perioder med forbindelsene, tilsett 20 μL av fargeløsningen per brønn til brønnene som ble inkubert med forbindelser i 10 minutter. Inkuber ved 37 °C i 2 timer.
- Utfør fluorescens konfokal avbildning ved hjelp av en 20x objektivlinse.
- Gjenta samme farge- og avbildningsprosedyre for brønner som ble inkubert med forbindelser i 24 (dag 4) og 72 (dag 6) timer.
MERK: I dette eksperimentet brukes calcein AM som en tredje komponent i den flerfargede fargeløsningen. Bilder hentet fra 2D- og 3D-eksperimenter analyseres ved hjelp av instrumentets automatiserte bildeanalyseprogramvare. Celler farget med Hoechst og propidiumjodidfargestoffer betraktes som nekrotisk døde, og deres fraksjon som en funksjon av konsentrasjonen brukes til å beregne IC50-verdien .
Figur 2: Eksempel på typiske platekart for 2D-kultureksperimenter. Fargekoder for forbindelsene og kontrollen er angitt. Konsentrasjoner av testede forbindelser (antall inne i brønnene) er gitt i μM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
2. Bestemmelse av fotoswitching-effektiviteten i et vevsurrogat
- Monter det optiske toget for prøvebestrålingen som vist i figur 3 (bestående av en optisk kabel fra laserlyskilden, en linse med variabel brennvidde, en sprøyte med et ikke-gjennomsiktig deksel og en flat kuttet).
- Ved å endre brennvidden og blenderåpningen på objektivet, får du en flat lysstråle med en diameter som er 1-1,5 mm større enn den indre diameteren til den brukte sprøyten, men som fortsatt er så mye som mulig innenfor blenderåpningen.
- Bruk en 5 ml sprøyte med en kuttende ende og en indre diameter på 12,4 mm og er dekket med et ikke-gjennomsiktig plastdeksel. Ved en lasereffekt på 200 mW, sett effekttettheten ved utgangen til det optiske systemet til ~ 103 mW / cm2 målt med et fotometer.
MERK: Alle påfølgende operasjoner må utføres i et mørkt rom med minst mulig arbeidsplassbelysning. - Klargjør 3 ml LMB002 ("ringlukket" form) stamoppløsning i PBS med en konsentrasjon på 1 mg/ml.
- Forbered en modellvevsprøve lastet med den inaktive fotoformen av LMB002 i en plastbeholder. I et typisk løp blandes 5 g ferskt kjøttdeig fra svinekjøtt mekanisk med 277 μL LMB002-stamløsning og 260 μL PBS for å nå den endelige konsentrasjonen på 50 mg/kg i prøven, og forholdet vev/PBS på ~9/1 (v/v).
- Fyll sprøyten med den klargjorte prøven, sørg for at det ikke er luftbobler på innsiden, og form en flat overflate ved eksponeringsenden (kuttet).
MERK: Sylinderen i prøven i sprøyten må oppta ~40 mm langs aksen. - Bestråle prøven i det optiske toget som vist i figur 3 i 9 min 44 s, tilsvarende ~60 J/cm2 eksponering.
- Forbered 4 mm tykke skiver av prøven etter eksponeringen ved å skyve den av sprøyten med stempelet og kutte den med en skalpell. Vei og legg skivene i separate reagensrør og merk dem med middelavstanden (mm) fra den bestrålte overflaten.
- Forbered to kontrollprøver (optimal mengde, 0,5-0,7 g) i reagensrør: i ett, kjøttdeig blandet med 10% (volum) PBS (54 μL), og i den andre, modellvevsprøven oppnådd i trinn 2.4 bestrålt av 500 mW laserlys i 10 minutter for å sikre at alle LMB002 "ringlukkede" molekyler konverteres til "ringåpne" form.
- Tilsett acetonitril vannblanding (70%/30% v/v, supplert med 0,01% trifluoreddiksyre (TFA), 1,4 ml/g) til hver skive og kontrollprøvene. Bland innholdet grundig med en glassstang.
- Inkuber ved romtemperatur i minst 10 minutter og sentrifuger blandingene ved 5220 x g i 20 minutter eller sentrifuger ved 20 x g i 30 minutter to ganger for å fjerne det uoppløselige materialet og samle supernatanten.
- Samle forsiktig supernatantene (~0,7 ml) og sentrifuge dem igjen ved 16 000 x g i 30 minutter.
