Summary
Dit protocol presenteert een reeks experimenten die zijn aangenomen voor de evaluatie van fotoschakelbare antikankerpeptiden, die kunnen worden gebruikt bij de preklinische screening van dergelijke verbindingen. Dit omvat cytotoxiciteitsbeoordeling in 2D- en 3D-celculturen, de evaluatie van ex vivo (modelweefsel) foto-isomerisatie-efficiëntie en in vivo werkzaamheid.
Abstract
Fotogecontroleerde, biologisch actieve verbindingen zijn een opkomende klasse van "slimme" kandidaat-geneesmiddelen. Ze bieden extra veiligheid bij systemische chemotherapie vanwege hun nauwkeurige spatiotemporale activering door een goedaardig, niet-ioniseerbaar licht naar een specifieke locatie in het lichaam van de patiënt te leiden. Dit artikel presenteert een reeks methoden om de in vitro potentie en ex vivo efficiëntie van de fotoactivatie van fotogecontroleerde, biologisch actieve verbindingen te evalueren, evenals de in vivo werkzaamheid in vroege stadia van de ontwikkeling van geneesmiddelen. De methodologie wordt toegepast op cytotoxische peptiden tegen kanker, namelijk de diaryletheen-bevattende analogen van een bekend antibioticum, gramicidin S. De experimenten worden uitgevoerd met behulp van 2D (adherente cellen) en 3D (sferoïden) celculturen van een kankercellijn (Lewis longcarcinoom, LLC), levend weefsel surrogaten (varkensvleesgehakt) en een allograft kankermodel (subcutane LLC) in immunocompetente muizen. De selectie van de meest effectieve verbindingen en schatting van realistische fototherapeutische vensters worden uitgevoerd via geautomatiseerde fluorescentiemicroscopie. De fotoactiveringsefficiëntie bij verschillende verlichtingsregimes wordt bepaald op verschillende diepten in een modelweefsel en de optimale lichtdosering wordt toegepast in het uiteindelijke therapeutische in vivo experiment.
Introduction
Fotogecontroleerde biologisch actieve verbindingen zijn de afgelopen decennia naar voren gekomen als een veelbelovend onderdeel van veilige chemotherapieën voor menselijke ziekten en om specifiek kwaadaardige vaste tumoren uit te roeien1. Deze verbindingen bevatten reversibele foto-isomiseerbare fragmenten (moleculaire fotoschakelaars) en kunnen schakelen tussen inactieve en actieve foto-isomeren bij bestraling met licht van verschillende golflengten.
In vergelijking met hun niet-fotocontroleerbare analogen kunnen fotogecontroleerde geneesmiddelen veiliger zijn omdat ze systemisch in het lichaam van de patiënt kunnen worden ingebracht in minder actieve en in wezen niet-toxische vormen, en vervolgens alleen door licht worden geactiveerd waar nodig, zoals in tumoren, zweren en wonden. Hoewel meerdere opwindende demonstraties van dergelijke prototypes van moleculaire geneesmiddelen te vinden zijn in recente academische artikelen 2,3,4,5,6,7, bestaat het gebied van klinische fotofarmacologie - een toepassing van goedgekeurde combinaties van geneesmiddelen / medische hulpmiddelen / ziekten - niet. Fotofarmacologie bevindt zich nog in de fase van geneesmiddelenontdekking en systematische preklinische studies zijn onbekend.
We hebben pas zeer recent het in vivo veiligheidsvoordeel aangetoond voor sommige fotogecontroleerde antikankerpeptiden, namelijk de analogen van het peptide-antibioticum gramicidin S8. Deze fotogecontroleerde derivaten bevatten een diaryledatheen (DAE) fotoschakelaar, die omkeerbare foto-geïnduceerde transformaties ondergaat tussen de zogenaamde roodlicht-gegenereerde "ring-open" en UV-gegenereerde "ring-gesloten" fotovormen (geïllustreerd in figuur 1 voor een van de derivaten, verbinding LMB002).
Figuur 1: Fotogecontroleerd cytotoxisch peptide LMB002 en zijn foto-isomerisatie. Het dagboekledheenfragment is in rood weergegeven. Afkorting: DAE = diarylethene. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Het vinden van hits en het uitvoeren van hit-to-lead optimalisatie vereisen vaak in vitro en in vivo screening van geschikte samengestelde bibliotheken 9,10. Hier demonstreren we een methodologie die geschikt is voor de systematische high-throughput screening van cytotoxiciteit van fotogecontroleerde verbindingen. We bepalen ook de foto-isomerisatie-efficiëntie, schatten de lichtdosis in modelweefsels en evalueren de in vivo werkzaamheid van de best presterende kandidaten. De aanpak is in overeenstemming met bio-ethiek en dierverzorgingsoverwegingen.
In dit werk worden traditionele preklinische methoden aangepast om de niet-gecontroleerde foto-isomerisatie van geteste verbindingen te voorkomen. Het algemene doel van het toepassen van deze gemodificeerde methoden hierin is het ontwikkelen van een algemene strategie die eenvoudig en snel is en statistisch significante gegevens oplevert om in vitro activiteiten betrouwbaar te vergelijken en de in vivo werkzaamheidstests van fotoschakelbare verbindingen voor loodidentificatie en verdere ontwikkeling te rationaliseren.
De strategie bestaat uit drie opeenvolgende stappen. De eerste stap omvat de bepaling van IC50 (schijnbare 50 % cel levensvatbaarheid) in seriële verdunningen voor de actieve en inactieve fotovormen van geselecteerde fotogecontroleerde biologisch actieve verbindingen met behulp van tweedimensionale (2D, monolayer) en driedimensionale (3D, sferoïde) celculturen en confocale high-throughput geautomatiseerde fluorescentiemicroscopie. Fototherapeutische vensters worden vergeleken met betrekking tot het IC50-verschil tussen de twee fotovormen en de best presterende kandidaten worden geselecteerd. Er is geen specifiek voordeel bij toxiciteitsbeoordeling door geautomatiseerde microscopie en andere cytotoxiciteitsscreeningplatforms (assays)11; Complexere celgebaseerde tumormodellen12 kunnen in dit stadium eenvoudig worden geïmplementeerd.
Voor de verbindingen die in stap 1 zijn geselecteerd, is de tweede stap het realistisch schatten van hun fotoschakelingsefficiëntie in de weefsels als functie van de diepte van het bestraalde weefseloppervlak door de fotoschakelingsefficiëntie van de minder actieve fotovormen in een weefselsurrogaat te kwantificeren met behulp van UV-gedetecteerde high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) van bestraalde monsterextracten. In vivo kan de efficiëntie van fotoswitching worden bestudeerd, maar we stellen voor om een eenvoudig weefselsurrogaat te gebruiken - gehakt varkensvlees. We hebben de validiteit van deze aanpak getest. We maten de conversie van onze fotoschakelbare verbindingen in vivo op een muizenkankermodel en observeerden ongeveer dezelfde fotoconversie op een diepte gemeten in eerdere experimenten met muizen8. Elk geschikt alternatief kunstmatig weefsel13, 3D-biogeprint weefsel/ orgaan 14, biopsiemateriaal of ander vrijgesteld dierlijk materiaal kan worden gebruikt. Deze opstelling is echter een goed compromis omdat het economisch, snel en ethisch is.
De derde stap is de bepaling van in vivo antikanker werkzaamheid in een muizenkankermodel. De verbindingen die superieure eigenschappen vertonen in de in vitro experimenten en efficiënt fotoswitchen op een diepte van ten minste 1-1,5 cm in de modelweefsels worden geselecteerd voor dit experiment.
