Summary
Detta protokoll presenterar en uppsättning experiment som antagits för utvärdering av fotoswitchbara anticancerpeptider, som kan användas vid preklinisk screening av sådana föreningar. Detta inkluderar cytotoxicitetsbedömning i 2D- och 3D-cellkulturer, utvärdering av fotoisomeriseringseffektivitet ex vivo (modellvävnad) och in vivo-effekt .
Abstract
Fotokontrollerade, biologiskt aktiva substanser är en framväxande klass av "smarta" läkemedelskandidater. De ger ytterligare säkerhet vid systemisk kemoterapi på grund av deras exakta spatiotemporala aktivering genom att rikta ett godartat, icke-joniserbart ljus till en specifik plats i patientens kropp. Denna artikel presenterar en uppsättning metoder för att utvärdera in vitro-potensen och ex vivo-effektiviteten av fotoaktivering av fotokontrollerade, biologiskt aktiva föreningar samt in vivo-effekten i tidiga stadier av läkemedelsutveckling. Metoden tillämpas på cytotoxiska peptider mot cancer, nämligen de diaryleteninnehållande analogerna av ett känt antibiotikum, gramicidin S. Experimenten utförs med användning av 2D (vidhäftande celler) och 3D (sfäroider) cellkulturer av en cancercellinje (Lewis lungkarcinom, LLC), levande vävnadsurrogat (fläskköttfärs) och en allograftcancermodell (subkutan LLC) i immunkompetenta möss. Valet av de mest effektiva föreningarna och uppskattningen av realistiska fototerapeutiska fönster utförs via automatiserad fluorescensmikroskopi. Fotoaktiveringseffektiviteten vid varierande belysningsregimer bestäms på olika djup i en modellvävnad, och den optimala ljusdosen appliceras i det slutliga terapeutiska in vivo-experimentet .
Introduction
Fotokontrollerade biologiskt aktiva föreningar har uppstått under de senaste decennierna som en lovande komponent i säkra kemoterapier för mänskliga sjukdomar och för att specifikt utrota maligna solida tumörer1. Dessa föreningar innehåller reversibelt fotoisomerbara fragment (molekylära fotoswitchar) och kan växla mellan inaktiva och aktiva fotoisomerer vid bestrålning med ljus av olika våglängder.
Jämfört med deras icke-fotokontrollerbara analoger kan fotokontrollerade läkemedel vara säkrare eftersom de systemiskt kan införas i patientens kropp i mindre aktiva och väsentligen icke-toxiska former och aktiveras sedan av ljus endast vid behov, såsom i tumörer, sår och sår. Även om flera spännande demonstrationer av sådana molekylära läkemedelsprototyper kan hittas i de senaste akademiska artiklarna 2,3,4,5,6,7, existerar inte fältet klinisk fotofarmakologi - en tillämpning av godkända kombinationer av läkemedel / medicinsk utrustning / sjukdom. Fotofarmakologi är ännu i läkemedelsupptäcktsstadiet, och systematiska prekliniska studier är okända.
Vi visade nyligen säkerhetsfördelen in vivo för vissa fotokontrollerade cancerpeptider, nämligen analogerna till peptidantibiotikumet gramicidin S8. Dessa fotokontrollerade derivat innehåller en diaryleten (DAE) fotoswitch, som genomgår reversibla fotoinducerade transformationer mellan de så kallade röda ljusgenererade "ringöppna" och UV-genererade "ringstängda" fotoformerna (illustrerad i figur 1 för ett av derivaten, förening LMB002).
Figur 1: Fotokontrollerad cytotoxisk peptid LMB002 och dess fotoisomerisering. Dagbokletenfragmentet visas i rött. Förkortning: DAE = diaryleten. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Att hitta träffar och utföra hit-to-lead-optimering kräver ofta in vitro- och in vivo-screening av lämpliga föreningsbibliotek 9,10. Här demonstrerar vi en metodik som lämpar sig för systematisk high-throughput screening av cytotoxicitet hos fotokontrollerade substanser. Vi bestämmer också fotoisomeriseringseffektiviteten, uppskattar ljusdosen i modellvävnader och utvärderar in vivo-effekten hos de bäst presterande kandidaterna. Tillvägagångssättet är förenligt med bioetik och djurvård.
I detta arbete modifieras traditionella prekliniska metoder för att undvika okontrollerad fotoisomerisering av testade substanser. Det övergripande målet med att tillämpa dessa modifierade metoder här är att utveckla en allmän strategi som är enkel och snabb och ger statistiskt signifikanta data för att på ett tillförlitligt sätt jämföra in vitro-aktiviteter och rationalisera in vivo-effektivitetstestningen av fotoswitchbara föreningar för blyidentifiering och vidareutveckling.
Strategin består av tre på varandra följande steg. Det första steget innefattar bestämning av IC 50 (skenbar50 % cellviabilitet) i serieutspädningar för aktiva och inaktiva fotoformer av utvalda fotokontrollerade biologiskt aktiva föreningar med användning av tvådimensionella (2D, monolager) och tredimensionella (3D, sfäroid) cellkulturer och konfokal automatiserad fluorescensmikroskopi med hög genomströmning. Fototerapeutiska fönster jämförs med avseende på IC50-skillnaden mellan de två fotoformerna, och de bäst presterande kandidaterna väljs. Det finns ingen specifik fördel med toxicitetsbedömning med hjälp av automatiserad mikroskopi och andra plattformar för screening av cytotoxicitet (assays)11. Mer komplexa cellbaserade tumörmodeller12 skulle lätt kunna implementeras i detta skede.
För de föreningar som valts ut i steg 1 är det andra steget att realistiskt uppskatta deras fotoväxlingseffektivitet inuti vävnaderna som en funktion av djupet från den bestrålade vävnadsytan genom att kvantifiera fotoväxlingseffektiviteten hos de mindre aktiva fotoformerna i ett vävnadsurrogat med hjälp av UV-detekterad högpresterande vätskekromatografi (HPLC) av bestrålade provextrakt. In vivo kan fotoväxlingseffektivitet studeras, men vi föreslår att man använder ett enkelt vävnadsurrogat - fläskfärskött. Vi har testat giltigheten av detta tillvägagångssätt. Vi mätte omvandlingen av våra fotoswitchbara föreningar in vivo på en muscancermodell och observerade ungefär samma fotokonvertering på ett djup uppmätt i tidigare experiment med möss8. Alla lämpliga alternativa konstgjorda vävnader13, 3D-bioprintade vävnader/organ14, biopsimaterial eller annat undantaget animaliskt material kan användas. Denna inställning är dock en bra kompromiss eftersom den är ekonomisk, snabb och etisk.
Det tredje steget är bestämningen av in vivo anticancereffekt i en murin cancermodell. De föreningar som uppvisar överlägsna egenskaper i in vitro-experimenten och effektivt fotoväxlar på ett djup av minst 1-1,5 cm i modellvävnaderna väljs ut för detta experiment.