- Samle supernatantene (~0,5 ml hver) og analyser dem ved omvendt fase høyytelsesvæskekromatografi (RP HPLC) med en analytisk C18-kolonne, lineær A:B-gradient på 3,46 % B/min, 2,0 ml/min strømningshastighet og 100 μL injisert volum. Registrer UV-detekterte kromatogrammer ved 570 nm (påvisning av "ringlukket" form) og 270 nm (påvisning av "ringåpne" form). Bruk de ikke-bestrålte (trinn 2.4) og bestrålte kontrollprøvene (trinn 2.8) for å bestemme de spesifikke retensjonstidene for begge fotoformene (eluent A: vandig 0,1% TFA; eluent B: 90% acetonitrilvann, 0,1% TFA) og kalibrer metoden.
- Bestem de faktiske mengdene LMB002 fotoformer i de analyserte prøvene ved hjelp av kalibreringskurvene oppnådd ved å ta og analysere kromatogrammer av LMB002-løsninger med kjente konsentrasjoner. For kalibrering, klargjør LMB002 "ringlukkede" løsninger ved å fortynne stamløsningen (trinn 2.3) med acetonitril-vannblanding (70% / 30% v / v supplert med 0,01% TFA) for å oppnå 0,36, 0,9 og 3,6 μg per 100 μL (injisert volum); Den unnvikende gradienten og strømningshastigheten er den samme som i trinn 2.12.
- Gjenta eksperimentet (trinn 2.4-2.12) tre ganger og plott den normaliserte prosentandelen av hver fotoform på plottet (prosent) i forhold til avstanden (fra den bestrålte vevsoverflaten). Beregn statistikken (dvs. standardavvik ved hvert konsentrasjonspunkt).
Figur 3: Eksperimentelt oppsett for å bestemme effektiviteten av fotokonvertering i modellvev. (A) Skjematisk og (B) fotografi; 1, optisk kabel fra laserlyskilden; 2, objektiv med variabel brennvidde; og 3, kjøttdeig-LMB002-fosfatbufret saltvannsblanding plassert i 4, en sprøyte med et ikke-gjennomsiktig deksel og kuttet frontend (vist i (B) uten dekselet). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
3. Bestemmelse av effekt in vivo mot kreft
MERK: Eksperimentplanen og endepunktene er vist i figur 4. Dyrepleiestandarder i etterbehandlingsperioden bør overholde 3R-reglene - huset bør inkludere riktig burtetthet og ressurstilgjengelighet. Når det er mulig, følg ikke-aversive dyrehåndteringsmetoder som tunnel eller kopping.
Figur 4: Tidsplan for in vivo terapeutisk eksperiment. Eksperimentelle gruppers betegnelse, terapidetaljer, endepunkter og analyseplaner post mortem . Forkortelser: LLC = Lewis lungekarsinom; IV = intravenøs; SC = subkutan. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Klargjøring av kreftcellene for subkutan inokulasjon (dag 0).
- Pass LLC-cellene i DMEM (4,5 g / l glukose) med 10% FBS, 100 U / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin ved 37 ° C og 5% CO2.
- Høst cellene ved hjelp av 0,05% trypsin-EDTA-løsning, sentrifuge og suspendere i serumfri DMEM.
- Telle cellene og bestemme deres levedyktighet ved hjelp av en hemocytometer og trypan blå ekskluderingstest.
- Klargjør endelig cellesuspensjon med konsentrasjon 10 × 106 celler/ml i DMEM og Matrigel mix (1:1). Oppbevar suspensjonen på is før injeksjon.
- LLC celle inokulering (dag 0)
- Plasser den voksne hunnmusen C57BL/6NCrl (som veier ~20 g) i induksjonskammeret til isoflurananestesimaskinen. Utfør sedasjon ved 5 % av isofluran og vent til dyret er helt bevisstløst.
- Fjern pelsen fra området med celleinokulering ved barbering.
- Inokuler 5 × 105 LLC-celler i ~ 100 μL DMEM: Matrigel (1: 1) blanding i høyre bakben.
MERK: Når det er mulig, følg praksisen med bruk av enkeltnåler.
- Sammensatt administrasjon og fotobestråling
MERK: I 5-8 dager etter inokulering er dyrene klare til behandling når svulstene deres er palpable og har nådd ~ 50-100 mm3 volum. Utfør alle påfølgende operasjoner med LMB002 og mus behandlet av denne forbindelsen under halvmørke forhold (en 4 W LED-lampe minst 5 m fra arbeidsplassen).- Løs opp LMB002 ("lukket ring") i steril fysiologisk saltoppløsning i en konsentrasjon på 1 mg/ml for en dose på 5 mg/kg (i.v.) for å oppnå mørkeblå homogene oppløsninger.