Dit protocol kan worden toegepast op verbindingen met verschillende soorten fotoschakelaars, op voorwaarde dat hun fotovormen (of hun fotostationaire toestanden, PSS) stabiel zijn gedurende een redelijke tijd (een paar dagen of langer). Ter illustratie wordt een eerder beschreven DAE-afgeleide LMB002 gebruikt15. De LMB002 fotovormen zijn thermisch stabiel en kunnen minstens een jaar bij −20 °C bewaard worden zonder noemenswaardige degradatie. Lewis longcarcinoom (LLC) cellen worden gekozen voor deze in vitro en in vivo demonstratie, maar er worden geen beperkingen opgelegd aan het celtype. LLC-cellen zijn aanhangend, gemakkelijk te kweken in 3D en worden gebruikt om tumoroïden te genereren (zoals beschreven in de referentie16). In vivo LLC-cellen worden gebruikt om metastatische processen te modelleren en kunnen gemakkelijk solide tumoren genereren bij immunocompetente muizen na subcutane injectie. Deze in vivo methodologie kan universeel worden toegepast op andere kankermodellen17,18. De gedetailleerde implementatie van deze strategie wordt hieronder beschreven.
Protocol
Dierverzorging en experimentele procedures werden uitgevoerd volgens de lokale en internationale regelgeving voor het uitvoeren van onderzoeksprojecten met proefdieren (de wet van Oekraïne "Over de bescherming van dieren tegen wreedheid", Europees Verdrag voor de bescherming van gewervelde dieren die worden gebruikt voor experimentele en andere wetenschappelijke doeleinden (Europees verdrag, Strasburg, 1986), Richtlijn 2010/63 / EU inzake de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt). Deze studie is goedgekeurd door de Bioethics Commission van Bienta company. C57BL/6NCrl muizen (volwassen vrouwtjes met een gewicht van ongeveer 20 g per stuk) werden gebruikt in deze experimenten. Specifieke materialen, reagentia en apparatuur worden vermeld in de materiaaltabel.
1. IC50-evaluatie voor LMB002 ("ring-gesloten" en "ring-open" vormen) met behulp van 2D- en 3D LLC-celculturen
- Bereiding van buffers en stamoplossingen van de verbindingen
OPMERKING: Bereid buffers voor met behulp van standaardprocedures. U kunt ook commercieel beschikbare oplossingen gebruiken.- Bereid 10x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) door 14,2 g Na 2 HPO 4, 2,4 g KH 2 PO4, 80 g NaCl en2g KCl toe te voegen aan 1 L gedestilleerd water. Autoclaaf bereid 10x PBS en verdun het tot 1x oplossing door 100 ml 10x oplossing toe te voegen aan 900 ml gedestilleerd water. Bewaar de oplossing vervolgens bij 4 °C.
- Bereid Dulbecco's PBS (DPBS) door 4,78 g DPBS-poeder toe te voegen aan 1 L gedestilleerd water. Roer de oplossing totdat alle vaste stof is opgelost, controleer de pH met een pH-meter en pas deze aan door 1 M NaOH of 1 M HCl (pH 7,3-7,4) toe te voegen. Nadat u de gewenste pH-waarde hebt bereikt, filtert u het medium door een vacuümfilter van 0,22 μm in een steriele kast. Bewaren bij 4 °C.
- Bereid 1 M 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonzuur (HEPES) bufferoplossing door 238,3 g HEPES toe te voegen aan 1 l gedestilleerd water. Pas de pH van de oplossing aan met 1 M NaOH tot pH 7,5. Filtreer door een vacuümfilter van 0,22 μm in een steriele kast. Bewaren bij 4 °C.
- Bereid 1x trypsine-EDTA (EDTA = ethyleendiaminetetra-azijnzuur) oplossing door 10x oplossing te verdunnen. Voeg hiervoor 5 ml 10x Trypsine-EDTA toe aan 45 ml 1x PBS-oplossing in een steriele buis van 50 ml. Bewaren bij 4 °C.
- Bereid Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) basic door 13,4 g DMEM-hoog glucosepoeder en 3,7 g Na2CO3 tot 1 L gedestilleerd water toe te voegen in een maatcilinder met een magnetische roerstaaf op een roerplaat. Roer de oplossing totdat alle vaste stof is opgelost, controleer de pH met een pH-meter en pas deze aan door 1 M NaOH of 1 M HCl (pH 7,3-7,4) toe te voegen. Na het bereiken van de gewenste pH filtert u het medium door een vacuümfilter van 0,22 μm in een steriele kast en bewaart u het bij 4 °C.
- Bereid DMEM compleet medium door 100 ml foetaal runderserum (FBS), 10 ml penicilline-streptomycine-oplossing, 10 ml L-glutamine-oplossing en 10 ml 1 M HEPES-buffer toe te voegen aan 900 ml DMEM basisch. Bewaren bij 4 °C.
- Bereid stamoplossingen voor de teststoffen.
- Weeg voor elke verbinding twee batches van 5,12 mg (bijv. LMB002) in de ringgesloten fotovorm in twee microcentrifugebuizen van 1,5 ml (één met heldere en andere zwarte niet-transparante wanden). Weeg 2,28 mg positieve controle (bijv. gramicidin S) af in een extra heldere wandbuis. Voeg 100 μL zuivere DMSO toe aan elk monster en vortex gedurende 30 s.
- Foto-isomeriseer de stamoplossing (LMB002) in de heldere wandbuis van de "ring-gesloten" naar de "ring-open" vorm door de oplossing te bestralen met 660 nm laser (lichtvermogensdichtheid 0,6 W / cm2) met vortexing om een grondige menging te garanderen. Ga door totdat de kleur zichtbaar verandert van donkerpaars naar lichtbruin. Bescherm tegen licht met aluminiumfolie.
- 2D celkweek experiment-seeding van de cellen (dag 1)
- Breng 10 ml van het DMEM complete medium over van de T-75 kolf met een LLC-celcultuur naar een steriele buis van 15 ml. Zuig het overgebleven medium op met een vacuümpomp.
- Was de celkweek met 5 ml 1x DPBS en zuig de oplossing op met een vacuümpomp.
- Bedek de cellen met 3 ml 1x trypsine-EDTA-oplossing en incubeer de kolf gedurende 2-3 minuten bij 37 °C in een CO 2-atmosfeer van 5%.
- Stop de trypsine-werking door 6 ml van het DMEM-medium (eerder overgebracht naar een steriele buis) toe te voegen aan de celkweekkolf met 1x trypsine-EDTA-oplossing en de suspensie meerdere keren te pipetteren om de cellen van de celkweekkolfwanden te wassen.
- Breng de suspensie over in een buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 4 minuten op 200 × g . Na centrifugeren, zuig het supernatant op met een vacuümpomp. Raak de celkorrel aan de onderkant van de buis niet aan.
- Resuspendeer de cellen door 2 ml vers DMEM compleet medium toe te voegen en meerdere keren te pipetteren.
- Tel de cellen door ongeveer 15 μL van de suspensie in een buis van 0,5 ml te bemonsteren, 15 μL 0,4% trypanblauw toe te voegen en het verkregen mengsel in een celtelkamer over te brengen.
- Bereid na het tellen 25 ml van de celsuspensie per tijdstip voor. Zaai 5.000-10.000 (gemiddeld 8.000) LLC-cellen / put in 200 μL DMEM in de centrale 60 putten van een 96-putplaat met heldere bodem en zwarte niet-transparante wanden. Vul de overige 36 putten met pure DMEM.
- Plaats de platen een nacht in een celkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2. Gebruik plastic plaatdeksels eronder om ongelijkmatige verwarming van de bodemplaat te voorkomen.
- 2D-celkweekexperiment - toevoegen van de verbindingen (dag 2)
- Controleer de cellen door lichtmicroscopie in de platen totdat de cellen 70% -80% confluentie hebben bereikt.