Detta protokoll kan tillämpas på föreningar som har olika typer av fotoswitchar, förutsatt att deras fotoformer (eller deras fotostationära tillstånd, PSS) är stabila under en rimlig tid (några dagar eller längre). Som illustration används en tidigare beskriven DAE-härledd LMB00215. LMB002-fotoformerna är termiskt stabila och kan lagras vid −20 °C i minst ett år utan väsentlig nedbrytning. Lewis lungkarcinom (LLC) -celler väljs för denna in vitro- och in vivo-demonstration, men inga begränsningar införs för celltypen. LLC-celler är vidhäftande, lätt odlingsbara i 3D och används för att generera tumöroider (som beskrivs i referens16). In vivo LLC-celler används för att modellera metastatiska processer och kan lätt generera solida tumörer hos immunkompetenta möss efter subkutan injektion. Denna in vivo-metod kan tillämpas universellt på andra cancermodeller17,18. Det detaljerade genomförandet av denna strategi beskrivs nedan.
Protocol
Djurvård och experimentella förfaranden utfördes enligt lokala och internationella bestämmelser för genomförande av forskningsprojekt som involverar försöksdjur (Ukrainas lag "om skydd av djur mot grymhet", Europeiska konventionen för skydd av ryggradsdjur som används för försök och andra vetenskapliga ändamål (Europeiska konventionen, Strasburg, 1986), direktiv 2010/63 / EU om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål). Denna studie är godkänd av Bioethics Commission of Bienta Company. C57BL/6NCrl-möss (vuxna honor som väger cirka 20 g vardera) användes i dessa experiment. Specifika material, reagenser och utrustning listas i materialtabellen.
1. IC50-utvärdering för LMB002 ("ringstängda" och "ringöppna" former) med användning av 2D- och 3D LLC-cellkulturer
- Beredning av buffertar och stamlösningar av föreningarna
Förbered buffertar med standardprocedurer. Alternativt kan du använda kommersiellt tillgängliga lösningar.- Bered 10x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) genom att tillsätta 14,2 g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4, 80g NaCloch 2 g KCl till 1 liter destillerat vatten. Autoklav beredd 10x PBS och späd den till 1x lösning genom att tillsätta 100 ml 10x lösning till 900 ml destillerat vatten. Förvara sedan lösningen vid 4 °C.
- Förbered Dulbeccos PBS (DPBS) genom att tillsätta 4,78 g DPBS-pulver till 1 liter destillerat vatten. Rör om lösningen tills allt fast ämne löser sig, kontrollera pH med en pH-mätare och justera den genom att tillsätta 1 M NaOH eller 1 M HCl (pH 7,3-7,4). Efter att ha nått den önskvärda pH-nivån, filtrera mediet genom ett 0,22 μm vakuumfilter i ett sterilt skåp. Förvaras vid 4 °C.
- Bered 1 M 4-(2-hydroxietyl)-1-piperazinetansulfonsyra (HEPES) buffertlösning genom att tillsätta 238,3 g HEPES till 1 liter destillerat vatten. Justera lösningens pH med 1 M NaOH tills pH 7,5. Filtrera genom ett 0,22 μm vakuumfilter i ett sterilskåp. Förvaras vid 4 °C.
- Förbered 1x trypsin-EDTA (EDTA = etylendiamintetraättiksyra) lösning genom att späda 10x lösning. För att göra det, tillsätt 5 ml 10x trypsin-EDTA till 45 ml 1x PBS-lösning i ett 50 ml sterilt rör. Förvaras vid 4 °C.
- Förbered Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) basiska genom att tillsätta 13,4 g DMEM högglukospulver och 3,7 gNa2CO3till 1 liter destillerat vatten i en mätcylinder med en magnetisk omrörningsstav placerad på en omrörningsplatta. Rör om lösningen tills allt fast ämne löser sig, kontrollera pH med en pH-mätare och justera den genom att tillsätta 1 M NaOH eller 1 M HCl (pH 7,3-7,4). När önskat pH-värde har uppnåtts, filtrera mediet genom ett 0,22 μm vakuumfilter i ett sterilt skåp och förvara vid 4 °C.
- Bered DMEM komplett medium genom att tillsätta 100 ml fetalt bovint serum (FBS), 10 ml penicillin-streptomycinlösning, 10 ml L-glutaminlösning och 10 ml 1 M HEPES-buffert till 900 ml DMEM basisk. Förvaras vid 4 °C.
- Förbered stamlösningar för testföreningarna.
- För varje förening vägs två satser om 5,12 mg (t.ex. LMB002) i den ringslutna fotoformen i två 1,5 ml mikrocentrifugrör (ett med klara och andra svarta icke-transparenta väggar). Väg upp 2,28 mg positiv kontroll (t.ex. gramicidin S) i ett extra klart väggrör. Tillsätt 100 μL ren DMSO till varje prov och virvel i 30 sekunder.
- Fotoisomerisera stamlösningen (LMB002) i klarväggsröret från "ringstängd" till "ringöppen" form genom att bestråla lösningen med 660 nm laser (ljuseffekttäthet 0,6 W/cm2) med virveling för att säkerställa noggrann blandning. Fortsätt tills färgen synligt ändras från mörklila till ljusbrun. Skydda mot ljus med aluminiumfolie.
- 2D-cellodling experiment-sådd cellerna (dag 1)
- Överför 10 ml av DMEM komplett medium från T-75-kolven med en LLC-cellkultur till ett 15 ml sterilt rör. Aspirera det kvarvarande mediet med en vakuumpump.
- Tvätta cellkulturen med 5 ml 1x DPBS och aspirera lösningen med en vakuumpump.
- Täck cellerna med 3 ml 1x trypsin-EDTA-lösning och inkubera kolven i 2-3 minuter vid 37 °C i en atmosfär med 5 %CO2 .
- Stoppa trypsinverkan genom att tillsätta 6 ml av DMEM-mediet (tidigare överfört till ett sterilt rör) till cellodlingskolven innehållande 1x trypsin-EDTA-lösning och pipettera suspensionen flera gånger för att tvätta cellerna från cellodlingskolvväggarna.
- Överför suspensionen till ett 15 ml rör och centrifugera vid 200 × g i 4 minuter. Efter centrifugering, aspirera supernatanten med en vakuumpump. Undvik att röra cellpelleten längst ner på röret.
- Resuspendera cellerna genom att tillsätta 2 ml färskt DMEM komplett medium och pipettera flera gånger.
- Räkna cellerna genom provtagning av ca 15 μL av suspensionen i ett 0,5 ml rör, tillsätt 15 μL 0,4% trypanblått och överför den erhållna blandningen till en cellräkningskammare.
- Efter räkning, förbered 25 ml av cellsuspensionen per tidpunkt. Frö 5,000-10,000 (8,000 i genomsnitt) LLC-celler / brunn i 200 μL DMEM i de centrala 60-brunnarna i en 96-brunnsplatta med klar botten och svarta icke-transparenta väggar. Fyll de återstående 36 brunnarna med ren DMEM.
- Placera plattorna i en cellodlingsinkubator över natten vid 37 °C och 5% CO2. Använd plastplattlock under för att förhindra ojämn uppvärmning av bottenplattan.