- Før bestrålingen, tilfeldig samle fire grupper på åtte dyr og fjern pelsen fra svulsten og nærliggende områder ved barbering.
- Plasser en mus i holderen for intravenøse injeksjoner og forvarm dyrets hale i et vannbad ved 37 °C for å gjøre halevenen synlig.
MERK: Vurder preoperativ analgesi. - Injiser forbindelsen med 5 ml/kg inn i halevenen. For de to kontrollgruppene, injiser 100 mikrol saltvann (intravenøst) per dyr (20 g kroppsvekt). Sørg for at dyrene i de to forsøksgruppene får den testede forbindelsen i den inaktive fotoformen (1 mg/ml i saltvann).
MERK: Når det er mulig, følg praksisen med bruk av enkeltnåler. - Deretter, 2 t 45 min etter injeksjon av forbindelsen, plasser musen under anestesi. Induser sedasjon med 3-4 % isofluran i oksygen. Oppretthold anestesi i 15 minutter med 0,5% -1% isofluran i oksygen.
- Dekk musen med en svart maske som har et hull som bare utsetter svulstområdet for lyset.
- Slå på laserdiodemodulen med en 650 nm laser og sett effekten til den røde laseren til 200 mW og den blå / UV-guidelaseren til 2 mW.
MERK: Bruk blå beskyttelsesbriller når laserenheten er på. - Mål lysstrømmen fra den røde laseren (vekk fra musene) med et fotometer og bestem avstanden fra den optiske kabelen der lysstrømmen er 100 mW / cm2. Fest kabelen på et stativ for å sikre at lyskilden er i bestemt avstand fra svulsten og lyset dekker hele tumorområdet. Bruk blått/UV-laserlys under denne prosedyren.
- Slå på den røde laseren for å bestråle svulstområdet i 20 minutter.
- Etter bestrålingen, slå av isofluranstrømmen, returner dyret til buret, og følg nøye tilstanden i løpet av de neste 30 minuttene.
NOTAT: Etter sammensatt administrering, hold musene i mørket i 2 dager. Bare lysdagssyklusen må endres; Alle de øvrige boforholdene skal forbli uendret.
- Observasjoner etter behandling
- Observer dyrene daglig og måle vekten og dimensjonene til svulstene deres. Mål tumorvolumet og noter utviklingen av nekrosen.
MERK: Dyrepleiestandarder i etterbehandlingsperioden skal overholde 3R-reglene - hus bør inkludere riktig burtetthet og ressurstilgjengelighet. - Bruk data samlet inn i forrige trinn for å evaluere dødelighet. Bestem overlevelsesraten ved hjelp av standardprosedyren.
MERK: Dyr skal ofres og telles som døde når de avslører alvorlige kliniske tegn (kroppsvektstap på mer enn 15%, tumorsår leges ikke om 7 dager og vokalisering) eller så snart tumorvolumet når 2,500 mm3.
- Observer dyrene daglig og måle vekten og dimensjonene til svulstene deres. Mål tumorvolumet og noter utviklingen av nekrosen.
Representative Results
I dette arbeidet ble 2D- og 3D-celleeksperimenter utført for å bestemme IC50 for "ringlukkede" og "ringåpne" former for LMB002 (se figur 1) ved forskjellige inkubasjonstider. Disse verdiene ble sammenlignet med de som ble oppnådd for prototypen peptid, gramicidin S (brukt som en positiv kontroll). Et typisk sett med bilder av inkubasjonen i 2D-vokst LLC-kultur etter farging er vist i figur 5. Samfarging med Hoechst 33342 (blå) og propidiumjodid (rød) som resulterer i forskjellige nyanser av lilla i en større brøkdel av celler ved behandling med "ringåpne" form sammenlignet med "ringlukket" indikerer en merkbar forskjell i cytotoksisitet mellom to former som lett kan kvantifiseres. Det demonstrerte eksemplet på et vellykket eksperiment er basert på dataene samlet inn ved hjelp av 96-brønnsplateformatet, hvor peptidvariantene ved varierende konsentrasjoner ble lagt til, som vist i figur 2. Lignende data kan kjøpes med 384-brønner og plater med høy tetthet. Men siden volumene per brønn reduseres, vil tekniske og systematiske feil, og som et resultat av dette, reduseres nøyaktigheten av IC50-bestemmelsen med å øke brønntettheten.