- Zuig het medium uit de putten met een vacuümpomp in een steriele kast. Voeg 100 μL van het verse voorverwarmde DMEM-medium toe en plaats de platen in een celkweekincubator.
- Bereid seriële verdunningen van de teststoffen en positieve controle in polypropyleen geautoclaveerde heldere platen. Maak de volgende oplossingen voor individuele tijdpuntmetingen:
OPMERKING: Begin met de voorraden in DMSO en verdun met DMEM, maar niet meer dan 1% v/v DMSO in de uiteindelijk hoogste concentratie.- Om een 128 μM-oplossing van gramicidin S te verkrijgen, voegt u 1,3 μL 20 mM stamoplossing toe aan 198,7 μL DMEM.
- Om een 256 μM-oplossing van LMB002, "ring-open" vorm te verkrijgen, voegt u 1,3 μL 40 mM-oplossing toe aan 198,7 μL DMEM.
- Om een 512 μM-oplossing van LMB002, "ring-gesloten" vorm te verkrijgen, voegt u 2,6 μL 40 mM stamoplossing toe aan 197,4 μL DMEM.
- Voer drie extra herhalingen uit om vier sets van elk concentratiepunt te verkrijgen. Bereid een dubbele verdunningsreeks voor door 100 μL uit elk startputje te zuigen, over te brengen naar een put met 100 μL DMEM en grondig te mengen.
OPMERKING: Het werken met fotoschakelbare verbindingen vereist aanpassing van de verlichting om foto-isomerisatie terug te voorkomen. Het uitschakelen van het licht in steriele kasten wordt aanbevolen. - Verkrijg de eindconcentraties van de verbindingen in putten (5-150 μM) door telkens 100 μL van de bereide oplossingen over te brengen in 56 putten met 100 μL eerder toegevoegde DMEM. Voeg elke keer 100 μL DMEM toe in vier putten om als negatieve controle te dienen.
- Dekplaten af met aluminiumfolie of plastic beschermende niet-transparante afdekking om ongecontroleerde fotoswitching te voorkomen. Plaats de platen in een celkweekincubator bij 37 °C (met daaronder extra plastic plaatdeksels) voor de gekozen incubatietijd (10 min, 60 min, 24 h of 72 h).
- 2D-celkweekexperiment - kleuring en beeldvorming (dag 2-5)
- Voeg na incubatie met verbindingen gedurende verschillende perioden 50 μL van de kleuringsoplossing per put toe aan de platen die gedurende 10 en 60 minuten met verbindingen zijn geïncubeerd. Incubeer de platen bij 37 °C gedurende 20 min.
OPMERKING: Bereid voorraadkleuringsoplossingen per tijdstip door 8 μL 20 mM Hoechst 33342-oplossing (eindconcentratie is 5 μM), 32,5 μL 1 mM propidiumjodide (PI)-oplossing (eindconcentratie) en 650 μL niet-steriele FBS toe te voegen aan 5.810 μL niet-steriele 1x PBS. Verwarm FBS en PBS voor in een waterbad bij 37 °C om te voorkomen dat de cellen een temperatuurschok ervaren. - Voer geautomatiseerde fluorescentiebeeldvorming uit met behulp van een 20x objectieflens.
- Herhaal dezelfde kleurings- en beeldvormingsprocedure (stappen 1.4.1 -1.4.2) voor de platen die gedurende 24 (dag 3) en 72 (dag 5) met verbindingen zijn geïncubeerd.
OPMERKING: Typische 2D-plaatkaarten worden weergegeven in figuur 2.
- Voeg na incubatie met verbindingen gedurende verschillende perioden 50 μL van de kleuringsoplossing per put toe aan de platen die gedurende 10 en 60 minuten met verbindingen zijn geïncubeerd. Incubeer de platen bij 37 °C gedurende 20 min.
- 3D-celkweekexperiment - zaaien van de cellen (dag 1)
OPMERKING: De stappen voor deze sectie zijn identiek aan die beschreven voor de 2D-experimentvoorbereiding van de celcultuur, incubatie met de geteste verbindingen en beeldvorming (stappen 1.1-1.4.) In dit geval worden de cellen echter bereid als compacte volwassen sferoïden in een 384-well ultra-low adhesion U-bodemplaat met zwarte, niet-transparante wanden. Met behulp van een plaat van deze grootte kunnen twee verbindingen in één experiment worden vergeleken.- Herhaal stap 1.2.1-1.2.9 van het 2D-experimentprotocol met een LLC-celcultuur.
- Bereid na het tellen van de cellen 25 ml van de celsuspensie voor. Zaai 1.000 cellen per put in alle putten in 50 μL DMEM in een 384-put, laagbindende U-bodemplaat.
- Centrifugeer op 40 × g gedurende 30 s en schud met een plaatschudder bij 250 tpm gedurende 1 minuut om de cellen van de wanden van de putten naar de bodem te schudden.
- Plaats de platen in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 bovenop extra plastic plaatdeksels om ongelijke verwarming van de plaatbodem gedurende 48 uur te voorkomen.
- 3D-celkweekexperiment - toevoegen van de verbindingen (dag 3)
- Controleer de cellen in platen door middel van microscopie om er zeker van te zijn dat er compacte volwassen sferoïden zijn gevormd.
- Bereid een seriële verdunning van bestudeerde verbindingen in polypropyleen geautoclaveerde heldere platen. Neem in dit geval een extra verbinding op. Maak de volgende oplossingen voor individuele tijdpuntmetingen:
- Om 175 μM- en 350 μM-oplossingen van gramicidin S te verkrijgen, voegt u 1,8 μL stockoplossing toe aan 198,2 μL DMEM en voegt u 3,6 μL voorraad toe aan 196,4 μL DMEM dienovereenkomstig.
- Om 175 μM- en 350 μM-oplossingen van LMB002, "ring-open"-vorm te verkrijgen, voegt u 1 μL stockoplossing van 40 mM toe aan 199 μL DMEM en voegt u 1,8 μL voorraad toe aan 198,2 μL DMEM dienovereenkomstig.
- Om 350 μΜ- en 1.750 μM-oplossingen van LMB002, "ring gesloten" vorm te verkrijgen, voegt u 1,8 μL 40 mM stamoplossing toe aan 198,2 μL DMEM en voegt u 8,8 μL voorraad toe aan 191,2 μL DMEM dienovereenkomstig.
- Voer drie extra replicaties uit om vier sets van elk concentratiepunt te verkrijgen. Verkrijg seriële verdunningen door 20 μL uit elk startputje op te zuigen, het over te brengen naar de put, met 180 μL DMEM, en grondig te mengen.
OPMERKING: Het werken met fotoschakelbare verbindingen vereist aanpassing van de verlichting om foto-isomerisatie terug te voorkomen. Het uitschakelen van de lichten in steriele kasten wordt aanbevolen. - Verkrijg de uiteindelijke concentraties van verbindingen in putten door telkens 20 μL van de bereide oplossingen over te brengen in 128 putten die 50 μL DMEM bevatten. Voeg elke keer 20 μL DMEM toe in drie putten om als controle te dienen. Bedek de platen met aluminiumfolie of plastic beschermhoes om fotoschakeling of verdamping te voorkomen.
- Plaats de platen in een celkweekincubator op plastic plaatdeksels voor de gekozen incubatietijd.
- 3D-celkweekexperiment - kleuring en beeldvorming (dag 3-6)
- Bereid de kleuringsoplossing per tijdstip door toevoeging van 13 μL calceïne AM-oplossing (eindconcentratie is 1 μM), 22 μL 20 mM Hoechst 33342-oplossing (eindconcentratie is 33 μM), 40 μL 1 mM PI-oplossing (eindconcentratie is 3 μM), 300 μL niet-steriele FBS aan 2,625 μL niet-steriele 1x PBS. Verwarm FBS en PBS voor in een waterbad bij 37 °C om te voorkomen dat de cellen een temperatuurschok ervaren.