- 2D-cellodlingsexperiment - tillsats av föreningarna (dag 2)
- Övervaka cellerna med ljusmikroskopi i plattorna tills cellerna har nått 70% -80% sammanflöde.
- Aspirera mediet från brunnarna med en vakuumpump i ett sterilt skåp. Tillsätt 100 μL av det färska förvärmda DMEM-mediet och placera plattorna i en cellodlingsinkubator.
- Bered serieutspädningar av testföreningarna och positiv kontroll i autoklaverade klarplattor av polypropen. Gör följande lösningar för enskilda tidpunktsmätningar:
Börja med lagren i DMSO och späd med DMEM, men överskrid inte 1 % v/v av DMSO i den slutliga högsta koncentrationen.- För att erhålla en 128 μM lösning av gramicidin S, tillsätt 1,3 μL 20 mM stamlösning till 198,7 μL DMEM.
- För att erhålla en 256 μM lösning av LMB002, "ringöppen" form, tillsätt 1,3 μL 40 mM lösning till 198,7 μL DMEM.
- För att erhålla en 512 μM lösning av LMB002, "ringsluten" form, tillsätt 2,6 μL 40 mM stamlösning till 197,4 μL DMEM.
- Utför ytterligare tre upprepningar för att erhålla fyra uppsättningar av varje koncentrationspunkt. Bered en serie utspädning i två steg genom att aspirera 100 μl från varje startbrunn, överföra till en brunn med 100 μl DMEM och blanda noggrant.
OBS: Att arbeta med fotoomkopplingsbara föreningar kräver ljusjustering för att förhindra fotoisomerisering av baksidan. Att stänga av ljuset i sterila skåp rekommenderas. - Erhåll de slutliga koncentrationerna av föreningarna i brunnar (5-150 μM) genom att överföra 100 μL av de beredda lösningarna varje gång i 56 brunnar med 100 μL tidigare tillsatt DMEM. Tillsätt 100 μL DMEM varje gång i fyra brunnar för att fungera som en negativ kontroll.
- Täckplattor med aluminiumfolie eller plastskyddande ogenomskinligt lock för att förhindra okontrollerad fotoväxling. Placera plattorna i en cellodlingsinkubator vid 37 °C (med hjälp av extra plastplattlock) under den valda inkubationstiden (10 min, 60 min, 24 timmar eller 72 timmar).
- 2D-cellodlingsexperiment - färgning och avbildning (dag 2-5)
- Efter inkubation med föreningar under olika perioder, tillsätt 50 μL av färgningslösningen per brunn till plattorna som inkuberades med föreningar i 10 och 60 minuter. Inkubera plattorna vid 37 °C i 20 minuter.
Anmärkning: Förbered stamfärgningslösningar per tidpunkt genom att tillsätta 8 μL 20 mM Hoechst 33342-lösning (slutlig koncentration är 5 μM), 32,5 μL 1 mM propidiumjodid (PI) lösning (slutlig koncentration är 1 μM) och 650 μL icke-steril FBS till 5,810 μL icke-steril 1x PBS. Förvärm FBS och PBS i ett vattenbad vid 37 ° C för att förhindra att cellerna upplever temperaturchock. - Utför automatiserad fluorescensavbildning med en 20x objektivlins.
- Upprepa samma färgnings- och bildtagningsförfarande (steg 1.4.1-1.4.2) för plattorna som inkuberades med föreningar i 24 (dag 3) och 72 (dag 5) timmar.
OBS: Typiska 2D-plattkartor visas i figur 2.
- Efter inkubation med föreningar under olika perioder, tillsätt 50 μL av färgningslösningen per brunn till plattorna som inkuberades med föreningar i 10 och 60 minuter. Inkubera plattorna vid 37 °C i 20 minuter.
- 3D-cellodlingsexperiment - sådd av cellerna (dag 1)
OBS: Stegen i detta avsnitt är identiska med dem som beskrivs för 2D-experimentberedning av cellkulturen, inkubation med de testade föreningarna och avbildning (steg 1.1-1.4.) I detta fall framställs cellerna emellertid som kompakta mogna sfäroider i en 384-brunns U-bottenplatta med ultralåg vidhäftning med svarta, icke-transparenta väggar. Genom att använda en platta av denna storlek kan två föreningar jämföras i ett experiment.- Upprepa steg 1.2.1-1.2.9 från 2D-experimentprotokollet med en LLC-cellodling.
- Efter att ha räknat cellerna, förbered 25 ml av cellsuspensionen. Frö 1 000 celler per brunn i alla brunnar i 50 μL DMEM i en 384-brunns, lågbindande, U-bottenplatta.
- Centrifugera vid 40 × g i 30 s och skaka med en plattskakare vid 250 rpm i 1 min för att skaka cellerna från brunnarnas väggar till botten.
- Placera plattorna i en inkubator vid 37 °C och 5 %CO2 ovanpå extra plastlock för att förhindra ojämn uppvärmning av plattans botten i 48 timmar.
- 3D-cellodlingsexperiment - tillsats av föreningarna (dag 3)
- Övervaka cellerna i plattor med mikroskopi för att säkerställa att kompakta mogna sfäroider har bildats.
- Bered en serieutspädning av studerade föreningar i autoklaverade klara plattor av polypropen. I detta fall inkludera en ytterligare förening. Gör följande lösningar för enskilda tidpunktsmätningar:
- För att erhålla 175 μM och 350 μM lösningar av gramicidin S, tillsätt 1,8 μL 20 mM stamlösning till 198,2 μL DMEM och tillsätt 3,6 μL stamlösning till 196,4 μL DMEM på motsvarande sätt.
- För att erhålla 175 μM och 350 μM lösningar av LMB002, "ringöppen" form, tillsätt 1 μL 40 mM stamlösning till 199 μL DMEM och tillsätt 1,8 μL lager till 198,2 μL DMEM på motsvarande sätt.
- För att erhålla 350 μΜ och 1 750 μM lösningar av LMB002, "ringsluten" form, tillsätt 1,8 μL 40 mM stamlösning till 198,2 μL DMEM och tillsätt 8,8 μL lager till 191,2 μL DMEM på motsvarande sätt.
- Utför ytterligare tre replikat för att erhålla fyra uppsättningar av varje koncentrationspunkt. Skaffa seriella utspädningar genom att dra ut 20 μL från varje startbrunn, överföra den till brunnen med 180 μL DHUR och blanda noggrant.
OBS: Att arbeta med fotoomkopplingsbara föreningar kräver ljusjustering för att förhindra fotoisomerisering av baksidan. Att släcka lamporna i sterila skåp rekommenderas. - Erhåll de slutliga koncentrationerna av föreningar i brunnar genom att överföra 20 μL av de beredda lösningarna varje gång i 128 brunnar innehållande 50 μL DMEM. Tillsätt 20 μL DMEM varje gång i tre brunnar för att fungera som kontroll. Täck plattorna med aluminiumfolie eller plastskyddande täckning för att förhindra fotoväxling eller avdunstning.
- Placera plattorna i en cellodlingsinkubator på plastplåtlock för den valda inkubationstiden.