Figur 5: Representative bilder fra cytotoksisitetsanalysen i monolayer-grown LLC. Cellene ble farget med Hoechst 33342 (blå) og propidiumjodid (rød). Tidene som vises: 10 min, 60 min, 24 timer og 72 timer er inkubasjonstider med forbindelser. Skalastenger = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Fotokonverteringen av LMB002 ved laserlysbestråling i et modellvev - fersk svinekjøttdeig - ble bestemt ved hjelp av en prøve sammensatt av hakket kjøtt blandet med LMB002 "ringlukket" (inaktiv) form oppløst i PBS og måling av omdannelsen av denne inaktive formen til LMB002 "ringåpne" (aktiverte) form i retning av strålingsutbredelse. Prøven ble plassert i en sprøyte og bestrålt fra den ene siden med en flat stråle av laserstråling for eksponeringstiden på ~ 10 min (vanligvis brukt i in vivo eksperimenter), som vist i figur 3. Etter eksponeringen ble prøvesylinderen delt inn i deler ved å trykke sprøytestempelet og kutte skivene av samme høyde med en skalpell. Konsentrasjonen av LMB002 "ring-open" i ekstraktene fra skivene ble bestemt ved bruk av RP HPLC.
Figur 6 illustrerer dose-effektkurvene Figur 6A-D hentet fra dataanalyse. For å identifisere prosentandelen døde celler med kjernefysisk samfarging av Hoechst 33342 og PI-fargestoffer, brukte vi et innebygd klassifiseringsverktøy som setter numeriske terskler ved utvalgte målte parametere for å dele alle celletallene i flere kategorier. For eksempel, når signalet om rød kanal (propidiumjodid) i kontrollen var ved terskelen (ca. 110-130 enheter), kunne cellene klassifiseres som PI-positive, betraktet som døde eller PI-negative, betraktet som upåvirket av forbindelsene. For LMB002 kan sigmoidale avhengigheter av prosentandelen propidiumjodid-positive celler på forbindelseskonsentrasjonen sees. Fra disse dataene kan IC50-verdiene bestemmes.
Figur 6: Analyse av cytotoksisitet i 2D-kultur. Sigmoid passer som ble oppnådd i LLC-kulturen for (A) 10 min, (B) 60 min, (C) 24 timer og (D) 72 h-tidsintervaller tatt for inkubering med forbindelser. Montering muliggjør nøyaktig bestemmelse av IC50-verdier (ikke vist). Feilfelt er SEM. Forkortelser: LLC = Lewis lungekarsinom; PI = propidiumjodid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Med tanke på de oppnådde IC50-verdiene , kan vi konkludere med at toksisiteten til alle tre forbindelsene økte med inkubasjonstiden. Vårt eksperiment viste at "ring-åpen" form av LMB002 er omtrent ett fortynningstrinn mindre giftig enn prototypen peptid, gramicidin S. Mens den "ringlukkede" formen demonstrerer tre til fire fortynningstrinn lavere toksisitet, noe som øker med inkubasjonstiden. Forskjellen mellom de to fortynningstrinnene påvirkes ikke av økningen i inkubasjonstid og kan brukes numerisk som et eksperimentelt bestemt fototerapeutisk vindu6 for sammenligning med andre forbindelser i en potensiell bibliotekscreening. IC50-verdien for gramicidin S ble satt som referansepunkt for å korrigere eksperimentelle feil eller differensialutganger i biologiske replikater.
3D-celleeksperimentene produserte samme type rådata - de enkeltcelleløste en-per-brønn sfæroidbildene. Inkluderingen av kalcein som et tredje fargestoff muliggjør kvantifisering av fraksjonen av metabolsk aktive celler (observert i den grønne kanalen). Ved å bruke 384-brønnplater, øke antall tekniske replikater, ekskludere overflødige koinkubasjonstidspunkter og endre fortynningsfolden, kunne vi direkte sammenligne flere forbindelser i en enkelt testkjøring (ved bruk av enkeltplate) som illustrert i platekartet i figur 7.
Figur 7: Platekart for 3D-kultureksperimentet med to forbindelser. Fargekoder for forbindelsene og kontrollen er angitt. Antall i brønner er konsentrasjoner i μM. 10 min, 24 timer og 72 timer er inkubasjonstider. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8 viser bildene av utvalgte tekniske replikater av LLC sfæroider dyrket med en tetthet på 1 sfæroid / brønn i nærvær av testede forbindelser og kontrollsfæroider fanget etter farging.