- Voeg na incubatie gedurende verschillende perioden met de verbindingen 20 μL van de kleuringsoplossing per put toe aan de putten die gedurende 10 minuten met verbindingen zijn geïncubeerd. Incubeer bij 37 °C gedurende 2 uur.
- Voer confocale fluorescentiebeeldvorming uit met een 20x objectieflens.
- Herhaal dezelfde kleurings- en beeldvormingsprocedure voor putten die gedurende 24 (dag 4) en 72 (dag 6) met verbindingen werden geïncubeerd.
OPMERKING: In dit experiment wordt calceïne AM gebruikt als derde component van de meerkleurige kleuringsoplossing. Beelden verkregen uit 2D- en 3D-experimenten worden geanalyseerd met behulp van de geautomatiseerde beeldanalysesoftware van het instrument. Cellen die samen met Hoechst en propidiumjodidekleurstoffen zijn gekleurd, worden als necrotisch dood beschouwd en hun fractie als functie van de concentratie wordt gebruikt om de IC50-waarde te berekenen.
Figuur 2: Voorbeeld van typische plaatkaarten voor de 2D-cultuurexperimenten. Kleurcodes voor de verbindingen en controle worden aangegeven. Concentraties van geteste verbindingen (aantallen in de putten) worden gegeven in μM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Bepaling van de fotoschakelingsefficiëntie in een weefselsurrogaat
- Monteer de optische trein voor de monsterbestraling zoals weergegeven in figuur 3 (bestaande uit een optische kabel van de laserlichtbron, een lens met variabele brandpuntsafstand, een spuit met een niet-transparante afdekking en een vlak gesneden uiteinde).
- Door de brandpuntsafstand en het diafragma van de lens te veranderen, verkrijgt u een vlakke lichtbundel met een diameter die 1-1,5 mm groter is dan de binnendiameter van de gebruikte spuit, maar toch zoveel mogelijk binnen het diafragma ligt.
- Gebruik een spuit van 5 ml met een gesneden uiteinde en een binnendiameter van 12,4 mm en is bedekt met een niet-transparante plastic hoes. Bij een laservermogen van 200 mW stelt u de vermogensdichtheid aan de uitgang van het optische systeem in op ~103 mW/cm2 zoals gemeten met een fotometer.
OPMERKING: Alle volgende bewerkingen moeten worden uitgevoerd in een verduisterde ruimte met zo min mogelijk verlichting op de werkplek. - Bereid 3 ml LMB002 ("ringgesloten" vorm) stamoplossing in PBS met een concentratie van 1 mg/ml.
- Bereid een modelweefselmonster geladen met de inactieve fotovorm van LMB002 in een plastic container. In een typische run wordt 5 g vers gehakt varkensvlees mechanisch gemengd met 277 μL LMB002-stamoplossing en 260 μL PBS om de uiteindelijke concentratie van 50 mg / kg in het monster te bereiken, en de verhouding weefsel / PBS van ~ 9/1 (v / v).
- Vul de spuit met het voorbereide monster, zorg ervoor dat er geen luchtbellen in zitten, en vorm een vlak oppervlak aan het blootstellingsuiteinde (snijpunt).
OPMERKING: De cilinder van het monster in de spuit moet ~40 mm langs de as beslaan. - Bestraal het monster in de optische trein zoals weergegeven in figuur 3 gedurende 9 min 44 s, wat overeenkomt met ~60 J/cm2 blootstelling.
- Bereid 4 mm dikke plakken van het monster na de blootstelling door het met de zuiger van de spuit te duwen en het met een scalpel te snijden. Weeg en plaats de plakjes in afzonderlijke reageerbuizen en markeer ze met de gemiddelde afstand (mm) tot het bestraalde oppervlak.
- Bereid twee controlemonsters (optimale hoeveelheid, 0,5-0,7 g) in reageerbuizen: in het ene, gehakt gemengd met 10% (volume) PBS (54 μL), en in het andere, het modelweefselmonster verkregen in stap 2.4 bestraald door 500 mW laserlicht gedurende 10 minuten om ervoor te zorgen dat alle LMB002 "ring-gesloten" moleculen worden omgezet in de "ring-open" vorm.
- Voeg acetonitril-watermengsel (70%/30% v/v, aangevuld met 0,01% trifluorazijnzuur (TFA), 1,4 ml/g) toe aan elke plak en de controlemonsters. Meng de inhoud grondig met behulp van een glazen staaf.
- Incubeer gedurende ten minste 10 minuten bij kamertemperatuur en centrifugeer de mengsels gedurende 20 minuten bij 5220 x g of centrifugeer gedurende 30 minuten twee keer bij 20 x g om het onoplosbare materiaal te verwijderen en het supernatant te verzamelen.
- Verzamel de supernatanten voorzichtig (~ 0,7 ml) en centrifugeer ze opnieuw op 16.000 x g gedurende 30 minuten.
- Verzamel de supernatanten (~ 0,5 ml elk) en analyseer ze door omgekeerde fase high-performance vloeistofchromatografie (RP HPLC) met een analytische C18-kolom, lineaire A: B-gradiënt van 3,46% B / min, 2,0 ml / min-stroomsnelheid en 100 μL geïnjecteerd volume. Noteer de UV-gedetecteerde chromatogrammen bij 570 nm (detectie van de "ring-gesloten" vorm) en 270 nm (detectie van de "ring-open" vorm). Gebruik de niet-bestraalde (stap 2.4) en bestraalde controlemonsters (stap 2.8) om de specifieke retentietijden van beide fotovormen te bepalen (eluent A: waterig 0,1% TFA; eluent B: 90% acetonitrilwater, 0,1% TFA) en kalibreer de methode.
- Bepaal de werkelijke hoeveelheden LMB002-fotovormen in de geanalyseerde monsters met behulp van de kalibratiecurven die worden verkregen door de chromatogrammen van LMB002-oplossingen van bekende concentraties te nemen en te analyseren. Bereid voor kalibratie LMB002 "ringgesloten" oplossingen door de stamoplossing (stap 2.3) te verdunnen met acetonitril-watermengsel (70%/30% v/v aangevuld met 0,01% TFA) om 0,36, 0,9 en 3,6 μg per 100 μl (het geïnjecteerde volume) te verkrijgen; De eluentgradiënt en het debiet zijn hetzelfde als in stap 2.12.
- Herhaal het experiment (stappen 2.4-2.12) drie keer en plot het genormaliseerde percentage van elke fotovorm op de plot (percentage) versus de afstand (van het bestraalde weefseloppervlak). Bereken de statistieken (d.w.z. de standaardafwijking op elk concentratiepunt).
Figuur 3: Experimentele opstelling voor het bepalen van de efficiëntie van fotoconversie in modelweefsel. (A) Schematische en (B) foto; 1, optische kabel van de laserlichtbron; 2, lens met variabele brandpuntsafstand; en 3, vleesgehakt-LMB002-fosfaat-gebufferd zoutoplossingmengsel geplaatst in 4, een spuit met een niet-transparante afdekking en gesneden voorkant (weergegeven in (B) zonder de hoes). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. In vivo bepaling van de werkzaamheid tegen kanker
OPMERKING: Het experimentschema en de eindpunten worden weergegeven in figuur 4. De normen voor de verzorging van dieren in de nabehandelingsperiode moeten voldoen aan de 3V-regels - huisvesting moet een goede kooidichtheid en beschikbaarheid van middelen omvatten. Houd je waar mogelijk aan niet-aversieve methoden voor het hanteren van dieren, zoals tunnel- of cupping.