- 3D-cellodlingsexperiment - färgning och avbildning (dag 3-6)
- Bered färgningslösningen per tidpunkt genom att tillsätta 13 μl 1 mM calcein AM-lösning (slutkoncentrationen är 1 μM), 22 μL 20 mM Hoechst 33342-lösning (slutkoncentrationen är 33 μM), 40 μL 1 mM PI-lösning (slutkoncentrationen är 3 μM), 300 μL icke-steril FBS till 2,625 μL icke-steril 1x PBS. Förvärm FBS och PBS i ett vattenbad vid 37 ° C för att förhindra att cellerna upplever temperaturchock.
- Efter inkubation under olika perioder med föreningarna, tillsätt 20 μL av färgningslösningen per brunn till brunnarna som inkuberades med föreningar i 10 minuter. Inkubera vid 37 °C i 2 timmar.
- Utför fluorescenskonfokal avbildning med en 20x objektivlins.
- Upprepa samma färgnings- och avbildningsprocedur för brunnar som inkuberades med föreningar i 24 (dag 4) och 72 (dag 6) timmar.
OBS: I detta experiment används calcein AM som en tredje komponent i den flerfärgade färgningslösningen. Bilder som erhållits från 2D- och 3D-experiment analyseras med hjälp av instrumentets automatiserade bildanalysprogramvara. Celler samfärgade med Hoechst och propidiumjodidfärgämnen anses nekrotiskt döda, och deras fraktion som en funktion av koncentrationen används för att beräkna IC50-värdet .
Figur 2: Exempel på typiska plattkartor för 2D-odlingsexperimenten. Färgkoder för föreningarna och kontrollen anges. Koncentrationer av testade föreningar (antal inuti brunnarna) anges i μM. Klicka här för att se en större version av denna figur.
2. Bestämning av fotoswitchningseffektiviteten i ett vävnadsurrogat
- Montera det optiska tåget för provbestrålning enligt figur 3 (bestående av en optisk kabel från laserljuskällan, en lins med variabel brännvidd, en spruta med ett ogenomskinligt lock och en planskuren ände).
- Genom att ändra brännvidden och bländaren på linsen, få en platt ljusstråle med en diameter som är 1-1,5 mm större än den inre diametern på den använda sprutan men är fortfarande, så mycket som möjligt, inom öppningen.
- Använd en 5 ml spruta med en skuren ände och en innerdiameter på 12,4 mm och är täckt med ett icke-transparent plastlock. Vid en lasereffekt på 200 mW ställs effekttätheten vid utgången från det optiska systemet in på ~ 103 mW / cm2 mätt med en fotometer.
OBS: Alla efterföljande operationer måste utföras i ett mörkt rum med minsta möjliga arbetsplatsbelysning. - Bered 3 ml LMB002 ("ringsluten" form) stamlösning i PBS med en koncentration på 1 mg/ml.
- Bered ett modellvävnadsprov laddat med den inaktiva fotoformen av LMB002 i en plastbehållare. I en typisk omgång blandas 5 g färskt fläskfärs mekaniskt med 277 μL stamlösning LMB002 och 260 μL PBS för att uppnå den slutliga koncentrationen på 50 mg/kg i provet och förhållandet vävnad/PBS på ~9/1 (v/v).
- Fyll sprutan med det förberedda provet, se till att inga luftbubblor är inuti och bilda en plan yta vid exponeringsänden (skuren).
OBS: Provets cylinder i sprutan måste uppta ~ 40 mm längs axeln. - Bestråla provet i det optiska tåget enligt figur 3 under 9 min 44 s, vilket motsvarar ~60 J/cm2 exponering.
- Förbered 4 mm tjocka skivor av provet efter exponeringen genom att trycka bort det från sprutan med kolven och skära det med en skalpell. Väg och placera skivorna i separata provrör och markera dem med medelavståndet (mm) från den bestrålade ytan.
- Förbered två kontrollprover (optimal mängd, 0,5-0,7 g) i provrör: i den ena köttfärs blandad med 10% (volym) PBS (54 μL) och i den andra, modellvävnadsprovet erhållet i steg 2.4 bestrålat med 500 mW laserljus i 10 minuter för att säkerställa att alla LMB002 "ringslutna" molekyler omvandlas till "ringöppen" form.
- Tillsätt acetonitril-vattenblandningen (70 %/30 % v/v, kompletterad med 0,01 % trifluorättiksyra (TFA), 1,4 ml/g) till varje skiva och kontrollproverna. Blanda innehållet noggrant med en glasstav.
- Inkubera vid rumstemperatur i minst 10 minuter och centrifugera blandningarna vid 5220 x g i 20 minuter eller centrifugera vid 20 x g i 30 minuter två gånger för att avlägsna det olösliga materialet och samla upp supernatanten.
- Samla försiktigt upp supernatanterna (~ 0,7 ml) och centrifugera dem igen vid 16 000 x g i 30 minuter.
- Samla supernatanterna (~ 0,5 ml vardera) och analysera dem med omvänd fas högpresterande vätskekromatografi (RP HPLC) med en analytisk C18-kolonn, linjär A: B-gradient på 3,46% B / min, 2,0 ml / min flödeshastighet och 100 μL injicerad volym. Registrera de UV-detekterade kromatogrammen vid 570 nm (påvisande av "ringsluten" form) och 270 nm (påvisande av "uppringningsform"). Använd proverna för icke-bestrålad (steg 2.4) och bestrålad kontroll (steg 2.8) för att bestämma de specifika retentionstiderna för båda fotoformerna (elueringsmedel A: vattenhaltig 0,1 % TFA; elueringsmedel B: 90 % acetonitrilvatten, 0,1 % TFA) och kalibrera metoden.
- Bestäm de faktiska mängderna av LMB002-fotoformer i de analyserade proverna med hjälp av kalibreringskurvorna erhållna genom att ta och analysera kromatogrammen av LMB002-lösningar med kända koncentrationer. Bered LMB002 "ringslutna" lösningar för kalibrering genom att späda stamlösningen (steg 2.3) med acetonitril-vattenblandningen (70 %/30 % v/v kompletterat med 0,01 % TFA) så att 0,36, 0,9 och 3,6 μg per 100 μl (injicerad volym) erhålls. Elueringsgradienten och flödeshastigheten är desamma som i steg 2.12.
- Upprepa experimentet (steg 2.4-2.12) tre gånger och plotta den normaliserade procentandelen av varje fotoform på diagrammet (procent) kontra avståndet (från den bestrålade vävnadsytan). Beräkna statistiken (dvs. standardavvikelse vid varje koncentrationspunkt).
Figur 3: Experimentell uppställning för bestämning av effektiviteten av fotokonvertering i modellvävnad . a) Schematisk och b) fotografi. 1, optisk kabel från laserljuskällan; 2, objektiv med variabel brännvidd; och 3, köttfärs-LMB002-fosfatbuffrad saltlösning placerad i 4, en spruta med ett ogenomskinligt lock och skuren framdel (visas i (B) utan locket). Klicka här för att se en större version av denna figur.