Figur 8: Representative bilder fra cytotoksisitetsanalyse i 3D-kultur. Bilder viser 48 h gamle LLC sfæroider farget med Hoechst 33342 (blå), calcein AM (grønn) og propidiumjodid (rød) etter 10 minutter, 24 timer og 72 timer saminkubasjon med både LMB002 fotoformer og gramicidin S. Skalastenger = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Ved hjelp av instrumentprogramvaren ble dose-effektkurvene, som de i 2D-eksperimentet, hentet fra de z-stablede haugene med bilder (figur 9A). I tillegg kan kompakte og ikke-deformerte sfæroider i 3D-kulturer karakteriseres av hele sfæroiddiameteren (figur 9B). Det ble også bemerket at den totale sfæroiddiameteren varierer med sammensatt konsentrasjon.
Figur 9: Cytotoksisitetsevaluering med 3D-kulturer. (A) Konsentrasjonsavhengige cytotoksisitetstilpasningskurver og (B) konsentrasjonsavhengige sfæroids diameterplott oppnådd i 3D-kulturer av LLC co-inkubert med gramicidin S i 10 minutter, 24 timer og 72 timer og fanget før farging. Feilfelt er SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Eksperimentet for trinn 2 gjør det mulig å bestemme LMB002-konsentrasjoner i begge fotoformer ved å bruke UV-detektert væskekromatografi med høy ytelse. Effektiviteten av fotokonvertering i modellvev ble enkelt vurdert og kvantifisert ved hjelp av dette oppsettet (figur 3). Dataene ble hentet fra den kvantitative analysen av kromatogrammene til prøveekstraktene. I disse testforsøkene ble LMB002-kromatogrammer detektert spektroskopisk ved 270 nm og 570 nm. Ved 270 nm ble mange ekstra signaler observert og tilskrevet forbindelsene som ble ekstrahert fra modellvevet (verifisert fra kontrollekstraktet uten forbindelsen). Begge fotoformene var tilstrekkelig forskjellige i retensjonstider og absorbans. Imidlertid var LMB002 "ringåpne" -signalet baseline-separert fra disse bakgrunnssignalene (se et representativt kromatogram i figur 10A). Derfor kan dette signalet integreres uten problemer. Ved 570 nm inneholdt kromatogrammene bare LMB002 "ringlukket" formsignal (figur 10B). Her utførte vi konsentrasjonsbestemmelse ved hjelp av RP HPLC. Likevel kan enda høyere nøyaktighet og lavere deteksjonsgrenser oppnås med LC/MS som analysemetode.
Figur 10: Representative kromatogrammer av LMB002 ekstrahert fra modellvev. (A) Prøve ved 2 mm fra bestrålt overflate, registrert ved 270 nm (LMB002 "ring-åpen" form er integrert); (B) prøve ved 38 mm fra den bestrålte overflaten, registrert ved 570 nm (toppen av LMB002 "ringlukket" er integrert). Verdier for retensjonstid (angitt) bekreftet i tillegg forbindelsens identitet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Dataene som ble oppnådd etter å ha integrert de tilsvarende signalene fra alle de innsamlede prøvene, ble brukt til å bygge konsentrasjonsdybdegrafene, som vist i figur 11. På grunnlag av disse grafene ble effektiviteten av fotokonvertering på forskjellige dybder av modellvevet lett vurdert. Det bekrefter at vår røde lyskilde induserer "ringlukket" LMB002 fotokonvertering på en dybde på opptil 1 C, i vevsurrogat, kjøttdeig (ved ca. 103 mW / cm2).
Figur 11: Evaluering av fotokonverteringseffektivitet. Konsentrasjon (A, mg/kg) av LMB002 "ringlukkede" (ikke-aktiverte, blå prikker) og "ringåpne" former (aktiverte, oransje prikker) i forskjellige avstander fra den bestrålte overflaten av modellvevet (L, mm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Resultatene fra in vivo-eksperimentet - trinn 3 i vår metodikk utført i henhold til tidsplanen presentert i figur 4 - ble representert ved grafer som viste tumorvekst som funksjon av tid (figur 12) og Kaplan-Meier-overlevelseskurver (figur 13).