Figuur 4: Schema voor het in vivo therapeutisch experiment. De aanduiding van experimentele groepen, therapiedetails, eindpunten en post mortem-analyseschema's. Afkortingen: LLC = Lewis longcarcinoom; IV = intraveneus; SC = subcutaan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Voorbereiding van de kankercellen voor subcutane inenting (dag 0).
- Passeer de LLC-cellen in DMEM (4,5 g / L glucose) met 10% FBS, 100 U / ml penicilline en 100 μg / ml streptomycine bij 37 ° C en 5% CO2.
- Oogst de cellen met behulp van 0,05% trypsine-EDTA-oplossing, centrifugeer en suspensie in serumvrije DMEM.
- Tel de cellen en bepaal hun levensvatbaarheid met behulp van een hemocytometer en trypan blauwe uitsluitingstest.
- Bereid de laatste celsuspensie met een concentratie van 10 × 106 cellen/ml in DMEM en Matrigel-mix (1:1). Houd de suspensie op ijs voor injectie.
- LLC celinenting (dag 0)
- Plaats de volwassen vrouwelijke C57BL/6NCrl-muis (met een gewicht van ~ 20 g) in de inductiekamer van het isofluraananesthesieapparaat. Voer sedatie uit op 5% isofluraan en wacht tot het dier volledig bewusteloos is.
- Verwijder de vacht uit het gebied van celinenting door te scheren.
- Ent 5 × 105 LLC-cellen in ~ 100 μL DMEM: Matrigel (1: 1) mengsel in de rechter achterpoot.
OPMERKING: Houd u waar mogelijk aan de praktijk voor het gebruik van één naald.
- Toediening van verbindingen en fotoirstraling
OPMERKING: In 5-8 dagen na inenting zijn de dieren klaar voor behandeling wanneer hun tumoren voelbaar zijn en ~ 50-100 mm3 volume hebben bereikt. Voer alle volgende bewerkingen uit met LMB002 en muizen die met deze verbinding zijn behandeld onder halfdonkere omstandigheden (één LED-lamp van 4 W op ten minste 5 m van de werkplek).- Los LMB002 ("ringgesloten" vorm) op in steriele fysiologische zoutoplossing in een concentratie van 1 mg/ml voor de dosis van 5 mg/kg (IV) om donkerblauwe homogene oplossingen te verkrijgen.
- Stel vóór de bestraling willekeurig vier groepen van acht dieren samen en verwijder de vacht uit de tumor en nabijgelegen gebieden door te scheren.
- Plaats een muis in de houder voor IV-injecties en verwarm de staart van het dier in een waterbad bij 37 °C om de staartader zichtbaar te maken.
OPMERKING: Overweeg preoperatieve analgesie. - Injecteer de verbinding met 5 ml / kg in de staartader. Injecteer voor de twee controlegroepen 100 μl zoutoplossing (intraveneus) per dier (20 g lichaamsgewicht). Zorg ervoor dat de dieren in de twee experimentele groepen de geteste verbinding in de inactieve fotovorm (1 mg/ml in zoutoplossing) ontvangen.
OPMERKING: Houd u waar mogelijk aan de praktijk voor het gebruik van één naald. - Plaats vervolgens 2 h 45 min na de injectie van de verbinding de muis onder narcose. Induceer sedatie met 3%-4% isofluraan in zuurstof. Handhaaf de anesthesie gedurende 15 minuten met 0,5% -1% isofluraan in zuurstof.
- Bedek de muis met een zwart masker met een gat dat alleen het tumorgebied aan het licht blootstelt.
- Schakel de laserdiodemodule in met een laser van 650 nm en stel het vermogen van de rode laser in op 200 mW en de blauw/UV-geleidingslaser op 2 mW.
OPMERKING: Gebruik een blauwe beschermende bril wanneer het laserapparaat is ingeschakeld. - Meet de lichtstroom van de rode laser (weg van de muizen) met een fotometer en bepaal de afstand tot de optische kabel waar de lichtstroom 100 mW/cm2 is. Bevestig de kabel op een standaard om ervoor te zorgen dat de lichtbron zich op de bepaalde afstand van de tumor bevindt en dat het licht het hele tumorgebied bedekt. Gebruik blauw/UV-geleidingslaserlicht tijdens deze procedure.
- Schakel de rode laser in om het tumorgebied gedurende 20 minuten te bestralen.
- Schakel na de bestraling de isofluraanstroom uit, breng het dier terug naar zijn kooi en observeer de toestand ervan gedurende de volgende 30 minuten zorgvuldig.
OPMERKING: Houd de muizen na toediening van de verbinding gedurende 2 dagen in het donker. Alleen de lichtdagcyclus moet worden gewijzigd; Alle andere woonomstandigheden moeten ongewijzigd blijven.
- Nabehandelingsobservaties
- Observeer de dieren dagelijks en meet het gewicht en de afmetingen van hun tumoren. Meet het tumorvolume en noteer de progressie van de necrose.
OPMERKING: De normen voor de verzorging van dieren in de nabehandelingsperiode moeten voldoen aan de 3V-regels - huisvesting moet een goede kooidichtheid en beschikbaarheid van middelen omvatten. - Gebruik gegevens die in de vorige stap zijn verzameld om de mortaliteit te evalueren. Bepaal de overlevingskans met behulp van de standaardprocedure.
OPMERKING: Dieren moeten worden geofferd en als dood worden geteld bij het onthullen van ernstige klinische symptomen (verlies van lichaamsgewicht van meer dan 15%, tumorzweren geneest niet binnen 7 dagen en vocalisatie) of zodra het tumorvolume 2.500mm 3 bereikt.
- Observeer de dieren dagelijks en meet het gewicht en de afmetingen van hun tumoren. Meet het tumorvolume en noteer de progressie van de necrose.
Representative Results
In dit werk werden 2D- en 3D-celexperimenten uitgevoerd om de IC50 te bepalen voor "ring-gesloten" en "ring-open" vormen van LMB002 (zie figuur 1) op verschillende incubatietijden. Deze waarden werden vergeleken met die verkregen voor het prototype peptide, gramicidin S (gebruikt als positieve controle). Een typische reeks afbeeldingen van de incubatie in 2D-gekweekte LLC-cultuur na kleuring wordt weergegeven in figuur 5. Co-kleuring met Hoechst 33342 (blauw) en propidiumjodide (rood) resulterend in verschillende tinten paars in een groter deel van de cellen in het geval van behandeling met "ring-open" vorm in vergelijking met "ring-gesloten" duidt op een merkbaar verschil in cytotoxiciteit tussen twee vormen die gemakkelijk kunnen worden gekwantificeerd. Het gedemonstreerde voorbeeld van een succesvol experiment is gebaseerd op de gegevens die zijn verzameld met behulp van het 96-well plaatformaat, waarbij de peptidevarianten in verschillende concentraties werden toegevoegd, zoals weergegeven in figuur 2. Vergelijkbare gegevens kunnen worden verkregen met platen met 384 putten en hoge dichtheid. Aangezien echter de volumes per put worden verminderd, zullen technische en systematische fouten en als gevolg daarvan de nauwkeurigheid van de IC50-bepaling afnemen met toenemende putdichtheid.