3. Bestämning av effekt mot cancer in vivo
Experimentschemat och slutpunkterna visas i figur 4. Djurvårdsstandarder under efterbehandlingsperioden bör överensstämma med 3R-reglerna - inhysning bör inkludera korrekt burtäthet och resurstillgänglighet. När det är möjligt, följ icke-aversiva djurhanteringsmetoder som tunnel eller koppning.
Figur 4: Schema för det terapeutiska experimentet in vivo . Experimentgruppernas beteckning, behandlingsdetaljer, slutpunkter och postmortemanalysscheman . Förkortningar: LLC = Lewis lungcancer; IV = intravenös; SC = subkutan. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- Förberedelse av cancercellerna för subkutan inokulering (dag 0).
- Passera LLC-cellerna i DMEM (4,5 g / L glukos) med 10% FBS, 100 U / ml penicillin och 100 μg / ml streptomycin vid 37 ° C och 5% CO2.
- Skörda cellerna med 0,05% trypsin-EDTA-lösning, centrifugera och suspendera i serumfri DMEM.
- Räkna cellerna och bestäm deras livskraft med hjälp av en hemocytometer och trypanblått uteslutningstest.
- Bered slutlig cellsuspension med koncentration 10 × 106 celler/ml i DMEM och Matrigel mix (1:1). Förvara suspensionen på is före injektion.
- LLC cellinokulering (dag 0)
- Placera den vuxna kvinnliga C57BL/6NCrl-musen (som väger ~20 g) i induktionskammaren i isoflurananestesimaskinen. Utför sedering med 5% isofluran och vänta tills djuret är helt medvetslöst.
- Ta bort pälsen från cellinokuleringsområdet genom rakning.
- Inokulera 5 × 105 LLC-celler i ~ 100 μL DMEM: Matrigel (1: 1) blandning i höger bakben.
OBS: När det är möjligt, följ praxis för användning av en nål.
- Föreningsadministrering och fotoirstrålning
OBS: Inom 5-8 dagar efter inokulering är djuren redo för behandling när deras tumörer är palpabla och har nått ~ 50-100 mm3 volym. Utför alla efterföljande operationer med LMB002 och möss behandlade av denna förening under halvmörka förhållanden (en 4 W LED-lampa minst 5 m från arbetsplatsen).- Lös LMB002 ("ringsluten" form) i steril fysiologisk saltlösning i en koncentration av 1 mg/ml för dosen 5 mg/kg (i.v.) för att erhålla mörkblå homogena lösningar.
- Före bestrålningen, montera slumpmässigt fyra grupper om åtta djur och ta bort pälsen från tumören och närliggande områden genom rakning.
- Placera en mus i hållaren för intravenösa injektioner och förvärm djurets svans i ett vattenbad vid 37 °C för att göra svansvenen synlig.
OBS: Överväg preoperativ analgesi. - Injicera föreningen vid 5 ml/kg i svansvenen. För de två kontrollgrupperna, injicera 100 μl saltlösning (intravenöst) per djur (20 g kroppsvikt). Se till att djuren i de två experimentgrupperna får den testade föreningen i den inaktiva fotoformen (1 mg / ml i saltlösning).
OBS: När det är möjligt, följ praxis för användning av en nål. - Sedan, 2 h 45 min efter injektionen av föreningen, placera musen under anestesi. Inducera sedering med 3%-4% isofluran i syre. Behåll anestesi i 15 min med 0,5%-1% isofluran i syre.
- Täck musen med en svart mask som har ett hål som endast utsätter tumörområdet för ljuset.
- Slå på laserdiodmodulen med en 650 nm laser och ställ in effekten på den röda lasern till 200 mW och den blå / UV-guidelasern till 2 mW.
Använd blå skyddsglasögon när laserenheten är på. - Mät ljusflödet från den röda lasern (bort från mössen) med en fotometer och bestäm avståndet från den optiska kabeln där ljusflödet är 100 mW / cm2. Fäst kabeln på ett stativ för att säkerställa att ljuskällan är på det bestämda avståndet från tumören och ljuset täcker hela tumörområdet. Använd blått / UV-styrlaserljus under denna procedur.
- Slå på den röda lasern för att bestråla tumörområdet i 20 minuter.
- Efter bestrålningen, stäng av isofluranflödet, återför djuret till buren och observera noggrant dess tillstånd under de närmaste 30 minuterna.
OBS: Efter sammansatt administrering, håll mössen i mörkret i 2 dagar. Endast ljusdagscykeln måste ändras. Alla andra bostadsförhållanden bör förbli oförändrade.
- Observationer efter behandling
- Observera djuren dagligen och mäta vikten och dimensionerna av deras tumörer. Mät tumörvolymen och notera utvecklingen av nekrosen.
OBS: Djurvårdsstandarder under efterbehandlingsperioden bör överensstämma med 3R-reglerna - stall bör inkludera korrekt burdensitet och resurstillgänglighet. - Använd data som samlats in i föregående steg för att utvärdera dödligheten. Bestäm överlevnadsgraden med hjälp av standardproceduren.
OBS: Djur ska offras och räknas som döda när allvarliga kliniska tecken avslöjas (viktminskning på mer än 15%, tumörsår läker inte på 7 dagar och läten) eller så snart tumörvolymen når 2 500 mm3.
- Observera djuren dagligen och mäta vikten och dimensionerna av deras tumörer. Mät tumörvolymen och notera utvecklingen av nekrosen.
Representative Results
I detta arbete utfördes 2D- och 3D-cellexperiment för att bestämma IC50 för "ringstängda" och "ringöppna" former av LMB002 (se figur 1) vid olika inkubationstider. Dessa värden jämfördes med de som erhölls för prototyppeptiden, gramicidin S (används som positiv kontroll). En typisk uppsättning bilder av inkubationen i 2D-odlad LLC-kultur efter färgning visas i figur 5. Samfärgning med Hoechst 33342 (blå) och propidiumjodid (röd) som resulterar i olika nyanser av lila i en större andel celler vid behandling med "ringöppen" form jämfört med "ringstängd" indikerar en märkbar skillnad i cytotoxicitet mellan två former som lätt kan kvantifieras. Det demonstrerade exemplet på ett framgångsrikt experiment är baserat på data som samlats in med hjälp av 96-brunnsplattformatet, där peptidvarianterna vid varierande koncentrationer tillsattes, som visas i figur 2. Liknande data kan förvärvas med 384-brunns- och högdensitetsplattor. Eftersom volymerna per brunn reduceras kommer emellertid tekniska och systematiska fel och som ett resultat noggrannheten i IC50-bestämningen att minska med ökad brunnsdensitet.
Figur 5: Representativa bilder från cytotoxicitetsanalysen i monolagerodlad LLC. Cellerna färgades med Hoechst 33342 (blå) och propidiumjodid (röd). Tiderna som visas: 10 min, 60 min, 24 h och 72 h är inkubationstider med föreningar. Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Fotokonverteringen av LMB002 genom laserljusbestrålning i en modellvävnad - färsk fläskfärs - bestämdes med hjälp av ett prov bestående av malet kött blandat med LMB002 "ringsluten" (inaktiv) form upplöst i PBS och mätning av omvandlingen av denna inaktiva form till LMB002 "ringöppen" (aktiverad) form i riktning mot strålningsutbredning. Provet placerades i en spruta och bestrålades från ena sidan med en platt stråle av laserstrålning under exponeringstiden ~ 10 minuter (används vanligtvis i in vivo-experiment ), som visas i figur 3. Efter exponeringen delades provcylindern i delar genom att trycka på sprutkolven och skära skivorna av samma höjd med en skalpell. Koncentrationen av LMB002 "ringöppen" i extrakten från skivorna bestämdes med RP HPLC.