Figur 12: Tumorvekstdynamikk hos dyr. Dyr behandlet med LMB002 sammenlignet med kjøretøybehandlede dyr (subkutan LLC allograftmodell i C57BL/6NCrl mus, sammensatt dose 7 mg/kg, IV, 2 t 40 min inkubasjon, deretter bestråling ved 650 nm, 100 mW/cm2, 20 min). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 13: Dødelighetskurver for dyr. Dyr behandlet med LMB002 sammenlignet med kjøretøybehandlede dyr (subkutan LLC allograftmodell i C57BL/6NCrl mus, sammensatt dose 7 mg/kg, IV, 2 t 40 min inkubasjon, deretter bestråling ved 650 nm, 100 mW/cm2, 20 min). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Fotokontrollerte forbindelser er enestående i stoffutvikling; Det er imidlertid ikke etablert metoder for preklinisk og klinisk evaluering. Den nærmeste monoterapianalogen, fotodynamisk terapi (PDT), er behandlingsmodaliteten for klinisk bruk som mange land har tatt i bruk mot kreft og er under utvikling for andre indikasjoner19,20. I likhet med fotofarmakologi er PDT også basert på bruk av lys for å aktivere det bioaktive stoffet (singlet oksygen). Derfor kan noen eksperimentelle metoder som brukes til prekliniske og kliniske studier i PDT, tas i bruk for fotofarmakologi. For eksempel er lyskilder, lysleveringsmetoder og medisinsk utstyr godt utviklet og godkjent for PDT; De kan brukes direkte til evaluering av fotokontrollerte stoffer. Imidlertid har PDT og fotofarmakologi mange forskjeller fra hverandre4, noe som rettferdiggjør behovet for å etablere spesifikke metoder for sistnevnte.
For det første er det ikke-aktiverte stoffet i PDT (oksygen) alltid tilstede i levende vev ved ikke-toksiske konsentrasjoner. I motsetning til dette kan ikke-aktiverte fotokontrollerte biologisk aktive forbindelser ha gjenværende aktivitet og uønsket toksisitet. Derfor bør ideelle fotofarmakologiske legemidler ha minimert biologisk aktivitet i sin administrerte form og må være svært aktive i sin lysgenererte form, det "fototerapeutiske vinduet"21 må være så stort som mulig. Å finne treffet og utføre hit-to-lead optimalisering krever identifisering av egnede forbindelser og screening av relativt store biblioteker, allerede i tidlige stadier av stoffutvikling. Her foreslo vi en automatisert konfokal fluorescerende mikroskopi med høy gjennomstrømning for å identifisere effektive fotobryterforbindelser.
Den valgte metoden for cytotoksisitetsevaluering muliggjør enkel implementering av det mest kritiske kravet - vedlikehold av PSS eller stabiliteten til den synlige-lysfølsomme fotoisomeren. Dette skyldes at lyseksponeringen minimeres ved implementeringen. Derfor, hvis du velger alternative metoder, bør automatiserte foretrekkes. Denne tilnærmingen er pålitelig og informativ. Bruken av 3D-cellekulturer (sfæroider) på dette stadiet gir en helhetlig forståelse av cellens respons på behandlingen i et mer realistisk vevslignende mikromiljø. I tillegg kan verdifull innsikt i forbindelsenes virkningsmekanisme fås ved hjelp av mikroskopi som direkte metode. Den konfokale fluorescerende mikroskopien med riktig fargeprotokoll muliggjør visuell vurdering av morfologien til cellene og sfæroidene; Viktige detaljer om celledød og endringer inne i cellene kan også oppdages.
For det andre krever lett applikasjon et nøye valg av lysdosering. Ved PDT er lett overdose ekstremt skadelig for vev22. Fotofarmakologisk terapi kan være fordelaktig ved overdreven lysbestråling. Den øvre grensen for det aktiverte stoffet er definert av den administrerte dosen av det ikke-aktiverte stoffet og dets farmakokinetikk. Imidlertid er lysdosering fortsatt et problem i fotofarmakologi. Det må utvises forsiktighet for å sikre at bestrålingseffekten og eksponeringstiden ikke er mindre enn behovet for behandlingen. I prinsippet kan genereringen av det aktiverte stoffet overvåkes in vivo. Av bioetiske grunner foreslo vi imidlertid et eksperiment med et modellvev (ferskt kjøttdeig) blandet med den ikke-aktiverte forbindelsen15. Dette eksperimentet er enkelt og kan modifiseres for å bruke forskjellige lyskilder. Det kan også tilpasses for fotofysisk estimering av lysdosering og måling av termiske påvirkninger. Her igjen, ved å bruke modellvev, er lyseksponeringen mulig å minimere, sammenlignet for eksempel med den mer nøyaktige bestemmelsen av fotovekslingseffektivitet under in vivo-forholdene , et alternativ som alltid kan være interessant å vurdere.