Figuur 5: Representatieve beelden van de cytotoxiciteitstest in de monolayer-grown LLC. Cellen werden gekleurd met Hoechst 33342 (blauw) en propidiumjodide (rood). De getoonde tijden: 10 min, 60 min, 24 h en 72 h zijn incubatietijden met verbindingen. Schaalbalken = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De fotoconversie van LMB002 door laserlichtbestraling in een modelweefsel - vers varkensgehakt - werd bepaald met behulp van een monster bestaande uit gehakt gemengd met LMB002 "ringgesloten" (inactieve) vorm opgelost in PBS en het meten van de omzetting van deze inactieve vorm in de LMB002 "ring-open" (geactiveerde) vorm in de richting van stralingsvoortplanting. Het monster werd in een spuit geplaatst en van één kant bestraald met een platte straal laserstraling gedurende de blootstellingstijd van ~ 10 minuten (meestal gebruikt in in vivo experimenten), zoals weergegeven in figuur 3. Na de blootstelling werd de monstercilinder in delen verdeeld door op de zuiger van de spuit te drukken en de plakjes van dezelfde hoogte met een scalpel te snijden. De concentratie LMB002 "ring-open" in de extracten van de plakjes werd bepaald met behulp van RP HPLC.
Figuur 6 illustreert de dosis-effectcurven Figuur 6A-D verkregen uit data-analyse. Om het percentage dode cellen met nucleaire co-kleuring van Hoechst 33342 en PI-kleurstoffen te identificeren, gebruikten we een ingebouwde classificatortool die numerieke drempels instelt op geselecteerde gemeten parameters om alle celtellingen in verschillende categorieën te splitsen. Wanneer bijvoorbeeld het rode kanaal (propidiumjodide) signaal in de controle op de drempel was (ongeveer 110-130 eenheden), konden de cellen worden geclassificeerd als PI-positief, beschouwd als dood, of PI-negatief, beschouwd als niet-beïnvloed door de verbindingen. Voor LMB002 kunnen sigmoïdale afhankelijkheid van het percentage propidiumjodide-positieve cellen op de concentratieverbinding worden gezien. Uit deze gegevens kunnen de IC50-waarden worden bepaald.
Figuur 6: Analyse van cytotoxiciteit in 2D-cultuur. Sigmoïde past zoals verkregen in de LLC-cultuur voor (A) 10 min, (B) 60 min, (C) 24 h en (D) 72 h-tijdsintervallen genomen voor incubatie met verbindingen. Montage maakt de nauwkeurige bepaling van IC50-waarden mogelijk (niet weergegeven). Foutbalken zijn SEM. Afkortingen: LLC = Lewis longcarcinoom; PI = propidiumjodide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Gezien de verkregen IC50-waarden kunnen we concluderen dat de toxiciteit van alle drie de verbindingen toenam met de incubatietijd. Ons experiment onthulde dat de "ring-open" vorm van LMB002 ongeveer één verdunningsstap minder toxisch is dan het prototype peptide, gramicidin S. Terwijl de "ring-gesloten" vorm drie tot vier verdunningsstappen lagere toxiciteit vertoont, die toeneemt met de incubatietijd. Het verschil tussen de twee verdunningsstappen wordt niet beïnvloed door de toename van de incubatietijd en kan numeriek worden gebruikt als een experimenteel bepaald fototherapeutisch venster6 voor vergelijking met andere verbindingen in een potentiële bibliotheekscreening. De IC50-waarde voor gramicidin S werd ingesteld als referentiepunt om experimentele fouten of differentiële outputs in biologische replicaties te corrigeren.
De 3D-celexperimenten produceerden hetzelfde type onbewerkte gegevens - de single cell-resolved one-per-well sferoïde beelden. De opname van calceïne als derde kleurstof maakt de kwantificering van de fractie metabolisch actieve cellen (waargenomen in het groene kanaal) mogelijk. Door 384-putplaten te gebruiken, het aantal technische replicaties te verhogen, redundante co-incubatietijdpunten uit te sluiten en de verdunningsplooi te veranderen, konden we verschillende verbindingen direct vergelijken in een enkele testrun (met behulp van één plaat) zoals geïllustreerd in de plaatkaart in figuur 7.
Figuur 7: Plaatkaart voor het 3D-cultuurexperiment met twee verbindingen. Kleurcodes voor de verbindingen en controle worden aangegeven. Getallen in putten zijn concentraties in μM. 10 min, 24 h en 72 h zijn incubatietijden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8 toont de afbeeldingen van geselecteerde technische replicaties van LLC-sferoïden gekweekt met een dichtheid van 1 sferoïde / put in de aanwezigheid van geteste verbindingen en controlesferoïden die zijn vastgelegd na kleuring.
Figuur 8: Representatieve beelden van 3D-cultuur cytotoxiciteitstest. Afbeeldingen tonen 48-h-oude LLC-sferoïden gekleurd met Hoechst 33342 (blauw), calceïne AM (groen) en propidiumjodide (rood) na 10 min, 24 uur en 72 uur co-incubatie met zowel LMB002-fotovormen als gramicidin S. Schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Met behulp van de instrumentsoftware werden de dosis-effectcurven, zoals die in het 2D-experiment, verkregen uit de z-gestapelde stapels afbeeldingen (figuur 9A). Bovendien kunnen compacte en niet-vervormde sferoïden in de 3D-culturen worden gekenmerkt door de diameter van de hele sferoïde (figuur 9B). Er werd ook opgemerkt dat de totale sferoïde diameter varieert met de concentratie van de verbinding.
Figuur 9: Cytotoxiciteitsevaluatie met 3D-culturen. (A) Concentratieafhankelijke cytotoxiciteitsaanpassingscurven en (B) concentratieafhankelijke sferoïdediameterplots verkregen in de 3D-culturen van LLC co-geïncubeerd met gramicidin S gedurende 10 minuten, 24 uur en 72 uur en vastgelegd vóór kleuring. Foutbalken zijn SEM. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Het experiment voor stap 2 maakt het mogelijk om LMB002-concentraties in beide fotovormen te bepalen met behulp van UV-gedetecteerde high-performance vloeistofchromatografie. De efficiëntie van fotoconversie in modelweefsels kon eenvoudig worden beoordeeld en gekwantificeerd met behulp van deze opstelling (figuur 3). De gegevens werden verkregen uit de kwantitatieve analyse van de chromatogrammen van de monsterextracten. In deze testexperimenten werden LMB002-chromatogrammen spectroscopisch gedetecteerd bij 270 nm en 570 nm. Bij 270 nm werden veel extra signalen waargenomen en toegeschreven aan de verbindingen die samen uit het modelweefsel werden geëxtraheerd (geverifieerd uit het controle-extract zonder de verbinding). Beide fotovormen waren voldoende verschillend in retentietijden en absorptie. Het LMB002 "ring-open"-signaal was echter baseline-gescheiden van deze achtergrondsignalen (zie een representatief chromatogram in figuur 10A). Daarom kan dit signaal zonder problemen worden geïntegreerd. Bij 570 nm bevatten de chromatogrammen alleen LMB002 "ring-gesloten" vormsignaal (figuur 10B). Hier hebben we concentratiebepaling uitgevoerd met behulp van RP HPLC. Niettemin kunnen nog hogere nauwkeurigheid en lagere detectiegrenzen worden bereikt met LC/MS als analysemethode.
Figuur 10: Representatieve chromatogrammen van LMB002 geëxtraheerd uit modelweefsels. (A) Monster op 2 mm van het bestraalde oppervlak, geregistreerd bij 270 nm (LMB002 "ring-open"-vorm is geïntegreerd); B) monster op 38 mm van het bestraalde oppervlak, geregistreerd bij 570 nm (de piek van LMB002 "ringgesloten" is geïntegreerd). Retentietijdwaarden (aangegeven) bevestigden bovendien de identiteit van de verbinding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De gegevens die werden verkregen na integratie van de overeenkomstige signalen van alle verzamelde monsters werden gebruikt om de concentratiedieptegrafieken te maken, zoals weergegeven in figuur 11. Op basis van deze grafieken kon de efficiëntie van fotoconversie op verschillende diepten van het modelweefsel eenvoudig worden beoordeeld. Het bevestigt dat onze rode lichtbron de "ring-gesloten" LMB002-fotoconversie induceert op een diepte van maximaal 1 c, in het weefsel surrogaat, gehakt (bij ongeveer 103 mW / cm2).