Figur 6 illustrerar dos-effektkurvorna Figur 6A-D erhållen från dataanalys. För att identifiera andelen döda celler med nukleär samfärgning av Hoechst 33342 och PI-färgämnen använde vi ett inbyggt klassificeringsverktyg som ställer in numeriska tröskelvärden vid utvalda uppmätta parametrar för att dela upp alla cellräkningar i flera kategorier. Till exempel, när den röda kanalsignalen (propidiumjodid) i kontrollen var vid tröskeln (cirka 110-130 enheter), kunde cellerna klassificeras som PI-positiva, betraktas som döda eller PI-negativa, betraktas som opåverkade av föreningarna. För LMB002 kan sigmoidala beroenden av procentandelen propidiumjodidpositiva celler på föreningskoncentrationen ses. Från dessa data kan IC50-värdena bestämmas.
Figur 6: Analys av cytotoxicitet i 2D-odling. Sigmoid passar som erhölls i LLC-kulturen för (A) 10 min, (B) 60 min, (C) 24 h och (D) 72 h-tidsintervall tagna för inkubation med föreningar. Montering möjliggör noggrann bestämning av IC50-värden (visas inte). Felstaplar är SEM. Förkortningar: LLC = Lewis lungkarcinom; PI = propidiumjodid. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Med tanke på de erhållna IC50-värdena kan vi dra slutsatsen att toxiciteten hos alla tre föreningarna ökade med inkubationstiden. Vårt experiment avslöjade att "ringöppen" form av LMB002 är ungefär ett utspädningssteg mindre giftigt än prototyppeptiden, gramicidin S. Medan den "ringslutna" formen visar tre till fyra utspädningssteg lägre toxicitet, vilket ökar med inkubationstiden. Skillnaden mellan de två utspädningsstegen påverkas inte av ökningen av inkubationstiden och kan användas numeriskt som ett experimentellt bestämt fototerapeutiskt fönster6 för jämförelse med andra föreningar i en potentiell biblioteksscreening. IC50-värdet för gramicidin S sattes som referenspunkt för att korrigera experimentella fel eller differentiella utgångar i biologiska replikat.
3D-cellexperimenten producerade samma typ av rådata - de enda cellupplösta sfäroidbilderna per brunn. Införandet av kalcein som ett tredje färgämne möjliggör kvantifiering av fraktionen av metaboliskt aktiva celler (observerad i den gröna kanalen). Genom att använda plattor med 384 brunnar, öka antalet tekniska replikat, exklusive redundanta saminkubationstidpunkter, och ändra utspädningsvecket, kunde vi direkt jämföra flera föreningar i en enda testkörning (med en enda platta) som illustreras i plattkartan i figur 7.
Figur 7: Plattkarta för 3D-odlingsexperimentet med två föreningar. Färgkoder för föreningarna och kontrollen anges. Antal i brunnar är koncentrationer i μM. 10 min, 24 h och 72 h är inkubationstider. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8 visar bilderna av utvalda tekniska replikat av LLC-sfäroider odlade med en densitet av 1 sfäroid/brunn i närvaro av testade föreningar och kontrollsfäroider som fångats efter färgning.
Figur 8: Representativa bilder från 3D-odlingscytotoxicitetsanalys. Bilder visar 48-h-gamla LLC-sfäroider färgade med Hoechst 33342 (blå), calcein AM (grön) och propidiumjodid (röd) efter 10 min, 24 timmar och 72 h saminkubation med både LMB002-fotoformer och gramicidin S. Skalstänger = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Med hjälp av instrumentprogramvaran erhölls dos-effektkurvorna, liksom de i 2D-experimentet, från z-staplade bildhögar (figur 9A). Dessutom kan kompakta och icke-deformerade sfäroider i 3D-kulturerna karakteriseras av hela sfäroiddiametern (figur 9B). Det noterades också att den totala sfäroiddiametern varierar med föreningskoncentrationen.
Figur 9: Cytotoxicitetsutvärdering med 3D-kulturer. (A) Koncentrationsberoende cytotoxicitetskurvor och (B) koncentrationsberoende sfäroids diameterdiagram erhållna i 3D-kulturerna av LLC som saminkuberas med gramicidin S i 10 min, 24 timmar och 72 timmar och fångas upp före färgning. Felstaplar är SEM. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Experimentet för steg 2 möjliggör bestämning av LMB002-koncentrationer i båda fotoformerna med hjälp av UV-detekterad högpresterande vätskekromatografi. Effektiviteten av fotokonvertering i modellvävnader kunde enkelt bedömas och kvantifieras med hjälp av denna inställning (figur 3). Data erhölls från kvantitativ analys av kromatogrammen av provextrakten. I dessa testexperiment detekterades LMB002-kromatogram spektroskopiskt vid 270 nm och 570 nm. Vid 270 nm observerades många ytterligare signaler och tillskrevs föreningarna som extraherades från modellvävnaden (verifierad från kontrollextraktet utan föreningen). Båda fotoformerna var tillräckligt olika i retentionstider och absorbans. LMB002-signalen "ring-open" separerades dock från dessa bakgrundssignaler (se ett representativt kromatogram i figur 10A). Därför kan denna signal integreras utan problem. Vid 570 nm innehöll kromatogrammen endast LMB002 "ringsluten" formsignal (figur 10B). Här utförde vi koncentrationsbestämning med RP HPLC. Ännu högre noggrannhet och lägre detektionsgränser skulle dock kunna uppnås med LC/MS som analysmetod.
Figur 10: Representativa kromatogram av LMB002 extraherade från modellvävnader. a) Prov på 2 mm från den bestrålade ytan, registrerat vid 270 nm (LMB002 "ringöppen" form är integrerad). b) Prov 38 mm från den bestrålade ytan, registrerat vid 570 nm (toppen av LMB002 "ringsluten" är integrerad). Retentionstidsvärden (indikerade) bekräftade dessutom föreningens identitet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
De data som erhölls efter integrering av motsvarande signaler från alla insamlade prover användes för att bygga koncentrationsdjupdiagrammen, som visas i figur 11. På grundval av dessa grafer var effektiviteten av fotokonvertering på olika djup av modellvävnaden lätt bedömd. Det bekräftar att vår röda ljuskälla inducerar den "ringstängda" LMB002-fotokonverteringen på ett djup av upp till 1 c, i vävnadssurrogatet, köttfärs (vid cirka 103 mW / cm2).