Til slutt kan forbindelsene som demonstrerer overlegne egenskaper i in vitro toksisitetsskjermene og effektivt fotoswitcher minst 1-1,5 cm dypt i modellvevet, velges for kostbare, arbeidskrevende og langvarige in vivo-studier . I denne protokollen brukte vi samme cellelinje (LLC) som in vitro-vurderingen for å generere allograftkreftmodellen. Tumorvekstdynamikken, dødeligheten og metastasetallet er parametrene som er mest egnet for å vurdere krefteffekt. Sammenlignet med konvensjonell kjemoterapi, brukes en ekstra faktor i den fotofarmakologiske behandlingen - lyset. Derfor er det nødvendig med to kontrolldyrgrupper: en som bare mottar kjøretøyet og den andre som mottar kjøretøyet og bestrålingen. Dette oppsettet gjør det mulig å evaluere lysets innvirkning på de målte parametrene. I vårt forsøk mottok dyrene i de to eksperimentelle gruppene den ikke-aktiverte forbindelsen, og musens svulster i en gruppe ble bestrålt. Bestrålingsregimet var likt for kontroll- og behandlingsgruppene. Sammenligning med referanse kjemoterapi er ikke nødvendig på dette stadiet fordi hovedformålet med forsøket er å demonstrere den kombinerte effekten av lys og sammensatt applikasjon. De best presterende forbindelsene som viser denne effekten, kan deretter velges for videre studier av deres in vivo-toksisitet og sammenligning med referanseverdier for å ta viktige go-no-go-beslutninger om deres utvikling. Teknisk sett kan in vivo-eksperimentet som vi beskriver, lett tilpasses farmakokinetiske eller farmakodynamiske studier, for eksempel av en forbindelse som allerede er valgt som legemiddelledning.
Disclosures
IVK, OB, SA og ASU er oppfinnere på den utstedte patentfamilien: "Peptidomimetika som har fotokontrollert biologisk aktivitet" (WO2014127919 [A1], EP2958934 [B1], US9481712 [B2], UA113685 [C2]) lisensiert til Lumobiotics GmbH. IVK, OB, TS og SA er grunnleggere og aksjonærer i Lumobiotics GmbH. IVK er en vitenskapelig rådgiver, HK, TM, IP og PB er ansatte i Enamine LLC. Forfatterne har ingen andre relevante tilknytninger eller økonomisk engasjement med noen organisasjon eller enhet med økonomisk interesse i eller økonomisk konflikt med emnet eller materialet som diskuteres i publikasjonen, bortsett fra de som er avslørt.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner EU-finansiering av H2020-MSCA-RISE-programmet gjennom PELICO (#690973) og ALISE (#101007256) prosjekter. Dette arbeidet ble støttet av DFG-GRK 2039 (SA, TS og ASU), NACIP programmet til Helmholtz Society (SA og ASU), og VIP + av BMBF (OB og ASU). Vi anerkjenner Dr. Serhii Koniev, Karlsruhe Institute of Technology, som har syntetisert forbindelsen LMB002, renset den og vennlig gitt forbindelsen til studien. Forfatterne takker også Chupryna Maksym som filmet og samlet videoen i Ukraina, og til alle modige forsvarere av Ukraina som gjorde det eksperimentelle arbeidet, skrivingen og filmingen av denne publikasjonen mulig.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent 1100 Series capillary LC system | ALSI-Chrom (Agilent distributor) | - | |
| ATCC CRL-1642, LL/2 (LLC1) Lewis lung carcinoma cell line | ECACC | 90020104 | |
| C57BL/6NCrl mice, female, inbred | Charles River | Strain code: 027 | |
| CelCulture, CO2 incubator | Esco Micro | CCL-170B | |
| Corning Matrigel Basement membrane matrix | Merck | CLS354234 | |
| Corning, 384- well spheroid microplates | Merck | CLS3830 | |
| Fetal bovine serum | Merck | F7524 | |
| Gibco, DPBS | Thermo Fisher Scientific | 21600044 | |
| Gramicidin S | Lumobiotics | Custom synthesis | |
| HyClone, DMEM/high glucose | Cytiva | SH30003.04 | |
| IN Cell Analyzer 6500HS, imaging system | Cytiva | 29240358 | |
| Invitrogen, Calcein AM | Thermo Fisher Scientific | C1430 | |
| Isoflurane anesthesia machine | ASA | S/N ASA 1305 | |
| L-glutamine, 200 mM solution | Merck | G7513 | |
| LIKA-surgeon, diode surgery laser | Fotonika plus | - | |
| LMB002 | Lumobiotics | Custom synthesis | |
| Penicillin–Streptomycin, solution stabilized | Merck | P4333 | |
| PhenoPlate, 96-well plates | PerkinElmer | 6055302 | |
| Photometer PCE-LED 20 | PCE Instruments | PCE-LED 20 | |
| Thermo Scientific, Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Thermo Scientific, Propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | J66764-MC | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Merck | T8154 | |
| Trypsin–EDTA, 10 x solution | Merck | T4174 | |
| UltraCruz Cell culture flasks with vented caps, 75 cm2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-200263 | |
| UltraCruz, bottle top filters, PES, 0.22 μm | Santa Cruz Biotechnology | sc-360882 | |
| Vydac 218TP, C18 HPLC column (4.6 mm × 250 mm, 5 µm) | Altmann Analytik (Avantor distributor) | GR5103827 |
References
- Fuchter, M. J. On the promise of photopharmacology using photoswitches: a medicinal chemist's perspective. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (20), 11436-11447 (2020).