Figuur 11: Evaluatie van de efficiëntie van de fotoconversie. Concentratie (A, mg/kg) van LMB002 "ring-gesloten" (niet-geactiveerde, blauwe stippen) en "ring-open" vormen (geactiveerde, oranje stippen) op verschillende afstanden van het bestraalde oppervlak van het modelweefsel (L, mm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De resultaten van het in vivo experiment - stap 3 van onze methodologie uitgevoerd volgens het schema in figuur 4 - werden weergegeven door grafieken met tumorgroei als functie van de tijd (figuur 12) en Kaplan-Meier-overlevingscurven (figuur 13).
Figuur 12: Tumorgroeidynamiek bij dieren. Dieren behandeld met LMB002 in vergelijking met de met het medium behandelde dieren (subcutaan LLC allograftmodel in C57BL/6NCrl muizen, samengestelde dosis 7 mg/kg, IV, 2 h 40 min incubatie, vervolgens bestraling bij 650 nm, 100 mW/cm2, 20 min). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 13: Sterftecurven voor dieren. Dieren behandeld met LMB002 in vergelijking met de met het medium behandelde dieren (subcutaan LLC allograftmodel in C57BL/6NCrl muizen, samengestelde dosis 7 mg/kg, IV, 2 h 40 min incubatie, vervolgens bestraling bij 650 nm, 100 mW/cm2, 20 min). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Fotogecontroleerde verbindingen zijn ongekend in de ontwikkeling van geneesmiddelen; Er zijn echter geen methoden vastgesteld voor hun preklinische en klinische evaluatie. De dichtstbijzijnde monotherapie-analoog, fotodynamische therapie (PDT), is de behandelingsmodaliteit voor klinisch gebruik die door veel landen tegen kanker wordt gebruikt en is in ontwikkeling voor andere indicaties19,20. Net als fotofarmacologie is PDT ook gebaseerd op het gebruik van licht om de bioactieve stof (singlet zuurstof) te activeren. Daarom kunnen sommige experimentele methoden die worden gebruikt voor preklinische en klinische studies in PDT worden gebruikt voor fotofarmacologie. Lichtbronnen, lichtafgiftebenaderingen en medische hulpmiddelen zijn bijvoorbeeld goed ontwikkeld en goedgekeurd voor PDT; Ze kunnen direct worden gebruikt voor de evaluatie van fotogecontroleerde geneesmiddelen. PDT en fotofarmacologie hebben echter veel verschillen van elkaar4, wat de noodzaak rechtvaardigt om specifieke methoden voor de laatste vast te stellen.
Ten eerste is de niet-geactiveerde stof in PDT (zuurstof) altijd aanwezig in levende weefsels in niet-toxische concentraties. Daarentegen kunnen niet-geactiveerde fotogecontroleerde biologisch actieve verbindingen restactiviteit en ongewenste toxiciteit hebben. Daarom moeten ideale fotofarmacologische geneesmiddelen de biologische activiteit in hun toegediende vorm hebben geminimaliseerd en zeer actief zijn in hun door licht gegenereerde vorm, het "fototherapeutische venster"21 moet zo groot mogelijk zijn. Het vinden van de hit en het uitvoeren van hit-to-lead optimalisatie vereist de identificatie van geschikte verbindingen en de screening van relatief grote bibliotheken, al in een vroeg stadium van de ontwikkeling van geneesmiddelen. Hier stelden we een geautomatiseerde confocale fluorescerende microscopie met hoge doorvoer voor om efficiënte fotoschakelverbindingen te identificeren.
De gekozen methode voor cytotoxiciteitsevaluatie maakt een eenvoudige implementatie van de meest kritische vereiste mogelijk - behoud van de PSS of stabiliteit van het zichtbaar-lichtgevoelige foto-isomeer. Dit komt omdat, bij de implementatie, de blootstelling aan licht wordt geminimaliseerd. Daarom moet bij het selecteren van alternatieve methoden de voorkeur worden gegeven aan geautomatiseerde methoden. Deze aanpak is betrouwbaar en informatief. Het gebruik van 3D-celculturen (sferoïden) in dit stadium biedt een holistisch begrip van de reactie van de cel op de behandeling in een meer realistische weefselachtige micro-omgeving. Bovendien kunnen waardevolle inzichten in het werkingsmechanisme van de verbindingen worden verkregen met behulp van microscopie als directe methode. De confocale fluorescerende microscopie met het juiste kleuringsprotocol maakt de visuele beoordeling van de morfologie van de cellen en sferoïden mogelijk; Belangrijke details over de celdood en veranderingen in de cellen kunnen ook worden gedetecteerd.
Ten tweede vereist lichte toepassing een zorgvuldige keuze van de lichtdosering. Bij PDT is een lichte overdosis uiterst schadelijk voor weefsels22. Fotofarmacologische therapie kan voordelig zijn bij overmatige lichtbestraling. De bovengrens van de geactiveerde stof wordt bepaald door de toegediende dosis van de niet-geactiveerde stof en de farmacokinetiek ervan. Lichtdosering is echter nog steeds een probleem in de fotofarmacologie. Er moet voor worden gezorgd dat het bestralingsvermogen en de blootstellingstijd niet minder zijn dan de vereiste voor de therapie. In principe kan de aanmaak van de geactiveerde stof in vivo worden gemonitord. Om bio-ethische redenen stelden we echter een experiment voor met een modelweefsel (vers gehakt) gemengd met de niet-geactiveerde verbinding15. Dit experiment is eenvoudig en kan worden aangepast om verschillende lichtbronnen te gebruiken. Het kan ook worden aangepast voor de fotofysische schatting van de lichtdosering en de meting van thermische invloeden. Ook hier is het mogelijk om door gebruik te maken van modelweefsels de lichtbelichting te minimaliseren, bijvoorbeeld vergeleken met de nauwkeurigere bepaling van de fotoschakelefficiëntie in de in vivo omstandigheden, een alternatief dat altijd interessant kan zijn om te overwegen.
Ten slotte kunnen de verbindingen die superieure eigenschappen vertonen in de in vitro toxiciteitsschermen en efficiënt fotoswitching van ten minste 1-1,5 cm diep in het modelweefsel worden geselecteerd voor kostbare, bewerkelijke en langdurige in vivo studies. In dit protocol gebruikten we dezelfde cellijn (LLC) als in de in vitro beoordeling om het allograft kankermodel te genereren. De tumorgroeidynamiek, mortaliteit en metastasetelling zijn de parameters die het meest geschikt zijn voor het beoordelen van de werkzaamheid tegen kanker. In vergelijking met conventionele chemotherapie wordt een extra factor toegepast in de fotofarmacologische behandeling - het licht. Daarom zijn twee groepen bestrijdingsdieren nodig: een die alleen het voertuig ontvangt en de andere die het voertuig en de bestraling ontvangt. Deze opstelling maakt de evaluatie van de impact van licht op de gemeten parameters mogelijk. In ons experiment ontvingen de dieren van de twee experimentele groepen de niet-geactiveerde verbinding en werden de tumoren van de muizen in één groep bestraald. Het bestralingsregime was identiek voor de controle- en behandelingsgroepen. Vergelijking met benchmarkchemotherapie is in dit stadium niet nodig omdat het belangrijkste doel van het experiment is om het gecombineerde effect van lichte en samengestelde toepassing aan te tonen. De best presterende verbindingen die dit effect vertonen, kunnen vervolgens worden geselecteerd voor verder onderzoek naar hun in vivo toxiciteit en vergelijking met benchmarks voor het nemen van belangrijke go-no-go-beslissingen over hun ontwikkeling. Technisch gezien kan het in vivo experiment dat we beschrijven gemakkelijk worden aangepast aan farmacokinetische of farmacodynamische studies, bijvoorbeeld van een verbinding die al is geselecteerd als het geneesmiddellood.