Figur 11: Utvärdering av fotokonverteringseffektivitet. Koncentration (A, mg/kg) av LMB002 "ringstängda" (icke-aktiverade, blå prickar) och "uppringande" former (aktiverade, orange prickar) på olika avstånd från modellvävnadens bestrålade yta (L, mm). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Resultaten av in vivo-experimentet - steg 3 i vår metod utförd enligt schemat som presenteras i figur 4 - representerades av grafer som visar tumörtillväxt som en funktion av tiden (figur 12) och Kaplan-Meier överlevnadskurvor (figur 13).
Figur 12: Tumörtillväxtdynamik hos djur. Djur behandlade med LMB002 jämfört med vehikelbehandlade djur (subkutan LLC-allograftmodell i C57BL/6NCrl-möss, sammansatt dos 7 mg/kg, IV, 2 h 40 min inkubation, därefter bestrålning vid 650 nm, 100 mW/cm2, 20 min). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 13: Dödlighetskurvor för djur. Djur behandlade med LMB002 jämfört med vehikelbehandlade djur (subkutan LLC-allograftmodell i C57BL/6NCrl-möss, sammansatt dos 7 mg/kg, IV, 2 h 40 min inkubation, därefter bestrålning vid 650 nm, 100 mW/cm2, 20 min). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Fotokontrollerade föreningar saknar motstycke i läkemedelsutveckling; Inga metoder har dock fastställts för deras prekliniska och kliniska utvärdering. Den närmaste monoterapianalogen, fotodynamisk terapi (PDT), är den behandlingsmodalitet för klinisk användning som antagits av många länder mot cancer och är under utveckling för andra indikationer19,20. I likhet med fotofarmakologi är PDT också baserat på användningen av ljus för att aktivera den bioaktiva substansen (singlettsyre). Därför kan vissa experimentella metoder som används för prekliniska och kliniska studier i PDT antas för fotofarmakologi. Till exempel är ljuskällor, ljusleveransmetoder och medicintekniska produkter välutvecklade och godkända för PDT; De kan användas direkt för utvärdering av fotokontrollerade läkemedel. PDT och fotofarmakologi har emellertid många skillnader från varandra4, vilket motiverar behovet av att fastställa specifika metoder för den senare.
För det första är den icke-aktiverade substansen i PDT (syre) alltid närvarande i levande vävnader vid icke-toxiska koncentrationer. Däremot kan icke-aktiverade fotokontrollerade biologiskt aktiva föreningar ha kvarvarande aktivitet och oönskad toxicitet. Därför bör ideala fotofarmakologiska läkemedel ha minimerat biologisk aktivitet i sin administrerade form och måste vara mycket aktiva i sin ljusgenererade form, det "fototerapeutiska fönstret"21 måste vara så stort som möjligt. Att hitta träffen och utföra hit-to-lead-optimering kräver identifiering av lämpliga föreningar och screening av relativt stora bibliotek, redan i tidiga stadier av läkemedelsutveckling. Här föreslog vi en automatiserad konfokal fluorescerande mikroskopi med hög genomströmning för att identifiera effektiva fotoväxlingsföreningar.
Den valda metoden för utvärdering av cytotoxicitet möjliggör enkel implementering av det mest kritiska kravet - underhåll av PSS eller stabilitet hos den synliga ljuskänsliga fotoisomeren. Detta beror på att ljusexponeringen minimeras vid genomförandet. Därför, om du väljer alternativa metoder, bör automatiserade metoder föredras. Detta tillvägagångssätt är tillförlitligt och informativt. Användningen av 3D-cellkulturer (sfäroider) i detta skede ger en holistisk förståelse för cellens svar på behandlingen i en mer realistisk vävnadsliknande mikromiljö. Dessutom kan värdefulla insikter i föreningarnas verkningsmekanism erhållas med hjälp av mikroskopi som den direkta metoden. Den konfokala fluorescerande mikroskopin med korrekt färgningsprotokoll möjliggör visuell bedömning av cellernas och sfäroidernas morfologi; Viktiga detaljer om celldöd och förändringar inuti cellerna kan också detekteras.
För det andra kräver lätt applicering ett noggrant val av ljusdosering. Vid PDT är lätt överdosering extremt skadlig för vävnader22. Fotofarmakologisk behandling kan vara fördelaktig vid överdriven ljusbestrålning. Den aktiva substansens övre gräns bestäms av den administrerade dosen av den icke-aktiverade substansen och dess farmakokinetik. Emellertid, ljus dosering är fortfarande ett problem i fotofarmakologi. Försiktighet bör iakttas för att säkerställa att bestrålningseffekttätheten och exponeringstiden inte är mindre än kravet för behandlingen. I princip kan genereringen av den aktiverade substansen övervakas in vivo. Av bioetiska skäl föreslog vi dock ett experiment med en modellvävnad (färskt malet kött) blandat med den icke-aktiverade föreningen15. Detta experiment är enkelt och kan modifieras för att använda olika ljuskällor. Den kan också anpassas för fotofysisk uppskattning av ljusdosering och mätning av termisk påverkan. Även här, genom att använda modellvävnader, är ljusexponeringen möjlig att minimera, jämfört med till exempel den mer exakta fotoswitchningseffektivitetsbestämningen i in vivo-förhållandena , ett alternativ som alltid kan vara intressant att överväga.
Slutligen kan de föreningar som uppvisar överlägsna egenskaper i in vitro-toxicitetsskärmarna och effektivt fotoväxlar minst 1-1,5 cm djupt i modellvävnaden väljas för kostsamma, mödosamma och långa in vivo-studier. I detta protokoll använde vi samma cellinje (LLC) som i in vitro-bedömningen för att generera allograftcancermodellen. Tumörtillväxtdynamiken, dödligheten och antalet metastaser är de parametrar som är mest lämpade för att bedöma effekten mot cancer. Jämfört med konventionell kemoterapi appliceras en ytterligare faktor i den fotofarmakologiska behandlingen - ljuset. Därför behövs två kontrolldjurgrupper: en som endast tar emot fordonet och den andra som tar emot fordonet och bestrålning. Denna inställning möjliggör utvärdering av ljusets inverkan på de uppmätta parametrarna. I vårt experiment mottog djuren i de två experimentgrupperna den icke-aktiverade föreningen, och tumörerna hos mössen i en grupp bestrålades. Bestrålningsregimen var identisk för kontroll- och behandlingsgrupperna. Jämförelse med benchmarkkemoterapi är inte nödvändig i detta skede eftersom huvudsyftet med experimentet är att visa den kombinerade effekten av ljus- och sammansatt applikation. De bäst presterande föreningarna som uppvisar denna effekt kan sedan väljas ut för vidare studier av deras in vivo-toxicitet och jämförelse med riktmärken för att fatta viktiga go-no-go-beslut om deras utveckling. Tekniskt sett kan in vivo-experimentet som vi beskriver enkelt anpassas till farmakokinetiska eller farmakodynamiska studier, till exempel av en förening som redan är vald som läkemedelsledare.