- Volarić, J., Szymanski, W., Simeth, N. A., Feringa, B. L.
- Paoletti, P., Ellis-Davies, G. C. R., Mourot, A. Optical control of neuronal ion channels and receptors. Nature Reviews Neuroscience. 20, 514-532 (2019).
- Hüll, K., Morstein, J., Trauner, D.
- Ma, X., et al. In vivo photopharmacology with a caged mu opioid receptor agonist drives rapid changes in behavior. Nature Methods. 20, 682-685 (2023).
- Sarabando, S. N., Palmeira, A., Sousa, M. E., Faustino, M. A. F., Monteiro, C. J. P. Photomodulation Approaches to Overcome Antimicrobial Resistance. Pharmaceuticals. 16 (5), 682 (2023).
- Kolarski, D., Szymanski, W., Feringa, B. L. Chronophotopharmacology: Methodology for high spatiotemporal control over the circadian rhythm with light. Neuromethods. Hirota, T., Hatori, M., Panda, S. 186, Humana, New York, NY. (2022).
- Babii, O., et al. Peptide drugs for photopharmacology: how much of a safety advantage can be gained by photocontrol. Future Drug Discovery. 2 (1), FDD28 (2020).
- Davis, A. M., Keeling, D. J., Steele, J., Tomkinson, N. P., Tinker, A. C.
- Balani, S. K., Miwa, G. T., Gan, L., Wu, J., Lee, F. W. Strategy of utilizing in vitro and in vivo adme tools for lead optimization and drug candidate selection. Current Topics in Medicinal Chemistry. 5 (11), 1033-1038 (2005).
- Kleijn, A., et al. A Systematic comparison identifies an ATP-based viability assay as most suitable read-out for drug screening in glioma stem-like cells. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Rodrigues, J., Heinrich, M. A., Teixeira, L. M., Prakash, J. 3D in vitro model revolution: unveiling tumor-stroma interactions. Trends in Cancer. 7 (3), 249-264 (2021).
- Sittinger, M., et al. Tissue engineering and autologous transplant formation: practical approaches with resorbable biomaterials and new cell culture techniques. Biomaterials. 17 (3), 237-242 (1996).
- Matai, I., Kaur, G., Seyedsalehi, A., McClinton, A., Laurencin, C. T. Progress in 3D bioprinting technology for tissue/organ regenerative engineering. Biomaterials. 226, 119536 (2020).
- Babii, O., et al. Direct photocontrol of peptidomimetics: an alternative to oxygen-dependent photodynamic cancer therapy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (18), 5493-5496 (2016).
- De Ridder, K., et al. Novel 3D lung tumor spheroids for oncoimmunological assays. Advanced NanoBiomed Research. 2 (4), 2100124 (2022).
- Pauli, C., et al. Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Van Straten, D., Mashayekhi, V., De Bruijn, H. S., Oliveira, S., Robinson, D. J. Oncologic photodynamic therapy: basic principles, current clinical status and future directions. Cancers. 9 (2), 19 (2017).
- Li, X., Kwon, N., Guo, T., Liu, Z., Yoon, J. Innovative strategies for hypoxic-tumor photodynamic therapy. Angewandte Chemie International Edition. 57 (36), 11522-11531 (2018).
- Hull, K., Morstein, J., Trauner, D.
- Babii, O., et al. Structure-activity relationships of photoswitchable diarylethene-based β-hairpin peptides as membranolytic antimicrobial and anticancer agents. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (23), 10793-10813 (2018).
- Heckl, C., Aumiller, M., Rühm, A., Sroka, R., Stepp, H. Fluorescence and treatment light monitoring for interstitial photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 96 (2), 388-396 (2020).