Disclosures
IVK, OB, SA en ASU zijn uitvinders van de uitgegeven octrooifamilie: "Peptidomimetics bezitten fotogecontroleerde biologische activiteit" (WO2014127919 [A1], EP2958934 [B1], US9481712 [B2], UA113685 [C2]) in licentie gegeven aan Lumobiotics GmbH. IVK, OB, TS en SA zijn oprichters en aandeelhouders van Lumobiotics GmbH. IVK is een wetenschappelijk adviseur, HK, TM, IP en PB zijn werknemers van Enamine LLC. De auteurs hebben geen andere relevante banden of financiële betrokkenheid bij een organisatie of entiteit met een financieel belang in of financieel conflict met het onderwerp of de materialen die in de publicatie worden besproken, afgezien van de openbaar gemaakte onderwerpen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen EU-financiering door het H2020-MSCA-RISE-programma via PELICO (#690973) en ALISE (#101007256) projecten. Dit werk werd ondersteund door de DFG-GRK 2039 (SA, TS en ASU), het NACIP-programma van de Helmholtz Society (SA en ASU) en de VIP + van de BMBF (OB en ASU). We erkennen Dr. Serhii Koniev, Karlsruhe Institute of Technology, die de verbinding LMB002 heeft gesynthetiseerd, gezuiverd en vriendelijk de verbinding voor de studie heeft verstrekt. De auteurs zijn ook dankbaar voor Chupryna Maksym die de video in Oekraïne heeft gefilmd en samengesteld, en voor alle dappere verdedigers van Oekraïne die het experimentele werk, het schrijven en filmen van deze publicatie mogelijk hebben gemaakt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent 1100 Series capillary LC system | ALSI-Chrom (Agilent distributor) | - | |
| ATCC CRL-1642, LL/2 (LLC1) Lewis lung carcinoma cell line | ECACC | 90020104 | |
| C57BL/6NCrl mice, female, inbred | Charles River | Strain code: 027 | |
| CelCulture, CO2 incubator | Esco Micro | CCL-170B | |
| Corning Matrigel Basement membrane matrix | Merck | CLS354234 | |
| Corning, 384- well spheroid microplates | Merck | CLS3830 | |
| Fetal bovine serum | Merck | F7524 | |
| Gibco, DPBS | Thermo Fisher Scientific | 21600044 | |
| Gramicidin S | Lumobiotics | Custom synthesis | |
| HyClone, DMEM/high glucose | Cytiva | SH30003.04 | |
| IN Cell Analyzer 6500HS, imaging system | Cytiva | 29240358 | |
| Invitrogen, Calcein AM | Thermo Fisher Scientific | C1430 | |
| Isoflurane anesthesia machine | ASA | S/N ASA 1305 | |
| L-glutamine, 200 mM solution | Merck | G7513 | |
| LIKA-surgeon, diode surgery laser | Fotonika plus | - | |
| LMB002 | Lumobiotics | Custom synthesis | |
| Penicillin–Streptomycin, solution stabilized | Merck | P4333 | |
| PhenoPlate, 96-well plates | PerkinElmer | 6055302 | |
| Photometer PCE-LED 20 | PCE Instruments | PCE-LED 20 | |
| Thermo Scientific, Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Thermo Scientific, Propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | J66764-MC | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Merck | T8154 | |
| Trypsin–EDTA, 10 x solution | Merck | T4174 | |
| UltraCruz Cell culture flasks with vented caps, 75 cm2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-200263 | |
| UltraCruz, bottle top filters, PES, 0.22 μm | Santa Cruz Biotechnology | sc-360882 | |
| Vydac 218TP, C18 HPLC column (4.6 mm × 250 mm, 5 µm) | Altmann Analytik (Avantor distributor) | GR5103827 |
References
- Fuchter, M. J. On the promise of photopharmacology using photoswitches: a medicinal chemist's perspective. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (20), 11436-11447 (2020).
- Volarić, J., Szymanski, W., Simeth, N. A., Feringa, B. L.
- Paoletti, P., Ellis-Davies, G. C. R., Mourot, A. Optical control of neuronal ion channels and receptors. Nature Reviews Neuroscience. 20, 514-532 (2019).
- Hüll, K., Morstein, J., Trauner, D.
- Ma, X., et al. In vivo photopharmacology with a caged mu opioid receptor agonist drives rapid changes in behavior. Nature Methods. 20, 682-685 (2023).
- Sarabando, S. N., Palmeira, A., Sousa, M. E., Faustino, M. A. F., Monteiro, C. J. P. Photomodulation Approaches to Overcome Antimicrobial Resistance. Pharmaceuticals. 16 (5), 682 (2023).
- Kolarski, D., Szymanski, W., Feringa, B. L. Chronophotopharmacology: Methodology for high spatiotemporal control over the circadian rhythm with light. Neuromethods. Hirota, T., Hatori, M., Panda, S. 186, Humana, New York, NY. (2022).
- Babii, O., et al. Peptide drugs for photopharmacology: how much of a safety advantage can be gained by photocontrol. Future Drug Discovery. 2 (1), FDD28 (2020).
- Davis, A. M., Keeling, D. J., Steele, J., Tomkinson, N. P., Tinker, A. C.
- Balani, S. K., Miwa, G. T., Gan, L., Wu, J., Lee, F. W. Strategy of utilizing in vitro and in vivo adme tools for lead optimization and drug candidate selection. Current Topics in Medicinal Chemistry. 5 (11), 1033-1038 (2005).
- Kleijn, A., et al. A Systematic comparison identifies an ATP-based viability assay as most suitable read-out for drug screening in glioma stem-like cells. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Rodrigues, J., Heinrich, M. A., Teixeira, L. M., Prakash, J. 3D in vitro model revolution: unveiling tumor-stroma interactions. Trends in Cancer. 7 (3), 249-264 (2021).
- Sittinger, M., et al. Tissue engineering and autologous transplant formation: practical approaches with resorbable biomaterials and new cell culture techniques. Biomaterials. 17 (3), 237-242 (1996).
- Matai, I., Kaur, G., Seyedsalehi, A., McClinton, A., Laurencin, C. T. Progress in 3D bioprinting technology for tissue/organ regenerative engineering. Biomaterials. 226, 119536 (2020).
- Babii, O., et al. Direct photocontrol of peptidomimetics: an alternative to oxygen-dependent photodynamic cancer therapy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (18), 5493-5496 (2016).
- De Ridder, K., et al. Novel 3D lung tumor spheroids for oncoimmunological assays. Advanced NanoBiomed Research. 2 (4), 2100124 (2022).
- Pauli, C., et al. Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Van Straten, D., Mashayekhi, V., De Bruijn, H. S., Oliveira, S., Robinson, D. J. Oncologic photodynamic therapy: basic principles, current clinical status and future directions. Cancers. 9 (2), 19 (2017).
- Li, X., Kwon, N., Guo, T., Liu, Z., Yoon, J. Innovative strategies for hypoxic-tumor photodynamic therapy. Angewandte Chemie International Edition. 57 (36), 11522-11531 (2018).
- Hull, K., Morstein, J., Trauner, D.
- Babii, O., et al. Structure-activity relationships of photoswitchable diarylethene-based β-hairpin peptides as membranolytic antimicrobial and anticancer agents. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (23), 10793-10813 (2018).
- Heckl, C., Aumiller, M., Rühm, A., Sroka, R., Stepp, H. Fluorescence and treatment light monitoring for interstitial photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 96 (2), 388-396 (2020).