Disclosures
IVK, OB, SA och ASU är uppfinnare på den utfärdade patentfamiljen: "Peptidomimetics possessing photocontrolled biological activity" (WO2014127919 [A1], EP2958934 [B1], US9481712 [B2], UA113685 [C2]) licensierade till Lumobiotics GmbH. IVK, OB, TS och SA är grundare och aktieägare i Lumobiotics GmbH. IVK är vetenskaplig rådgivare, HK, TM, IP och PB är anställda av Enamine LLC. Författarna har inga andra relevanta anknytningar eller ekonomiska engagemang med någon organisation eller enhet med ett ekonomiskt intresse i eller ekonomisk konflikt med ämnet eller materialet som diskuteras i publikationen förutom de som avslöjas.
Acknowledgments
Författarna erkänner EU-finansiering från H2020-MSCA-RISE-programmet genom projekten PELICO (#690973) och ALISE (#101007256). Detta arbete stöddes av DFG-GRK 2039 (SA, TS och ASU), NACIP-programmet för Helmholtz Society (SA och ASU) och VIP+ för BMBF (OB och ASU). Vi erkänner Dr. Serhii Koniev, Karlsruhe Institute of Technology, som har syntetiserat föreningen LMB002, renat den och vänligen tillhandahållit föreningen för studien. Författarna tackar också Chupryna Maksym som filmade och sammanställde videon i Ukraina, och till alla modiga försvarare av Ukraina som gjorde det experimentella arbetet, skrivandet och filmningen av denna publikation möjlig.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent 1100 Series capillary LC system | ALSI-Chrom (Agilent distributor) | - | |
| ATCC CRL-1642, LL/2 (LLC1) Lewis lung carcinoma cell line | ECACC | 90020104 | |
| C57BL/6NCrl mice, female, inbred | Charles River | Strain code: 027 | |
| CelCulture, CO2 incubator | Esco Micro | CCL-170B | |
| Corning Matrigel Basement membrane matrix | Merck | CLS354234 | |
| Corning, 384- well spheroid microplates | Merck | CLS3830 | |
| Fetal bovine serum | Merck | F7524 | |
| Gibco, DPBS | Thermo Fisher Scientific | 21600044 | |
| Gramicidin S | Lumobiotics | Custom synthesis | |
| HyClone, DMEM/high glucose | Cytiva | SH30003.04 | |
| IN Cell Analyzer 6500HS, imaging system | Cytiva | 29240358 | |
| Invitrogen, Calcein AM | Thermo Fisher Scientific | C1430 | |
| Isoflurane anesthesia machine | ASA | S/N ASA 1305 | |
| L-glutamine, 200 mM solution | Merck | G7513 | |
| LIKA-surgeon, diode surgery laser | Fotonika plus | - | |
| LMB002 | Lumobiotics | Custom synthesis | |
| Penicillin–Streptomycin, solution stabilized | Merck | P4333 | |
| PhenoPlate, 96-well plates | PerkinElmer | 6055302 | |
| Photometer PCE-LED 20 | PCE Instruments | PCE-LED 20 | |
| Thermo Scientific, Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Thermo Scientific, Propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | J66764-MC | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Merck | T8154 | |
| Trypsin–EDTA, 10 x solution | Merck | T4174 | |
| UltraCruz Cell culture flasks with vented caps, 75 cm2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-200263 | |
| UltraCruz, bottle top filters, PES, 0.22 μm | Santa Cruz Biotechnology | sc-360882 | |
| Vydac 218TP, C18 HPLC column (4.6 mm × 250 mm, 5 µm) | Altmann Analytik (Avantor distributor) | GR5103827 |
References
- Fuchter, M. J. On the promise of photopharmacology using photoswitches: a medicinal chemist's perspective. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (20), 11436-11447 (2020).
- Volarić, J., Szymanski, W., Simeth, N. A., Feringa, B. L.
- Paoletti, P., Ellis-Davies, G. C. R., Mourot, A. Optical control of neuronal ion channels and receptors. Nature Reviews Neuroscience. 20, 514-532 (2019).
- Hüll, K., Morstein, J., Trauner, D.
- Ma, X., et al. In vivo photopharmacology with a caged mu opioid receptor agonist drives rapid changes in behavior. Nature Methods. 20, 682-685 (2023).
- Sarabando, S. N., Palmeira, A., Sousa, M. E., Faustino, M. A. F., Monteiro, C. J. P. Photomodulation Approaches to Overcome Antimicrobial Resistance. Pharmaceuticals. 16 (5), 682 (2023).
- Kolarski, D., Szymanski, W., Feringa, B. L. Chronophotopharmacology: Methodology for high spatiotemporal control over the circadian rhythm with light. Neuromethods. Hirota, T., Hatori, M., Panda, S. 186, Humana, New York, NY. (2022).
- Babii, O., et al. Peptide drugs for photopharmacology: how much of a safety advantage can be gained by photocontrol. Future Drug Discovery. 2 (1), FDD28 (2020).
- Davis, A. M., Keeling, D. J., Steele, J., Tomkinson, N. P., Tinker, A. C.
- Balani, S. K., Miwa, G. T., Gan, L., Wu, J., Lee, F. W. Strategy of utilizing in vitro and in vivo adme tools for lead optimization and drug candidate selection. Current Topics in Medicinal Chemistry. 5 (11), 1033-1038 (2005).
- Kleijn, A., et al. A Systematic comparison identifies an ATP-based viability assay as most suitable read-out for drug screening in glioma stem-like cells. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Rodrigues, J., Heinrich, M. A., Teixeira, L. M., Prakash, J. 3D in vitro model revolution: unveiling tumor-stroma interactions. Trends in Cancer. 7 (3), 249-264 (2021).
- Sittinger, M., et al. Tissue engineering and autologous transplant formation: practical approaches with resorbable biomaterials and new cell culture techniques. Biomaterials. 17 (3), 237-242 (1996).
- Matai, I., Kaur, G., Seyedsalehi, A., McClinton, A., Laurencin, C. T. Progress in 3D bioprinting technology for tissue/organ regenerative engineering. Biomaterials. 226, 119536 (2020).
- Babii, O., et al. Direct photocontrol of peptidomimetics: an alternative to oxygen-dependent photodynamic cancer therapy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (18), 5493-5496 (2016).
- De Ridder, K., et al. Novel 3D lung tumor spheroids for oncoimmunological assays. Advanced NanoBiomed Research. 2 (4), 2100124 (2022).
- Pauli, C., et al. Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Van Straten, D., Mashayekhi, V., De Bruijn, H. S., Oliveira, S., Robinson, D. J. Oncologic photodynamic therapy: basic principles, current clinical status and future directions. Cancers. 9 (2), 19 (2017).
- Li, X., Kwon, N., Guo, T., Liu, Z., Yoon, J. Innovative strategies for hypoxic-tumor photodynamic therapy. Angewandte Chemie International Edition. 57 (36), 11522-11531 (2018).
- Hull, K., Morstein, J., Trauner, D.
- Babii, O., et al. Structure-activity relationships of photoswitchable diarylethene-based β-hairpin peptides as membranolytic antimicrobial and anticancer agents. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (23), 10793-10813 (2018).
- Heckl, C., Aumiller, M., Rühm, A., Sroka, R., Stepp, H. Fluorescence and treatment light monitoring for interstitial photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 96 (2), 388-396 (2020).
